KR101107570B1 - 제한효소 절편 질량다형성법을 이용한 윌슨병 원인 유전자 변이 검출방법 - Google Patents

제한효소 절편 질량다형성법을 이용한 윌슨병 원인 유전자 변이 검출방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 제한효소 절편 질량다형성법(RFMP)을 사용하여 한국인 윌슨병 환자 및/또는 보인자에서 가장 흔히 발견되는 3가지 변이, 즉 c.2333G>T (p.R778L), c.2621C>T (p.A874V) 및/또는 c.3809A>G (p.N1270S)를 확인하는 새로운 윌슨병 원인 유전자 변이 검출방법을 제공한다.
윌슨병, 제한효소 절편 질량 다형성법, ATP7B, 대립유전자, 열성, 구리 대사장애

Description

제한효소 절편 질량다형성법을 이용한 윌슨병 원인 유전자 변이 검출방법{Method for detecting the mutations of genes related to Wilson's disease using restriction fragments mass polymorphism}
본 발명은 한국인에서 흔한 윌슨병(Wilson's disease) 원인 유전자 변이를 제한효소 절편 질량 다형성법(restriction fragments mass polymorphism; RFMP)을 이용하여 검출하는 방법, 이에 사용되는 윌슨병 원인 유전자 변이 검출용 프라이머, 그리고 이러한 프라이머를 포함하는 윌슨병 원인 유전자 변이 검출용 키트에 관한 것이다.
구체적으로, 본 발명은 제한효소 절편 질량 다형성법을 사용하여 한국인 윌슨병 환자에서 가장 흔히 발견되는 3가지 유전자 변이를 대량으로 그리고 신속하면서도 정확하고 간편하게 분석하고, 윌슨병 환자 및/또는 보인자의 윌슨병 원인 유전자 변이를 검출에서 판독까지 자동화할 수 있는 윌슨병 원인 유전자 변이 검출방법 등에 관한 것이다.
윌슨병은 선천성 구리 대사장애로 인하여 음식물로부터 섭취된 구리가 사람의 체내에 축척됨으로써 간과 뇌 등의 장기에 손상을 주어 질병을 일으키는 상염색 체 열성 유전자 질환이다. 1912년 Kinnear Wilson에 밝혀져 간 병변이 동반된 진행성 신경증상이 가족성으로 발생한 것이 처음 기술되면서 병이 알려지기 시작했으며, 1993년에 관련 유전자가 밝혀짐에 따라 윌슨병의 유전적 임상적 양상에 대하여 재조명되고 있다.
윌슨병 원인 유전자는 염색체 13q14.3 부위에 위치한 ATP7B(ATPase, Cu++ transporting, beta polypeptide)를 엔코딩하는 유전자로서 이 유전자에 돌연변이가 생기면 구리운반 P-형 ATPase 단백질에 이상이 생겨 구리가 간에서 담도로 배출되지 못하고 축적되면서 구리이온에 의한 자유라디칼(free radical)의 발생으로 장기에 산화 손상(oxidative damage)을 준다.
구체적으로, 상기 유전자가 암호화하고 있는 단백질인 ATP7B는 간 세포 안으로 운반된 구리를 셀룰로플라즈민과 결합시켜 세포 밖으로 운반하거나 담도로 배출하는 등 구리를 운반하는 데 필요한 에너지를 생산하는 역할을 담당하며, 주로 신장과 간에서 발현된다. 그러나, 윌슨병 환자의 경우 염색체 13q14.3 부위에 위치한 ATP7B 유전자의 돌연변이에 의해 구리가 담즙으로 배설되지 못하고 간에 쌓이게 되며 축적 한계가 지나면 혈류로 흘러 나와 뇌, 각막, 신장 및 적혈구 등에 축적되어 간 손상, 뇌 손상, 눈의 각막에 반지모양의 구리 침착 및 신세뇨관 기능장애 등을 일으킨다. 따라서, 윌슨병의 징후는 황달 등의 간증상, 간질환, 운동장애 및 강직성 근긴장이상 등 대뇌 기저핵 구리 침착으로 인한 행동장애와 같은 신경증상 및 정신증상들, 각막 내 구리 침착으로 생기는 카이저-플라이셔 고리(Kayser-Fleischer ring; K-F고리), 그리고 세룰로플라즈민의 생화학적 검사상 이상소견 등 이다.
윌슨병은 한국인에서 흔한 상염색체 열성유전 방식의 질환 중 하나이다. 즉, 돌연변이가 한 개만 있으면 보인자가 되고, 두 개가 존재하면 환자가 되어 각종 증상이 발현된다. 윌슨병은 희귀병이나 국내에서 지난 10년간(2006년 9월 기준) 발생한 유전질환 중 가장 많이 발생한 질환이며 다른 나라와 비교해 높은 편에 속한다. 따라서, 점차 윌슨병 환자에 대한 조기 진단과 치료의 중요성이 강조되고 있다.
