CN102869786B

CN102869786B - 用于诊断路易体痴呆的遗传标记

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Publication number: CN102869786B
Application number: CN201180011143.7A
Authority: CN
Inventors: K·拜尔; M·多明戈萨巴特; A·阿利茨费尔南德斯
Original assignee: Universitat Autonoma de Barcelona UAB; Fundacio Institut dInvestigació en Ciencies de la Salut Germans Trias I Pujol IGTP
Current assignee: Universitat Autonoma de Barcelona UAB; Fundacio Institut dInvestigació en Ciencies de la Salut Germans Trias I Pujol IGTP
Priority date: 2010-02-24
Filing date: 2011-02-24
Publication date: 2014-12-24
Anticipated expiration: 2031-02-24
Also published as: ZA201206975B; EP2360280A1; NZ602551A; CL2012002347A1; BR112012021260A2; EP2539461A1; IL221313A0; SG183437A1; JP2013520185A; KR20130049771A; EP2539461B1; RU2012140458A; MX2012009506A; CN102869786A; KR20130043107A; US20130101997A1; CA2789054A1; AU2011220065A1; WO2011104023A1

Abstract

已经发现了BChE基因中的特异性改变，这种特异性改变允许确定患者是否患有路易体痴呆(DLB)，并且使得可以将其与阿尔茨海默病区别开来。本发明提供了用于诊断DLB的体外方法，包括在来自受试者的生物学样本中确定丁酰胆碱酯酶(BChE)基因的下列改变的基因型：NCBI登录号NG_009031位置68974处的多态性位点(即SEQ ID NO：28中的位置934)，和多态性位点3687、4206、4443、以及位置4780至4786的多聚胸腺嘧啶区，所述位置参照对应于人BChE基因核苷酸序列的NCBI登录号NG_009031(即分别为SEQ ID NO：1中的位置3687、4206和4443)。

Description

用于诊断路易体痴呆的遗传标记

本发明涉及医学领域，并且特别涉及神经退行性疾病。本发明具体涉及用于路易体痴呆诊断的标记。

背景技术

路易体疾病包括以存在称作路易体(LB)的蛋白质性神经元包涵体(proteinaceous neuronal inclusion)为特征的一组病症。在临床上，可以区分帕金森病(PD)和路易体痴呆(DLB)两种病症。PD是老年人中最常见的进行性运动病症，而DLB是仅次于阿尔茨海默病(AD)的导致痴呆的第二大常见的原因。虽然LB实际上在每个脑区域内的广泛分布是DLB的典型特征，但是在PD中黑质受影响最大。

最初描述DLB时，认为DLB是罕见的病症，但是在过去几年，广泛研究已表明DLB占尸检病例的10-15％。主要的DLB症状包括认知损害波动、经常出现视幻觉和帕金森症，然而，许多与AD重叠的症状导致时常发生DLB误诊。由于AD和DLB患者在对药物治疗的响应和预后方面不同，重要的是提高DLB诊断的准确度。

为了实现DLB与AD之间更好的临床区分，在过去几年内已经开展了多种纵向研究和比较研究。仅具有路易体(LB)病理学的患者比仅具有AD或者具有混合性AD/LB病理学的患者表现出相对较少的严重损害但是更显著的执行功能和注意力衰退。此外，DLB患者比具有AD的患者表现出较慢的认知记忆减退，但是具有更多的精神病学症状，其中该种症状学在较后的疾病阶段会观察到。最后，已经证明在早期阶段痴呆中视幻觉的存在对DLB最具有特异性。值得提及的是，虽然达到了临床诊断的高特异性(在不同研究中从90至99％的范围变化)，但其灵敏度仍然相对较低(18-83％)。因此，对在1996年建立的用于很可能和可能DLB临床诊断的第一公认指南已经进行修订以提高DLB诊断的灵敏度，然而，许多与AD重叠的症状导致在40-80％病例之间的频繁DLB误诊。

低的DLB诊断灵敏度的主要原因源于增加比率的病例表现出除了LB相关病理学之外的AD特征性变化。为了评价该类型的组合病理学，第三DLB协会提出一个模型将AD相关病理学置入到LB病理学环境中。AD类型病理学阶段越高，实现正确诊断DLB的灵敏度越低。因此，最近的报告证实，随着AD相关病理学的增加，DLB的误诊增加，但是即便如此，仅大约52％的患者在低AD病理学阶段被正确诊断为DLB。

对DLB的治疗是症状性的，并且基于有限次数的临床试验和来自AD试验的结果延伸。现在，AD治疗包括使用胆碱酯酶抑制剂或者通过增加脑内乙酰胆碱水平或者通过强化神经细胞对乙酰胆碱响应的方式来改善乙酰胆碱的有效性。此外，神经安定药用于减少通常在病程过程中出现的精神病症状。相反，对于治疗DLB，使用神经安定药会在大约50％的DLB患者中引起不良反应并可能引起死亡。

因此，区别性地诊断AD与DLB的能力不仅对于待治疗个体而言是主要的优势，而且对于公共健康系统的经济压力而言也是主要的优势。然而，当前，精确地区分AD与DLB仅可能依靠死后的脑组织分析。

现在，DLB诊断基于按照由DLB国际工作组协会(the Consortium on DLBInternational Workshop)建立的指南(I.G.McKeith，“Consensus guidelines for theclinical and pathologic diagnosis of dementia with Lewy bodies(DLB)(路易体痴呆(DLB)临床和病理诊断的公认指南：DLB国际工作组协会报告)”，J.Alzheimer′s Dis.2006，第9卷，第417-23页)对症状和特征的临床评价，但是如上面所解释，其导致DLB误诊。影像学方法如正电子断层成像术(PET)和单光子发射计算机断层成像术(SPECT)可以利用，但是它们的敏感性不是非常高并且它们对于常规临床应用而言非常昂贵。早期明确诊断将给出治疗范围以降低或停止疾病进展。

已经存在一些尝试试图找到遗传标记以精确地识别患有DLB的患者。遗传学试验将是非常有用的工具并且在DLB生前诊断中的每日临床实践中容易开展。在这个意义上，为发现与DLB的关系而研究联系的一些蛋白质和基因是α-7烟碱乙酰胆碱受体亚基、骨桥蛋白、一氧化氮合酶、泛素羧基末端水解酶L1基因、BDNF基因或β-突触核蛋白基因。它们当中有许多已经在试验水平在脑样本中进行了研究，并且它们无法用于真正的临床诊断，因为难于得到患者脑活检。

