KR20130043107A

KR20130043107A - 루이 소체 치매 진단용 유전자 마커

Info

Publication number: KR20130043107A
Application number: KR1020127029377A
Authority: KR
Inventors: 카트린 비어; 사바트 몬트세라트 도밍고; 페르난데즈 아우렐리오 아리자
Original assignee: 유니버시타트 아우토노마 데 바르셀로나; 푼다시오 인스티튜트 드인베스티가시오 엥 시엔시스 드 라 살루트 저만스 트리아스 아이 푸졸
Priority date: 2010-02-24
Filing date: 2011-02-24
Publication date: 2013-04-29
Also published as: CN102869786A; US20130101997A1; WO2011104023A1; EP2539461A1; CN102869786B; SG183437A1; EP2360280A1; NZ602551A; CL2012002347A1; KR20130049771A; RU2012140458A; JP2013520185A; ZA201206975B; MX2012009506A; CA2789054A1; BR112012021260A2; IL221313A0; EP2539461B1; AU2011220065A1

Abstract

루이 소체 치매 진단을 위한 유전자 마커
루이 소체 치매(DLB) 환자인지 여부를 결정하게 하고, 또 알츠하이머 질병으로부터 구별할 수 있게 하는 BChE 유전자에서 특이적 변경이 밝혀졌다. 본 발명은 검체로부터 얻은 생물학적 샘플에서 부티릴콜린에스테라제(BChE) 유전자에서 하기 변경의 유전자형을 결정하는 단계를 포함하는, DLB를 진단하기 위한 시험관내 방법을 제공한다:
NCBI 등록번호 NG_009031 중의 위치 68974에서 다형성 부위(즉 서열번호 28에서 위치 934); 및
NCBI 등록번호 NG_009031 중의 위치 4780 내지 4786에서 폴리티민 영역(즉, 서열번호 1에서 위치 4780-4786).
위치 4780 내지 4786에서 다형성 부위 3687, 4206, 4443, 및 폴리티민 영역,
상기 위치는 인간 BChE 유전자의 뉴클레오티드에 대응하는 NCBI 등록번호 NG_009031(즉 서열번호 1에서 위치 3687, 4206 및 4443)를 참조한다.

Description

루이 소체 치매 진단용 유전자 마커{Genetic marker for the diagnosis of dementia with Lewy bodies}

본 발명은 의약분야에 관한 것으로, 자세하게는 신경퇴행성 장애에 관한 것이다. 본 발명은 특히 루이 소체(Lewy bodies) 치매 진단용 마커에 관한 것이다.

루이 소체 질병은 루이 소체(LB)라 불리는 단백질성 신경 봉입체의 존재를 특징으로 하는 장애 군을 포함한다. 임상적으로, 2개의 장애가 구별될 수 있다: 파킨슨병(PD) 및 루이 소체 치매(DLB). PD는 노인에서 가장 일반적인 진행성 이동 장애인 반면에, DLB는 알츠하이머병(AD) 다음의 두 번째로 가장 흔한 치매 원인이다. 거의 모든 뇌 영역에서 LB의 광범위한 분포가 DLB의 전형적인 특징인 반면에, PD에서는 흑질(substancia nigra)이 가장 영향을 받는다.

처음 기재되었을 때, DLB는 드문 장애인 것으로 생각되었으나, 지난 수년간 집중적인 연구에 의해 부검된 증례의 10-15%를 차지한다는 것이 밝혀졌다. 주요 DLB 증상은 변동적 인지장애, 재발성 시각적 환영 및 파킨슨증(Parkinsonism)을 포함하지만, 그럼에도 불구하고, AD와 중복되는 다수 증상으로 인해 DLB의 빈번한 오진이 초래된다. AD 및 DLB 환자들은 약물치료에 대한 반응 및 예후 면에서 상이할 수 있기 때문에, DLB 진단 정확성을 개선하는 것이 중요하다.

DLB와 AD 사이의 임상적 구별을 더 잘하기 위하여, 다양한 종적 연구와 비교연구가 지난 수년간 실시되어 왔다. 루이 소체(LB) 병리만을 갖는 환자들은 비교적 덜 심각한 손상을 나타내지만, AD 병리만을 갖는 환자 또는 혼합된 AD/LB 병리를 갖는 환자들에 비하여 실행기능 및 주의력의 더욱 현저한 악화를 나타낸다. 또한, DLB 환자들은 AD 환자에 비하여 인지 기억의 완만한 감소를 나타내지만, 더 많은 정신질환 증상을 가지며, 이러한 유형의 징후는 질병의 후기 단계에서 관찰된다. 마침내, 치매 초기 단계에서 시각적 환영의 존재는 DLB에 있어서 가장 특이적인 것으로 밝혀졌다. 고 특이성(상이한 연구에서 90 내지 99% 범위)의 임상 진단이 달성될 수 있지만, 그의 민감성은 비교적 낮게 유지(18-33%)된다는 것은 언급할 가치가 있다. 따라서, 예상가능한(probable) 및 가능한(possible) DLB의 임상 진단을 위해 1996년 확립된 최초의 일치된 가이드라인은 DLB 진단에 대한 민감성을 개선하기 위해 개정되어 왔지만, 그럼에도 불구하고, AD와 중복되는 다수의 증상으로 인하여 상기 증례의 40-80%의 DLB의 빈번한 오진을 초래한다.

DLB에 대한 낮은 진단 민감성의 주요 원인은 LB 관련된 병리 이외에 AD 특징적 변화를 나타내는 증례의 비율 증가에 기인한다. 이러한 유형의 조합된 병리를 평가하기 위하여, 제3 DLB 컨소시엄은 AD-관련 병리를 LB 병리 내용에 채워넣는 모델을 제시하였다. AD-유형 병리의 단계가 높을수록 DLB의 정확한 진단을 달성할 민감성이 더 낮다. 따라서, 최근의 보고에 의하면 DLB의 오진은 AD 관련 병리 증가에 따라서 증가하지만, 그래도 대략 52%의 환자만이, 낮은 AD-병리 단계에서, DLB의 정확한 진단을 받는다는 것이 확인되었다.

DLB의 치료는 증상적이며 또 제한된 수의 임상 시험과 AD에서 시험 결과의 연장을 기초로 한다. 현재로는 AD 치료는 뇌에서 그 양을을 증가시키는 것에 의해 또는 신경세포가 그에 반응하는 방식을 강화시키는 것에 의해 아세틸콜린의 효능을 개선하기 위하여 콜린에스테라제 억제제의 사용으로 이루어진다. 또한, 상기 질병 과정동안 보통 존재하는 정신병 증상을 감소시키기 위하여 신경이완제(neuroleptic) 약물이 사용된다. 반대로, DLB를 치료하기 위하여 신경이완제의 사용은 약 50%의 DLB 환자에서 악영향을 초래할 수 있고 또 치사를 초래할 수 있다.

따라서, AD와 DLB를 구별하여 진단하는 능력은 치료받을 개별 환자에 대해서뿐만 아니라 공중 건강 시스템의 경제적 부담에 대해서도 주요한 이점일 것이다. 그러나, 현재로서는, AD와 DLB를 엄밀히 구별하는 것은 뇌 조직의 사후 분석에 의해서만 가능하다.

최근, DLB의 진단은 증상 및 특징(traits)의 임상적 평가를 기본으로 하여 DLB 국제 워크샵에서 컨소시엄에 의해 확립된 가이드라인을 따르고 있지만(참조: I.G. McKeith, "Consensus guidelines for the clinical and pathologic diagnosis of dementia with Lewy bodies(DLB): report of the Consortium on DLB International Workshop", J. Alzheimer's Dis. 2006, vol. 9, pp. 417-23), 상기 설명한 바와 같이, 이것은 DLB의 오진을 초래하고 있다. 양전자 단층촬영(PET: positron tomography) 및 단일 광자 방출 컴퓨터 단층촬영(SPECT)과 같은 영상 방법을 이용할 수 있지만, 이들의 민감성은 아주 높지 않고 또 이들은 보통의 임상적 사용하기에는 아주 고가이다. 조기의 확실한 진단은 질병의 진행을 감소시키거나 중지시키는 치료적 여유를 제공할 것이다.

DLB 환자를 정확하게 확인하기 위한 유전자 마커를 찾으려는 시도가 실시되어 왔다. 유전자 시험은 매우 유용한 도구일 것이고 또 DLB의 생전 진단에서 매일 임상 시험에서 실시하기 용이할 것이다. 이러한 의미에서, DLB와의 연관성을 찾기 위하여 연구된 일부 단백질 및 유전자는 알파-7 니코틴 아세틸콜린 수용체 서브유닛, 오스테오폰틴, 산화질소 합성효소, 유비퀴틴 카복시-말단 가수분해효소 L1 유전자, BDNF 유전자, 또는 베타-시누클레인 유전자이다. 이들의 다수는 실험 수준에서 뇌 샘플에서 연구되었고 또 이들은 환자 뇌 생검을 얻기 어렵기 때문에 실제 임상 진단에서는 유용하지 않다.

부티릴콜린에스테라제(BChE)는 간에서 합성된 당단백질 효소이다. 인간의 뇌에서 이것은 주로 신경교세포, 특히 피질 및 피질하(subcortical) 구조에서 발견되지만, 인지 작용에서 관여되는 뉴런에서도 물론 또한 발견된다. AD 환자에서 BChE는 아밀로이드 플라크(amyloid plaque)에서뿐만 아니라 신경원섬유 엉킴에서도 발견된다. 이 효소는 유기인 및 카바메이트 화합물의 해독효소로서 작용하고 또 숙시닐콜린, 아스피린 및 코카인을 가수분해한다. 인간의 뇌에서 BChE 작용은 잘 알려져 있지 않지만, 아세틸콜린에스테라제(AChE)가 감소되거나 또는 부재할 때 아세틸콜린(ACh)을 가수분해하는 것으로 알려져 있다. 이것은 무호흡(apnea) 민감성을 결정하는 마커이다. 지금까지 염색체 3(3q26.1-q26.2)에 위치하는 BChE 유전자에서는 65개 변종이 확인되었다(참조: F. Parmo-Folloni et al., "Two new mutations of the human BCHE gene(IVS3-14T>C and L574fsX576)" Chemico - Biological Interactions 2008, vol. 175, pp. 135-7).

BChE 유전자의 엑손 4에서 돌연변이 A539T의 존재는 베르너 카로우(Werner Kalow)를 기념하여 K 변종이라 칭한다. K-변종은 DNA 서열(NCBI 등록번호 NG_009031)의 위치 68974에 상응하는 mRNA에서 뉴클레오티드 1615에 있는 구아닌이 아데닌으로 DNA 전이되는 것과 관련되며, 알라민 539로부터 트레오닌으로 아미노산 변화를 초래한다. K-변종은 한편으로는 그의 사합체화에 관여하고 또 다른 한편으로는 베타-아밀로이드 피브릴 형성의 감쇠에 관여하는 단백질의 C-말단에 위치한다. 혈청에서 상기 BChE K 변종은 혈청 BChE 활성 수준의 1/3 감소에 관여한다. 뇌에서 주요 BChE 작용은 알려져 있지 않지만, 상기 K-변종은 베타-아밀로이드 피브릴 형성의 감쇠 속도를 약화시켜서 AD 진행을 가속시키는 것으로 보인다. 반면에, 타우(tau) 단백질은 AD에 대한 보호 메카니즘을 나타내는 적어도 하나의 K-대립유전자를 갖는 AD 환자에서 덜 인산화된다.