ATP7B 돌연변이의 종류는 전세계적으로 보고된 바가 많고 국가 및 종족 간에 차이가 있는데 인구 3만명~10만명당 한명의 유병률을 보이며 보인자율은 90명중 1명이다. 따라서, 한 명의 보인자가 보인자 여부를 알지 못하는 배우자와 결혼해서 윌슨병 아기를 가질 가능성은 360:1 (0.27%)이고, 보인자 부부가 결혼해서 윌슨병 아기를 가질 가능성은 4:1 (25%)이다. 그러나, 인구집단 내 보인자 비율이 25명 중 1명으로 높아질 경우 한 명의 보인자가 보인자 여부를 알지 못하는 배우자와 결혼해서 윌슨병 아기를 가질 가능성은 100:1 (1%)로 높아진다.
특히 한국인에서는 c.2333G>T (p.R778L), c.2621C>T (p.A874V) 및 c.3809A>G (p.N1270S)의 3가지가 전체 돌연변이 대립유전자의 54.2%를 차지하는 것으로 알려져 있다. 이 중 c.2333G>T (p.R778L) 돌연변이는 18세 이하 아시아 지역 윌슨병 환자 염색체의 57%에서 발견되는 흔한 돌연변이로 대립유전자 빈도를 보면 우리나라 41%를 비롯하여 중국 30%, 대만 30~45%, 일본 12%로 발표된 바가 있다. ATP7B의 윌슨병 관련 대립유전자 한 쌍 중 하나만 돌연변이인 경우는 보인자가 되고 한 쌍(두개)이 모두 돌연변이인 경우는 환자가 되어 여러 증상을 보이게 된다.
윌슨병의 진단은 임상, 생화학 및 분자유전학 검사로 할 수 있으며, 혈청 세룰로플라즈민 감소, 소변 구리 배출 증가, 간 조직 내 구리 함량 증가 그리고 K-F고리 등 4가지 소견 중 2가지 이상 양성이면 윌슨병의 확진 가능성이 매우 높다.
이와 관련하여 대한민국 등록특허공보 제10-0459644호는 완전 셀룰로플라즈민(holoceruloplasmin)의 농도를 측정하는 방법에 관한 것으로서, 완전 셀룰로플라즈민 특이적 폴리클로날 항체(polyclonal antibody)와 완전 셀룰로플라즈민 특이적 모노클로날 항체(monoclonal antibody)를 사용하여 완전 셀룰로플라즈민의 농도를 측정하여 윌슨병을 진단하는 키트와 진단 시약에 대해 개시하고 있다. 그러나, 이러한 셀룰로플라즈민의 농도 측정을 통한 생화학적 윌슨병 진단 방법은 보인자의 경우에 양성여부를 판별하기 어렵고, 생화학 소견이 아직 충분히 나타나지 않은 윌슨병 초기의 어린 연령의 환자에 대한 정확한 조기 진단이 어려운 문제가 있다.
따라서, 현재 윌슨병에서 유전자 진단은 임상 진단이 불명확한 사례들에서 가장 특이도가 높고 예민한 진단방법이 되었다. 즉, 유전자 돌연변이 분석에 의한 환자의 진단은 생화학, 임상양상이 비전형적이거나 생화학 소견이 아직 충분히 나타나지 않은 윌슨병 초기의 어린 연령 또는 간이식을 받은 전격간염에서 매우 유용하다.
이와 관련하여 현재 윌슨병의 유전자 진단법으로 알려진 방법으로는 직접염기서열 분석법과 PCR-SSCP법 정도가 알려져 있다. PCR-SSCP법(Orita, M. et.al, Genomics, 1989, 5:8874-8879)은 PCR로 분석하고자 하는 염기를 포함하는 서열을 증폭한 후, DNA 가닥을 변성시켜 단일 가닥으로 분리시킨 다음, 폴리아크릴아마이 드 젤에서 전기영동을 수행한다. 1개의 염기 차이에 의하여 DNA 가닥의 2차 구조가 달라지므로 이 차이에 기인한 전기영동 이동속도 차이에 따라 염기변이 여부를 조사한다. 그러나 이 방법은 폴리아크릴아마이드 젤을 사용하여 많은 양의 샘플을 분석하기에 불편하며 때로 영동 후 밴드의 구별이 쉽지 않을 수 있다.
또한, 직접염기서열 분석법은 한 번의 반응으로 광범위한 서열분석 또는 변이의 스크리닝에 효과적이나, 특정위치의 유전변이 여부만을 조사하는 경우에는 비효율적이다. 굳이 조사하지 않아도 되는 주변의 염기서열을 동시에 제공함으로써 조사대상이 되는 변이만을 해석하는데 오히려 불필요한 노력을 소모하게 하고, 어떤 서열의 경우에는 해당 부위의 물리화학적 성격에 따라 정확한 염기서열 정보를 얻어낼 수 없는 경우가 발생하며, 유사한 서열이 여러 위치에 존재하는 경우나 원하는 위치가 아닌 다른 위치의 정보를 제공하는 경우가 발생할 수 있다. 또한, 대용량으로 시행하기 어렵고 시간이 많이 소비되는 근원적인 문제점이 있다.