丁酰胆碱酯酶(BChE)是在肝脏中合成的糖蛋白酶。在人脑中发现其主要位于神经胶质中，特别是皮质和皮质下结构中，但是其还发现于神经元中，尤其是涉及认知功能的那些神经元中。在AD患者中，BChE存在于淀粉状蛋白斑中，以及神经原纤维缠结中。该酶作为有机磷和氨基甲酸酯化合物的解毒酶起作用并且水解琥珀酰胆碱、阿司匹林和可卡因。BChE在人脑中的功能尚不熟知，但是已知当乙酰胆碱酯酶(AChE)减少或者缺乏时其水解乙酰胆碱(ACh)。它是用于决定呼吸暂停易感性的标记。到目前，已经在位于3号染色体上(3q26.1-q26.2)的BChE基因中鉴定出65个变体(参见F.Parmo-Folloni等，“Twonew mutations of the human BCHE gene(人BCHE基因的两个新突变)(IVS3-14T＞C和L574fsX576)”Chemico-Biological Interactions 2008，第175卷，第135-7页)。

为了表示对Werner Kalow的敬意，将BChE基因外显子4中存在的A539T突变命名为K变体。K变体与对应于DNA序列(NCBI登录号NG_009031)中位置68974的mRNA中核苷酸1615位置处的从鸟嘌呤至腺嘌呤的DNA转换有关，这导致氨基酸从丙氨酸539改变成苏氨酸。

K变体位于蛋白质的C末端，一方面负责其四聚体化并且另一方面负责弱化β-淀粉状蛋白纤丝形成。在血清中，BChE K变体造成血清BChE活性水平降低三分之一。虽然BChE在脑中的主要功能仍然未知，但是K变体似乎降低了β-淀粉状蛋白纤丝形成的衰减速率，从而加速了AD进展。相反，tau蛋白在携带至少一个K等位基因的AD患者中较少磷酸化，这表示出对AD的保护性机制。

许多研究已经研究了BChE基因，尤其是BChE K变体与AD之间可能的关联。已经讨论了载脂蛋白E基因(ApoE4)ε4等位基因——一种对于AD已知的主要遗传风险因子——与BChE基因变体的同时出现影响AD病理学。一些报告显示，在具有BChE野生型和ApoE4基因型组合的受试者中AD风险增加。其它报告发现，BChE K和ApoE4组合增加AD风险。已经表明，AD中认知减退的进行受BChE基因型的影响。然而，关于BChE K变体既不作为AD风险因子也不作为AD进展标记的作用没有明确结论。

已经研究了BChE K基因型和DLB之间可能的相关性。Singleton等(A.B.Singleton等，“Butyrylcholinesterase K：an association with dementia with Lewybodies(丁酰胆碱酯酶K：与路易体痴呆的相关性)”，Lancet 1998，第351卷，第1818页)报导了与对照相比DLB中纯合BChE K携带者频率增加。最近的研究发现，与PDD患者相比，DLB患者中BChE K和ApoE4频率增加(R.Lane等，“BuChE-K and APOE epsilon4 allele frequencies in Lewy body dementias，andinfluence of genotype and hyperhomocysteinemia on cognitive decline(路易体痴呆中BuChE-K和APOE ε4等位基因频率，以及基因型和高同型半胱氨酸血症对认知减退的影响)”，Mov.Disord.2009，第24卷，第392-400页)。基于比PDD受试者更高百分比的DLB具有额外的AD类型病理学并且额外的AD类型病理学导致更快速认知减退的假设，作者推断，该基因型在痴呆发生和LBD进展中可能是重要的。然而，最近的研究表明，在BChE K变体与痴呆的DLB表型之间不存在显著的相关性(参见W.Maetzler等，“No differences ofbutyrylcholinesterase protein activity and allele frequency in Lewy body diseases(在路易体疾病中，丁酰胆碱酯酶蛋白质活性以及等位基因频率无差异)”Neurobiol. Dis.2009，第35卷，第296-301页)。

因此，需要提供将在普通临床实践中使用的用于精确鉴别患有路易体痴呆的患者并与阿尔茨海默病相区别的方法。

发明内容

发明人已经发现了使得能够确定患者是否患有路易体痴呆并且将其与阿尔茨海默病相区别的BChE基因中的特异性改变。

在现有技术中存在旨在寻找BChE K变体与DLB之间相关性的文献，但是如下所解释，最近的研究认为没有明显的相关性(参见W.Maetzler等，见上)。令人惊奇地是，本发明的发明人已经发现，利用与在BChE基因中在位置4780至4786的多聚胸腺嘧啶区迄今为止未知改变的基因型同时出现的K变体基因型，获得了用于DLB诊断的特异信息。因此，确定这两个基因型可用于区别DLB与AD，这两个基因型构成了DLB的特异性遗传标记。

本发明人还进一步观察到，基因型的组合可以鉴别一组患有DLB并与AD相区别的患者。该组合由NCBI登录号NG_009031中在位置3687、4206和4443处的多态性位点、在位置4780至4786的多聚胸腺嘧啶区的基因型(即分别是SEQ ID NO：1的位置3687、4206、4443和4780-4786)，和在NCBI登录号NG_009031中在位置68974的多态性位点(即SEQ ID NO：28中的位置934)的基因型形成。

BChE核苷酸序列中改变的位置从对应于启动子和基因的NCBI登录号NG_009031的核苷酸序列给出。该序列于2010年1月31日公布。

多态性位点3687、4206、4443和在位置4780至4786处的多聚胸腺嘧啶区位于启动子区域内。对于这些位点，还参考SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：1对应于NCBI中BChE完整序列从核苷酸1至核苷酸5040的序列。有时使用的核苷酸可能编号使用转录起始作为位置1，并且因此，该位置上游的核苷酸作为负数位置。转录起始位置1对应于NG_0090031中的位置5001。在本说明书中使用的编号与“负数”编号之间的对应在此给出：

A3687G对应于A-1314G

A4206G对应于A-795G

C4443T对应于C-558T

从4780至4786的多聚胸腺嘧啶对应于-215至-221

位置68974处的多态性位点位于NG_009031的编码区内。从NG_009031的位置68041至7020的区域作为SEQ ID NO：28包括在内。单独以该区域来说，将核苷酸重新编号，因此在完整基因序列中的位置68974变成了SEQ IDNO：28中的位置934。该多态性与BChE外显子4中氨基酸变化有关，导致产生K变体。由于序列编号不同，所以在文献中对于该多态性使用的位置是1615(参照编码无信号肽的成熟BChE蛋白质的mRNA序列)。