많은 연구들이 BChE 유전자, 특히 BChE K 변종과 AD 사이의 가능한 연관성에 대해 조사하여 왔다. AD에 대한 공지된 주요 유전자 위험 인자인 아포지단백질 E 유전자(ApoE4)의 입실론 4 대립유전자 및 BChE 유전자 변종의 동시 발생은 AD 병리에 영향을 주는 것으로 논의되어 왔다. 일부 보고는 BChE 야생형과 ApoE4 유전자형의 조합을 갖는 검체에서 AD에 대한 위험 증가를 나타낸다. 다른 보고는 BChE K와 ApoE4의 조합이 AD에 대한 위험을 증가시켰음을 밝혀내었다. AD에서 인지 감소의 진행은 BChE 유전자형에 의해 영향을 받는 것으로 밝혀져 있다. 그러나, 위험 인자도 아니고 AD에 대한 진행 마커도 아니므로 BChE K 변종의 역할에 관한 명확한 결론은 존재하지 않는다.

BChE K 유전자형과 DLB의 가능한 연계가 또한 연구되었다. 싱글레톤 일행(Singleton et al.)(A.B. Singleton et al., "Butyrylcholinesterase K: an association with dementia with Lewy bodies", Lancet 1998, vol. 351, pp. 1818)은 대조군과 비교하여 DLB에서 동형접합 BChE K 보균자의 증가된 빈도를 보고하였다. 최근의 연구는 PDD 환자와 비교하여 DLB 환자에서 증가된 BChE K 및 ApoE4 빈도를 밝혀내었다(R. Lane et al., "BuChE-K and APOE epsilon4 allele frequencies in Lewy bodies dementias, and influence of genotype and hyperhomocysteinemia on cognitive decline", Mov . Disord . 2009, vol. 24, pp. 392-400). PDD 검체에 비하여 DLB의 더 높은 비율이 부가적 AD-유형 병리를 갖고 또 부가적 AD 유형 병리가 더욱 신속한 인지 감소를 초래한다는 가설을 기초로 하여, 상기 저자들은 이 유전자형이 LBD에서 치매 발병과 진행에서 중요할 수 있다고 결론지었다. 그러나, 최근의 연구는 BChE K 변종과 정신이상 DLB 표현형 사이에 현저한 연관성이 존재하지 않는다는 것을 나타낸다(참조: W. Maetzler et al., "No differences of butyrylcholinesterase protein activity and allele frequency in Lewy bodies disease" Neurobiol . Dis . 2009, vol. 35, pp. 296-301).

따라서, 보통의 임상시험에서 사용될 루이 소체 치매에 걸린 환자를 정확히 확인하고 또 알츠하이머 질병으로부터 구별하기 위한 수단을 제공할 필요가 존재한다.

발명의 요약

본 발명자들은 환자가 루이 소체 치매에 걸렸는지 여부를 결정하고 또 알츠하이머 질병으로부터 루이 소체 치매의 구별을 허용하는 BChE 유전자에서 특이적 변경(alterations)을 밝혀내었다.

BChE K 변종과 DLB 사이의 연관성을 찾기 위하여 종래 기술에 문헌이 있으나, 이하에 설명한 바와 같이, 최근의 연구는 유의한 연관성이 없는 것으로 간주한다(참조: W. Maetzler et al., supra). 놀랍게도, 본 발명의 발명자들은 위치 4780 내지 4786의 폴리티민 영역에서 BChE 유전자에서 지금까지 알려지지 않은 변경의 유전자형과 동시발생하는 K 변종의 유전자형에 의해 DLB의 특이적 진단 정보를 얻을 수 있음을 밝혀내었다. 따라서 이들 2개 유전자형의 결정은 DLB를 AD로부터 구별하는데 유용하므로, 이들 2개 유전자형은 DLB에 대한 특이적 유전자 마커를 구성한다.

본 발명자들은 또한 유전자형의 조합이 DLB 환자군을 AD로부터 구별하여 확인하게 해준다는 것을 밝혀내었다. 이러한 조합은 NCBI 등록번호 NG_009031 중의 위치 3687, 4206, 및 4443의 다형성 부위, 위치 4780 내지 4786에서 폴리티민 영역의 유전자형(즉, 서열번호 1에서 각각 위치 3687, 4206, 4443 및 4780-4786), 및 NCBI 등록번호 NG_009031 중의 위치 68974에서 다형성 부위(즉 서열번호 28에서 위치 934)의 유전자형에 의해 형성된다.

BChE 뉴클레오티드 서열에서 변경 위치는 프로모터 및 유전자에 상응하는 NCBI 등록번호 NG_009031의 뉴클레오티드 서열로부터 주어진다. 이 서열은 2010년 1월 31일에 공개되었다.

상기 다형성 부위 3687, 4206, 4443 및 위치 4780 내지 4786에서의 폴리티민 영역은 프로모터 영역에 존재한다. 이들 부위의 경우, NCBI에서 BChE의 완전 서열의 뉴클레오티드 1 내지 뉴클레오티드 5040의 서열에 상응하는 서열번호 1을 참조한다. 때때로 사용된 뉴클레오티드의 가능한 번호는 전사개시를 위치 1로 하고 또 따라서 이 위치 상류의 뉴클레오티드는 네가티브 위치로 한다. 전사 개시 위치 1은 NG_0090031 중의 위치 5001에 상응한다. 이 상세한 설명에서 이용된 번호와 "네가티브" 번호 사이의 대응은 다음과 같다:

A3687G는 A-1314G에 상응하고,

A4206G는 A-795G에 상응하며,

C4443T는 C-558T에 상응하고,

4780 내지 4786의 폴리티민은 -215 내지 -221에 상응한다.

위치 68974에서 다형성 부위는 NG_009031의 암호화 영역에 존재한다. NG_009031의 위치 68041 내지 7020의 영역은 서열번호 28로서 포함된다. 이 영역 단독을 취하여, 뉴클레오티드 번호를 다시 매기며, 따라서, 완전 유전자 서열 중의 위치 68974는 서열번호 28 중의 위치 934로 된다. 이러한 다형성은 K 변종을 초래하는 BChE의 엑손 4 중의 아미노산의 변화와 관련된다. 이러한 다형성에 대하여 문헌에서 사용된 위치는 상이한 서열 번호로 인하여 1615이다(시그널 펩티드없이 성숙 BChE 단백질을 암호화하는 mRNA 서열 참조).

이하의 실시예에 기재한 바와 같이, 독립적으로 평가된 BChE 유전자 중에서 5개 변경 각각과 DLB 사이에는 특이적 관련이 없다는 것이 밝혀졌다; 그러나 놀랍게도, 이들 변경은 조합되어 DLB에 대한 특이적 정보를 제공한다.

따라서, 본 발명의 일 요지는 검체로부터 얻은 생물학적 샘플에서 부티릴콜린에스테라제(BChE) 유전자에서 하기 변경의 유전자형 또는 그의 연관 불평형(linkage disequilibrium)에서 다형성의 유전자형: 위치 68974에서 다형성 부위 및 위치 4780 내지 4786에서 폴리티민 영역을 결정하는 것을 포함하는 DLB를 진단하기 위한 시험관내(in vitro) 방법을 제공한다.

특정 실시양태에서, 상기 방법은 BChE 유전자에서 하기 변경의 유전자형 또는 그의 연관 불평형에서 다형성의 유전자형: 위치 3687, 4206, 및 4443에서 다형성 부위를 결정하는 것을 더 포함한다.

이하의 실시예에 나타낸 바와 같이, AD(n=26), 순수한 DLB(n=12), 보통의 DLB(n=24) 및 대조군(n=23)의 사후 샘플뿐만 아니라 223명의 AD 검체 및 160명의 대조군 검체로부터 얻은 임상적으로 진단된 샘플을 분석하였다. 그 결과, 3개 유형의 유전자 마커가 기재된다. 먼저, 2개의 다형성 부위에서 특이적 변화의 동시발생은 위치 4780 내지 4786에서 7개 티민을 갖는 1개 대립유전자 및 위치 68974에서 1개 대립유전자에 대한 1개 구아닌 및 다른 대립유전자에 대한 1개 아데닌의 존재를 특징으로 한다. 이러한 동시발생은 DLB 대 AD의 분별 진단을 위한 특이적 마커이다. 오진이 있을 수 있는 약 50%의 DLB 환자는 이 마커의 사용에 의해 구제될 수 있다.

본 발명의 다른 실시양태는 유전자형 조합, AAAGCC8+K+인 제2 유전자 마커에 관한 것이다. 이것은 위치 3687(양쪽 대립유전자는 이 위치에서 아데닌을 함유함), 4206(1개 대립유전자는 하나의 아데닌 및 나머지 하나는 구아닌을 함유함), 4443(양쪽 대립유전자는 시토신을 함유함), 4780 내지 4786(2개의 대립유전자의 적어도 하나는 8개 티민으로 구성됨) 및 68974(2개의 대립유전자의 적어도 하나는 아데닌을 함유한다)에서 다형성 부위의 특이적 유전자형에 의해 구성된다. 정신이상 환자에서 이러한 유전자형 조합의 결정은 차등적 진단 마커로 작용하여 DLB의 임상적 진단을 제공하지만, 무증상 개인에서 DLB에 대한 조기 진단 마커로서 작용할 수 있다.

본 발명의 다른 실시양태는 유전자형 조합, AAAAC+77KW인 제3 유전자 마커에 관한 것이다. 이것은 위치 3687(양쪽 대립유전자는 이 위치에서 아데닌을 함유함), 4206(양쪽 대립유전자는 이 위치에서 아데닌을 함유함), 4443(2개의 대립유전자의 적어도 하나는 이 위치에서 시토신을 함유함), 4780 내지 4786(양쪽 대립유전자는 7개 티민에 의해 구성됨) 및 68974(1개 대립유전자가 아데닌을 함유하고 또 나머지 하나는 구아닌을 함유함)에서 다형성 부위의 특이적 유전자형에 의해 구성된다. 정신이상 환자에서 이러한 유전자형 조합의 결정은 분별 진단 마커로 작용하여 DLB의 임상적 진단을 제공하지만, 무증상 개인에서 DLB에 대한 조기 진단 마커로서 작용할 수 있다.

유리하게는, DLB의 상당한 이질성 내에서 또 실시예에 따르면, 본 발명의 방법은 AD로 진단될 수 있었던 DLB 증례의 45-60%를 분별적으로 검출하게 한다. 임상 시험에서는 진단하기 어려운 이러한 환자의 퍼센트는 질병의 초기부터 정확한 진단을 받을 수 있게 할 것이다. 이러한 질병에 대한 특이성은 99%이다. 이것은 DLB에 대한 최초의 특이적 마커를 나타낸다.

지금까지, 종래 기술에서의 입수가능한 도구는 임상 시험에서 DLB의 특이적 확인을 허용하지 않았다. 이와 같이, 검체가 AD로 진단되면, 그는 AD에서 정신병 증상에 대한 가장 적절한 치료인 신경이완제를 사용한 요법에 처리되지만, DLB 환자의 50% 이상이 이러한 유형의 치료에 대해 악영향을 나타내어, 많은 경우에서 사망을 초래한다. 본 발명의 방법은 아주 중요한데 이는 의료 공동체가 부정확한 요법의 우려없이 DLB 환자에 대해 적절한 치료를 적용할 수 있기 때문이다. 따라서, 본 발명의 방법을 적용하여, DLB에 대한 진단 특이성이 증가될 뿐만 아니라 신경이완제에 의한 치료의 악영향에 의해 유발되는 사망이 감소될 것이다.

또한 본 발명의 방법이 DLB 환자를 특이적으로 진단할 수 있게 하므로, 명확한 환자군을 임상 시험에 포함시킬 수 있다.