한편, 윌슨병 원인유전자를 조기 진단하기 위한 DNA 칩도 개발된 바가 있다. 즉, 대한민국 등록특허공보 제10-0420785호는 윌슨병 환자에게서 나타나는 아미노산 변이를 지정하는 유전자 코돈을 프로브로 제작하여 윌슨병을 진단할 수 있는 DNA 칩에 대해 개시하고 있다. 그러나, DNA칩을 이용한 진단방법은 올리고뉴클레오타이드 프로브가 원하는 위치에 결합하지 못해서 발생하는 오류를 피할 수 없는데, 예를 들어 올리고뉴클레오타이드 프로브가 윌슨병 원인 유전자에 돌연변이가 발생하지 않은 경우에도 검체 유전자와 결합하여 윌슨병 위험군으로 진단할 수 있는 문제, 즉 민감도 문제로 여러 차례 재검을 해야 하는 문제점이 있다.
결국, 윌슨병의 가장 정확한 진단법은 ATP7B(ATPase, Cu++ transporting, beta polypeptide) 유전자 검사이며 두 개의 돌연변이 대립유전자를 확인하는 것임에도 불구하고 기존의 돌연변이 확인 검사법은 진단의 정확도 문제 및 오류 문제가 있거나, 검사에 많은 시간이 소요되고 대량으로 시행하기 어려운 단점이 있었다.
따라서, 본 발명이 속하는 기술분야에서는 종래의 윌슨병 유전자 분석법에 비해 대량으로 그리고 신속하면서도 간편하게 분석 검사를 시행하는데 적합하며, 검사에서부터 판독까지 자동화할 수 있는 장점을 가진 유전자 분석법의 개발이 요구되고 있다고 할 수 있다.
한편, 본 발명자들은 생명체의 유전자 변이를 정확하게 그리고 효율적으로 분석할 수 있는 유전자 변이 검출방법들을 개발한 바가 있다. 이러한 유전자 변이 검출방법들의 예가 대한민국 등록특허 제10-0477766호와 제10-0642829호에 개시되어 있다. 이러한 유전자 변이 검출방법들은 C형 간염바이러스의 유전자형을 조사하고 인간의 MTHFR 유전자의 염기서열 변이를 검출하기 위해 이용되는 제한효소 절편 질량다형성법(RFMP)에 대해 기술하고 있다. 본 발명자들이 개발한 이들 기술들은 우수한 기술임에 틀림없으나, 그럼에도 다른 우수한 기술과 마찬가지로 끊임없는 개선이 이루어질 수 있는 것이다.
이에 본 발명자들은 제한효소 절편 질량다형성법(RFMP)을 이용하여 윌슨병(Wilson's disease) 원인 유전자 변이를 검출하는 방법, 이에 사용되는 윌슨병 원인 유전자 변이 검출용 프라이머, 그리고 이러한 프라이머를 포함하는 윌슨병 원인 유전자 변이 검출용 키트 등을 고안하기에 이르렀다.
본 발명은 윌슨병 환자 및/또는 보인자를 규명하기 위해 ATP7B 유전자 변이 대립유전자를 빠르고, 간편하고, 정확한 방법으로 대량으로 분석할 수 있는 윌슨병 원인 유전자 변이 검출방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
구체적으로, 본 발명은 한국인에서 가장 흔한 상염색체 열성 유전질환인 윌슨병 환자의 진단, 보인자 진단 및 인구집단 선별검사에 적합한 새로운 윌슨병 원인 유전자 변이 검출방법으로서, 제한효소 절편 질량 다형성법(RFMP)을 이용하여 윌슨병 원인 유전자 변이를 대량으로 그리고 신속하면서도 정확하고 간편하게 검출하는 방법, 이에 사용되는 윌슨병 원인 유전자 변이 검출용 프라이머, 그리고 이러한 프라이머를 포함하는 윌슨병 원인 유전자 변이 검출용 키트를 제공하는데 그 목적이 있다.
본 발명은 제한효소 절편 질량다형성법(RFMP)을 사용하여 한국인 윌슨병 환자 및/또는 보인자에서 가장 흔히 발견되는 3가지 변이, 즉 c.2333G>T (p.R778L), c.2621C>T (p.A874V) 및/또는 c.3809A>G (p.N1270S)를 확인하는 새로운 윌슨병 원인 유전자 변이 검출방법을 제공한다.
본 발명의 명세서에서 사용되는 "제한효소 절편 질량 다형성법(RFMP)"이란 ATP7B 유전자를 중합효소연쇄반응을 통해 증폭시킨 후에 변이가 위치한 염기서열 부위를 인식하는 제한효소를 이용하여 절단을 하면 염기의 변이 유무에 따라 절단 된 유전자 절편의 질량이 달라지게 되는데, 이러한 절단된 유전자 절편의 질량 차이를 측정하는 방식을 의미한다.