如在下面实施例中所述，在独立评价的BChE基因中五个改变的每一个与DLB之间没有发现特异的相关性；但是令人惊奇地是，这些改变相组合提供对于DLB的特异性信息。

因此，本发明的一个方面提供用于诊断DLB的体外方法，包括在来自受试者的生物学样本中确定丁酰胆碱酯酶(BChE)基因中下列改变的基因型，或者与所述改变连锁不平衡的多态性的基因型：位置68974处的多态性位点和位置4780至4786处的多聚胸腺嘧啶区。

在特定的实施方案中，该方法还包括确定BChE基因中下列改变的基因型，或者与所述改变连锁不平衡的多态性的基因型：位置3687、4206和4443处的多态性位点。

如在下面实施例中所示，分析了AD(n＝26)、纯DLB(n＝12)、普通DLB(n＝24)和对照(n＝23)的死后样本，以及从223例AD和160例对照受试者得到的临床诊断样本。作为结果，描述了三种类型的遗传标记。首先，在两个多态性位点上的特异性变化同时出现的特征在于，存在在位置4780至4786具有7个胸腺嘧啶的一个等位基因，并且在位置68974，对于一个等位基因存在鸟嘌呤，而对于另一等位基因存在腺嘌呤。这种同时出现是鉴别诊断DLB与AD的特异性标记。大约50％的可能误诊的DLB患者通过使用该标记将得到挽救。

本发明的另一实施方案涉及第二种遗传标记，其是基因型组合AAAGCC8+K+。其由位置3687(两个等位基因在该位置均包含腺嘌呤)、4206(一个等位基因包含腺嘌呤并且另一个等位基因包含鸟嘌呤)、4443(两个等位基因均包含胞嘧啶)、4780至4786(两个等位基因的至少一个由8个胸腺嘧啶构成)和68974(两个等位基因的至少一个包含腺嘌呤)上多态性位点的特异性基因型构成。在痴呆患者中该基因型组合的确定用作鉴别诊断标记，提供对DLB的临床诊断，但是其还可用作无症状个体中DLB的早期诊断标记。

本发明的另一实施方案涉及第三种遗传标记，其是基因型组合AAAAC+77KW。其由位置3687(两个等位基因在该位置均包含腺嘌呤)、4206(两个等位基因在该位置均包含腺嘌呤)、4443(两个等位基因的至少一个在该位置包含胞嘧啶)、4780至4786(两个等位基因均由7个胸腺嘧啶构成)和68974(一个等位基因包含腺嘌呤并且另一个等位基因包含鸟嘌呤)上多态性位点的特异性基因型构成。痴呆患者中该基因型组合的确定用作鉴别诊断标记，提供对DLB的临床诊断，但是其还可用作无症状个体中DLB的早期诊断标记。

有利地，在DLB的巨大异质性内并根据实施例，本发明的方法使得可以鉴别性检测45-60％的DLB病例，否则这些病例将被诊断为AD。在临床实践中难于诊断的这些百分比的患者将会从疾病一开始就接受正确的诊断。对于该疾病的特异性是99％。这代表着用于DLB的第一种特异性标记。

直到现在，在现有技术中可利用的工具不能在临床实践中特异性鉴别DLB。这样，当受试者被诊断为AD时，他会接受精神安定药治疗，这是对于AD中精神病症状最恰当的治疗，但是超过50％的DLB患者对该种治疗表现出不良反应，在许多病例中导致死亡。本发明方法之所以重要，是因为其能够使医学界对患有DLB的患者应用恰当的治疗，而无不正确治疗的危险。因此，应用本发明的方法，DLB的诊断特异性增加以及由使用神经安定药治疗的副作用引起的死亡将会降低。

此外，由于本发明的方法使得特异性诊断患有DLB的患者，所以在临床试验中包含状况明确的的患者群体是可能的。

医学中的“诊断”意思是指通过其外在的征兆、症状和潜在的生理学/生物化学原因(一种或多种)识别疾病或病症的行为或过程。

从本说明书的意义上说，BChE基因中的“改变”意思是指在被认为是野生型的核苷酸序列中的任何结构变化。改变的实例可以包括单核苷酸多态性，一个或多个核苷酸的缺失、插入、置换或重复，以及核苷酸上的化学修饰(例如甲基化)。

在本说明书中“确定基因型”意思是指鉴定给定位置处的核苷酸。

在本说明书中，“一个等位基因中的给定核苷酸”意思是指对于该基因中的该核苷酸而言受试者是杂合子，“在两个等位基因中”意思是指对于该核苷酸而言其是纯合子。

根据本发明，所述方法包括确定BChE基因上的所指出的改变，并且还确定与所述改变连锁不平衡的多态性，这将给出相同信息。在群体遗传学中，连锁不平衡是不必然位于同一染色体上的两个或更多个基因座上等位基因的非随机关联。

按照本发明的诊断方法，DLB分析如下：怀疑发生痴呆和/或具有非确定性临床家族性评价的患者将通过确定上述BChE基因的改变的遗传测试进行诊断。在检测DLB特异性基因型的情况下，不需要额外的测试或试验来正确诊断DLB。基因分型的直接应用意味着在日常临床实践中大量节省金钱。

本发明方法用于下列的疑似诊断：很可能为AD对可能为DLB；可能为AD对很可能为DLB；可能为AD对可能为DLB；很可能为AD对很可能为DLB；很可能为AD对可能为AD；可能为DLB；和很可能为DLB。医生诊断可能的AD是基于覆盖个人和家族医学史的完整患者会面，结合所开展的任何神经病学、精神病学和实验室检验结果。当患者抱怨记忆力减退的逐渐进展，并且当医生找不到可以解释记忆力丧失的任何其他情况时，医生可能认为是AD。医生将寻找例如抑郁或者甲状腺功能低下的病症、中风引起的神经病学损伤、或可促进记忆力丧失的任何药物治疗。无法揭示任何促成的疾病使得确定有可能是AD。很可能为AD是晚于可能为阿尔茨海默病的下一步，并且这意味着医生“相对确定”患者具有该疾病。

有利地，本发明方法允许诊断DLB，而不需要通过创伤性方法得到样本，所述创伤性方法如活检；并且在该种情况下为脑组织显微活检。作为遗传检验，本发明方法在从受试者移出的任何生物学样本如血液上实施，原因在于其适用于身体的任何细胞类型。

在另一个实施方案中，确定基因型通过选自由以下各项组成的群组的技术之一实施：引物特异性多重PCR然后检测、多重等位基因特异性引物延伸、基于微列阵的方法、和动态等位基因特异性杂交。在特定的实施方案中，其通过引物特异性多重PCR然后检测来实施。