의료에서 "진단"이라는 것은 외부 표시, 증상 및 근본적인 생리학적/생화학적 원인에 의한 질병 또는 상태를 인지하는 작용 또는 과정을 의미한다.

본 발명의 상세한 설명의 의미에서, "BChE 유전자에서 변경"은 야생형으로 간주되는 뉴클레오티드 서열에서 구조적 변화를 의미한다. 변경의 예는 단일 뉴클레오티드 다형성, 결실, 삽입, 치환 또는 하나 이상의 뉴클레오티드의 중복, 및 뉴클레오티드 상에서 화학적 변형(예컨대 메틸화)을 포함한다.

본 발명의 상세한 설명에서 "유전자형의 결정"은 소정 위치에 있는 뉴클레오티드를 확인하는 것을 의미한다.

본 발명의 상세한 설명에서 "1개 대립유전자에서 소정 뉴클레오티드"는 검체가 그 유전자 중의 뉴클레오티드에 대해 이형접합체임을 의미하고, 또 "양쪽 대립유전자에서"는 상기 뉴클레오티드에 대해 동형접합체임을 의미한다.

본 발명에 따르면, 상기 방법은 BChE 유전자에서 나타난 변경을 결정할 뿐만 아니라 동일 정보를 줄 수 있는 상기 변경과 연관 불평형에서 다형성을 결정하는 것을 포함한다. 집단 유전학에서, 연관 불평형은 2 이상의 위치에서 대립유전자의 비-랜덤 결합이며, 반드시 동일 염색체 상에서 있는 것은 아니다.

본 발명의 진단 방법에 따르면, DLB의 분석은 다음과 같다:

치매 발병이 의심되는 및/또는 명확하지 않은 임상-집안내력 평가를 갖는 환자는 상술한 BChE 유전자의 변경을 결정하는 유전자 시험에 의해 진단될 것이다. DLB 특이적 유전자형을 검출하는 경우, DLB를 정확하게 진단하기 위해서는 어떠한 부가적 시험이나 실험도 필요로 하지 않을 것이다. 유전자형 판별(genotyping)을 직접 적용하는 것은 매일의 임상 시험에서 중요한 금전 절약을 나타낸다.

본 발명의 방법은 이하의 의심되는 진단에서 유용하다: 예상가능한 AD 대 가능한 DLB; 가능한 AD 대 예상가능한 DLB; 가능한 AD 대 가능한 DLB; 예상가능한 AD 대 예상가능한 DLB; 예상가능한 AD 대 가능한 AD; 가능한 DLB; 및 예상가능한 DLB. 내과의는 개인 및 가족 병력을 비롯한 충분한 환자 인터뷰를 기본으로 하고, 실시된 신경학적, 정신의학적 및 실험실 시험의 결과와 조합하여 가능한 AD를 진단한다. 환자가 점진적인 기억 약화의 진행을 불평할 때 및 이들이 기억 손실을 설명해줄 다른 상태를 찾지 못할 때 의사들은 AD를 예상할 것이다. 의사들은 기억 손실에 관여할 수 있는 우울증 또는 갑상선기능저하증, 중풍에 의해 유발된 신경학적 손상과 같은 장애 또는 약물 치료를 찾을 것이다. 원인이 되는 병을 밝혀낼 수 없는 것은 AD가 가능하다는 결정으로 이끈다. 예상가능한 AD는 가능한 알츠하이머를 초과하는 다음 단계이며 또 환자가 그 질병을 갖는 것으로 의사가 "비교적 확신"하는 것을 의미한다.

유리하게는, 본 발명의 방법은 생검과 같이 침습적인 방법에 의해 샘플을 얻을 필요없이 DLB 진단을 허용한다; 또 이 경우 뇌 조직 미세생체검사(microbiopsy). 본 발명의 방법은 유전자 시험이므로 혈액과 같은 검체로부터 제거된 생물학적 샘플 상에서 실시되며, 때문에 몸의 어떤 세포 유형에도 적용할 수 있다.

다른 실시양태에서, 유전자형의 결정은 프라이머-특이적 PCR 멀티플렉스에 이은 검출, 멀티플렉스 대립유전자 특이적 프라이머 연장, 마이크로어레이-계 방법, 및 다이나믹 대립유전자-특이적 혼성화(hybridization)로 이루어진 군으로부터 선택된 수법 중의 하나에 의해 실시된다. 특정 실시양태에서, 프라이머-특이적 PCR 멀티플렉스에 이은 검출에 의해 실시된다.

중합효소 연쇄반응(PCR)은 핵산의 시험관 증폭을 위해 가장 널리 사용되는 방법이다. PCR은 실시간 PCR일 수 있고, 라벨링된 프로브(probe)에 의한 표적 유전자형 존재의 검출은 증폭에 대해 거의 즉각적이다.

표적 다형성의 증폭은 폴리아크릴아미드 전기영동에 의해 또는 유전자 분석기를 이용한 분석에 의한 검출을 갖는 프라이머-특이적 PCR 멀티플렉스(PCR multiplex)에 의해 실시될 수 있다. 다르게는, 다양한 PCR 반응은 아가로오스 겔 전기영동 또는 서열결정화에 의해 실시될 수 있다.

유전자형의 결정은 대립유전자 특이적 프라이머 연장(ASPE)에 의해 실시될 수 있다. 이것은 단일 튜브에서 다수의 SNP를 분석하기 위해 이용될 수 있는 서열 특이적 효소 반응 기술이다. 상기 ASPE 방법은 2개 상, 즉 표적 유전자형을 결정하는 효소 반응 이후, 검출을 위해 고상 미소구체(microsphere) 표면 상에 포획하는 것을 포함한다. 용액상 동역학의 이점을 이용하여, 상기 수법은 서열 라벨링된 미소구체가 새로운 주형(templates)을 검출하는데 사용될 수 있게 한다. 이는 대립유전자 특이적 올리고뉴클레오티드에 부착된 적절한 포획 서열의 도움으로 실시된다.

경우에 따라, 검출은 임의 메카니즘에 의해 기탁된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 제조된 DNA 바이오칩/마이크로어레이에 의해, 포토리소그래피(photolithography) 또는 다른 메카니즘에 의해 그 자리에서 합성된 올리고뉴클레오티드를 사용하여 제조된 DNA 바이오칩에 의해 실시될 수 있다. 표적 증폭 또는 복잡성 감소의 필요 없이 전체 인간 게놈 DNA에서 멀티플렉스 SNP 유전자형 판별을 허용하는 마이크로어레이-계 방법은 BChE 변경의 유전자형 판별을 위해서 또한 사용될 수 있다. 이러한 직접적 SNP 유전자형 판별 방법은 효소를 필요로 하지 않고 또 금 나노입자 프로브의 고감도에 의존한다. 특이성은 대립유전자-특이적 표면-고정화된 포획 프로브 및 유전자-특이적 올리고뉴클레오티드-작용화된 금 나노입자 프로브에 의해 표적에 대한 2개의 순차적 올리고뉴클레오티드 혼성화로부터 유도된다. 이 에세이 포맷은 단순하고, 신속하며 강인하며, 이는 "현장(point of care)"에서 멀티플렉스 SNP 프로파일링에 대한 적합성을 나타낸다.

또한, 유전자형의 결정은 다이나믹 대립유전자-특이적 혼성화(DASH)에 의해 실시될 수 있으며, 이는 일부 실험실에서 처리 SNP 유전자형 판별을 위한 기초를 제공한다. DASH의 핵심적 반응 원리는 DNA 변성 과정에서 대립유전자-특이적 차이의 실시간(다이나믹) 추적하는 것이다. 이를 달성하기 위하여, 올리고뉴클레오티드 프로브는, 필수적으로 모든 유전자형 판별 방법의 필요 성분인, 표적 DNA에 대해 먼저 혼성화된다. 상기 표적 DNA는 고체 표면 상으로 고정화된 PCR 생성물의 1개 가닥을 포함하며, 또 표적 대립유전자의 1개에 상보적인 단일 프로브가 사용된다. 이러한 에세이 개념은 매우 정확한 것으로 밝혀졌다(>99.9% 정확도).

제2 요지로서, 본 발명은 BChE 유전자에서 변경의 유전자형을 결정하는 적절한 수단을 포함하는, 상기 정의된 바와 같은 방법을 실시하기 위한 키트를 제공한다.

특정 실시양태에서, 상기 키트는 프라이머-특이적 PCR 멀티플렉스에 의해 증폭을 실시하기 위한 적절한 수단을 포함한다.

본 발명에 의해 제공된 키트는 DLB 환자를 확인하기 위한 통상의 임상 시험에서 사용될 수 있으므로, 상기 환자를 다른 AD 환자로부터 구별한다. 본 발명의 키트를 사용함으로써 임상의들은 더욱 개별화되고 또 위험이 조정된 치료 전략을 DLB 환자에 대해 적용할 수 있을 것이다.

다른 요지로서, 본 발명은 상기 정의한 바와 같은 키트의 DLB 진단을 위한 용도에 관한 것이다.

본 발명은 또한 루이 소체 치매를 진단하기 위한 마커로서, 위치 4780 내지 4786에서 폴리티민 영역, 위치 3687에서 다형성 부위; 위치 4206에서 다형성 부위; 및 위치 4443에서 다형성 부위로 이루어진 군으로부터 선택된 BChE 유전자에서 하나 이상의 변경과 조합된 위치 68974에서 다형성 부위의 용도에 관한 것이다. 특정 실시양태에서, 위치 68974에서 다형성 부위는 위치 4780 내지 4786에서 폴리티민 영역과 조합하여 사용된다. 다른 실시양태에서, 위치 68974에서 다형성 부위는 위치 4780 내지 4786에서 폴리티민 영역, 및 위치 3687, 4206, 및 4443에서 다형성 부위와 조합되어 사용된다.

본 발명은 또한 BChE 유전자에서 상술한 변경의 유전자형을 분석하는 것에 의해, 검체가 신경이완제를 사용한 치료에 대응할지 여부를 결정하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 환자가 DLB 또는 AD인지 결정할 수 있게 하므로, 적절한 치료를 줄 수 있다.

발명의 상세한 설명 및 특허청구범위를 통하여 단어 "포함한다" 및 이 단어의 변형, 예컨대 "포함하는"은 다른 기술적 특징, 첨가제, 성분 또는 단계를 배제하려는 것이 아니다. 본 발명의 부가적 목적, 이점 및 특징은 본 발명의 상세한 설명을 조사한다면 당업자에게 명백하거나 또는 본 발명의 실시에 의해 알 수 있을 것이다. 또한, 본 발명은 본 명세서에 기재된 특정 및 바람직한 실시양태의 모든 가능한 조합을 포괄한다.

이하의 실시예 및 도면은 예시적으로 제공된 것이며 본 발명을 제한하려는 것이 아니다.