본 발명의 윌슨병 원인 유전자 변이 검출방법을 간략히 설명하면, 본 발명은 한국인에서 가장 많이 발생하는 윌슨병 관련 유전자 변이를 제한효소 절편 질량다형성법(RFMP)을 이용하여 검사 대상자의 ATP7B 유전자 변이를 간편하고 빠르게 조사하면서, 정확하고 효율적으로 분석하되, 제한된 범위 이내, 예를 들어 32개 염기 범위 이내로 인접한 여러 개의 염기변이를 개별적으로 분석하지 않고 동시에 조사할 뿐 아니라 결실 또는 삽입에 의한 유전변이도 검측할 수 있다. 특별히, 한 생명체 내에 여러 유전형이 동시에 존재하는 경우, 서로 다른 위치의 염기 변이가 한 유전형에 동시에 존재하는지, 아니면 서로 다른 유전형에 혼재되어 존재하는지를 구별할 수 있다. 예를 들어, 인간은 동일한 유전정보를 담고 있는 염색체가 2개(1쌍)씩 존재하고 있어, 유전변이가 일어나는 경우 2개의 염색체에 모두 변이가 있을 수도 있지만(호모), 하나의 염색체에만 변이가 일어날 수도 있다(헤테로).
이와 관련하여 한국인 윌슨병 환자에서 가장 많이 나타나는 c.2333G>T (p.R778L)를 예로 들면 13번 염색체의 두 개 모두에서 변이가 있다면 c.2333T(p.R778L)를 가지고 있는 호모 돌연변이를 가진 경우이며, 하나는 c.2333G(p.778R)로 야생형이고 나머지 하나가 c.2333T(p.778L)의 변이를 가지고 있는 경우라면 헤테로로서 보인자이다.
본 발명의 윌슨병 원인 유전자 변이 검출방법은 윌슨병 유전변이를 분석하기 위하여, 증폭된 생성물이 제한효소로 절단될 수 있는 부위를 포함하도록 원하는 염 기서열(ATP7B 유전자의 변이위치 염기를 포함하는 염기서열)을 증폭하되, 제한효소에 의해 절단된 후의 절편의 염기의 수가 제한된 범위 이내, 예를 들어 32개 이하가 되도록 하고 그 중 적어도 1개의 염기는 프라이머가 아닌 주형(template)의 복제에 의해 생성되도록 하며, 증폭된 생성물을 제한효소로 절단한 후, 각 절편의 분자량을 측정함으로써 ATP7B 유전자의 변이를 분석하는 방법을 제공한다.
즉, 본 발명의 윌슨병 원인 유전자 변이 검출방법은 포워드 프라이머 및 리버스 프라이머를 이용하여 ATP7B 유전자의 변이위치 염기를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 증폭하는 단계; 상기 증폭된 폴리뉴클레오타이드를 제한효소로 절단하여 절단된 후의 절편의 염기의 수가 제한된 범위 이내이면서 변이위치 염기를 포함하는 2가지 이상의 단일 가닥의 폴리뉴클레오타이드 절편을 생성하는 단계; 및 상기 절단된 절편의 분자량을 측정하는 단계를 포함하는 ATP7B 유전자의 변이 분석방법을 제공한다. 바람직하게는, 본 발명의 윌슨병 원인 유전자 변이 검출방법은 c.2333G>T (p.R778L), c.2621C>T (p.A874V) 및 c.3809A>G (p.N1270S)로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 ATP7B 유전자의 변이를 분석하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 윌슨병 원인 유전자 변이 검출방법은 ATP7B 유전자의 변이를 분석하기 위하여 그 생성물이 제한효소로 절단될 수 있는 부위를 포함하도록 원하는 염기서열을 증폭하되 아래의 그림과 같은 구조의 단편을 만드는 방법을 제공한다.
5'- 프라이머
결합서열1		 제한효소
인지서열		 프라이머
결합서열2		 변이전서열 변이서열 변이후서열 프라이머
결합서열3		 - 3'
상기 구조의 단편에서 '제한효소인지서열'은 서로 다른 제한효소에 의해 동시에 또는 인접하여 인지되는 서열로서 절단되는 서열과 일치하지 않을 수 있다. 제한효소 FokI과 BtsCI은 모두 GGATG 서열을 인지하나 절단되는 위치는 인지서열의 3'말단으로부터 각각 9번째/13번째와 2번째/0번째 염기의 다음이다. 제한효소인지서열을 인지하는 본 발명에서 사용될 수 있는 두 제한효소는 본 발명의 목적에 사용될 수 있는 모든 제한 효소 즉 서로 같은 최적온도 또는 서로 다른 최적 온도를 갖는 제한 효소가 가능하며, 그 중에서도 서로 다른 최적온도를 가지고 있는 것이 더욱 바람직하다. 상대적으로 낮은 최적온도를 갖는 제한효소로, FokI, BbvI, BsgI, BcgI, BpmI, BseRI, MmelI, AvaII 또는 BaeI이 바람직하며, 상대적으로 높은 최적온도를 갖는 제한효소로 BtsCI, BstF5I, TaqI, BsaBI, BtrI, BstAPI, FauI, BclI, PciI, 또는 ApoI이 바람직하고, FokI 및 BtsCI 쌍이 가장 바람직하다.
