JP2021114946A

JP2021114946A - 側弯症の検査方法

Info

Publication number: JP2021114946A
Application number: JP2020011222A
Authority: JP
Inventors: 志郎池川; Shiro Ikegawa; 郁代稲葉; Ikuyo Inaba
Original assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Current assignee: RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 2020-01-27
Filing date: 2020-01-27
Publication date: 2021-08-10

Abstract

【課題】側弯症の発症リスクを高確率で精度よく検査するための方法を提供すること。【解決手段】rs1978060、rs482012、rs12149832、rs142502288、rs11205303、rs17011903、rs12029076、rs141903557、rs658839、rs11341092、rs397948882、rs160335、rs11787412、rs188915802、rs2467146、rs73235136、およびrs545608の一塩基多型ならびにこれらの一塩基多型と連鎖不平衡にある一塩基多型から選択される一種類以上の一塩基多型を分析し、該分析結果に基づいて側弯症を検査することを特徴とする、側弯症の検査方法。【選択図】図１

Description

本発明は側弯症の発症リスクを判定するための検査方法および該検査方法に用いられる試薬に関する。また、側弯症の予防薬または治療薬をスクリーニングする方法に関する。

側弯症は、脊椎が左右方向に弯曲した病態をいう。側弯症のうち、その病因が明らかでないものを特発性側弯症と呼び、側弯症の８０〜９０％を占める。
側弯症は、通学年代の児童に多く発症し、１０歳から骨格が成熟するまでの児童において、側弯の指標であるコブ角（Cobb angle）で少なくとも１０°の弯曲を示し、且つ、その病因が明らかでないものを思春期特発性側弯症（Adolescent idiopathic scoliosis；AIS）と定義する。AISの発症頻度は、通学年代の児童のうち、日本で２％、世界では２〜
３％であり、日本では毎年１万人程度が発症している。

側弯症の診断は主にＸ線検査により行われるが、Ｘ線検査は発症前や発症初期における側弯症の診断には有効でない。また、特発性側弯症の治療は、対症療法により行われるのみで、病因が明らかでない以上、原因療法は行われていない。
そこで、側弯症の発症前診断（リスク診断）や早期診断を可能にし、また、原因治療を可能にするため、側弯症と関連する遺伝子や一塩基多型（SNP）の同定が試みられている
。

ゲノムワイド連鎖解析（genome-wide linkage analysis）によりAISの病因となる多く
の遺伝子座が見出されており、AISは複雑な遺伝的素因に基づくと考えられている。また
、候補遺伝子解析によりAIS感受性遺伝子が報告されているが、再現性などの点で問題が
ある。
さらに、近年、伝達不平衡解析（Transmission Disequilibrium Test；TDT）法に基づ
くゲノムワイド関連解析（Genome-wide association study；GWAS）によって、AISと関連する遺伝子の候補が報告された（非特許文献１）。しかしながら、それらは、多重検定補正後のケース−コントロール関連解析においてはAISとの関連の再現性が得られていない
。

一方、近年、GWASによって、第１０染色体長腕24.31領域（10q24.31領域）に存在するSNPが、日本人集団および中国人集団において、ゲノムワイド水準を満たしてAISと関連す
ることが見出された（特許文献１）。また、同様にGWASによって、第６染色体長腕24.1領域（6q24.1領域）に存在するSNPが、日本人集団において、AISと関連することが示唆された（特許文献２）。
また、第９染色体短腕22.2領域（9p22.2領域）に存在するBNC2 (basonuclin-2)遺伝子
のSNPと側弯症の関連についても報告されている（特許文献３）。
さらに、1q42.13領域、2ｐ21領域、20ｑ13.12領域、11q14.1領域に存在するSNPsと側弯症の関連についても報告されており、その中には女性における側弯症リスクに関連するものや側弯症の進行リスクに関連するものが含まれている（特許文献４）。

特開2013-042673号公報特開2014-132875号公報特開2016-214091号公報特開2018-134060号公報

Sharma, S. et al., Hum Mol Genet. 20, 1456-1466 (2011).

上記の通り、GWASによってAISの発症リスクと関連するSNPｓが明らかにされてきてはいるが、これらのSNPｓの変異で説明のつくAIS遺伝率の割合はわずか３％以下と推定され、AISの病因および病原性を理解するにはさらなる感受性遺伝子座の同定が不可欠である。
したがって、本発明は、側弯症の発症リスクを正確かつ高確率で検査できる方法、および該方法に用いられる検査試薬を提供することを課題とする。本発明はまた、側弯症の予防薬または治療薬のスクリーニング方法を提供することを課題とする。

本発明者らは上記課題の解決のためにGWASメタ解析を行って検討した結果、rs1978060
、rs482012、rs12149832、rs142502288、rs11205303、rs17011903、rs12029076、rs141903557、rs658839、rs11341092、rs397948882、rs160335、rs11787412、rs188915802、rs2467146、rs73235136、およびrs545608の一塩基多型ならびにこれらと連鎖不平衡にある一
塩基多型がAISと関連することを見出した。そして、これらの多型を調べることにより側
弯症の発症リスクを正確に高確率で予測できることを見出した。さらに、TBX1遺伝子の発現を増加させる物質が側弯症の予防薬や治療薬として有用であることを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち、本発明は以下の態様を含む。
［１］rs1978060、rs482012、rs12149832、rs142502288、rs11205303、rs17011903、rs12029076、rs141903557、rs658839、rs11341092、rs397948882、rs160335、rs11787412、rs188915802、rs2467146、rs73235136、およびrs545608の一塩基多型ならびにこれらの一塩基多型と連鎖不平衡にある一塩基多型から選択される一種類以上の一塩基多型を分析し、該分析結果に基づいて側弯症を検査することを特徴とする、側弯症の検査方法。
［２］前記側弯症が思春期特発性側弯症である、［１］に記載の方法。
［３］少なくともrs1978060の一塩基多型またはrs1978060と連鎖不平衡にある一塩基多型を分析する、［１］または［２］に記載の方法。
［４］前記rs1978060と連鎖不平衡にある一塩基多型がrs2238777またはrs737869の一塩基多型である、［１］〜［３］のいずれかに記載の方法。
［５］配列番号１〜１７のいずれかに示す塩基配列において、塩基番号２６番目の塩基を含む１５塩基以上の配列またはその相補配列を有する側弯症検査用プローブ。
［６］配列番号１〜１７のいずれかに示す塩基配列において、塩基番号２６番目の塩基を含む領域を増幅することのできる側弯症検査用プライマー。
［７］TBX1遺伝子またはTBX1遺伝子のプロモーターに連結されたレポーター遺伝子を発現する細胞に医薬候補物質を添加する工程、TBX1遺伝子またはレポーター遺伝子の発現量を測定する工程、および前記発現量を増加させる物質を選択する工程を含む、側弯症の予防薬または治療薬をスクリーニングする方法。
［８］TBX1遺伝子のmRNAまたはタンパク質の発現量を測定する工程を含む、側弯症の検査方法。

本発明によれば、側弯症の発症リスクを正確かつ高確率で予測することができる。また、本発明のスクリーニング方法によれば、側弯症の治療薬または予防薬を得ることができる。したがって、本発明は側弯症の予防や早期治療に貢献するものである。