도 1은 4개 그룹에 대해 얻은 대응을 도시한다. 원형은 4차원 그래프 내에서 상이한 유전자형 조합의 위치를 나타낸다. 별표는 질병군 및 대조군의 대응하는, 유전자형-조합 의존적 국재화를 도시한다. 이들의 위치는 cDLB와 대조군, AD와 대조군 사이에서 뿐만 아니라 AD와 cDLB 사이의 현저한 차이를 분명히 나타내었다. 대조군은 차원의 네가티브 사등분 내에 위치한 반면에, cLBD는 일차원 포지티브 및 이차원 네가티브 사등분 내에 위치하였고 또 AD는 일차원 및 이차원의 포지티브 사등분 내에 위치하였다. 이들 결과는 상기 3개 군이 BChE 유전학에 대하여 현저한 차이를 제공함을 강하게 나타낸다. 이는 상기 질병-특이적 유전자형 조합이 유용한 질병 마커를 나타낼 수 있음을 의미한다.
도 2는 다음 3개의 유전자형-조합-의존적 DLB 군의 전두 피질에서 상대적 BChE 발현 양을 도시한다: (1) 유전자형 조합 AAAGCC8+K+ 보균자, n=4; (2) 유전자형 77KW 보균자, n=7; (3) 나머지 DLB 환자, n=12.　 결과는, BChE 발현을 1로 간주한 나머지 DLB 환자와 비교하여, deltadeltaCt 방법에 의해 얻은 상대적 발현 변화로서 나타낸다. 에러바(Error bars)는 분산 추정량(variance estimates)을 나타낸다. * 참조군보다 1.5 내지 2배 낮은 현저한 발현 변화, ** 참조군보다 2배 이상 낮음. 2개의 DLB-특이적 BChE 유전자형 조합(AAAGCC8+K+ 또는 AAAAC+77WW) 중의 하나를 갖는 모든 DLB 환자는 나머지 DLB 환자보다 더 낮은 BChE 발현량을 나타낸다. 이러한 감소된 발현은 대조군 뇌에서 BChE 발현량과 유사하며, 이는 AAAGCC8+K+ 또는 AAAAC+77WW를 갖는 DLB 환자는 콜린에스테라제 억제제를 사용한 통상 사용되는 치료에 반응하지 않을 것이라는 사실을 나타낸다. 이러한 발견은 또한 이들 DLB 환자에 대하여 특이적인 특징을 나타내며, DLB의 분자 서브그룹을 정의한다.

실시예

사후 샘플

임상적 및 신경병리학적 진단을 갖는 사후(post-mortem) 전두 피질 샘플은 지역 윤리 위원회의 확립된 규정에 따라서 University of Barcelona Neurological Tissue Bank 및 Bellvitge Institute of Neuropathology Brain Bank(BrainNet Europe)에 의해 실시되었다. 이들은 보통의 루이 소체 질병(cLBD)에 걸린 24개 뇌 (사망 연령: 79.9; 연령 범위: 64세 내지 90세; 여성: 남성 비율 1.5:1), 루이 소체 순수 치매(pDLB)에 걸린 12개 뇌(사망 연령: 74.4; 연령 범위: 60세 내지 80세; 여성:남성 비율 1:2), 26개의 AD 뇌(사망 연령: 78.1; 연령 범위: 61세 내지 95세; 여성:남성 비율 1:1.1) 및 23개의 대조용 뇌(사망 연령: 68.5; 연령 범위: 54세 내지 83세; 여성:남성 비율 1:1.1)에 상응하였다.

신경병리학적 조사에 의해 모든 AD 뇌는 AD 브라아크 및 브라아크(Braak and Braak) 단계 VI를 나타내었다. 브라아크 및 브라아크는 뇌에서 AD를 평가/정량하기 위한 단계이다. 이것은 아밀로이드 플라크 및 신경원섬유 엉킴의 밀도를 평가하기 위해 신경병리학자에 의해 사용된다. AD는 다음 단계를 거친다: 브라아크 및 브라아크, I-VI: 신경원섬유 엉킴; A-C: 아밀로이드 플라크. cLBD 샘플의 2개는 브라아크 및 브라아크 단계 III에 상응하고, 3개는 브라아크 및 브라아크 단계 IV에 상응하며 또 19개의 나머지 샘플은 단계 V 및 VI에 상응한다. pDLB 뇌에서 브라아크 및 브라아크 단계 0 내지 II가 검출되었고 또 대조군 샘플에서 AD 관련 변화는 존재하지 않았다. AD 뇌도 대조군 뇌도 PD-연관 병리를 나타내지 않는 반면에, 모든 pDLB뿐만 아니라 cLBD 샘플은 PD-관련 변화에 이은 브라아크 및 브라아크의 구분에 상응하는 단계 5 및 6을 제공하였다.

임상적으로 진단된 샘플

혈액 샘플은 Department of Neurology of our Hospital Germans Trias i Pujol에서 NINCDS-ADRDA 및 DSM-IV 기준에 따라서 진단된 223명의 AD 환자(연령: 71.1; 연령범위: 49세 내지 86세; 여성: 남성 비율 1:1.6)로부터 얻었다. 또한, 59명의 연령-매칭된 대조군 검체(연령: 68.8; 연령 범위: 46세 내지 91세); 여성:남성 비율 1:1.5)로부터 얻었다.

부가적 실험으로, 160명 연령-매칭된 대조군 검체 샘플(연령: 68.8; 연령 범위: 46세 내지 91세; 여성:남성 비율 1:1.5)을 취하였다.

이 연구는 병원의 윤리 위원회의 승인 받고 서명된 동의서를 얻은 후에 실시되었다.

DNA 추출

냉동 뇌 샘플로부터의 DNA는 제조자의 지시에 따라서 TRI 시약을 사용하여 추출하였다. TRI 시약 용액은 페놀 및 구아니딘 티오시아네이트를 단상 용액으로 조합하여 동일 샘플로부터 RNA, DNA 및 단백질의 연속 추출에 사용된다. 순도 및 농도를 분광광도계로 측정한 후, DNA 샘플은 사용할 때까지 4℃에서 저장하였다. 혈액으로부터 DNA 추출은 유리-필터 막 상에서 DNA-결합을 기본으로 한 표준 과정에 의해 실시되었다.

BChE 프로모터 서열결정

BChE 프로모터 서열은 대략 5000개 bp에 의해 구성되기 때문에, 이들의 서열 분석을 위해 3개의 중복되는 PCR 단편을 증폭시켰다. PCR1(프라이머 BChEprom1UA 및 BChEprom1L; 표 1)은 위치 -1869 내지 위치 -1031 사이의 838개 bp 단편을 얻었다. PCR2(프라이머 BChEprom2UA 및 BChEpromS6; 표 1)에서는 위치 -1152 내지 -315 사이의 837개 bp 단편을 얻었고 또 PCR3(프라이머 BChEprom2UB 및 BChEprom2L; 표 1)에서는 위치 -473 내지 위치 +231 사이의 688 bp 단편을 얻었다. 최종 부피 15 ㎕의 PCR 반응은 1.7 mM MgCl₂, 200 μM의 각 dNTP(Ecogen), 2 pmol의 각 프라이머, 1 단위의 EcoTaq DNA 중합효소(Ecogen) 및 대략 300 ng의 DNA를 함유하였다. PCR1의 경우 58℃의 어닐링 온도 및 PCR 2와 3의 경우 60℃의 어닐링 온도를 갖는 표준 PCR 프로그램은 PCR1의 경우 30주기 또 PCR 2와 3의 경우에는 35 주기로 구성되었다.

표 1: BChE 프로모터 서열결정에 사용된 프라이머
프라이머 명칭	프라이머 서열(5' →3')	서열번호
BChEprom1UA	TGATAGGCTGACCGTATGCT	서열번호 2
BChEprom1L	ACCTCATCAGATGAGAAAGC	서열번호 3
BChEprom2UA	TCTCTTGGAAGCAGTTGACAT	서열번호 4
BChEpromS6	CCATTATAGCTTCAATCTGTGC	서열번호 5
BChEprom2UB	AGATACATATCAGAGACATCCATT	서열번호 6
BChEprom2L	GAAGAGATCACTCTCATCCC	서열번호 7

PCR 생성물은 ExoSap-IT 키트(GE Healthcare)를 이용하여 정제하였다. 서열결정 반응은 BigDye(BigDyeTM Terminator 대 1.1 Cycle Sequencing Kit, Perkin Elmer), 10 pmol/㎕의 각 프라이머 및 3.5 ㎕의 정제된 PCR 생성물을 사용하여 실시하였다. 주기 서열결정 및 DNA 석출 후, ABI PRISMTM3100(Perkin Elmer) 상에서 서열을 얻었다.

BChE 프로모터 다형성의 분석

4개의 새로운 다형성이 BChE 유전자의 프로모터 영역에서 발견되었다. 이들의 3개뿐만 아니라 잘 공지된 K-변종 다형성은 돌연변이-특이적-PCR(MS-PCR): A3687G, A4206G, C4443T 및 BChE-K를 사용하여 연구하였다. 최종 부피 15㎕의 각 PCR은 1.7 mM MgCl₂, 200 μM의 각 dNTP(Ecogen), 2 pmol의 각 3개 프라이머(표 2), 1 단위의 EcoTaq DNA 중합효소(Ecogen) 및 300 ng의 DNA를 함유하였다. A3687G, BChE-K의 경우 62℃의 어닐링 온도 또 A4206G, C4443T 증폭의 경우 57℃ 어닐링 온도를 이용한 35 주기의 표준 PCR 프로그램을 실시하였다. 얻어진 PCR 단편은 고해상도 아가로오스 겔 상에서 분리하였다. BChE A3687G 다형성의 A-대립유전자는 153 bp로 표시되고 또 G-대립유전자는 133 bp 단편으로 표시된다. K-대립유전자는 149 bp 단편으로 표시되었고 또 K-변종 다형성로부터의 대립유전자에 상응하는 야생형은 169 bp 밴드로 표시되었다. BChE A4206G 다형성의 A-대립유전자는 124 bp 길이이었고 또 G-대립유전자는 104 bp 길이이었다. 마지막으로, C4443T 다형성의 경우에서, T-대립유전자는 145 bp 단편에 상응하였고 또 C-대립유전자는 125 bp 단편에 상응하였다.

폴리T(polyT) 다형성은 오직 1개 뉴클레오티드가 다른 상이한 단편 크기로 구성되었다. 그의 유전자형 판별은 플루오로크롬 라벨링된 프라이머(표 2)를 사용한 ABI PRISM^TM 3100(Perkin Elmer) 상에서 모세관 전기영동에 의해 달성되었다. PCR은 30-주기 프로그램을 이용하는 표준 조건하에서 실시하였다. 7T-대립유전자는 196 bp를 얻었고 또 8T-대립유전자에 의해서는 197 bp 단편을 얻었다.

표 2: BChE 프로모터 유전자형 판별에 사용된 프라이머
다형성¹	프라이머 명칭	프라이머 서열(5' →3')	서열번호
A3687G	BChE ―314U	TCTTGAACTCCCAGACTGAAGCA	서열번호 8
	BChE ―314G	TACACAAAAGGTACAGAATACAC	서열번호 9
	BChE ―314A	TTATGTAATAACAAGTTAGTTACACAAAAGGTACAGAATACAT	서열번호 10
A4206G	BChE ―95U	AAGTGCTCCACCTGCAAATATTA	서열번호 11
	BChE ―795G	TAATCTTCTGTAAGTGATAGCC	서열번호 12
	BChE ―95A	TTCTCAATGCAATATATTCTTAATCTTCTGTAAGTGATAGCT	서열번호 13
C4443T	BChE ―58L	TGTCTCTGATATGTATCTCCTT	서열번호 14
	BChE ―58CS	TCTTGACCAGAAAATTGTGGC	서열번호 15
	BChE ―58TL	TATTCATTTTATTTTTCCTGTCTTGACCAGAAAATTTGTGGT	서열번호 16
BchE-K	BchE-4U	CTGTACTGTGTAGTTAGAGAAATTGGC	서열번호 17
	BchE-K	ATGGAATCCTGCTTTCCACTCCCATTCCGT	서열번호 18
	BchE-W	ATCATGTAATTGTTCCAGCGTAGGAATCCTGCTTTCCACTCCCATTCTCC	서열번호 19
폴리T	BChEpolyT-U	²[FAM]TCAATAATAGCACTACTTTAGAATGA	서열번호 20
	BChEpolyT-L	AGGTAGTCTTCTAAGAATGAAGA	서열번호 21

다형성¹: 다형성 명칭; ²[FAM]　: 플루오로크롬 팸을 사용한 5' 프라이머 변형

통계적 분석

대응 분석(Correspondence analysis)(CORRESPONDENCE, Version 1.1, Data Theory Scaling System Group(DTSS), Faculty of Social and Behavioral Sciences, Leiden University, The Netherlands)은 신경병리학적으로 진단된 환자군의 경우에서 대응 표를 얻는 것을 허용하였다. 환자군(신경병리학적으로 진단된 환자군 및 임상적으로 진단된 환자군)에 대한 유전자형 조합의 분포는 SSPS 버젼 11.0에 의해 산출하였다.