제한효소 Bae I는 25℃, FokI, BbvI, BsgI, BcgI, BpmI, BseRI, MmelI 및 AvaII는 37℃의 상대적으로 낮은 최적온도를 갖고, BstF5I 및 TaqI는 65℃, BsaBI, BtrI 및 BstAPI는 60℃, FauI는 55℃, BtsCI, BclI, PciI 및 ApoI는 50℃의 상대적으로 높은 최적온도를 갖는다.
PCR 증폭에 사용하는 두 프라이머 중 하나는 프라이머결합서열1, 제한효소인지서열 그리고 프라이머결합서열2로 이루어져 있으며, 나머지 하나는 프라이머결합서열3으로 이루어져 있다.
상기 구조의 단편에서 '프라이머결합서열'은 주형이 되는 핵산과 상보적으로 결합할 수 있는 서열이지만, 제한효소인지서열은 핵산과 상보적이지 않을 수 있다. 프라이머결합서열1, 2 그리고 3은 프라이머가 주형(template) DNA와 결합하기 위해서는 적어도 4개 이상이어야 하므로 그 염기의 수가 4개 이상이어야 하며, 8∼30개의 크기에서 주형(template) DNA와 가장 잘 결합하였기 때문에 8개 이상 30개 이하인 것이 바람직하다. '변이전서열'은 조사하고자 하는 염기변이의 5'쪽의 서열이다. '변이서열'은 조사하고자 하는 염기의 변이, 즉 ATP7B 유전자의 염기 변이에 해당하는 서열이다. 염기의 치환, 삽입, 결실이 일어날 수 있는데, 염기의 수는 1개인 것이 보통이나 2개 이상인 경우도 있다. '변이후서열'은 변이서열의 3'쪽의 서열이다.
본 발명의 방법의 일실시예에서는 '변이전서열'과 '변이후서열'을 합하여 1개 이상인 것이 바람직하다. 제한효소 절단 후 생성되는 절편은 변이서열을 포함하고 있어야 하고, 절편의 염기의 수는 2∼32 개인 것이 바람직하다. 더욱 바람직하게는 절편의 염기의 수가 6개 내지 16개이고, 더더욱 바람직하게는 12개의 염기를 가지는 것이 좋다. 절단된 절편의 크기를 수치한정한 이유는 매스 스펙트로메트리로 분석할 때, 분석 결과가 양호한 절편의 사이즈를 반영한 것이다. 32개를 초과하는 크기를 갖는 절편은 매스 스펙트로메트리를 이용하여 분자량을 계산함으로써 염기변이를 조사하기에는 너무 크므로 상기와 같은 절편의 염기수가 바람직하다. 또한, 1개의 염기만으로 이루어진 절편인 경우에는 변이서열만을 포함하고 있는 것이므로 프라이머가 잘못된 위치에 결합한 것인지를 확인하기 어렵게 하므로 바람직하지 않다.
또한, 본 발명의 방법의 바람직한 일실시예에서는 두 제한효소가 동일한 또 는 인접한 부위를 인지하므로 두 제한효소 중 어느 하나의 반응이 진행되는 동안에 다른 또 하나의 제한효소는 작용하지 않는 것이 바람직하다. 바람직한 예로서, 제한효소 FokI은 37℃가 최적온도이며, BtsCI는 50℃가 최적온도이나 37℃에서는 50%의 활성도를 가지는 특성을 이용하여 FokI이 먼저 작용하고 BtsCI가 뒤를 이어 작용함으로써 같은 서열을 인지하는 제한효소의 인지서열이나 절단위치를 손괴하지 않게 된다. 즉, 먼저 사용하는 제한효소에 의한 절단이 변이서열을 포함하는 절편에 존재하는 두 번째 제한효소의 인지서열이나 절단위치를 제거하거나 손괴하여서는 아니된다는 조건을 만족시키게 된다.
한편, 프라이머가 주형 DNA(Template DNA)와 결합하기 위해서는, 프라이머 결합서열의 염기 수가 적어도 4개 이상이어야 하며, 8개 이상 30개 이하인 것이 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다. "변이전서열"은 조사하고자 하는 변이서열의 5'쪽 서열로서 염기 수는 0개 내지 31개이어야 한다. "변이서열"은 조사하고자 하는 ATP7B 유전자의 변이된 염기가 포함된 서열로서 주형에서 유래하며, 염기의 치환, 삽입, 결실 등이 일어난 서열이고, 변이염기의 수는 1개인 것이 보통이나 2개 이상인 경우도 있다. "변이후서열"은 조사하고자 하는 변이서열의 3'쪽의 서열로서 염기의 수는 0개 내지 31개이어야 한다.