３回のGWASのメタ解析におけるAIS関連SNPsについての-log₁₀P値を示すマンハッタンプロット。 rs1978060の各アレルをレポーターアッセイ、電気泳動移動度シフト解析およびFOXA2抗体を用いるスーパーシフトアッセイで解析した結果を示す。（ａ）MCF-7細胞内レポーターアッセイ。rs1978060のリスクアレル（G）ではノンリスク（A）アレルと比べて転写活性の著しい低下があった。データは２回の実験値の平均±S.D.である。*はP＜0.01を示す。（ｂ）MCF-7細胞から抽出した核タンパク質を用いた電気泳動移動度シフト解析（写真）。rs1978060のＡアレルプローブ（レーン１、黒い矢印）およびＧアレルプローブ（レーン２、白い矢印）について特異的なバンドが存在した。過剰量の未標識Ａアレルプローブ（レーン３、レーン６）およびＧアレルプローブ（レーン４、レーン５）を競合物として用いて競合分析を行った。（ｃ）FOXA2抗体を用いたスーパーシフトアッセイ（写真）。黒い矢印は、レーン３中のスーパーシフトしたFOXA2複合体を示す。

＜１＞本発明の検査方法
本発明の方法は、rs1978060、rs482012、rs12149832、rs142502288、rs11205303、rs17011903、rs12029076、rs141903557、rs658839、rs11341092、rs397948882(rs57982636)、rs160335、rs11787412、rs188915802、rs2467146、rs73235136、およびrs545608のSNPsならびにこれらのSNPsと連鎖不平衡にあるSNPsから選択されるSNP（s）を分析し、該分析結果に基づいて側弯症を検査することを特徴とする。
ここで、rs番号は、National Center for Biotechnology InformationのdbSNPデータベース（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/snp/）の登録番号を示す。

ここで「上記の塩基と連鎖不平衡にある塩基」とは、上記の塩基と好ましくはｒ²＞０
．８、さらに好ましくはｒ²＞０．９の関係を満たす塩基をいう。ｒ²は連鎖不平衡係数である。連鎖不平衡にある塩基は、例えば、HapMapデータベース(http://www.hapmap.org/index.html.ja)等を用いて同定することができる。

本発明において、「検査」とは側弯症の発症リスクの検査および側弯症の発症の有無の検査、さらには側弯症の進行度の検査および予測を含む。本発明の方法においては、SNP
の分析結果を、側弯症の発症リスク、発症の有無、および進行リスク等と関連付けることができる。

側弯症としては、特に限定されないが、例えば、従来病因が特定されていない特発性側弯症の検査に好適に用いられる。側弯症は、先天性、若年性、思春期性、成人性等、いずれの時期に発症するものであってもよいが、思春期性側弯症であるのが好ましく、思春期特発性側弯症（AIS）であるのがより好ましい。

本発明の方法は、いずれの人種の被験者に対しても用いることができる。本発明の方法は、例えば、日本人や中国人等のアジア人の被験者や白人の被験者に好適に用いることができる。また、本発明の方法は、いずれの性別の被験者に対しても用いることができるが、特に、rs140745598またはこれと連鎖不平衡にあるSNP（rs142502288など）は女性被験
者に対して好適に用いることができる。

＜rs1978060＞
rs1978060は22q11.21領域のTBX1遺伝子が含まれる連鎖不平衡ブロックに位置するSNPであり、GenBank Accession No. NC_000022.10の19749525番目の塩基におけるアデニン（A
）／グアニン（G）の多型を意味する。

この塩基がGである場合は側弯症の可能性または発症リスクが高い。また、遺伝子型を
考慮して解析した場合は、GG＞AG＞AAの順で側弯症の可能性または発症リスクが高い。よって、この塩基がGである被験者には、側弯症の予防または治療を行うことが考えられる
。

なお、rs1978060について、SNP塩基およびその前後２５ｂｐの領域を含む合計５１ｂｐの長さの配列を、配列番号１に示した。配列番号１における２６番目の塩基が多型を有し、この塩基がG（リスクアレル）である場合は側弯症の可能性または発症リスクが高いと
判定される。
GGGTGCCGCGCTGTGTCTAATGTAC(A/G)CACCAGCTCGGAGTCCGAACAGCCA（配列番号１）

なお、本発明においては、上記塩基に相当する塩基が解析される。「上記塩基に相当する塩基」とは、ヒト染色体上の上記領域における該当塩基を意味する。すなわち、「上記塩基に相当する塩基を解析する」ことには、仮に人種の違いなどによって上記配列がSNP
以外の位置で若干変化したとしても、上記領域における該当塩基を解析することが含まれる。

rs1978060と連鎖不平衡にある塩基として、具体的には、例えば、rs2238777とrs737869が挙げられ、これらの遺伝子型を解析してもよい。

＜rs482012＞
rs482012はヒト第6染色体のNT5DC1遺伝子内に位置するSNPであり、GenBank Accession No. NC_000006.11の116430533番目の塩基におけるグアニン（G）／チミン（T）の多型を
意味し、この塩基がTである場合は側弯症の可能性または発症リスクが高い。また、遺伝
子型を考慮して解析した場合は、TT＞TG＞GGの順で側弯症の可能性または発症リスクが高い。よって、この塩基がTである被験者には、側弯症の予防や治療を行うことが考えられ
る。

なお、rs482012について、SNP塩基およびその前後２５ｂｐの領域を含む合計５１ｂｐ
の長さの配列を、配列番号２に示した。配列番号２における２６番目の塩基が多型を有し、この塩基がT（リスクアレル）である場合は側弯症の可能性または発症リスクが高いと
判定される。
GTTTGTTTCCATGTTTATTTCTCAG（G/T）CATTGAGAGATAGGGTATGTGTAAA（配列番号２）

rs482012と連鎖不平衡にある塩基として、具体的には、例えば、rs564980、rs563176、rs564253、rs534932、rs517352、rs493467、rs568725、rs563962、rs9488836、およびrs9488837が挙げられ、これらの遺伝子型を解析してもよい。

＜rs12149832＞
rs12149832はヒト第16染色体のFTO遺伝子内に位置するSNPであり、GenBank Accession No. NC_000016.9の53842908番目の塩基におけるグアニン（G）／アデニン（A）の多型を
意味し、この塩基がGである場合は側弯症のリスクが高い。また、遺伝子型を考慮して解
析した場合は、GG＞AG＞AAの順で側弯症のリスクが高い。よって、この塩基がGである被
験者には、側弯症の予防や治療を行うことが考えられる。

なお、rs12149832について、SNP塩基およびその前後２５ｂｐの領域を含む合計５１ｂ
ｐの長さの配列を、配列番号３に示した。配列番号３における２６番目の塩基が多型を有し、この塩基がG（リスクアレル）である場合は側弯症のリスクが高いと判定される。
CACATTTATGCCTTTTATATGCCAC（G/A）TACACACGAAAACTCCATATATTCT（配列番号３）

rs12149832と連鎖不平衡にある塩基として、具体的には、例えば、rs62033413、rs72805611、rs7188250、rs72805612、rs11075993、rs72805613、rs12149574、rs11649091、rs3751812、およびrs17817712が挙げられ、これらの遺伝子型を解析してもよい。

＜rs142502288＞
rs142502288はヒト第１染色体のUHMK1遺伝子の近傍に位置するSNPであり、GenBank Accession No. NC_000001.10の162450931番目の塩基におけるアデニン（A）／グアニン（G）の多型を意味し、この塩基が Gである場合は側弯症のリスクが高い。また、遺伝子型を考慮して解析した場合は、GG＞GA＞AAの順で側弯症のリスクが高い。よって、この塩基がG
である被験者には、側弯症の予防や治療を行うことが考えられる。