임상적 진단과 신경병리학적 진단의 매칭

임상적 진단과 신경병리학적 진단 사이의 매칭은 Neurological Tissue Bank로부터 얻은 샘플에서 최초로 분석되었다. AD 환자의 100%는 이들의 임상진단과 신경병리학적 진단에서 일치하였고 또 pDLB 환자의 42%는 DLB 진단을 받은 반면에, cLBD 환자의 17%만이 DLB의 임상 진단을 받았다. 대신에, 이들의 62%는 AD로 진단되었고 또 21%는 다른 치매 관련 장애에 대응하였다. 이러한 관찰은 cLBD에 대한 진단 기준의 결핍과 충분한 상관관계가 있다.

BChE K-변종

BChE K-변종은 위치 68974에서 g에서 a로의 단일 뉴클레오티드 치환으로 구성되며, g-대립유전자는 W(야생형)라 칭하고 또 a-대립유전자는 K(돌연변이)라 칭한다.

이 분석의 중요한 발견은 대조군(cLBD에서 0.62, pDLB에서 0.42 및 AD에서 0.38 대 대조군에서 0.13, 각각 p < 0.001, p=0.090 및 p=0.058)과 비교할 때 cLBD에서 뿐만 아니라 pDLD와 AD에서의 유전자형을 갖는 K-대립유전자의 과잉비율(overrepresentation)이었다. 유전자형 분석에 의해 또한 AD와 대조군에서 유사한 빈도로 나타났던 KW 유전자형은 pDLB에서는 약간 증가하였지만, cLBD 샘플의 약 1/3은 KW-유전자형 보균자이었다(표 3). 연구된 샘플에는 H-변종뿐만 아니라 J-변종도 존재하지 않는 반면에, A-변종 보유 유전자형은 상이한 질병에서 매우 낮은 빈도로 발견되었다(cLBD에서 0.04, pDLB에서 0.08 및 AD에서 0.04 대 대조군 0; p=1, p=0,34 및 p=1).

표 3: BChE K-변종 다형성의 대립유전자 및 유전자형 분포
		유전자형 빈도
질병	n¹	WW	KW	KK	p²
cLBD	24	0.38	0.29	0.33	0.003
pDLB	12	0.58	0.17	0.25	0.145
AD	26	0.62	0.08	0.30	0.047
C	23	0.87	0.09	0.04

¹n: 샘플 번호; ²p: 각 질병군 및 대조군 사이의 유전자형 비교를 위한 추출 시험 p 값

BChE 프로모터 다형성의 특징화

BChE 프로모터 서열결정으로 이전에 개시되지 않았던 4개의 새로운 다형체가 밝혀졌다. 이들의 3개는 단일 뉴클레오티드 변화: 즉 위치 3687에서, A가 G로 변화되었고; 위치 4206에서 A가 G로 변화되었으며; 또 위치 4443에서 C가 T로 변화되었다. 4번째 다형성은 가변 길이의 폴리T 서열에 대응하였고 또 위치 4780과 4786 사이에 위치하였다. 2개의 확인된 대립유전자 중에서, 1개는 7개 T로 구성되었고 또 나머지 하나는 8개 T로 구성되었다. 흥미롭게도, 상기 8T-대립유전자는 공통되는 엑손 4 다형성의 K-대립유전자에 의해 분리되었다.

상기 다형성이 질병-특이적 연관성을 나타내는지 여부를 확인하기 위하여, 모든 4개 프로모터 다형성에 대한 알레르기 및 유전자형 빈도는 cLBD, pDLB, AD 및 대조군을 비롯한 신경병리학적으로 진단된 뇌 샘플에서 결정되었다. 먼저, 다형성을 독립적으로 분석한 다음 유전자형 조합의 존재를 시험하였다.

A3687G 다형성의 연구는 cLBD, pDLB 및 대조군에 비교하여 AD에서 AA 유전자형의 3배 정도의 증가를 나타내었다(AD에서 0.54 대 cLBD에서 0.21, p= 0.152; pDLB에서 0.16, p=0.298 및 대조군에서 0.13, p<0.001). 대조적으로, A4206G 다형성에 상응하는 G-대립유전자를 갖는 유전자형은 대조군과 비교하여 cLBD, pDLB뿐만 아니라 AD에서 축적되었다(cLBD에서 0.33, pDLB에서 0.17 및 AD에서 0.23 대 대조군에서 0.04, p=0.023, p=0.262 및 p=0.105). G-대립유전자를 갖는 유전자형의 축적이 질병 특이적인 것은 아니었지만, 이러한 축적은, G-대립유전자를 갖는 유전자형이 대조군에서는 거의 존재하지 않기 때문에, 특별히 중요한 것으로 보인다. C4443T 다형성에 대응하는 CC-유전자형은 cLBD 뿐만 아니라 대조군과 비교할 때 pDLB에서 매우 낮은 빈도로 존재하였다. 반대로, TC-유전자형의 빈도는 AD와 대조적으로 pDLB 와 cLBD에서 2배 정도 증가하였고 이는 또한 대조군에서보다 현저히 더 높았다.

8T-대립유전자를 갖는 유전자형의 빈도는 대조군과 비교할 때 cLBD, pDLB 및 AD에서 약 2배 증가를 나타내었지만, 이들 차이는 현저하지 않았다(cLBD에서 0.25, pDLB에서 0.17 및 AD에서 0.19 대 대조군에서 0.09; p=0.245, p=0.591 및 p=0.421).

사후 샘플에서 유전자형 조합의 분석

폴리 T-77 K-변종 KW 유전자형 조합

BChE 유전자형의 독립적 분석이 질병 사이의 중요한 차이를 드러내지 않았기 때문에, 2개 다형성에 의해 구성된 모든 유전자형 조합(GenComb)의 분석은 DLB에서 특이적으로 KW/polyT-77 유전자형의 동시발생을 드러내었다. 이러한 유전자형 조합은 AD 환자뿐만 아니라 대조군에서도 존재하지 않는 반면에, 그의 빈도는 cLBD 군에서 0.3(24명의 환자 중 6명의 KW/77 보균자)이었고 또 pDLB 군에서 0.17(12명 환자 중 2명의 KW/77 보균자)이었고, DLB의 경우 0.25의 보통 빈도를 나타내었다(표 4).

표 4: BChE-K 변종 및 폴리T 유전자형 조합의 질병 의존적 분포 및 빈도
질병군	n	WW/77	KW/77	KW/8+	KK/77	KK/8+
cLBD	24	0.45	0.3	0.0	0.15	0.1
pDLB	12	0.58	0.17	0.0	0.08	0.17
AD	26	0.47	0.0	0.1	0.26	0.16
C	23	0.87	0.0	0.09	0.04	0.0

대응 분석

4개의 프로모터 및 K-변종 다형성에 의해 구성된 GenComb의 분포, 빈도 및 특이성의 추가 분석을 연구하였다. 이들 GenComb의 대응 분석은 cLBD, AD 및 대조군 사이뿐만 아니라 cLBD와 AD 사이에서도 BChE-계 유전자 차이를 드러내었다. 이들 차이는 4분된 다이아그램(도 1)으로 분명하게 표시될 수 있었다. 대조군은 일차원 및 이차원의 네가티브(negative) 사분면 내에 위치할 수 있었으나, cLBD는 일차원 네가티브 사분면과 이차원 포지티드(positive) 사분면 내에 위치하였고 또 AD는 양쪽 차원의 포지티브 사분면 내에 위치하여다. 이들 결과는 3개 군이 BChE 유전학과 무관하며, 상응하게 질병-특이적 GenComb의 존재를 강하게 나타내었다.

공통 유전자형 조합

최초의 전체 분석은 31개의 상이한 GenComb의 존재를 드러내었다(표 5). 이들의 대부분(64.5%)은 1개 또는 2개 샘플에만 존재하였기 때문에, 이들의 빈도는 매우 낮았다(0.01 및 0.02). 모든 다형성의 동형접합 야생형 유전자형에 의해 구성된 가장 빈번한 GenComb(N°20)는 전체 샘플의 17.6%를 나타내었고 또 모든 군에서 유사한 빈도로 존재하였다. 가장 빈번한 나머지 2개 GenComb(N°8 및 20)는 모든 4개 군에서 이들의 존재로 인하여 역시 비특이적이었다. AD 및 대조군과 대조적으로, LB 치매의 양쪽 유형은 BChE 유전학에 대하여 가장 이질적인 질병이었다(표 5). 흥미롭게도, AD는 DLB 및 대조군보다 더욱 질병 특이적 GenComb를 특징으로 하였다(표 5).

표 5: 신경병리학적 샘플에 대해 얻은 대응 표
	단상형(haplotype)
	유전자형 조합	C	AD	cLBD	pDLB	활성 차액 (active margin)
1	AAAACC77KK	0	2	0	0	2
2	AAAACC77KW	0	0	1	0	1
3	AAAACC77WW	0	0	0	1	1
4	AAAACC78KW	1	0	0	0	1
5	AAAATC77KK	0	0	0	1	1
6	AAAATC77WW	2	1	0	0	3
7	AAAATT77KK	0	1	0	0	1
8	AAAATT77WW	0	7	0	0	7
9	AAAGCC78KK	0	0	2	0	2
10	AAAGCC78KW	0	0	1	0	1
11	AAAGCC88KK	0	0	1	0	1
12	AAAGTC78KK	0	2	0	0	2
13	AAAGTT78KK	0	1	0	0	1
14	AGAACC77KK	1	0	0	0	1
15	AGAACC77WW	1	0	0	0	1
16	AGAATC77KK	0	2	2	0	4
17	AGAATC77KW	0	0	2	1	3
18	AGAATC77WW	4	0	2	2	8
19	AGAATT77KW	0	0	1	0	1
20	AGAATT77WW	6	3	3	1	13
21	AGAGTC77KK	0	0	1	0	1
22	AGAGTC77KW	0	0	1	0	1
23	AGAGTC78KK	0	0	2	1	3
24	AGAGTC78KW	0	2	0	0	2
25	GGAACC77WW	0	1	0	0	1
26	GGAATC77WW	1	0	1	0	2
27	GGAATT77KW	0	0	1	1	2
28	GGAATT77WW	6	3	3	3	15
29	GGAGCC78KW	1	0	0	0	1
30	GGAGTC78KK	0	0	0	1	1
31	GGAGTT77WW	0	1	0	0	1
	활성 차액	23	26	24	12	85

질병-특이적 유전자형 조합

질병에 의해 분석할 때, 2개의 중요한 질병-특이적 GenComb가 검출될 수 있었다. 한편으로, GenComb AAAATT77WW는 AD 샘플에서만 비교적 높은 빈도 0.29로 존재하였다. 관련된 GenComb AAAATT77KK는 또한 AD 샘플에서도 발견되었고, 이는 질병 특이성을 분명히 보여준다(표 6). polyT-8T 대립유전자가 K-대립유전자와 함께 동시에 분리되는 사실은 GenComb 9-11을 관련된 것으로 확립하고 또 이들을 공통되는 GenComb AAAGCC8+K+로 정의하였다. 이 GenComb는 cLBD에서 발견된 가장 빈번(16.7%)하고 질병-특이적 GenComb이었다(표 6). 3개의 미관련 pDLB 특이적 GenComb(N°3, 5 및 30)는 0.08의 낮은 빈도를 가졌다(이들 각각은 1명 환자에서만 존재함). 대조군에서는 4개의 GenComb가 특이적으로 발견되었다. 이들 중 2개(N°14 및 15)는 관련되었고, 이들의 빈도는 0.1을 넘지 않았다.