본 발명의 방법의 바람직한 일실시예에 있어서, 제한효소 절단 후 생성되는 절편은 변이서열을 포함하고 있어야 하고, 상기 절편의 염기의 수는 2개 내지 32개인 것이 바람직하며, 6개 내지 16개인 것이 보다 바람직하고, 12개인 것이 보다 더 바람직하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이는 매스 스펙트로메트리로 분석할 때, 분석 결과가 양호한 절편의 사이즈를 반영한 것이다. 상기 절편이 1개의 염기만으로 이루어진 경우에는 변이서열만을 포함하고 있는 것이므로, 프라이머가 잘못된 위치에 결합한 것인지를 확인하기 어려우므로 바람직하지 않다.
또한, 본 발명의 윌슨병 원인 유전자 변이 검출용 프라이머는 ATP7B 유전자의 변이위치 염기를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 주형을 증폭하기 위한 프라이머로서, 서열번호 2, 7 및 12로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 프라이머와, 서열번호 3, 8 및 13으로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 프라이머를 포함한다.
본 발명의 프라이머의 일실시예는 c.2333G>T (p.R778L), c.2621C>T (p.A874V) 및 c.3809A>G (p.N1270S)로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 ATP7B 유전자의 변이를 포함하는 주형을 증폭하기 위한 것임을 특징으로 한다.
본 발명의 프라이머의 일실시예는 프라이머결합서열1, 제한효소인지서열 및 프라이머결합서열2를 포함할 수 있다.
본 발명의 윌슨병 원인 유전자 변이 검출용 키트는 서열번호 2, 7 및 12로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 프라이머와, 서열번호 3, 8 및 13으로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 프라이머와, 상기 프라이머들에 의해 증폭되고 ATP7B 유전자의 변이위치 염기를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 주형과, DNA 중합효소와, dNTPs와, 완충용액을 포함하고, 상기 프라이머들에 의해 증폭된 폴리뉴클레오타이드 단편은 상기 ATP7B 유전자의 변이위치 염기, 프라이머결합서열1, 제한효소인지서열 및 프라이머결합서열2를 포함하며, 상기 제한효소인지서열을 인지하는 적어도 2개의 제한효소에 의해 절단된 폴리뉴클레오타이드 절편은 염기의 수가 제한된 범 위 이내이면서 상기 ATP7B 유전자의 변이위치 염기를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 키트의 일실시예에서는 c.2333G>T (p.R778L), c.2621C>T (p.A874V) 및 c.3809A>G (p.N1270S)로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 ATP7B 유전자의 변이를 분석하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 키트의 바람직한 일실시예에서는 증폭된 폴리뉴클레오타이드 단편을 2개의 제한효소들이 절단하되, 제1의 제한효소 반응이 진행되는 동안 제2의 제한효소의 반응이 진행되지 않도록 한 후 제2의 제한효소가 반응하도록 하여 상기 증폭된 폴리뉴클레오타이드 단편을 절단하는 것을 특징으로 한다. 상기 증폭된 폴리뉴클레오타이드 단편을 2개의 제한효소들이 절단하는 단계는 서로 다른 최적온도를 갖는 2개의 제한효소들을 이용하여 수행될 수 있다.
본 발명의 키트의 더욱 바람직한 일실시예에서 상기 2개의 제한효소들은 FokI, BbvI, BsgI, BcgI, BpmI, BseRI, MmelI, AvaII 및 BaeI으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 낮은 최적온도를 갖는 제한효소와, BtsCI, BstF5I, TaqI, BsaBI, BtrI, BstAPI, FauI, BclI, PciI 및 ApoI으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 높은 최적온도를 갖는 제한효소일 수 있다.
본 발명에 따르면, ATP7B 유전자 변이 대립유전자를 빠르고, 간편하고, 정확한 방법으로 대량으로 분석하여 윌슨병 환자 및/또는 보인자를 효과적으로 판정할 수 있다. 따라서, 본 발명은 한국인에서 가장 흔한 상염색체 열성 유전질환인 윌슨 병 환자의 진단, 보인자 진단 및 인구집단 선별검사에 적합한 장점이 있다.
나아가, 본 발명은 대규모 인구집단을 대상으로 한국인에서 흔한 ATP7B 유전자 변이 여부를 확인하여 윌슨병 환자 및/또는 보인자 여부를 알 수 있어 윌슨병의 조기진단, 치료 및 유전 상담 등에 이용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 기초하여 보다 상세히 기술한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아님은 물론이다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. 본 발명에 인용된 참고문헌은 본 발명에 참고로서 통합된다.
실시예
하기 실시예들은 인간의 혈액으로부터 분리한 DNA를 대상으로 수행하였으며 참조할 ATP7B 유전자 염기서열은 GenBank accession number는 NM_000053이다.
실시예 1. 인간의 ATP7B 유전자의 c.2333G>T (p.R778L) 염기 변이 분석
1. PCR 증폭
분석대상이 되는 ATP7B의 주형 DNA의 서열(5'→3')은 하기와 같다.