なお、rs1402502288について、SNP塩基およびその前後２５ｂｐの領域を含む合計５１
ｂｐの長さの配列を、配列番号４に示した。配列番号４における２６番目の塩基が多型を有し、この塩基がG（リスクアレル）である場合は女性における側弯症のリスクが高いと
判定される。
AACATGGCAAAACCCTGTCTCTACT(A/G)AAAATTAGCCGGGCATGGTGGCGTG（配列番号４）

rs142502288と連鎖不平衡にある塩基として、具体的には、例えば、rs140745598が挙げられ、このSNPの遺伝子型を解析してもよい。

＜rs11205303＞
rs11205303はヒト第１染色体のMTMR11遺伝子内に位置するSNPであり、GenBank Accession No. NC_000001.10の149906413番目の塩基におけるチミン（T）／シトシン（C）の多型を意味し、この塩基がCである場合は側弯症のリスクが高い。また、遺伝子型を考慮して
解析した場合は、CC＞CT＞TTの順で側弯症のリスクが高い。よって、この塩基がCである
被験者には、側弯症の予防や治療を行うことが考えられる。

なお、rs11205303について、SNP塩基およびその前後２５ｂｐの領域を含む合計５１ｂ
ｐの長さの配列を、配列番号５に示した。配列番号５における２６番目の塩基が多型を有し、この塩基がC（リスクアレル）である場合は側弯症のリスクが高いと判定される。
TGAGCTCTGGCTTGGACAATGGCCA（T/C）GGTCACCTGCAGAGGAAAGGACATT（配列番号５）

rs11205303と連鎖不平衡にある塩基として、具体的には、例えば、rs11205277, rs12048493が挙げられ、このSNPの遺伝子型を解析してもよい。

＜rs17011903＞
rs17011903はヒト第１染色体のPLXNA2遺伝子内に位置するSNPであり、GenBank Accession No. NC_000001.10の208259531番目の塩基におけるシトシン（C）／アデニン（A）の多型を意味し、この塩基がAである場合は側弯症のリスクが高い。また、遺伝子型を考慮し
て解析した場合は、AA＞AC＞CCの順で側弯症のリスクが高い。よって、この塩基がAであ
る被験者には、側弯症の予防や治療を行うことが考えられる。

なお、rs17011903について、SNP塩基およびその前後２５ｂｐの領域を含む合計５１ｂ
ｐの長さの配列を、配列番号６に示した。配列番号６における２６番目の塩基が多型を有し、この塩基がA（リスクアレル）である場合は側弯症のリスクが高いと判定される。
TGTGAGCTTCTTGAGGATTAGGCTG（C/A）ATCTTACTCACCTCCATCTCCCCAG（配列番号６）

rs17011903と連鎖不平衡にある塩基として、具体的には、例えば、rs79430472、rs76883842、およびrs74631854が挙げられ、このSNPの遺伝子型を解析してもよい。

＜rs12029076＞
rs12029076はヒト第１染色体のARF1遺伝子内に位置するSNPであり、GenBank Accession
No. NC_000001.10の228272687番目の塩基におけるグアニン（G）／アデニン（A）またはシトシン（C）の多型を意味し、この塩基がGである場合は側弯症のリスクが高い。また、遺伝子型を考慮して解析した場合は、GG＞GA、GC＞AA、CCの順で側弯症のリスクが高い。よって、この塩基がGである被験者には、側弯症の予防や治療を行うことが考えられる。

なお、rs12029076について、SNP塩基およびその前後２５ｂｐの領域を含む合計５１ｂ
ｐの長さの配列を、配列番号７に示した。配列番号７における２６番目の塩基が多型を有し、この塩基がG（リスクアレル）である場合は側弯症のリスクが高いと判定される。
GAGGCTGCAGCCAGCCTGGGCTGGC（G/A,C）GGCCCATACTGTCTCTCATAGGCAT（配列番号７）

rs12029076と連鎖不平衡にある塩基として、具体的には、例えば、rs73092904およびrs3754356が挙げられ、このSNPの遺伝子型を解析してもよい。

＜rs141903557＞
rs141903557はヒト第４染色体のLOC101928978遺伝子内に位置するSNPであり、GenBank Accession No. NC_000004.11の85168056番目の塩基におけるグアニン（G）／シトシン（C）の多型を意味し、この塩基がCである場合は側弯症のリスクが高い。また、遺伝子型を
考慮して解析した場合は、CC＞GC＞GGの順で側弯症のリスクが高い。よって、この塩基がCである被験者には、側弯症の予防や治療を行うことが考えられる。

なお、rs141903557について、SNP塩基およびその前後２５ｂｐの領域を含む合計５１ｂｐの長さの配列を、配列番号８に示した。配列番号８における２６番目の塩基が多型を有し、この塩基がC（リスクアレル）である場合は側弯症のリスクが高いと判定される。
CCCTTCCTAAAATCTGGGGGGCTGG(G/C)GGTGGGGGAAGCCTTAGTGGCCTGG（配列番号８）

rs141903557と連鎖不平衡にある塩基として、具体的には、例えば、rs116916814、rs113011139、rs140756380、rs143563649、rs140725471、rs147241258、rs139726586、rs146346641、およびrs116948787が挙げられ、このSNPの遺伝子型を解析してもよい。

＜rs658839＞
rs658839はヒト第６染色体のBCKDHB/FAM46A遺伝子の近傍に位置するSNPであり、GenBank Accession No. NC_000006.11の81228722番目の塩基におけるアデニン（A）／グアニン
（G）の多型を意味し、この塩基がGである場合は側弯症のリスクが高い。また、遺伝子型を考慮して解析した場合は、GG＞GA＞AAの順で側弯症のリスクが高い。よって、この塩基がGである被験者には、側弯症の予防や治療を行うことが考えられる。

なお、rs658839について、SNP塩基およびその前後２５ｂｐの領域を含む合計５１ｂｐ
の長さの配列を、配列番号９に示した。配列番号９における２６番目の塩基が多型を有し、この塩基がG（リスクアレル）である場合は側弯症のリスクが高いと判定される。
ACAGAATAGAAATGGTTGACAATGC(A/G)TGCGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT（配列番号９）

＜rs11341092＞
rs11341092はヒト第７染色体のLOC101927021/UNCX遺伝子の近傍に位置するSNPであり、GenBank Accession No. NC_000007.13の1269598番目の塩基におけるdel(-)／Cの多型を意味し、この塩基がCである場合は側弯症のリスクが高い。また、遺伝子型を考慮して解析
した場合は、CC＞-/C＞-/-の順で側弯症のリスクが高い。よって、この塩基がCである被
験者には、側弯症の予防や治療を行うことが考えられる。

なお、rs11341092について、SNP塩基およびその前後２５ｂｐの領域を含む合計５１ｂ
ｐの長さの配列を、配列番号１０に示した。配列番号１０における２６番目の塩基が多型を有し、この塩基がC（リスクアレル）である場合は側弯症のリスクが高いと判定される
。
CGGGGCGCGTCCGGCAGCGCTGAGA(-/C)CCCCCACCCCGAATCAAAGTAGCGG（配列番号１０）

rs11341092と連鎖不平衡にある塩基として、具体的には、例えば、rs56980695、rs4487642、rs62435139、rs62435140、rs76210971、rs62435141、rs7785293、rs10228850、およびrs62435137が挙げられ、このSNPの遺伝子型を解析してもよい。