聚合酶链式反应(PCR)是用于体外扩增核酸的最广泛使用的方法。PCR可以是实时PCR，其中通过标记探针检测靶基因型的存在与扩增几乎是同时的。

靶多态性的扩增可以通过引物特异性多重PCR进行，并且随后通过聚丙烯酰胺电泳检测或者通过遗传分析仪分析。备选地，可以开展不同的PCR反应，之后进行琼脂糖凝胶电泳或者测序。

可通过等位基因特异性引物延伸(ASPE)开展基因型的测定。这是序列特异性酶促反应技术，可以用于在单管中测定多重SNPs。ASPE方法包括两个阶段，酶促反应确定靶基因型，之后捕获在固体微球表面上用于检测。该技术利用液相动力学，允许序列标记微球用于检测新模板。这借助于正确捕获与等位基因特异性寡核苷酸相连的序列实现。

任选地，检测可以通过下列进行：由通过任何机制沉积的寡核苷酸制成的DNA生物芯片/微列阵、由通过照相平板印刷术或任何其他机制原位合成的寡核苷酸制成的DNA生物芯片。允许在总的人基因组DNA中进行多重SNP基因分型而无需靶扩增或复杂性降低的基于微列阵的方法也可以用于BChE改变的基因分型。该直接的SNP基因分型方法学不需要酶并且依赖于金纳米微粒探针的高灵敏度。特异性来源于依靠等位基因特异性的表面固定化捕获探针和基因特异性的寡核苷酸功能化金纳米微粒探针的两次相继的寡核苷酸杂交至靶标。测定模式是简单的、快速的且强大的，意味着其适合于在“医护点(point ofcare)”进行多重SNP分析。

此外，基因型的确定可以通过动态等位基因特异性杂交(DASH)开展，动态等位基因特异性杂交在一些实验室中代表通量SNP基因分型的基础。DASH的核心反应原理是在DNA变性过程中实时(动态)跟踪等位基因特异性差异。为了达到该目的，寡核苷酸探针首先与靶DNA杂交，这是基本上所有基因分型方法必需的组成部分。靶DNA包含固定在固体表面上的PCR产物的一个链，并且使用与靶等位基因之一互补的单一探针。该测定构思显示非常精确(＞99.9％准确性)。

在第二个方面中，本发明提供用于开展如上所定义方法的试剂盒，包含用于确定BChE基因改变的基因型的适当手段。

在特定的实施方案中，试剂盒包含用于通过引物特异性多重PCR实施扩增的适当手段。

本发明提供的试剂盒可以在常规临床实践中用于鉴别患有DLB的患者，由此将所述患者与患有AD的其他患者区别开来。使用本发明的试剂盒，临床医生将能够对患有DLB的患者应用更加个体化的且风险适当的治疗策略。

在另一个方面中，本发明涉及如上所定义的试剂盒用作诊断DLB的用途。

本发明还涉及位置68974处的多态性位点与BChE基因中一个或多个改变相组合用作诊断路易体痴呆的标记的用途，所述一个或多个改变选自位置4780至4786处的多聚胸腺嘧啶区、位置3687处的多态性位点、位置4206处的多态性位点、和位置4443处的多态性位点。在特定的实施方案中，位置68974处的多态性位点与位置4780至4786处的多聚胸腺嘧啶区组合使用。在另一个实施方案中，位置68974处的多态性位点与位置4780至4786处的多聚胸腺嘧啶区，以及与位置3687、4206和4443处的多态性位点组合使用。

本发明还涉及通过分析BChE基因中上述改变的基因型，确定受试者是否会对使用精神安定药的治疗有响应的方法。由于该方法可以确定患者是否患有DLB或者AD，所以提供合适的治疗是可能的。

在整个说明书和权利要求书中，词语“包含/包括(comprise)”和该词语的改变形式，例如“包含/包括(comprising)”，不旨在排除其他技术特征、添加物(additive)、成分或步骤。通过研究本说明书，本发明其他的目标、优势和特征对本领域技术人员而言是显而易见的，或者可以通过本发明的实践而获知。此外，本发明涵盖本文所述特定和优选实施方案的所有可能的组合。

下列实施例和附图以解释说明的方式提供，并且不旨在限制本发明。

附图说明

图1显示针对四个组得到的对比。圆圈指示四维图内的不同基因型组合的位置。星号显示疾病组和对照组的一致的、基因型组合依赖性位置。它们的位置清楚地显示在cDLB和对照之间、AD和对照之间，还在AD和cDLB之间存在显著的差异。虽然对照组位于两个维度的负象限内，cLBD位于第一维度正象限和第二维度负象限内并且AD位于第一和第二维度正象限内。这些结果强有力地表明，对于BChE遗传学而言三个组存在显著差异。这意味着疾病特异性基因型组合可代表有用的疾病标记。

图2显示三个基因型组合依赖性DLB组的额皮质内的相对BChE表达水平：(1)基因型组合AAAGCC8+K+携带者，n＝4；(2)基因型77KW携带者，n＝7；(3)剩余的DLB患者，n＝12。这些结果表示为通过ΔΔCt方法得到的与剩余DLB患者相比的相对表达变化，而在剩余的DLB患者中BChE表达假设为1。误差线表示方差估计。*低于参照组1.5和2倍之间的显著性表达变化，**低于参照组超过2倍。携带两种DLB特异性BChE基因型组合(AAAGCC8+K+或者AAAAC+77WW)之一的所有DLB患者，表现出比剩余DLB患者低的BChE表达水平。这种降低的表达与对照脑中的BChE表达水平相似，该事实表明携带AAAGCC8+K+或AAAAC+77WW的DLB患者对通常使用的应用胆碱酯酶抑制剂的治疗不响应。此外，这一发现代表着这些DLB患者的特异性特征，定义DLB的分子亚组。

实施例

死后样本

根据当地伦理委员会制定的规则，具有临床和神经病理诊断的死后额皮质样本由巴塞罗那大学神经病学组织库(the University of Barcelona NeurologicalTissue Bank)和Bellvitge神经病理学脑库研究所(the Bellvitge Institute ofNeuropathology Brain Bank，BrainNet Europe)促成。它们对应于24个具有普通路易体疾病(cLBD)的脑(死亡年龄：79.9，年龄范围从64至90；女性：男性比1.5∶1)，12个具有纯路易体痴呆(pDLB)的脑(死亡年龄：74.4，年龄范围从60至80；女性：男性比1∶2)，26个AD脑(死亡年龄：78.1，年龄范围从61至95；女性：男性比1∶1.1)和23个对照脑(死亡年龄：68.5，年龄范围从54至83；女性：男性比1∶1.1)。