ACATTCTTCGACACGCCCCCCATGCTCTTTGTGTTCATTGCCCTGGGCCg GTGGCTGGAACACTTGGCAAA GAGCAAAACCTCAGAAGCCCTGGCTAAACTCATGTCTCTCCAAGCCACAGAAGCCACCGTTGTGACCCTTGGTGAGGACAATT (서열번호 1)
밑줄친 서열들은 아래의 프라이머 1과 프라이머 2가 결합하는 부위들이다. 소문자로 표기된 염기는 '변이서열'이다.
프라이머 1. 5'- CCCATGCTCTTTGTGTTCATTG - 3' (22mer) (서열번호 2)
프라이머 2. 5'- GTTTTGCTCTTTGCCAAGTGTggatgCCAGCCAC - 3' (34mer) (서열번호 3)
상기 프라이머 1과 프라이머 2는 각각 포워드 프라이머와 리버스 프라이머이다. 소문자로 표기된 서열은 FokI 및 BtsCI의 인지서열이다.
PCR 버퍼(PCR buffer)(1x), MgSO4 2 mM, dNTP 200 mM, 플레티넘 Taq 폴리머라아제(Platinum Taq Polymerase)(Invitrogen, 10966-026) 0.5U, 프라이머 1과 프라이머 2를 각각 0.5 μM, 지놈 DNA(genomic DNA) 100 ng을 넣고, 총 반응부피를 25 ㎕로 맞춘다. 그리고 다음의 조건으로 PCR 반응을 수행한다.
94℃ 5분,
94℃ 15초 55℃ 15초 72℃ 15초 (35 cycles),
72℃ 5분
DNA는 혈액으로부터 추출하며 통상적인 방법에 따라 순수 분리한다. 예를 들어, 'SDS/단백질분해효소K'방법(Maniatis, Molecular Cloning, A laboratory Manual, Cold Spring Harber Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1989) 또는 QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen 51106)을 사용하여 혈액으로부터 DNA를 분리할 수 있다. DNA의 농도가 낮은 경우 하기와 같은 방법으로 DNA를 농축하여 사용할 수 있다. DNA 용액에 1/10 부피의 3M 소듐 아세테이트(pH 5.3)와 2.5 부피의 에탄올을 넣고 부드럽게 섞은 후, -20℃에서 1시간 이상 동안 방치한다. 이후 4℃, 13000 rpm에서 15분 동안 원심분리한다. 상층액을 조심스럽게 제거하고 70% 에탄올을 넣은 후, 4℃, 13000 rpm에서 10분 동안 원심분리한다. 에탄올을 건조시킨 후, 원하는 부피의 증류수를 넣어 녹인다.
PCR을 통해 생성되는 단편의 서열은 다음과 같다(5'→3').
프라이머 1과 프라이머 2가 상기 주형을 대상으로 증폭한 생성물은,
CCCATGCTCTTTGTGTTCATTGCCCTGGGCC[ G/T ]GTGGCTGGcatccACACTTGGCAAAGAGCAAAAC
(서열번호 4) 및
GGGTACGAGAAACACAAGTAACGGGACCCGG[ C/A ]CACCGACCgtaggTGTGAACCGTTTCTCGTTTTG
(서열번호 5)이다.
상기 PCR을 통해 생성된 서열에서 소문자로 표시된 부위는 제한효소 인지서열이고, 밑줄 친 부위는 제한효소에 의한 절단에 의해 생성되는 절편의 서열이며, 대괄호로([]) 표기된 부위는 "변이서열"이다.
2. 제한효소에 의한 절단, 정제 및 탈염
상기 PCR을 통해 증폭된 생성물에 FokI(NEB R109) 1U, BtsCI(NEB R0647) 1U, 50 mM 포타슘 아세테이트, 20 mM 트리스-아세테이트(Tris-acetate), 10 mM 마그네슘 아세테이트, 및 1 mM DTT(25℃에서 PH 7.9)를 넣고, 37℃에서 1시간 동안 반응시킨다.
제한효소로 처리한 상기 용액으로부터 절단된 DNA절편을 순수분리한 후, 분리된 DNA절편의 분자량을 측정하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 제한효소에 의해 절단된 DNA절편의 순수 분리를 위해 Oasis (Waters) C18 이온 수지 교환 컬럼(C18 reverse phase column chromatography)을 이용할 수 있다. 먼저, 상기 제한효소로 처리한 용액에 0.15M 트리에틸암모늄아세테이트(TEAA, pH 7.6) 70 ㎕를 넣어 1분간 둔다. 컬럼에 100% 아세토니트릴(ACN; Sigma, USA)과 0.1M TEAA 1 ㎖를 통과시켜 레진(Resin)을 활성화시킨 후, 상기 제한효소로 처리한 용액과 0.15M TEAA와의 혼합액 100 ㎕, 0.1M TEAA 2 ㎖ 및 3차 증류수 1 ㎖를 차례로 완전히 통과시킨다. 수집 플레이트(Collection Plate) 위에 상기 컬럼을 위치시키고, 70% ACN 100 ㎕을 넣어 통과시킨다. 용출액이 수집 플레이트에 모아지면, 상기 수집 플레이트를 120℃에서 60분간 건조시킨다.