＜rs397948882 (rs57982636)＞
rs397948882はヒト第７染色体のAGMO/MEOX2遺伝子の近傍に位置するSNPであり、GenBank Accession No. NC_000007.13の15636869:15636870番目の塩基における-/Tの多型を意味し、この塩基が(-)である場合は側弯症のリスクが高い。また、遺伝子型を考慮して解析
した場合は、-/-＞-/T＞TTの順で側弯症のリスクが高い。よって、この塩基が(-)である
被験者には、側弯症の予防や治療を行うことが考えられる。

なお、rs397948882について、SNP塩基およびその前後２５ｂｐの領域を含む合計５１ｂｐの長さの配列を、配列番号１１に示した。配列番号１１における２６番目の塩基が多型を有し、この塩基が-（リスクアレル）である場合は側弯症のリスクが高いと判定される
。
GTCTGATCTAAACTTCTAGCAAGAA(-/T)TTTTTTTTTATAAAAATCAATTTTA（配列番号１１）

rs397948882と連鎖不平衡にある塩基として、具体的には、例えば、rs35807172、rs2057743、rs10950570、rs10950571、rs12538570、rs12538628、rs67240818、rs1155147、rs1155148、およびrs1155149が挙げられ、このSNPの遺伝子型を解析してもよい。

＜rs160335＞
rs160335はヒト第７染色体のCREB5遺伝子内に位置するSNPであり、GenBank Accession No. NC_000007.13の28587817番目の塩基におけるアデニン（A）／グアニン（G）の多型を意味し、この塩基がGである場合は側弯症のリスクが高い。また、遺伝子型を考慮して解
析した場合は、GG＞GA＞AAの順で側弯症のリスクが高い。よって、この塩基がGである被
験者には、側弯症の予防や治療を行うことが考えられる。

なお、rs160335について、SNP塩基およびその前後２５ｂｐの領域を含む合計５１ｂｐ
の長さの配列を、配列番号１２に示した。配列番号１２における２６番目の塩基が多型を有し、この塩基がG（リスクアレル）である場合は側弯症のリスクが高いと判定される。
TTTTTCACAACTGAAACATTGGGCC(A/G)TTGGTGGGACGTTCTGTGCCTTGAA（配列番号１２）

＜rs11787412＞
rs11787412はヒト第８染色体のCSMD1遺伝子内に位置するSNPであり、GenBank Accession No. NC_000008.10の3134239番目の塩基におけるシトシン（C）／アデニン（A）または
チミン（T）の多型を意味し、この塩基がAである場合は側弯症のリスクが高い。また、遺伝子型を考慮して解析した場合は、AA＞AC＞CCの順で側弯症のリスクが高い。よって、この塩基がAである被験者には、側弯症の予防や治療を行うことが考えられる。

なお、rs11787412について、SNP塩基およびその前後２５ｂｐの領域を含む合計５１ｂ
ｐの長さの配列を、配列番号１３に示した。配列番号１３における２６番目の塩基が多型を有し、この塩基がA（リスクアレル）である場合は側弯症のリスクが高いと判定される
。
TACTATGAAAATTTTGAATTAAGCT(C/A,T)AGCTCAATTACAAAGCATATTGTTT（配列番号１３）

rs11787412と連鎖不平衡にある塩基として、具体的には、例えば、rs7813353、rs149667630、rs13274061、rs12549534、rs12542756、rs6988478、rs10866948、およびrs10866949が挙げられ、このSNPの遺伝子型を解析してもよい。

＜rs188915802＞
rs188915802はヒト第９染色体のKIF24遺伝子内に位置するSNPであり、GenBank Accession No. NC_000009.11の34318683番目の塩基におけるグアニン（G）／アデニン（A）また
はチミン（T）の多型を意味し、この塩基がTである場合は側弯症のリスクが高い。また、遺伝子型を考慮して解析した場合は、TT＞GT＞GGの順で側弯症のリスクが高い。よって、この塩基がTである被験者には、側弯症の予防や治療を行うことが考えられる。

なお、rs188915802について、SNP塩基およびその前後２５ｂｐの領域を含む合計５１ｂｐの長さの配列を、配列番号１４に示した。配列番号１４における２６番目の塩基が多型を有し、この塩基がT（リスクアレル）である場合は側弯症のリスクが高いと判定される
。
AGGCGACCACGGCGTCGGAGGCCAA(G/T,A)GCAGTGCTGAGTGCCAAGCAGCTGA（配列番号１４）

＜rs2467146＞
rs2467146はヒト第１２染色体のLINC02378/MIR3974遺伝子の近傍に位置するSNPであり
、GenBank Accession No. NC_000012.11の17800607番目の塩基におけるアデニン（A）／
グアニン（G）の多型を意味し、この塩基がAである場合は側弯症のリスクが高い。また、遺伝子型を考慮して解析した場合は、AA＞AG＞GGの順で側弯症のリスクが高い。よって、この塩基がAである被験者には、側弯症の予防や治療を行うことが考えられる。

なお、rs2467146について、SNP塩基およびその前後２５ｂｐの領域を含む合計５１ｂｐの長さの配列を、配列番号１５に示した。配列番号１５における２６番目の塩基が多型を有し、この塩基がA（リスクアレル）である場合は側弯症のリスクが高いと判定される。
CAGGTAGTTCTTTAGAGCAGTGTGA(A/G)AATGGACTAATACACTGGGGTTGTG（配列番号１５）

rs2467146と連鎖不平衡にある塩基として、具体的には、例えば、rs2467147、rs2467145、rs2467144、rs35711769、rs2467142、rs10840770、rs2437984、rs2467140、rs2467139、およびrs2467138が挙げられ、このSNPの遺伝子型を解析してもよい。

＜rs545608＞
rs545608はヒト第１染色体のSEC16B遺伝子内に位置するSNPであり、GenBank Accession
No. NC_000001.10の177899121番目の塩基におけるグアニン（G）／シトシン（C）の多型を意味し、この塩基がGである場合は側弯症のリスクが高い。また、遺伝子型を考慮して
解析した場合は、GG＞GC＞CCの順で側弯症のリスクが高い。よって、この塩基がGである
被験者には、側弯症の予防や治療を行うことが考えられる。

なお、rs545608について、SNP塩基およびその前後２５ｂｐの領域を含む合計５１ｂｐ
の長さの配列を、配列番号１６に示した。配列番号１６における２６番目の塩基が多型を有し、この塩基がG（リスクアレル）である場合は側弯症のリスクが高いと判定される。ACAGCCCCAAACATGACTCTGCCCG(G/C)GGTTGATTGGACAGATGGAGCTAGG（配列番号１６）

rs545608と連鎖不平衡にある塩基として、具体的には、例えば、rs506589およびrs509325が挙げられ、このSNPの遺伝子型を解析してもよい。

＜rs73235136＞
rs73235136はヒト第3染色体のBOC遺伝子内に位置するSNPであり、GenBank Accession No. NC_000003.11の112951529番目の塩基におけるシトシン（C）／アデニン（A）またはチミン（T）の多型を意味し、この塩基がCである場合は側弯症のリスクが高い。また、遺伝子型を考慮して解析した場合は、CC＞CA,CT＞TT,AAの順で側弯症のリスクが高い。よって、この塩基がCである被験者には、側弯症の予防や治療を行うことが考えられる。