표 6: 신경병리학적으로 진단딘 환자에서 BChE-K 변종 및 polyT 유전자형 조합의 질병 의존적 분포 및 빈도
질병군	n	AAAATT77WW/KK	AAAGCC8+K+
cLBD	24	0	0.17
pDLB	12	0	0
AD	26	0.3	0
C	23	0	0

임상 진단에 의해 샘플에서 유전자형 조합의 분석

신경병리학적으로 진단된 사후 AD, DLB 및 대조군 샘플의 연구에 의해 얻어진 데이터를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 또한 230명의 AD 환자군뿐만 아니라 59명의 대조군을 연구하였다. AD 환자들은 1998년과 2002년 사이에 진단되었다. 임상적 DLB 진단을 위한 가장 최근의 가이드라인은 2005년에 확립되었고, 따라서 이들 AD 환자의 10 내지 25%는 오진된 DLB 환자이어야 할 것으로 예상될 수 있다.

PolyT -77 K-변종 KW 유전자형 조합

변종-K 및 polyT 유전자형의 동시발생의 분석은 AD(0.19) 및 대조군(0.15) 모두에서 유사한 KW/polyT-77 유전자형 동시발생 빈도를 나타내었다(표 7).

표 7: BChE-K 변종 및 polyT 유전자형 조합의 질병 의존적 분포 및 빈도
질병군	N	WW/77	KW/77	KW/8+	KK/77	KK/8+
AD	223	0.63	0.19	0.11	0.004	0.004
C	60	0.70	0.15	0.17	0	0

그럼에도 불구하고, KW/77 유전자형을 보유하는 42명의 환자의 임상 병력이 변경되었고 또 42명 환자 모두 DLB 진단과 상응하는 증상을 나타내었다.

KW/77 유전자형 동시발생이 환자군 및 대조군에서 유사하였지만, 이것은 AD 와 DLB를 유전자적으로 구별할 수 있는 특이성 증가를 특징으로 한다. AD 환자군의 20-40%가 오진된 DLB 환자이라는 것을 고려할 때, KW/77 유전자형의 질병-특이적 빈도는 50% 이상까지 증가될 것이다.

제2 DLB -특이적 BChE -유전자형 조합의 확인

BChE 발현 분석의 결과로 인하여, 임상 샘플에서 4개 유전자 조합에 대한 재분석이 실시되었다. 조합된 유전자형 77KW의 보균자는 AD 및 대조군에서 유사한 빈도를 갖는 것이 밝혀졌다. 대신에, GenComb AAAAC+77KW는 AD군 중 11명 환자(0.05 빈도) 및 대조군의 2명(0.012 빈도)으로 존재하였다. DLB와 혼화성인 증상 모두에서 임상적 병력의 변경이 드러났다. GenComb AAAGCC8+K+과 유사하게, AAAAC+77KW-빈도는 우리의 AD군의 20-40%가 실제로 DLB환자인 것을 고려할 때, 12-25% 범위일 수 있다. AAAAC+77KW의 특이성은 98.7%일 것이고 또 그의 민감성은 30%까지였다.

양쪽 GenComb를 조합하면, BChE 유전자형 조합의 시험은 60%까지 DLB 증례의 검출을 허용할 것이며, 민감성은 96.8%의 특이성이었다.

대응 분석

임상 진단에 의해 샘플은 AD군과 대조군의 2개 군만으로 나타났기 때문에, 대응분석의 결과는 상황표(표 8 및 표 10)로 얻어졌다. 5개의 다형성이 분석될 유전자형 조합 내에 포함되는 것을 고려할 때, 289명으로 구성된 샘플에서 25개의 상이한 유전자형 조합(243개의 가능한 유전자형 조합)만을 찾은 것은 매우 놀라왔다(표 8). 모든 검출된 유전자형 조합의 64%는 신경병리학적으로 진단된 샘플에서 또한 관찰되었다.

표 8: 임상 샘플(59명의 대조군)에 대해 얻어진 대응 표
	단산형
	유전자형 조합	AD	C	활성 차액
1	AAAACC77KW	7	1	8
2	AAAACC77WW	2	0	2
3	AAAACC78KK	1	0	1
4	AAAATC77KW	4	0	4
5	AAAATC77WW	5	1	6
6	AAAATT77KK	1	0	1
7	AAAATT77WW	5	2	7
8	AAAGCC77WW	0	1	1
9	AAAGCC78KK	5	0	5
10	AAAGCC78KW	4	0	4
11	AAAGCC88KK	4	0	4
12	AAAGCC88KW	1	0	1
13	AAAGTC78KW	4	5	9
14	AGAACC77KW	2	0	2
15	AGAATC77KW	24	5	29
16	AGAATC77WW	24	4	28
17	AGAATC78KW	2	0	2
18	AGAATT77KW	4	0	4
19	AGAATT77WW	32	13	45
20	AGAGTC77KW	0	1	1
21	AGAGTC78KW	19	4	23
22	AGAGTT77WW	1	0	1
23	AGAGTT78KW	1	0	1
24	GGAATT77KW	2	1	3
25	GGAATT77WW	76	21	97
	활성 차액	230	59	289

표 8의 공통 유전자형 조합

5개의 가장 빈번한 유전자형 조합은 다음과 같았다: 3.34의 빈도를 갖는 조합 25(AD에서 0.34 및 대조군에서 0.35), 0.16의 빈도를 갖는 조합 19(AD에서 0.14 및 대조군에서 0.22), 0.10의 빈도를 갖는 조합 15(AD에서 0.11 및 대조군에서 0.08), 0.10의 빈도를 갖는 조합 16(AD에서 0.11 및 대조군에서 0.07) 및, 마지막으로, 0.08의 빈도를 갖는 조합 21(AD에서 0.08 및 대조군에서 0.07; 표 8). 가장 빈번한 유전자형 조합은 신경병리학적 샘플 및 임상 샘플 모두에서 동일하였다. 또한, 다른 2개의 유전자형 조합도 양쪽 샘플에서 가장 빈번한 것과 일치하였다(표 5 및 표 8)

표 8의 질병-특이적 유전자형 조합

이전에 DLB- 및 AD-특이적으로 검출되었던 GenComb의 분포를 분석함으로써, 양쪽 모두에서 훨씬 더 낮은 표시를 밝혀내었다. 한편으로, GenComb AAAATT77WW는 AD 샘플의 2%로만 존재하였지만, 다른 한편으로, 대조군에서 3.3%로 검출되었다. 관련된 GenComb AAAATT77KK는 1개의 AD 샘플(0.4%)에서만 발견되었다(표 9).

GenComb 9-11은 신경병리학적 샘플의 GenComb와 일치하였고 또 공통되는 GenComb AAAGCC8+K+로 정의되었다. 이러한 GenComb는 AD군에서만 0.06의 빈도(6%)로 존재하였다(표 9).

표 9: 임상적으로 진단된 환자에서 BChE-K 변종 및 polyT 유전자형 조합의 질병 의존적 분포 및 빈도
질병군	n	AAAATT77WW/KK	AAAGCC8+K+
AD	223	0.03	0.06
C	60	0.03	0

AD 환자가 약 8년 전에 임상적으로 진단된 것을 고려하면, DLB 진단에 대한 새로운 가이드라인이 확립되기 훨씬 이전에, GenComb AAAGCC8+K+ 를 보유하는 13명의 환자의 임상 병력이 변경되었다. 13명 환자 모두는 가능한 또는 예상가능한 DLB와 혼화성인 증상을 제공하므로, AAAGCC8+K+를 특이적 DLB 마커로 확증한다.

AD 환자의 20-40%가 오진된 DLB 환자라는 것을 고려할 때, AAAGCC8+K+이 질병-특이적 빈도는 증가할 것이고 15-28% 범위일 것이다.

표 10: 임상 샘플에 대해 얻어진 대응 표(160 대조군)
유전자형 조합	C	AD	활성 차액
1 AAAACC77KW	2	7	9
2 AAAACC77WW	3	2	5
3 AAAACC78KK	0	1	1
4 AAAATC77KW	0	4	4
5 AAAATC77WW	1	5	6
6 AAAATT77KK	0	1	1
7 AAAATT77WW	5	5	10
8 AAAGCC77WW	1	0	1
9 AAAGCC78KK	1	5	6
10 AAAGCC78KW	1	4	5
11 AAAGCC88KK	1	1	2
12 AAAGCC88KW	0	1	1
13 AAAGTC78KW	6	4	10
14 AGAACC77KK	1	0	1
15 AGAACC77KW	2	2	4
16 AGAACC77WW	1	0	1
17 AGAATC77KK	1	0	1
18 AGAATC77KW	23	24	47
19 AGAATC77WW	20	24	44
20 AGAATC78KW	3	0	3
21 AGAATT77KW	1	2	3
22 AGAATT77WW	25	32	57
23 AGAGTC77KW	1	0	1
24 AGAGTC77WW	1	0	1
25 AGAGTC78KW	7	19	26
26 AGAGTT77WW	0	1	1
27 AGAGTT78KW	0	1	1
28 GGAATT77KW	4	2	6
29 GGAATT77WW	49	76	125
활성 차액	160	223	383

표 10의 공통 유전자형 조합

5개의 가장 빈번한 유전자형 조합은 다음과 같았다: 0.33의 빈도를 갖는 조합 29(AD에서 0.34 및 대조군에서 0.31), 0.15의 빈도를 갖는 조합 22(AD에서 0.14 및 대조군에서 0.16), 0.12의 빈도를 갖는 조합 18(AD에서 0.11 및 대조군에서 0.14), 0.11의 빈도를 갖는 조합 19(AD에서 0.11 및 대조군에서 0.12) 및, 마지막으로, 0.07의 빈도를 갖는 조합 25(AD에서 0.08 및 대조군에서 0.05; 표 10). 가장 빈번한 유전자형 조합은 신경병리학적 샘플 및 임상 샘플 모두에서 동일하였다. 또한, 다른 2개의 유전자형 조합은 모든 샘플에서 가장 빈번한 것과 일치하였다(표 5, 8 및 10).

질병-특이적 유전자형 조합

이전에 DLB- 및 AD-특이적으로 검출되었던 GenComb의 분포를 분석함으로써, 본 발명자들은 양쪽 경우 모두에 대해 현저히 낮은 표시를 밝혀내었다. 한편으로 GenComb AAAATT77WW는 AD 샘플에 2%로만 존재하였고, 반면에 대조군에서 3.1%로 검출되었다. 관련된 GenComb AAAATT77KK는 1개의 AD 샘플에서만(0.4%) 발견되었다(표 11).

GenComb 9-12는 신경병리학적 샘플의 GenComb와 일치하였고 또 공통되는 GenComb AAAGCC8+K+로서 정의되었다. 이 GenComb는 AD군에서 0.06의 빈도(6%) 및 대조군에서 0.01의 빈도로 존재하였다(표 11).