神经病理学检查显示，所有AD脑呈现AD Braak和Braak VI期。Braak和Braak是用于评价/定量脑内AD的分期。它被神经病理学家用于评价淀粉状蛋白斑和神经原纤维缠结的密度。根据Braak和Braak的AD分期，I-VI：神经原纤维缠结；A-C：淀粉状蛋白斑。两个cLBD样本相当于Braak和Braak III期，三个相当于Braak和Braak IV期并且19个剩余的样本相当于V和VI期。在pDLB脑中，检测到Braak和Braak 0至II期，并且在对照样本中无AD相关变化。虽然AD和对照脑均未显示PD相关病理学，但是按照Braak-Braak分类法，所有pDLB样本以及cLBD样本呈现出对应于PD相关变化的5和6期。

临床诊断的样本

血液样本获得自在我们的Germans Trias i Pujol医院的神经科，按照NINCDS-ADRDA和DSM-IV标准诊断的223名AD患者(年龄：71.1；年龄范围从49至86岁；女性：男性比率1∶1.6)。此外，还有59名年龄匹配对照受试者(年龄：68.8；年龄范围从46至91岁；女性：男性比1∶1.5)。

在另外的实验中，对160名年龄匹配对照受试者(年龄：68.8；年龄范围从46至91岁；女性：男性比1∶1.5)进行取样。

在医院伦理委员会授权并得到签名的知情同意书之后开展研究。

DNA提取

使用TRI试剂按照制造商的说明书从冰冻脑样本提取DNA。TRI试剂溶液混合苯酚和异硫氰酸胍于单项溶液中，并且其用于从同一样本相继提取RNA、DNA和蛋白质。在通过分光光度法测定纯度和浓度之后，将DNA样本储存于4℃下直至使用。通过基于玻璃滤膜上DNA结合的标准方法开展从血液提取DNA。

BChE启动子测序

由于BChE启动子序列由大约5000bp构成，所以扩增三个重叠的PCR片段用于序列分析。PCR1(引物BChEprom1UA和BChEprom1L；表1)获得跨越位置-1869至位置-1031的838bp片段。在PCR2中(引物BChEprom2UA和BChEpromS6；表1)获得跨越位置-1152至-315的837bp片段，并且在PCR3中(引物BChEprom2UB和BChEprom2L；表1)获得到跨越位置-473至位置+231的688bp片段。具有15μl终体积的PCR反应包含1.7mM MgCl₂，200μM每种dNTP(Ecogen)，2pmol每种引物，1单位EcoTaq DNA聚合酶(Ecogen)和大约300ng DNA。建立标准PCR程序，对于PCR1退火温度为58℃，对于PCR 2和3为60℃，对于PCR1为30个循环并且对于PCR 2和3为35个循环。

PCR产物通过使用ExoSap-IT试剂盒(GE Healthcare)纯化。使用BigDye(BigDyeTM终止子vs 1.1循环测序试剂盒，Perkin Elmer)，10pmol/μl各自引物和3.5μl纯化的PCR产物实施测序反应。在循环测序和DNA沉淀之后，在ABI PRISMTM3100(Perkin Elmer)上得到序列。

BChE启动子多态性分析

在BChE基因的启动子区发现4个新多态性。使用突变特异性PCR(MS-PCR)研究了它们当中三个以及众所周知的K变体多态性：A3687G、A4206G、C4443T和BChE-K。每一PCR反应具有15μl终体积，包含1.7mM MgCl₂，200μM每种dNTP(Ecogen)，2pmol三种引物中的每一种(表2)，1单位EcoTaq DNA聚合酶(Ecogen)和300ng的DNA。实施标准PCR程序，35个循环，在A3687G、BChE-K扩增中退火温度为62℃，在A4206G、C4443T扩增中退火温度为57℃。所得到的PCR片段在高分辨率琼脂糖凝胶上分离。BChE A3687G多态性的A等位基因表现为153bp片段，并且G等位基因表现为133bp片段。K等位基因表现为149bp片段并且来自K变体多态性的野生型相应等位基因表现为169bp条带。BChE A4206G多态性的A等位基因长度为124bp并且G等位基因为104bp。最后，在C4443T多态性的情况下，T等位基因对应于145bp片段并且C等位基因对应于125bp片段。

基于仅一个核苷酸差别的不同片段大小构成多聚T(polyT)多态性。其基因分型通过毛细管电泳应用荧光染料标记引物(表2)在ABI PRISM^TM 3100(PerkinElmer)上实现。在标准条件下使用30个循环的程序开展PCR。7T等位基因生成196bp，197bp片段代表8T等位基因。

Polymorp¹：多态性名称；²[FAM]：具有荧光染料Fam的5’引物修饰。

统计学分析

对应分析(CORRESPONDENCE，版本1.1，Data Theory Scaling SystemGroup(DTSS)，Faculty of Social and Behavioral Sciences，Leiden University，荷兰)可以获得对于神经病理诊断患者组的对应表。通过SSPS版本11.0计算针对两个患者组(神经病理诊断的患者组和临床诊断的患者组)的基因型组合的分布。

临床与神经病理学诊断的匹配

临床与神经病理学诊断之间的匹配首先在从神经病学组织库得到的样本中分析。虽然100％的AD患者的临床诊断与神经病理学诊断一致并且42％的pDLB患者诊断为DLB，但是仅17％的cLBD患者被临床诊断为DLB。反而，他们当中62％已经诊断为AD并且21％符合其他痴呆相关病症。该观察与缺乏cLBD诊断标准完全相关。

BChE K变体

BChE K变体由位置68974处从g至a的单核苷酸置换组成，其中g等位基因被命名为W(野生型)并且a等位基因被命名为K(突变的)。

该分析一个有趣的发现是，与对照相比，携带K等位基因的基因型在cLBD中并且在pDLD和AD中的过表达(cLBD中0.62，pDLB中0.42和AD中0.38相对于对照中0.13，分别为p＜0.001，p＝0.090和p＝0.058)。进一步的基因型分析表明，KW基因型在在AD和对照中呈现相似的频率，在pDLB中稍微增加，但是大约三分之一的cLBD样本是KW基因型携带者(表3)。虽然在研究的样本中既没有出现H变体也没有出现J变体，但是携带A变体的基因型以非常低的频率发现于不同的疾病中(cLBD中0.04，pDLB中0.08和AD中0.04相对于对照中0；分别为p＝1，p＝0.34和p＝1)。