なお、rs73235136について、SNP塩基およびその前後２５ｂｐの領域を含む合計５１ｂ
ｐの長さの配列を、配列番号１７に示した。配列番号１７における２６番目の塩基が多型を有し、この塩基がC（リスクアレル）である場合は側弯症のリスクが高いと判定される。
CCACCCTATGAGGGAGGTATCCAGC(C/T,A)CCTGAGATATTGCCTCTTCTTAAAT（配列番号１７）

rs73235136と連鎖不平衡にある塩基として、具体的には、例えば、rs7641410、rs4682482、rs10511323、rs4682481、rs78090522、rs73235142、rs73235143、rs4682478、rs4682131、およびrs12638030が挙げられ、このSNPの遺伝子型を解析してもよい。

上記SNPの塩基の種類を調べ、得られた結果を上記のような基準に基づいて側弯症と関
連付けることにより、側弯症を検査することができる。上記SNPは単独で解析されてもよ
いし、上記SNPの少なくとも１つを含む複数のSNPｓをまとめて解析（ハプロタイプ解析）してもよい。例えば、上記SNPの複数をまとめて解析してもよいし、上記SNPの少なくとも１つと、側弯症と関連する既知のSNPや当該既知のSNPと連鎖不平衡にあるＳＮＰｓとを組み合わせて解析してもよい。側弯症と関連する複数のSNPｓをまとめて解析すれば、側弯
症の検査の精度が向上する。なお、いずれのSNPも、二本鎖DNAのどちらの鎖を解析してもよい。例えば、各配列はセンス鎖を解析してもよいし、アンチセンス鎖を解析してもよい。

SNPの解析に用いる試料は、染色体DNAを含む試料であれば特に制限されない。SNPの解
析に用いる試料としては、例えば、血液、尿、髄液等の体液、子宮頸部や口腔粘膜などの細胞、毛髪等の体毛などが挙げられる。SNPの解析にはこれらの試料を直接使用すること
もできるが、これらの試料から染色体DNAを常法により単離し、これを用いて解析するこ
とが好ましい。

SNPの解析は、通常の遺伝子多型解析方法によって行うことができる。例えば、シーク
エンス解析、PCR、ハイブリダイゼーション、インベーダー法などが挙げられるが、これ
らに限定されない。

シークエンス解析は通常の方法により行うことができる。具体的には、多型を示す塩基の５’側数十塩基の位置に設定したプライマーを使用してシークエンス反応を行い、そ
の解析結果から、該当する位置がどの種類の塩基であるかを決定することができる。なお、シークエンス反応の前に、あらかじめSNP部位を含む断片をPCRなどによって増幅しておくことが好ましい。

また、SNPの解析は、PCRによる増幅の有無を調べることによって行うことができる。例えば、多型を示す塩基を含む領域に対応する配列を有し、かつ、３’末端が各多型に対応するプライマーをそれぞれ用意する。それぞれのプライマーを使用してPCRを行い、増幅
産物の有無によってどのタイプの多型であるかを決定することができる。また、LAMP法（特許第3313358号明細書）、NASBA法（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification；特
許2843586号明細書）、ICAN法（特開2002-233379号公報）、SmartAmp法（特許第3897805
号明細書）などによって増幅の有無を調べることもできる。その他、単鎖増幅法を用いて
もよい。

また、SNP部位を含むDNA断片を増幅し、増幅産物の電気泳動における移動度の違いによってどのタイプの多型であるかを決定することもできる。このような方法としては、例えば、PCR-SSCP（single-strand conformation polymorphism）法（Genomics. 1992 Jan 1;12(1): 139-146.）が挙げられる。具体的には、まず、目的のＳＮＰを含むDNAを増幅し、増幅したDNAを一本鎖DNAに解離させる。次いで、解離させた一本鎖DNAを非変性ゲル上で
分離し、分離した一本鎖DNAのゲル上での移動度の違いによってどのタイプの多型である
かを決定することができる。

さらに、多型を示す塩基が制限酵素認識配列に含まれる場合は、制限酵素による切断の有無によって解析することもできる（RFLP法）。この場合、まず、DNA試料を制限酵素に
より切断する。次いで、DNA断片を分離し、検出されたDNA断片の大きさによってどのタイプの多型であるかを決定することができる。

また、ハイブリダイゼーションの有無を調べることによって多型の種類を解析することも可能である。すなわち、各塩基に対応するプローブを用意し、いずれのプローブにハイブリダイズするかを調べることによってSNPがいずれの塩基であるかを調べることもでき
る。

このようにしてSNPがいずれの塩基であるかを決定することで、側弯症を検査するため
のデータを得ることができる。

本発明の方法により判定された結果は、必要に応じて医師等に提供される。結果を提供された医師等は、身体診察、X線検査、CT検査等の必要な検査を行った上で、発症リスク
や進行リスクを診断することができる。医師等がAISの発症リスクや進行リスクが高いと
診断した場合には、装具やギプスの装着や牽引等の治療を施すことができる。また、リスクが低いと診断した場合には、患者に取って負担が大きいこれらの治療を回避することができる。

＜２＞本発明の側弯症検査用試薬
本発明はまた、側弯症を検査するためのプライマーやプローブなどの検査試薬を提供する。このようなプローブとしては、上記SNP部位を含み、ハイブリダイズの有無によってSNP部位の塩基の種類を判定できるプローブが挙げられる。具体的には、配列番号１〜１７のいずれかに示す塩基配列の２６番目の塩基を含む配列、またはその相補配列を有する１５塩基以上の長さのプローブや、当該塩基と連鎖不平衡の関係にある塩基を含む配列、またはその相補配列を有する１５塩基以上の長さのプローブが挙げられる。なお、「当該塩基と連鎖不平衡の関係にある塩基」およびその前後の領域の塩基配列は、例えば、National Center for Biotechnology InformationのdbSNPデータベース（http//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/）から取得できる。プローブの長さは好ましくは、１５〜３５塩基であり、より好ましくは２０〜３５塩基である。
なお、２６番目の塩基が欠失や数塩基の挿入である場合は、欠失や数塩基の挿入を２６番目の塩基とみなす。

また、プライマーとしては、上記SNP部位を増幅するためのPCRに用いることのできるプライマー、または上記SNP部位を配列解析（シークエンシング）するために用いることの
できるプライマーが挙げられる。具体的には、配列番号１〜１７のいずれかに示す塩基配列の２６番目の塩基を含む領域を増幅したりシークエンシングしたりすることのできるプライマーや、当該塩基と連鎖不平衡の関係にある塩基を含む領域を増幅したりシークエンシングしたりすることのできるプライマーが挙げられる。このようなプライマーの長さは
１５〜５０塩基が好ましく、１５〜３５塩基がより好ましく、２０〜３５塩基がさらに好ましい。

上記SNP部位をシークエンシングするためのプライマーとしては、上記塩基の５’側領
域、好ましくは３０〜１００塩基上流の配列を有するプライマーや、上記塩基の３’側領域、好ましくは３０〜１００塩基下流の領域に相補的な配列を有するプライマーが例示される。ＰＣＲによる増幅の有無で多型を判定するために用いるプライマーとしては、上記塩基を含む配列を有し、上記塩基を３’側に含むプライマーや、上記塩基を含む配列の相補配列を有し、上記塩基の相補塩基を３’側に含むプライマーなどが例示される。