표 11: 임상적으로 진단된 환자에서 BChE-K 변종 및 polyT 유전자형 조합의 질병 의존적 분포 및 빈도
질병군	n	AAAATT77WW/KK	AAAGCC8+K+
AD	223	0.02	0.06
C	60	0.03	0.01

AD 환자가 약 8년 전에 임상적으로 진단된 것을 고려하면, DLB 진단에 대한 새로운 가이드라인이 확립되기 훨씬 이전에, GenComb AAAGCC8+K+를 보유하는 13명의 환자의 임상 병력이 변경되었다. 13명 환자 모두는 가능한 또는 예상가능한 DLB와 혼화성인 증상을 제공하므로, AAAGCC8+K+를 특이적 DLB 마커로 확증한다.

유전자형 조합에 대한 의존성에서 DLB 에서 BChE 발현

RNA 단리 및 역전사

TRI-시약(MRC, Cincinnati, USA)은 제조자의 지시에 따라서 RNA 단리에 사용되었다. 간단히 말해, 100 mg 조직 샘플을, 멸균 피스톤을 구비한 1.5 ml 튜브 내의 1.0 ml의 TRI-시약에서 균질화하였다. 세포파쇄액을 실온에서 5분간 배양한 다음 4℃, 12,000 g에서 10분간 원심분리시켜 불용성 물질과 고분자량 DNA를 펠릿화하였다. 상 분리한 후, RNA는 이소프로판올에 의해 석출시키고 또 적절한 부피의 DEPC-처리된 물에 재현탁시켰다. A260에서 분광광도계로 RNA 양을 결정하고, 260 nm 및 280 nm에서 광학 밀도비로부터 RNA 순도를 확실히 하였다. RNA 세기는 Agilent 2100 Bioanalyzer(Agilent Technologies, Santa Clara, USA)를 이용하여 확인하였다. 6보다 높은 RIN 값을 갖는 샘플만을 사용하기 전까지 -80℃에서 저장하였다.

제1 가닥 cDNA 합성은 Ready-to-go^TM You-Prime First-Strand Beads(애머샴 파마시아 바이오테크 제조, 스웨덴 웁살라 소재)을 사용하여 실시하였다. 2 mg의 RNA를 랜덤 헥사머(random hexamer) 및 First-Strand Beads와 함께 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 생성한 cDNA는 즉시 PCR에 사용되거나 또는 사용할 때까지 -20℃에 저장하였다.

실시간 PCR

BChE mRNA의 상대적 발현은 Rotor-Gene 6000(코벳 라이프 사이언스 제조, 오스트렐리아 시드니 소재)을 사용하여 결정하였다. QuantiTect SYBR Green PCR Kit(퀴아겐 제조, 독일 힐덴 소재)를 사용하여 프라이머-다이머 함량을 최소화하였다. 15 ml 반응은 16 pmol의 각 프라이머(BChE 2U GAGTAGATCCATAGTGAAACGG, 서열번호 22, 및 BChE 6LRNA CAGCGATGGAATCCTGCTTT, 서열번호 23) 및 1 ml의 cDNA를 또한 함유하였다. 상대적 BChE 양을 연구하기 위하여, 2개의 하우스키핑 유전자 (housekeeping gene), 베타-액틴(프라이머: 베타-액틴 U2 TCTACAATGAGCTGCGTGTG, 서열번호 24, 및 베타-액틴 L3 TAGATGGGCACAGTGTGGGT, 서열번호 25) 및 베타-글루쿠로니다제(GUS; 프라이머: GUS-U1 ATGTGGTTGGAGAGCTCATT, 서열번호 26 및 GUS-L2 TGTCTCTGCCGAGTGAAGAT, 서열번호 27)(M. Barrachina et al., "TaqMan PCR assay in the control of RNA normalization in human post-mortem brain tissue", Neurochem Int 2006, vol. 49, pp. 276-84)를 또한 분석하였다.

모든 BChE, GUS 및 베타-액틴에 대해 15분 변성 단계에 이어 56℃에서 30초간의 어닐링 이후, 표준 72℃ 연장 동안 최종 형광 데이터를 습득하였다. 최종 용융 분석은 특이적 증폭을 결정하기 위한 모든 생성물에 대해 실시하였다. 상대적 발현 데이터는 상대적 유전자 발현을 분석하기 위하여 유사한 PCR 효율을 가상하여 deltadelta Ct 방법에 의해 달성되었다(T.D. Schmittgen et al., "Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method", Nat Protoc 2008, vol. 3, pp 1101-8). 따라서, 각 유전자 및 이소폼의 상이한 프라이머 쌍을 시험하여 100 내지 150 bp 길이를 갖는 단편을 얻었고, 이들은 유사한 효율로 증폭되었다. PCR 효율은 각 실험에서 다양할 수 있으므로, 초기 실시에서 뿐만 아니라 각각에서 표준 곡선이 포함되었다. 정확한 표준 곡선 (R>0.99 및 R^2>0.99)과 함께 유사한 효율을 갖는 실험만이 다른 분석용으로 적합하였다. 표준 곡선은 동일하게 순차적으로 희석된 cDNA 대조 샘플을 증폭하는 것에 의해 생성되었다. 모든 에세이는 2회 실시되었고 또 독립적으로 재현성을 확실히 하였고 또 각 실험에서 음성 대조군을 비롯하여 가능한 실수를 최소화하였다.

결과

유전자형 조합의 존재에 대한 의존성에서 뇌에서 BChE의 상대적 발현 수준의 분석은 유전자형 조합 77/KW의 보균자가 뇌에서 BChE 발현을 3배 이상 감소시켰고; 또 유전자형 조합 AAAGCC8+K+의 보균자가 50%보다 더 높은 발현 감소를 나타냄을 보여주었다. 이것은 DLB의 서브그룹을 정의하며, 이는 BChE가 이미 감소되었기 때문에, 콜린에스테라제 및 억제제, 및 특이적으로 부티릴콜린에스테라제를 사용한 치료에 아마도 대응하지 않을 것이다.