¹n：样本数；²p：对于每一疾病与对照之间的基因型比较的精确检验p值。

BChE启动子多态性的表征

BChE启动子测序显示存在先前没有描述过的4个多态性。它们当中三个是单核苷酸变化：位置3687处A变成G；位置4206处A置换成G并且位置4443处C变成T。第4个多态性对应于可变长度的多聚T序列并且位于位置4780和4786之间。在两个鉴定的等位基因当中，一个由7T构成并且另一个由8T构成。有趣的是，8T等位基因与共有外显子4多态性的K等位基因分离。

为了证实是否多态性显示疾病特异性的相关性，在神经病理学诊断的脑样本(包括cLBD、pDLB、AD)和对照中确定的所有四个启动子多态性的等位基因和基因型频率。首先，独立地分析多态性，然后再检验基因型组合的存在。

对A3687G多态性的研究显示，与cLBD、pDLB和对照相比，AD中的AA基因型增加大约三倍(AD中0.54相对于cLBD中0.21，p＝0.152；pDLB中0.16，p＝0.298和对照中0.13，p＜0.001)。相反，与对照相比，对应于A4206G多态性的携带G等位基因的基因型在cLBD、pDLB以及AD中积累(cLBD中0.33，pDLB中0.17和AD中0.23相对于对照中0.04，分别为p＝0.023、p＝0.262和p＝0.105)。虽然携带G等位基因的基因型的积累不是疾病特异性的，但是这种积累似乎具有一定的重要性，因为对照中几乎没有携带G等位基因的基因型。与cLBD以及对照相比，对应于C4443T多态性的CC基因型在pDLB中以非常低的频率存在。相反，与AD相比，pDLB和cLBD中TC基因型的频率增加几乎两倍，并且显著高于在对照中的频率。

与对照中相比，在cLBD、pDLB和AD中携带8T等位基因的基因型的频率显示增加大约2倍，但是这些差异没有显著性(cLBD中0.25，pDLB中0.17和AD中0.19相对于对照中0.09；分别为p＝0.245、p＝0.591和p＝0.421)。

死后样本中基因型组合的分析

多聚T-77K变体KW基因型组合

既然对BChE基因型的独立分析没有显示疾病之间的重大差异，由两种多态性构成的所有基因型组合(GenComb)的分析显示KW/polyT-77基因型的同时出现，特别在DLB中的同时出现。该基因型组合在AD患者以及对照中不存在，然而其频率在cLBD组中为0.3(24个患者中6个是KW/77携带者)并且在pDLB组中为0.17(12个患者中2个是KW/77携带者)，这对于DLB构成0.25的共有频率(表4)。

对应分析

研究由四个启动子多态性和K变体多态性构成的GenComb的分布、频率和特异性的进一步分析。这些GenComb的对应分析显示了cLBD、AD和对照之间以及cLBD和AD之间的基于BChE的遗传差异。这些差异可以清楚地在四象限图中呈现(图1)。对照组位于第一和第二维负象限内，而cLBD位于第一维负象限和第二维正象限内，并且AD位于两个维度的正象限内。这些结果有力表明，三个组与BChE遗传学各自不相关，并且相应地与疾病特异性GenComb的存在不相关。

常见基因型组合

首次全面分析表明存在31种不同GenComb(表5)。由于它们当中大多数(64.5％)仅存在于一个或两个样本中，所以它们的频率非常低(0.01和0.02)。频率最高的GenComb(N°20)由所有多态性的纯合野生型基因型构成，占所有样本的17.6％并且在所有组中以相似频率存在。其它两个频率最高的GenComb(N°18和20)也是非特异性的，因为它们存在于所有四个组中。与AD和对照不同，两种类型的LB痴呆对于BChE遗传学而言是异质性最大的疾病(表5)。有趣的是，AD的特征在于比两种DLB和对照具有更多的疾病特异性GenComb(表5)。

疾病特异性基因型组合

当根据疾病进行分析时，可以检测到两个重要的疾病特异性GenComb。一方面，GenComb AAAATT77WW以0.29的相对高频率、仅存在于AD样本中。在AD样本中还发现相关的GenComb AAAATT77KK，预示着疾病特异性(表6)。多聚T-8T等位基因与K等位基因共分离的事实使得可以确立GenComb 9-11作为相关的并且将它们定义为共同GenComb AAAGCC8+K+。该GenComb是在cLBD中发现的频率最高(16.7％)的疾病特异性GenComb(表6)。三个无关的pDLB特异性GenComb(N°3，5和30)具有低频率0.08(它们中的每一个仅存在于一个患者中)。在对照中特别发现四个GenComb。虽然它们中的两个(N°14和15)是相关的，但是它们的频率没有超过0.1。

在具有临床诊断的样本中基因型组合的分析

为了证实通过对神经病理诊断的死后AD、DLB和对照样本进行研究所得到的数据，我们还研究了一组230名AD患者以及59名对照。AD患者已经于1998和2002之间被诊断。用于临床DLB诊断的最新指南已经于2005年建立，因此可以预期这些AD患者中10和25％之间的患者将是误诊的DLB患者。

多聚T-77K变体KW基因型组合

对变体K和多聚T基因型的同时出现的分析表明在AD组(0.19)和对照组(0.15)二者中KW/polyT-77基因型同时出现的频率相似(表7)。

然而，查阅了携带KW/77基因型的42名患者的临床病历，并且所有42名患者呈现与DLB诊断一致的症状。

虽然在患者和对照中基因型同时出现KW/77呈现相似的频率，但是其特征在于在遗传学上区分AD和DLB的特异性增加。当还考虑到AD患者组的20-40％是误诊DLB患者时，KW/77基因型的疾病特异性频率将增加至超过50％。

第二种DLB特异性BChE基因型组合的鉴定

由于BChE表达分析结果的缘故，在临床样本中再次分析所有基因型组合。发现组合基因型77KW的携带者在AD组和对照组中具有相似的频率。然而，GenComb AAAAC+77KW，存在于AD组的11名患者中(0.05的频率)和对照组的2个个体中(频率0.012)。查阅临床病历还表明，它们所有的症状与DLB一致。与GenComb AAAGCC8+K+相类似，考虑到AD组的20-40％实际上是DLB患者，AAAAC+77KW频率范围为12-25％。AAAAC+77KW的特异性将是98.7％并且灵敏性高达30％。

然后组合两种GenComb，对BChE基因型组合的测试可以高达60％的灵敏性和96.8％的特异性检测到DLB病例。

对应分析

由于仅通过两个组——AD组和对照组——来代表具有临床诊断的样本，所以对应分析结果以列联表获得(表8和表10)。考虑到在待分析的基因型组合内包括五个多态性，非常惊奇地是在由289个个体构成的该样本中仅发现25个不同的基因型组合(来自243个可能的基因型组合)(表8)。在神经病理诊断样本中还观察到64％的所有检测的基因型组合。