なお、本発明の検査用試薬はこれらのプライマーやプローブに加えて、PCR用のポリメ
ラーゼやバッファー、ハイブリダイゼーション用試薬などを含むものであってもよい。

＜３＞側弯症の予防薬または治療薬のスクリーニング方法
本発明においては、後述のとおり、rs1978060のリスクアレルが転写因子結合の減少お
よび転写活性の低下によりTBX1発現の減少を引き起こし、TBX1発現の減少がAISの発病に
影響する可能性があることが示唆された。したがって、TBX1の発現を増加させる活性を指標にして薬剤をスクリーニングすることにより、側弯症の予防薬または治療薬となりうる物質を得ることができる。

TBX1は発生プロセスの調節に関与する転写因子である、Ｔボックス遺伝子ファミリーの一員であり、具体的には、例えば、GenBank Accession No. NM_080647, NM_005992, NM_080646に登録されている遺伝子が挙げられる。

すなわち、本発明のスクリーニング方法としては、TBX1遺伝子またはTBX1遺伝子のプロモーターに連結されたレポーター遺伝子を発現する細胞に医薬候補物質を添加する工程、TBX1遺伝子またはレポーター遺伝子の発現量を測定する工程、および前記発現量を変化させる物質を選択する工程を含む、側弯症の予防薬または治療薬のスクリーニング方法が挙げられる。

例えば、医薬候補物質の存在下において、TBX1遺伝子またはレポーター遺伝子の発現量が医薬候補物質非存在下と比べて増加する場合に、当該医薬候補物質を側弯症の予防薬または治療薬の候補物質として選択することができる。

TBX1遺伝子を発現する細胞としては、マウスやヒトなどの哺乳動物細胞が挙げられ、例えば、卵巣、子宮、骨格筋、肝臓、皮膚、脳等の細胞を用いることができる。

TBX1遺伝子のプロモーターに連結されたレポーター遺伝子を用いる場合、TBX1遺伝子のプロモーターとしては、転写開始点の上流約２ｋｂｐを含む領域が好ましく、上流約５ｋｂｐを含む領域がより好ましい。プロモーターの配列情報はそれぞれGenBank Accession No. NC_000022.10の配列においてTBX1遺伝子の上流領域を探索することにより入手できる。

レポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ遺伝子、GFP遺伝子、クロラムフェニコー
ルアセチルトランスフェラーゼ遺伝子などが例示できる。これらのレポーター遺伝子をTBX1遺伝子のプロモーターに連結し、これを哺乳類細胞に遺伝子を導入するために用いられるプラスミドに組み込み、リポフェクションなどの通常の方法にて細胞にトランスフェクションする。

上記のようなTBX1遺伝子を発現する細胞、またはレポーター遺伝子が導入された細胞に
医薬候補物質を添加し、TBX1遺伝子またはレポーター遺伝子の発現量を測定する。

医薬候補物質としては特に制限はなく、例えば、低分子合成化合物であってもよいし、天然物に含まれる化合物であってもよい。また、ペプチドや核酸であってもよい。スクリーニングには個々の候補物質を用いてもよいが、これらの物質を含む化合物ライブラリーを用いてもよい。候補物質の中から、TBX1遺伝子またはレポーター遺伝子の発現量を（非添加時と比べて）変化（TBX1の場合は増加）させるものを選択することにより、側弯症の予防薬または治療薬となりうる物質を得ることができる。

TBX1遺伝子の発現量はRT-PCR、定量PCR、ノーザンブロット、ELISA、Western blotting、In situ hybridization、免疫組織染色などの方法により測定することができる。レポ
ーター遺伝子の発現量はレポーター遺伝子の種類にもよるが、蛍光強度や発光強度、放射能強度などによって測定することができる。

＜４＞TBX1遺伝子の発現量に基づく検査方法
本発明はまた、TBX1遺伝子のmRNAまたはタンパク質の発現量を測定する工程を含む、側弯症の検査方法（検査データを得る方法）を提供する。TBX1のmRNAまたはタンパク質の発現量が健常人などの対照と比べて減少している場合、側弯症に罹患している、または側弯症の危険性が高いと判定することができる。

TBX1遺伝子の発現量は、RT-PCR、ノーザンブロット、マイクロアレイ法などで調べることができる。また、TBX1遺伝子産物の発現量はELISA、ウエスタンブロットなどで調べる
ことができる。抗体は市販の抗体を用いることもできるし、TBX1に対する抗体を用いることもできる。検査に用いる試料としては、血液、尿、髄液等の体液、子宮頸部や口腔粘膜などの細胞、毛髪等の体毛などが挙げられる。

また、本発明においては、TBX1遺伝子の発現量を、側弯症治療薬の存在下と非存在下とで比較し、側弯症治療薬の効果を判定することもできる。例えば、TBX1遺伝子を発現する細胞などに側弯症治療薬を添加し、TBX1遺伝子の発現誘導が側弯症治療薬非添加時と比べて増加していれば、当該治療薬の効果はあると判定でき、また、抑制率が高いほど当該治療薬の効果は高いと判定することができる。

以下、実施例を挙げて本発明を具体的に説明する。ただし、本発明は以下の実施例に態様には限定されない。

＜実験手順＞
被検者
これまでのゲノムワイド連鎖解析（ＧＷＡＳ１およびＧＷＡＳ２：Nat Genet 43,1237-40 (2011)、Nat Genet 45, 676-9 (2013)およびAm J Hum Genet 97, 337-42 (2015)）の
結果と、今回新たに行ったゲノムワイド連鎖解析（ＧＷＡＳ３）の結果を総合して側弯症との関連付けを行った。
今回のＧＷＡＳ３においては、１０°を上回るコブ角の本例被検者は、協力病院から募り、Nat Genet 43,1237-40 (2011)に記載の通り、側弯症専門医による診断を受けた。対
照被検者はバイオバンクジャパン（ＢＢＪ）プロジェクトから無作為に選択した。ＧＷＡＳ３品質管理のため、コールレート＜０.９８のサンプルを除去した。ＰＩ＿ＨＡＴ＞０
．２５の血縁個体は除いた。ＰＩ＿ＨＡＴは、ＰＬＩＮＫ（Am J Hum Genet 81, 559-575
(2007)）で解析した血統によるＩＤ（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）に基づいて２個体間の関係性
を示す指数である。集団の構造化（階層化）を明らかにするため、ＦａｓｔＰＣＡを用いて遺伝子型について主成分分析（ＰＣＡ）を実施した（Am J Hum Genet 98, 456-72 (201
6)）。東アジア人クラスターからアウトライアーを除外した。３つのＧＷＡＳにおいては個体のオーバーラップはなかった。全参加者および被検者が未成年であればその両親からインフォームドコンセントを得た。本研究は、全ての協力機関およびＲＩＫＥＮの倫理委員会から承認を得た。

遺伝子型決定およびインピュテーション
ＩｌｌｕｍｉｎａＨｕｍａｎＯｍｎｉＥｘｐｒｅｓｓ遺伝子型決定ビーズチップまたはＩｌｌｕｍｉｎａＨｕｍａｎＯｍｎｉＥｘｐｒｅｓｓとＨｕｍａｎＥｘｏｍｅビーズチップとの組み合わせを用いて、ＧＷＡＳ３被検者の遺伝子型を決定した。バリアントの品質管理のため、標準的なＱＣ手段を用い、ｉ）ＳＮＰのコールレート＜０.９９、
ｉｉ）マイナーアレル頻度＜０.０５、およびｉｉｉ）ハーディー・ワインベルグ平衡Ｐ
値≦１.０×１０^-5のものを除外した。さらに、ＧＷＡＳデータセットと参照パネルにお
けるアジア人データとのアレル頻度の違いが＞０.０６であるバリアントを除外した。Ｅ
ＡＧＬＥを用いて遺伝子型をプレフェージングし、１０００人ゲノムプロジェクト第３フェーズリファレンスパネル（２０１３年５月リリース）、１０３７人の日本人のインハウスリファレンスパネル、ｍｉｎｉｍａｃ３を用いて、遺伝子量（ｄｏｓａｇｅｓ）をインピュテーションした。Ｘ染色体については、プレフェージングを男性、女性共に行い、インピュテーションは男女別々に行った。後の関連解析のためにインピュテーション品質スコアＲｓｑ≧０.３およびマイナーアレル頻度≧０.００５のバリアントを用いた。３つのＧＷＡＳの品質管理およびインピュテーション分析は別々に行った。