상세한 설명에서 인용된 참고문헌

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SEQUENCE LISTING <110> Fundaci? Institut d'Investigaci? en Ci?ncies de la Salut Germans Trias i Pujol Universitat Aut?noma de Barcelona <120> Genetic marker for the diagnosis of dementia with Lewy bodies <130> P1589EP00 <160> 28 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5040 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> variation <222> (3687)..(3687) <223> single nucleotide polymorphism at position 3687 of NCBI Accession Number NG_009031 (A3687G) <220> <221> variation <222> (4206)..(4206) <223> single nucleotide polymorphism at position 4206 of NCBI Accession Number NG_009031 (A4206G) <220> <221> variation <222> (4443)..(4443) <223> single nucleotide polymorphism at position 4443 of NCBI Accession Number NG_009031 (C4443T) <220> <221> variation <222> (4780)..(4786) <223> polythymine region from position 4780 to 4786 of NCBI Accession Number NG_009031 <400> 1 tccattttta tgttactatt tccaggaaaa atttaaaata gccttcatat acaataaaag 60 caagttagat aaattatatt gtacttatac aaataattaa tacataggca tataaatgaa 120 gttaaaaaaa tattcgatag cattattttg gaaaaactta agataggtta tatgaaagta 180 ggctaccaaa gactatgtat gatgtatttc caaattagct tgaagcaaaa ggtacagttg 240 tgcatgagaa taagcaatta aaaaaaagaa aaagcatata tatatatatg gtagcacaaa 300 aatgtcctta gtatccaagc tccaggactt tgcctcttag tgtgtagttt gtgaactccc 360 tctatcagct tcacagagga cagtagtata acgctgtcct caagtctact gaaaccaaag 420 cccagggatg tggcctagaa atctggatgt ttaaatagca ctttgatgaa tttgataatg 480 tgttactttg caatttttct gagagtgaga ctccaaagat agtcaagggt ttgggaagag 540 taaatttaag ccaattcagt aaattaggtg ataaacaaag aagcttgctg tttttctctc 600 tttttttatg ttttaaaaca atgagtttct ccttttttgc tcaagccctg aacaatttag 660 ttcagaattt gttttcttac tttgattctg ctggctttgc caattccatg aaaatccact 720 tggcaccaca tttccttaga agctcttgct ttttcttgat tttctttctg ttcttagagt 780 ctaatattct agtgtctcac caaattgttg ttgtctcttt ccaaaactcc tttaaccaaa 840 ctatctgtat cttcatgtaa aaggcaccac agacctccca tcactcactc tcccttaacc 900 ccaaaatatc tatgtgttat cccttacaga tgtcacttcc tgcaaggcct tccatattag 960 ttgctacaac atcactaaag aattttatta cctgtggctc tggacctact tctaatatct 1020 ctggagatat ccaccttcaa acacctgcca catccagcta tgagggtcta gtacctgggc 1080 tccagagaca tgttcaggtt agttctgatt ataagaacat ttctcttttt tgccagaatt 1140 gttggaaagt tatctctatt caacagtctg tgtaggattt cagaagattg aatatacata 1200 taaatatata tacatacaca catgtatata tacacacaca catatatgta tatgtacttt 1260 gtccatgtcg tatttggtta ttccaattct gggaaaataa attaagaaaa taattaaaag 1320 atgcactcaa atatcgatat acaaaatgcc tattgtaata atacataaaa aaagtcagaa 1380 gctaacctcg gtatctgtat gatttggagc aagttactta aactctttgt ggctatattt 1440 tctcaaatgt aaaataaggt taataatagt gcttatttta aaggtagtca tgagttttaa 1500 atgaattcat gtattcaaag tggatagaat agtgctttca aataatattt attacctaaa 1560 attattatta tcatcatata agtaacaaga gatacaatga accataatat gcccatatga 1620 taatatatca cacagtaatc aaaatatttt aataggaaat taatatcata agataaaaag 1680 caagaagaat gatgataagc catttgacta ccactatatt tatctatgta actataacca 1740 catacacata ttttaaaaaa ttgattggaa tatacaaaat ggtcttttca ttctctgtga 1800 tatgtaaaat gtagaaatat acttttctgg gctggatgca gtagctcaca cctataatcc 1860 cagcactttg ggaggccgag gttggtggag cacctgaggt caggaattcg agaccagcct 1920 ggccaacata gtgaaatcct gtgtctacta aaaatacaaa aattagccag atttggtggt 1980 gggtgcctgt aatcccagct actcaggagg ctgaggcagg aaaattgctt gaacccagga 2040 ggcagaggtt gcagtgagcc gagatcctgc cactgcactc cagcctgggc gacagagtga 2100 gactccatct caggaaaaaa aaaaaaaaat ctatctatct atctatctat ctatctatct 2160 atctatctat ctatctatct atacttatat atacttttct ttgttatcca tattcatttc 2220 agagaatgca gtgctattgt aaaaaaaatg aataaaatta atataagttt agagcacttt 2280 tttggcatca gtatgcctaa ggaaaactaa tgtataatac aggattaatg tttttcacac 2340 catctcaaat cttactgaat gctgctatct agaaaacagt ggtaactgag ttacaatggg 2400 accttaaaag caaaaaacca ctgtgactgg ctaactgaaa gtgatcatag agccaaaacc 2460 ataatgattg tcctgcccaa gcttcagcat atatggttgc aaaatgtgcg cagtgttaat 2520 gccgtgtcaa gtgtcttgtg gtatttcatc agtgtcgctt acaaggcata ctcaacattt 2580 aacagcagga tcattaacca tccatgctgt gatgtaatgg aatagtgctt ccctactaac 2640 cctgaaacaa gctcactgtg tgtgacctac atccttccgc tggatgagtg tgagaaaatg 2700 atgacaccac agaagcaaag cagctgctgt aagttgagcc acaaggaaga aactctcaag 2760 acaggaagaa taaatgcttt agaggtgcac taaaataatg aatgaactaa tgtggcatag 2820 ctgtgaaatc atgcgaggaa aagaactaca gggacagtaa cagaaggtgg ttctttgaag 2880 taaagacatt gagaagaaga aaaattgcca acttgtgtaa tcagttgatg ttgctagtta 2940 gccagtttaa acatgcgtta aagataaaga tctgcttgaa accaattatt ttattgtttg 3000 gcttcctgtt taaagatgaa aatgaaatat gtgtatatat gtgacatatt ttacctagca 3060 gtgagtagat gcaggaagca tgtaaaatgc tttgctgaat tcactaacgt cacaaaatat 3120 tccttaataa ttgccgcgtt tgataggctg accttatgct agcacaggaa acaatgcagt 3180 ggacttgggt tggagagaag aattttgaca tttggatttt taaaaatcat gtatattgaa 3240 cccatgaact ctcatgtgga acatcagatt tactatattt taaacagaaa tgccatcact 3300 ataaaaacca ttgcaaattt gtcaatatac ttccatttaa aaagcctttt cctgctttta 3360 ttgatttatt gattaatttt tttttgagac aggatctcac tctgtcaccc acgatgaagt 3420 gcagtggcac aatcgtggct tgcagcctcg acctcctagg ctcaggtgat actcttacct 3480 cagctacctc ccaagtaact gggaatgtag gcttgcacca ccatgtctga cccattttct 3540 tgcagaaatt gagttttgct atgttgtcca gacttgtctt gaactcccag actgaagcaa 3600 tccgcccact taggcctcct aaaatgttgg gattacagtc atgaaccact gtgctccacc 3660 tcctttttct ccttttcaga tagattatgt attctgtacc ttttgtgtaa ctaacttgtt 3720 attacataaa ctatattcta aatacattat aaattattgt gatcatgata tttatcattg 3780 aattaacact gcctaagtag caattttcac agaaaagata attttaaaag accaaaatgg 3840 ttattctctt ggaagcagtt gacataaaat aacagaataa tacagattaa aattctgttt 3900 tccaacagct actagtggta agaaatatag taagcttctg atttgtagaa accttagctt 3960 tctcatctga tgaggtggtt aataatatta actctcatat ttgctgaaat aatataaaat 4020 atttaatata aattgtcaat tataatgact ggcataaggt agaattacaa caaatgctaa 4080 ttatatttgc ttgtttgaaa atttaacact ctattaaaag gcaaaaaagt gctcacctgc 4140 aaatattaat acatgccttc tgtttagtcc atagaaagcc cacaagtaag agattcaaaa 4200 gtgaaagcta tcacttacag aagattaaga atatattgca ttgagaagat agggattaag 4260 gagtttatca aaggtttttt aaaaaattat tttcctgaac atcatttcaa gaaagataag 4320 cgccaaagac ataaatatat tctccagagc atgtgcactg caagttgaca aatgtgtctc 4380 ttttatagag tttggtgaag gttattcatt ttatttttcc tgtcttgacc agaaaattgt 4440 ggcttctcat catgtatgac tgcctgcagg gtcttctgaa taggaaatta ccaatgctga 4500 aatttgtatg acttaaataa gtgttgaagt gtgggggttg aaaggagata catatcagag 4560 acatccattc agttaataga actaagtttt tgatttgcat agcttatatc tagagcattg 4620 tgtttcttat tttctatatt actatcttct ctaactatat aattagcaca gattgaagct 4680 ataatggatt tcaataatag cactacttta gaatgatgta tacgtcttta aatcttaaga 4740 caagcatagg aaatatgtat attcttaaaa aaaggaaaat ttttttaaag tttagagtta 4800 aaagaaacat gcattttctg ttacatttca gattatttta gttaaagaat cttctatgct 4860 ttttttcttc attcttagaa gactacctgc aattgtaaag catgaatcct gtaatacttc 4920 tgtaaatgaa tcactattgc atttatacca ttagcctctg aacagatttc aagttgctgc 4980 tgccaactct cgcgagcttt gtcagtaaca gttgattgtt acattcagta acactgaatg 5040 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for BChE promoter sequencing: BChEprom1UA <400> 2 tgataggctg accgtatgct 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for BChE promoter sequencing: BChEprom1L <400> 3 acctcatcag atgagaaagc 20 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for BChE promoter sequencing: BChEprom2UA <400> 4 tctcttggaa gcagttgaca t 21 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for BChE promoter sequencing: BChEpromS6 <400> 5 ccattatagc ttcaatctgt gc 22 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for BChE promoter sequencing: BChEprom2UB <400> 6 agatacatat cagagacatc catt 24 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for BChE promoter sequencing: BChEprom2L <400> 7 gaagagatca ctctcatccc 20 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for genotyping A-1314G: BChE -1314U <400> 8 tcttgaactc ccagactgaa gca 23 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for genotyping A-1314G: BChE -1314G <400> 9 tacacaaaag gtacagaata cac 23 <210> 10 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for genotyping A-1314G: BChE -1314A <400> 10 ttatgtaata acaagttagt tacacaaaag gtacagaata cat 43 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for genotyping A-795G: BChE -795U <400> 11 aagtgctcca cctgcaaata tta 23 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for genotyping A-795G: BChE -795G <400> 12 taatcttctg taagtgatag cc 22 <210> 13 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for genotyping A-795G: BChE -795A <400> 13 ttctcaatgc aatatattct taatcttctg taagtgatag ct 42 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for genotyping C-558T: BChE -558L <400> 14 tgtctctgat atgtatctcc tt 22 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for genotyping C-558T: BChE -558CS <400> 15 tcttgaccag aaaattgtgg c 21 <210> 16 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for genotyping C-558T: BChE -558TL <400> 16 tattcatttt atttttcctg tcttgaccag aaaatttgtg gt 42 <210> 17 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for genotyping BchE-K: BchE-4U <400> 17 ctgtactgtg tagttagaga aattggc 27 <210> 18 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for genotyping BchE-K: BchE-K <400> 18 atggaatcct gctttccact cccattccgt 30 <210> 19 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for genotyping BchE-K: BchE-W <400> 19 atcatgtaat tgttccagcg taggaatcct gctttccact cccattctcc 50 <210> 20 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for genotyping polyT: BChEpolyT-U <220> <221> modified_base <222> (1)..(1) <223> FAM (6-carboxyfluorescein) <400> 20 tcaataatag cactacttta gaatga 26 <210> 21 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer for genotyping polyT: BChEpolyT-L <400> 21 aggtagtctt ctaagaatga aga 23 <210> 22 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer BChE 2U for real time PCR <400> 22 gagtagatcc atagtgaaac gg 22 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer BChE 6LRNA for real time PCR <400> 23 cagcgatgga atcctgcttt 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer beta-actin U2 for real time PCR <400> 24 tctacaatga gctgcgtgtg 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer beta-actin L3 for real time PCR <400> 25 tagatgggca cagtgtgggt 20 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer GUS-U1 for real time PCT <400> 26 atgtggttgg agagctcatt 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer GUS-L2 for real time PCR <400> 27 tgtctctgcc gagtgaagat 20 <210> 28 <211> 1980 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> variation <222> (934)..(934) <223> single nucleotide polymorphism corresponding to position 68974 of the NCBI Accession Number NG_009031 (G68974A). It is the K variant polymorphism. This SEQ ID NO: 28 represents the region from position 68041 to 70020 of this Accession Number. <400> 28 ggaggcagag gttgcggtga gccaagatgg cgccattgca ctccagcctg ggtggcaaga 60 gtgaactctg tctcaaaaaa aaataaataa ataaaataaa acattgtatt ataataaggg 120 taaaatctat gtggaatgat aattaaaaag ttatccttat gcattaataa atacagtatg 180 acctttgtat ttgcgggtta cacatccatg gatttaacca accacgagtc aaaaacattt 240 gataaataaa tacatctata ctaaacatat acagaccttt ttttcttatc attattcctt 300 aaacaatata atataataaa catttacaca gcactttcat tatattaggt atgaattatc 360 tagggatgtg catggcttat gtgaaaatgt tatgctattt tacattaggg acttgagtat 420 gagaggattt tggtatccct gagaggtcct agaaccaact ccccacaaat actaaggatg 480 actgtagtca tatataattt tcatcagaaa taattatctg ttatataact atatatgtaa 540 atgagaccat taaatgaaat ttgtgttatt ttaaagtggg tcaagaaaag agcataatat 600 ctacatatcc tcttgaaaac taaagaaaat atatgtaatg taattataca taatacaata 660 tataaactca ttttccattt tatatgttat acgttatata aattatatat acattatttg 720 cattttcaca taatctgtaa agattttatt aaaatctctt ttcaggcaaa gcgagctaat 780 aacaaataat aaagaataaa taaagaaaat aatgctgtac tgtgtagtta gagaaaatgg 840 cttttgtatt cgaaattatt tttcagttaa tgaaacagat aaaaattttg attaatacaa 900 cttattccat attttacagg aaatattgat gaagcagaat gggagtggaa agcaggattc 960 catcgctgga acaattacat gatggactgg aaaaatcaat ttaacgatta cactagcaag 1020 aaagaaagtt gtgtgggtct ctaattaata gatttaccct ttatagaaca tattttcctt 1080 tagatcaagg caaaaatatc aggagctttt ttacacacct actaaaaaag ttattatgta 1140 gctgaaacaa aaatgccaga aggataatat tgattcctca catctttaac ttagtatttt 1200 acctagcatt tcaaaaccca aatggctaga acgtgtttaa ttaaatttca caatataaag 1260 ttctacagtt aattatgtgc atattaaaac aatggcctgg ttcaatttct ttctttcctt 1320 aataaattta agtttttccc cccaaaatta tcagtgctct gcttttagtc acgtgtattt 1380 tcattaccac tcgtaaaaag gtatcttttt taaatgaatt aaatattgaa acactgtaca 1440 ccatagttta caatattatg tttcctaatt aaaataagaa ttgaatgtca atatgagata 1500 ttaaaataag cacagaaaat cattggtctc tttgtttttt atataaaggc aagaaagaat 1560 cttaaaatga gaggctcagc cactttaaaa caccttataa tagaaacaga atgctgctac 1620 caagaaacaa aatataaaat aatgtaatta tttatgtaat gccttcaaat tatattcttc 1680 atttgactct tgctctccct cacctcctct atcctcaaat caccacaaac atgtacatat 1740 gtgaattacc tttccgtaat tcaaaaattt ttaaaaagtg ggtgcataga agtctaaagt 1800 taggttgtgt accatctggg acagggcaac ccttgcctgg acccagaaat attaacatat 1860 taataggaaa attgttcaat tccagaagag aaatggttgt actttctgta gacaaactgt 1920 cttatttttg caattaaaaa aattacagag ctgcatttat tagcatgctt ggcaagggag 1980

Claims

검체로부터 얻은 생물학적 샘플에서 부티릴콜린에스테라제(BChE) 유전자에서 하기 변경의 유전자형, 또는 그의 연관 불평형에서 다형성의 유전자형을 결정하는 단계를 포함하는, 루이 소체 치매를 진단하기 위한 시험관내 방법:
NCBI 등록번호 NG_009031 중의 위치 68974에서 다형성 부위(즉 서열번호 28에서 위치 934); 및
NCBI 등록번호 NG_009031 중의 위치 4780 내지 4786에서 폴리티민 영역(즉, 서열번호 1에서 위치 4780-4786).