表8的常见基因型组合

五个频率最高的基因型组合是：频率为0.34的组合25(AD中0.34并且对照中0.35)，频率为0.16的组合19(AD中0.14并且对照中0.22)，频率为0.10的组合15(AD中0.11并且对照中0.08)，频率为0.10的组合16(AD中0.11并且对照中0.07)和最后的频率为0.08的组合21(AD中0.08并且对照中0.07；表8)。频率最高的基因型组合在神经病理样本和临床样本两者中相同。此外，其他两个基因型组合在两种样本中恰好都是频率最高的(表5和8)。

表8 的疾病特异性基因型组合

分析早期检测为DLB特异性和AD特异性的GenComb的分布，我们发现两者的低得多的表现。一方面，GenComb AAAATT77WW仅存在于2％的AD样本中，但是，另一方面，其也在3.3％的对照组中检测到。相关的GenCombAAAATT77KK仅在一个AD样本中发现(0.4％)(表9)。

GenComb 9-11与神经病理样本的GenComb相符，并且也被定义为共同GenComb AAAGCC8+K+。该GenComb在AD组中仅以0.06(6％)的频率出现(表9)。

考虑到AD患者于大约8年前临床诊断，远远早于用于DLB诊断的新指南的建立，查阅了携带GenComb AAAGCC8+K+的13名患者的临床病历。所有13名患者呈现与可能为或很可能为DLB一致的症状，证实了AAAGCC8+K+作为特异性DLB标记。

当进一步考虑到AD患者组中20-40％是误诊DLB患者时，AAAGCC8+K+的疾病特异性频率增加并且范围为15-28％。

表10的常见基因型组合

5个频率最高的基因型组合是：频率为0.33的组合29(AD中0.34并且对照中0.31)，频率为0.15的组合22(AD中0.14并且对照中0.16)，频率为0.12的组合18(AD中0.11并且对照中0.14)，频率为0.11的组合19(AD中0.11并且对照中0.12)和最后频率为0.07的组合25(AD中0.08并且对照中0.05；表10)。频率最高的基因型组合在神经病理样本和临床样本两者中是相同的。此外，其他两个基因型组合在所有样本中恰好是频率最高的(表5、8和10)。

疾病特异性基因型组合

分析早期检测为DLB特异性和AD特异性的GenComb的分布，我们发现对于两者低得多的表现。一方面，GenComb AAAATT77WW仅存在于2％的AD样本中，而另一方面，其也在3.1％的对照组中检测到。相关的GenCombAAAATT77KK仅在一个AD样本中被发现(0.4％)(表11)。

GenComb 9-12与神经病理样本的GenComb相符，并且也被定义为常见GenComb AAAGCC8+K+。该GenComb在AD组中以0.06(6％)的频率出现并且在对照中以0.01的频率出现(表11)。

BChE在DLB中依赖于基因型组合的表达

RNA分离和反转录

使用TRI-试剂(MRC，Cincinnati，美国)根据制造商的方案进行RNA分离。简言之，100mg组织样本在带有无菌活塞的1.5ml管中的1.0ml TRI-试剂中匀浆。将匀浆液于室温孵育5分钟，然后于4℃以12,000g离心10分钟将不溶材料和高分子量DNA沉淀。在相分离之后，用异丙醇沉淀RNA并重悬于适量体积的DEPC处理水中。通过分光光度法在A260下确定RNA的量，在260nm和280nm的光密度比确定RNA纯度。RNA完整性通过使用Agilent 2100Bioanalyzer(Agilent Technologies，Santa Clara，美国)确定。仅RIN值高于6的样本储存于-80℃下直至使用。

使用Ready-to-go^TM You-Prime First-Strand Beads(Amersham PharmaciaBiotech，Uppsala，瑞典)完成第一链cDNA合成。在1小时期间，2mg RNA与随机六聚物和First-Strand Beads于37℃孵育。所得到的cDNA或者立即用于PCR，或者于-20℃储存直至使用。

实时PCR

使用Rotor-Gene 6000(Corbett Life Science，Sydney，澳大利亚)确定BChEmRNA的相对表达。QuantiTect SYBR Green PCR试剂盒(QiaGen，Hilden，德国)用于使引物二聚体含量降到最低。15ml反应中还包含16pmol的每一引物(BChE 2U GAGTAGATCCATAGTGAAACGG，SEQ ID NO：22，和BChE 6LRNACAGCGATGGAATCCTGCTTT，SEQ ID NO：23)和1ml cDNA。为了研究相对的BChE数量，还分析了两个看家基因，β-肌动蛋白(引物：β-肌动蛋白U2TCTACAATGAGCTGCGTGTG，SEQ ID NO：24，和β-肌动蛋白L3TAGATGGGCACAGTGTGGGT，SEQ ID NO：25)和β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS；引物：GUS-U1 ATGTGGTTGGAGAGCTCATT，SEQ ID NO：26和GUS-L2TGTCTCTGCCGAGTGAAGAT，SEQ ID NO：27)(M.Barrachina等，“TaqManPCR assay in the control of RNA normalization in human post-mortem brain tissue(人死后脑组织中RNA标准化控制中的TaqMan PCR测定法)”，Neurochem Int2006，第49卷，第276-84页)。

在15分钟的变性步骤、接着对于所有的BChE、GUS和β-肌动蛋白在56℃退火30秒之后，在标准的72℃延伸过程中获得末端荧光数据。对于所有产物运行最后的解链分析以确定特异性扩增。通过ΔΔCt方法基于相似PCR效率的假设得到相对表达数据以分析相对基因表达(T.D.Schmittgen等，“Analyzingreal-time PCR data by the comparative C(T)method(通过比较C(T)方法分析实时PCR数据)”，Nat Protoc 2008，第3卷，第1101-8页)。因此，测试了每一基因和同种型的不同引物对以获得以相似效率扩增的长度在100和150碱基对之间的片段。由于PCR效率在每此运行中会变动，所以在每一运行而不是仅在最初运行中包含标准曲线。仅具有相似效率并且具有正确标准曲线(R＞0.99和R^2＞0.99)的运行才适宜进一步的分析。标准曲线通过扩增相同系列稀释的cDNA对照样本产生。所有测定独立开展两次以保证它们的再现性并最小化可能的误差，在每一运行中额外包括阴性对照。