ＧＷＡＳおよびメタ解析
ＧＷＡＳ１−３の常染色体の関連解析は、ｍａｃｈ２ｄａｔ（１.０.２４）を用いて独立して実施し、上位10の主成分について調整をかけ、相加モデルを推定した。この3つの
ＧＷＡＳに、固定効果モデル下、ＰＬＩＮＫを用いた逆分散法でメタ解析を実施した。Ｘ染色体については、関連解析はそれぞれのＧＷＡＳについて男女別々に実施し、関連解析結果についてメタ解析を実施した。強い異質性（コクランのQ検定＜０.０００１）を示すバリアントをフィルタリングした。領域関連プロット（Ｒｅｇｉｏｎａｌａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｐｌｏｔｓ）をＬｏｃｕｓｚｏｏｍ（ＵＲＬ参照）により作成した。隣接するゲノムワイドに有意な（Ｐ＜５.０×１０^-8）バリアントは、互いに１Ｍｂ以内離れて
位置する場合、一つの遺伝子座内にグループ分けした。複数の独立信号を２０の有意な遺伝子座（リードバリアント±１Ｍｂ）内に認識するため、条件付きステップワイズメタ解析を実施した。まず、ＧＷＡＳ１−３についてそれぞれ条件付き解析を実施し、続いて固定効果モデルを逆分散法で用いてその結果を組み合わせた。各遺伝子座における複数のテストのおおよその平均値に基づいて、指標となるバリアントが有意水準閾値の５.０×１
０^-6を下回るまでこのプロセスを繰り返した。性別分けＧＷＡＳのため、ＧＷＡＳで解析したサンプルを性別で分け、各性の層における関連を再計算した。

機能アノテーションおよびｅＱＴＬ解析
関連バリアントの特徴づけのため、ＨａｐｌｏＲｅｇｖ４.１、３ＤＳＮＰおよびＲ
ｅｇｕｌｏｍｅＤＢを利用して１４の新規ＡＩＳリードバリアントとＬＤ（１ＫＧＰ３のＥＡＳにおいてr²≧０.８）にあるバリアントの機能アノテーションを得た。ＬＤはウェ
ブベースのアプリケーションであるＬＤｌｉｎｋ（Bioinformatics 31, 3555-7 (2015)）を用いて算出した。ＣｈｒｏｍＨＭＭコア１５−ステートモデルとしてのエピジェネティックアノテーションソースを設定するＨａｐｌｏＲｅｇｖ４.１を用いて関連バリアン
ト、プロモーターおよびエンハンサーマーク間のオーバーラップを探索した。さらに、ＧＴＥｘ（リリースｖ７）における関連バリアントとリードｃｉｓ−ｅＱＴＬバリアント間のオーバーラップをも探索した。

遺伝的相関解析
６７の形質（６１の量的形質および６つの疾患）をまたがる遺伝的相関を推定するため、東アジア人のＬＤスコアおよび現行のＧＷＡＳメタ解析の要約統計量を用いて二変量ＬＤスコア回帰（Nat Genet 47, 291-5 (2015)）を行った。ＭＨＣ領域（染色体６：２５−３４Ｍｂ）中に見出されたＳＮＰはＬＤ構造が複雑であるため、分析から除外した。ＢＨ法（Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ−Ｈｏｃｈｂｅｒｇｍｅｔｈｏｄ）にて計算し複数回の試験を補正して算出した、ＦＤＲ＜０.０５のものを有意な遺伝的相関と定めた。

ルシフェラーゼアッセイ
ＴＢＸ１プロモーター（−９１２〜＋６３）とｒｓ１９７８０６０のリスクアレルまたはノンリスクアレルのどちらかを含むオリゴヌクレオチドを、プロモーターを含まないｐＧＬ４．１０［ｌｕｃ２］ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）にクローニングして、ルシフェラーゼレポーターベクターを構築した。またＦＯＸＡ２のｃＤＮＡをp３ｘＦＬＡＧ−ＣＭ
Ｖ−１４ベクター（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）内へクローニングし、哺乳動物細胞系内でタンパク質発現させた。全構築物のインサートを配列決定した。ｐｈＲＬ−ＳＶ４０ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）を内部コントロールとして用いて導入効率のばらつきを標準化した。ＭＣＦ−７細胞（ＨＴＢ−２２、ＡＴＣＣ）は、３７℃、５％ＣＯ₂下で１０％
ウシ胎仔血清、０.０１ｍｇ/ｍｌのヒト組換え体インスリン、５０単位/ｍｌのペニシリ
ンおよび５０μｇ/ｍｌのストレプトマイシンを添加したダルベッコ改変イーグル培地で
培養した。ＭＣＦ−７細胞は、２４穴プレートで密度５×１０⁴細胞/ウェルで２４時間培養し、製造業者の指示に従ってＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１（ＭｉｒｕｓＢｉｏ）を用いてトランスフェクトした。ルシフェラーゼ活性は、ピッカジーンデュアルシーパンジー発光キット（東洋インキ）を用いて測定した。

電気泳動移動度シフト解析
２５ｂｐの相補オリゴヌクレオチドをアニーリングし、ジゴキシゲニン（ＤＩＧ）−１１−ｄｄＵＴＰ（Ｒｏｃｈｅ）で標識することによってｒｓ１９７８０６０のリスク（Ｇ）およびノンリスク（Ａ）アレル用プローブを調製した。ＭＣＦ−７細胞からの核抽出物を調製した。製造業者の指示に従ってＤＩＧゲルシフトキット（Ｒｏｃｈｅ）を用いＤＮＡ-タンパク質結合反応を行った。競合アッセイのため、核抽出物は、ＤＩＧ−標識プロ
ーブの添加前に、過剰量の未標識プローブとプレインキュベートした。スーパーシフトアッセイのため、ＦＯＸＡ２抗体（ｓｃ−３７４３７６x）（Santa Cruz Biotechnology）
を反応混合物に添加し、室温で２０分間インキュベートした。ＤＮＡ−タンパク質複合体を６％ＤＮＡ遅延ゲル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上で分解し、化学発光検出システムを製造業者の指示（Ｒｏｃｈｅ）に従って用いて、その信号を検出した。

＜結果＞
ＡＩＳ感受性遺伝子座を同定するため、先のＧＷＡＳ（ＧＷＡＳ１およびＧＷＡＳ２）に加えて、新大規模ＧＷＡＳ（ＧＷＡＳ３）を実施した。３つのＧＷＡＳのそれぞれについてインピュテーション分析を別個に実施した。全部で５３２７例および７３８８４の対照例を用いて、メタ解析を実施した。その結果、１４の新規遺伝子座（表１および図１）を含む２０の有意なＡＩＳ遺伝子座を同定した。

［ＡＩＳ感受性遺伝子座の機能的アノテーション］
原因となるバリアント候補を各新規遺伝子座にて同定するため,いくつかのＳＮＰアノ
テーションツール（ＨａｐｌｏＲｅｇ、３ＤＳＮＰ、ＲｅｇｕｌｏｍｅＤＢなど）を用い
、これらバリアントの生物学的役割を調べた。各遺伝子座について、最も関連したバリアント（リードバリアント）と高ＬＤ（１ＫＧＰ３の西アジア人（ＥＡＳ）においてr²>０.８）にあるバリアントを全て探索し、調節機能を有するバリアント候補をいくつか見出した。さらにこの遺伝子座において感受性遺伝子を同定するために、発現量的形質遺伝子座（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｔｒａｉｔｌｏｃｉ（ｅＱＴＬ））を遺伝子型−組織発現（Ｇｅｎｏｔｙｐｅ−ＴｉｓｓｕｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ＧＴＥｘ））プロジェクト（Science 348, 648-60 (2015)）からのデータを用いて探索した。
１４の新規遺伝子座のうち７つ（rs11205303, rs12029076, rs482012, rs11341092, rs2467146, rs12149832, rs1978060）で有意なｃｉｓ−ｅＱＴＬｓを観察し、２１の遺伝子の発現量が、リードバリアントと高ＬＤ（ＥＡＳにおいてｒ²＞０.８）にある数個のバリアントと関連していた（表２）。これらｃｉｓ−ｅＱＴＬ−関連遺伝子は、ＡＩＳ感受性遺伝子の有力候補である。

[代表的なリスク遺伝子座の機能解析]
これらｃｉｓ−ｅＱＴＬのうち、ｒｓ１９７８０６０（ＴＢＸ１のリードｃｉｓ−ｅＱＴＬバリアントに対応する染色体２２q１１.２１のリードバリアント）に着目した。これは、骨格筋芽細胞を含む様々な組織内のＤＮａｓｅＩ過感受性部位および活性転写開始部位とオーバーラップした。ＴＢＸ１は、発生プロセスの調節に関与する転写因子である
、Ｔボックス遺伝子ファミリーの一員である。ｒｓ１９７８０６０と高ＬＤにあるバリアントは２つ存在した。

機能アノテーションに基づき、ｒｓ１９７８０６０を最も可能性の高い原因バリアントとし、ｉｎｖｉｔｒｏ解析を行った。ＴＢＸ１プロモーター領域をクローニングし、ｒｓ１９７８０６０のリスクアレルかノンリスクアレルのどちらかを含むオリゴヌクレオチドを挿入して、ルシフェラーゼレポーターベクターを構築した。ＴＢＸ１プロモーター活性に及ぼすｒｓ１９７８０６０の影響を評価し、リスクアレルＧが、非リスクアレルＡと比べて、活性を著しく低下させることを明らかにした（図２a）。

次いで電気泳動移動度シフトアッセイを行い、ｒｓ１９７８０６０のＤＮＡ−タンパク質結合について調べた。その結果、ｒｓ１９７８０６０のリスクアレルと非リスクアレル間に、ＤＮＡ−タンパク質複合体の異なる結合パターンが観察された（図２b）。

特異な結合効果をｒｓ１９７８０６０にもたらす可能性のある転写因子をアノテーションツールを用いて探索した。その結果、ＦＯＸＡ２がノンリスクアレルにおいてより高い結合スコアを有すると予測され、実際、ＦＯＸＡ２抗体を用いた電気泳動移動度シフトアッセイにより、この抗体の存在下でスーパーシフトが示された（図２c）。これらの結果
は、ＦＯＸＡ２がｒｓ１９７８０６０に結合し、ＴＢＸ１の転写を調節することを示唆する。

ｃｉｓ−ｅＱＴＬ解析により、ＡＩＳと関連する他のＳＮＰとしてリードＳＮＰｒｓ４８２０１２が同定された（表１および２）。ｒｓ４８２０１２はデルマタン硫酸エピメラーゼをコードする染色体６q２２.１のＤＳＥ遺伝子の発現に影響を与えると考えられた。ＤＳＥにおける機能変異の両アレル性欠失は進行性多重システム脆弱性関連の顕在化（ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅｍｕｌｔｉ−ｓｙｓｔｅｍｆｒａｇｉｌｉｔｙ−ｒｅｌａｔｅｄｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎｓ）を特徴とするエーラス・ダンロス症候群（ＥＤＳ）筋拘縮型２（ＯＭＩＭ#６１５５３９）を引き起こすとの報告がある。この型のＥＤＳ
患者は側弯や脊柱後側弯などの脊椎変形を呈する（J Orthop Res 29, 834-7 (2011)）。

また、ＡＩＳと関連する他のＳＮＰとしてｒｓ１２１４９８３２が同定された（表１および２）。ｒｓ１２１４９８３２を含むＡＩＳ関連バリアントは、染色体１６q１２.２において、ＦＴＯのイントロン領域に存在し、リスクアレルはＦＴＯの発現低下に関連することが示唆された。ＦＴＯがＢＭＩや肥満と関連しかつｒｓ１２１４９８３２のリスクアレルがより低いＢＭＩや肥満リスクの低下に関連することは周知である（Nat Genet 39, 724-6 (2007)、Science 316, 889-94 (2007)）。このような知見は最近報告のあったＢＭＩとＡＩＳ間の負の相関と一致する（Nat Genet 49, 1458-67 (2017)）。

ＡＩＳ患者には女性が圧倒的に多いことから、ＧＷＡＳの女性特異的メタ解析を実施した。その結果、１q２３.３、１q２５.２、および３q１３.２の新規遺伝子座を含む１５の遺伝子座の関連がゲノムワイド有意水準に達した（表３）。

Claims

rs1978060、rs482012、rs12149832、rs142502288、rs11205303、rs17011903、rs12029076、rs141903557、rs658839、rs11341092、rs397948882、rs160335、rs11787412、rs188915802、rs2467146、rs73235136、およびrs545608の一塩基多型ならびにこれらの一塩基多型と連鎖不平衡にある一塩基多型から選択される一種類以上の一塩基多型を分析し、該分析結果に基づいて側弯症を検査することを特徴とする、側弯症の検査方法。
前記側弯症が思春期特発性側弯症である、請求項１に記載の方法。
少なくともrs1978060の一塩基多型またはrs1978060と連鎖不平衡にある一塩基多型を分析する、請求項１または２に記載の方法。
前記rs1978060と連鎖不平衡にある一塩基多型がrs2238777またはrs737869の一塩基多型である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
配列番号１〜１７のいずれかに示す塩基配列において、塩基番号２６番目の塩基を含む１５塩基以上の配列またはその相補配列を有する側弯症検査用プローブ。
配列番号１〜１７のいずれかに示す塩基配列において、塩基番号２６番目の塩基を含む領域を増幅することのできる側弯症検査用プライマー。
TBX1遺伝子またはTBX1遺伝子のプロモーターに連結されたレポーター遺伝子を発現する細胞に医薬候補物質を添加する工程、TBX1遺伝子またはレポーター遺伝子の発現量を測定する工程、および前記発現量を増加させる物質を選択する工程を含む、側弯症の予防薬または治療薬をスクリーニングする方法。
TBX1遺伝子のmRNAまたはタンパク質の発現量を測定する工程を含む、側弯症の検査方法。