结果

对BChE在脑中依赖于基因型组合存在的相对表达水平的分析表明，基因型组合77/KW携带者显示脑中BChE表达降低超过3倍；并且基因型组合AAAGCC8+K+携带者显示表达降低高于50％。这定义了DLB中的亚组，其很可能不响应采用胆碱酯酶和抑制剂、特别是丁酰胆碱酯酶抑制剂的治疗，因为BChE已经降低。

说明书中引用的参考文献

-I.G.McKeith，“Consensus guidelines for the clinical and pathologic diagnosisof dementia with Lewy bodies(DLB)：report of the Consortium on DLBInternational Workshop”，J.Alzheimer′s Dis.2006，第9卷，第417-23页

-F.Parmo-Folloni等，“Two new mutations of the human BCHE gene(IVS3-14T＞C and L574fsX576)”Chemico-Biological Interactions 2008，第175卷，第135-7页

-A.B.Singleton等，“Butyrylcholinesterase K：an association with dementiawith Lewy bodies”，Lancet 1998，第351卷，第1818页

-R.Lane等，“BuChE-K and APOE epsilon4 allele frequencies in Lewy bodydementias，and influence of genotype and hyperhomocysteinemia on cognitivedecline”，Mov.Disord.2009，第24卷，第392-400页

-W.Maetzler等，“No differences of butyrylcholinesterase protein activity andallele frequency in Lewy body diseases”Neurobiol.Dis.2009，第35卷，第296-301页

-M.Barrachina等，“TaqMan PCR assay in the control of RNA normalizationin human post-mortem brain tissue”，Neurochem Int 2006，第49卷，第276-84页

-T.D.Schmittgen等，“Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T)method”，Nat Protoc 2008，第3卷，第1101-8页。

Claims

1.用于在来自受试者的生物学样本中确定丁酰胆碱酯酶(BChE)基因中下列改变的基因型的试剂在制备用于诊断路易体痴呆的诊断剂中的用途：

NCBI登录号NG_009031中位置68974(即SEQ ID NO：28中的位置934)处的多态性位点；和

NCBI登录号NG_009031中位置4780至4786(即SEQ ID NO：1中的位置4780-4786)处的多聚胸腺嘧啶区。

2.用于在来自受试者的生物学样本中确定丁酰胆碱酯酶(BChE)基因中下列改变的基因型的试剂

NCBI登录号NG_009031中位置4780至4786(即SEQ ID NO：1中的位置4780-4786)处的多聚胸腺嘧啶区与用于确定BChE基因中下列改变的基因型的试剂

位置3687处的多态性位点，

位置4206处的多态性位点，和

位置4443处的多态性位点，所述位置参照NCBI登录号NG_009031(即分别为SEQ ID NO：1的位置3687、4206和4443)的组合在制备用于诊断路易体痴呆的诊断剂中的用途。

3.根据权利要求1的用途，其中基因型是：

对于两个等位基因，位置4780至4786处的7个胸腺嘧啶；和

位置68974处，对于一个等位基因是鸟嘌呤并且对于另一个等位基因是腺嘌呤；

该基因型指示路易体痴呆并与阿尔茨海默病相区别。

4.根据权利要求2的用途，其中基因型是：

对于一个等位基因，位置68974处是腺嘌呤；

对于一个等位基因，位置4780至4786处是8个胸腺嘧啶；

对于两个等位基因，位置3687处均是腺嘌呤；

位置4206处，对于一个等位基因是腺嘌呤并且对于另一个等位基因是鸟嘌呤；和

位置4443处，对于两个等位基因均是胞嘧啶；

该基因型指示路易体痴呆并与阿尔茨海默病相区别。

5.根据权利要求2的用途，其中基因型是：

位置68974处，对于一个等位基因是腺嘌呤并且对于另一个等位基因是鸟嘌呤；

对于两个等位基因，位置4780至4786处均是七个胸腺嘧啶；

对于两个等位基因，位置3687处均是腺嘌呤；

对于两个等位基因，位置4206处均是腺嘌呤；和

位置4443处，对于一个等位基因是胞嘧啶；

该基因型指示路易体痴呆并与阿尔茨海默病相区别。

6.根据权利要求1-5任一项的用途，其中基因型的确定通过选自由以下各项组成的群组的技术之一完成：引物特异性多重PCR然后检测、多重等位基因特异性引物延伸、基于微列阵的方法和动态等位基因特异性杂交。

7.根据权利要求6的用途，其中所述确定是通过引物特异性多重PCR扩增然后检测来完成的。

8.根据权利要求1-5任一项的用途，其中所述生物学样本是血液样本。

9.根据权利要求6的用途，其中所述生物学样本是血液样本。

10.根据权利要求7的用途，其中所述生物学样本是血液样本。

11.用于实施诊断路易体痴呆的体外方法的试剂盒，其包含用于在来自受试者的生物学样本中确定BChE基因中下列改变的基因型的试剂：NCBI登录号NG_009031中位置68974(即SEQ ID NO：28中的位置934)处的多态性位点；和NCBI登录号NG_009031中位置4780至4786(即SEQ ID NO：1中的位置4780-4786)处的多聚胸腺嘧啶区。

12.根据权利要求11的试剂盒，其进一步包含用于确定BChE基因中下列改变的基因型的试剂：位置3687处的多态性位点，位置4206处的多态性位点，和位置4443处的多态性位点，所述位置参照NCBI登录号NG_009031(即分别为SEQ ID NO：1的位置3687、4206和4443)。

13.根据权利要求11的试剂盒，其中所述基因型是：

对于两个等位基因，位置4780至4786处的7个胸腺嘧啶；和

该基因型指示路易体痴呆并与阿尔茨海默病相区别。

14.根据权利要求12的试剂盒，其中所述基因型是：

对于一个等位基因，位置68974处是腺嘌呤；

对于一个等位基因，位置4780至4786处是8个胸腺嘧啶；

对于两个等位基因，位置3687处均是腺嘌呤；

位置4443处，对于两个等位基因均是胞嘧啶；

该基因型指示路易体痴呆并与阿尔茨海默病相区别。

15.根据权利要求12的试剂盒，其中所述基因型是：位置68974处，对于一个等位基因是腺嘌呤并且对于另一个等位基因是鸟嘌呤；

对于两个等位基因，位置4780至4786处均是七个胸腺嘧啶；

对于两个等位基因，位置3687处均是腺嘌呤；

对于两个等位基因，位置4206处均是腺嘌呤；和

位置4443处，对于一个等位基因是胞嘧啶；

该基因型指示路易体痴呆并与阿尔茨海默病相区别。