3. 말디-토프 매스 스펙트로메트리(MALDI-TOF Mass Spectrometry)
말디 매트릭스(MALDI matrix)[22.8 ㎎ 암모늄 시트레이트, 148.5 ㎎ 히드록시피콜린산(hydroxypicolinic acid), 1.12 ㎖ 아세토니트릴, 7.8 ㎖ H2O] 4 ㎕를 말 디-토프 매스 스펙트로메트리(Biflex IV, Bruker)의 앵커 칩 플레이트(Anchor chip plate)에 미리 점적(dotting)한 후, 37℃에서 30분 동안 건조시킨다. 정제 및 탈염 과정을 거친 수집 플레이트의 샘플에 3차 증류수를 10 ㎕을 넣어 녹여낸 후, 건조된 말디 매트릭스 위에 2 ㎕ 점적하고, 말디 매트릭스를 다시 37℃에서 30분 동안 건조시킨 후, 말디-토프 매스 스펙트로메트리로 분석한다. 분석방법은 말디-토프 매스 스펙트로메트리의 매뉴얼을 따른다.
인간의 ATP7B 유전자의 c.2333G>T (p.R778L) 염기가 정상인 경우(G/G), 제한효소에 의한 절단 후 생성되는 절편의 분자량은 2130.4D(7mer)과 4127.6D(13mer)이다(도 1의 (a) 참조). 헤테로인 경우(G/T), 생성되는 절편의 분자량은 2130.4D, 2154.4D(7mer)와 4127.6D, 4102.6D(13mer)이다(도 1의 (b) 참조). 만약 모두 T로 변이된 경우(T/T), 절편의 분자량은 2154.4 D(7mer)와 4102.6D(13mer)이다.
실시예 2. 인간의 ATP7B 유전자의 c.2621C>T (p.A874V) 염기 변이 분석
1. PCR 증폭
분석대상이 되는 ATP7B의 주형 DNA의 서열(5'→3')은 하기와 같다.
ATGCCAGTCACTAAGAAACCCGGAAGCACTGTAATTG cGGGGTCTATAAATGCACATGGCTCTGTGCTCATTAAAGCTACCCACGTGGGCAATGACACCACTTTGGCTCAGATTGTGAAACTGGTGGAAGAGGCTCAGATGTCAAAGGCACCCATTCA (서열번호 6)
밑줄친 서열들은 아래의 프라이머 3과 프라이머4가 결합하는 부위들이다. 소문자로 표기된 염기는 '변이서열'이다.
프라이머 3. 5'- TCACTAAGAAACCCGGAAGCAggatgTGTAATTG - 3' (34mer) (서열번호 7)
프라이머 4. 5'- GCACAGAGCCATGTGCATTTATAG - 3' (24mer) (서열번호 8)
상기 프라이머 3과 프라이머4는 각각 포워드 프라이머와 리버스 프라이머이다. 소문자로 표기된 서열은 FokI 및 BtsCI의 인지서열이다. PCR은 실시예 1과 동일한 방법으로 진행하였다.
PCR을 통해 생성되는 단편의 서열은 다음과 같다(5'→3').
프라이머 3과 프라이머4가 상기 주형을 대상으로 증폭한 생성물은,
TCACTAAGAAACCCGGAAGCAggatgTGTAATTG[ C/T ]GGGGTCTATAAATGCACATGGCTCTGTGC (서열번호 9) 및
AGTGATTCTTTGGGCCTTCGTcctacACATTAAC[ G/A ]CCCCAGATATTTACGTGTACCGAGACACG (서열번호 10)이다.
상기 PCR을 통해 생성된 서열에서 소문자로 표시된 부위는 제한효소 인지서열이고, 밑줄 친 부위는 제한효소에 의한 절단에 의해 생성되는 절편의 서열이며, 대괄호로([]) 표기된 부위는 "변이서열"이다.
2. 제한효소에 의한 절단, 정제 및 탈염
실시예 1과 동일한 방법으로 수행하였다.
3. 말디-토프 매스 스펙트로메트리(MALDI-TOF Mass Spectrometry)
실시예 1과 동일한 방법으로 수행하였으며, 그 결과는 아래와 같다.
인간의 ATP7B 유전자의 c.2621C>T (p.A874V) 염기가 정상인 경우(C/C), 제한효소에 의한 절단 후 생성되는 절편의 분자량은 2175.4D(7mer)와 3943.6 D(13mer)이다(도 2의 (a) 참조). 헤테로인 경우(C/T), 생성되는 절편의 분자량은 2175.4D, 2190.4 D(7mer)와 3943.6D, 3927.6D(13mer)이다(도 2의 (b) 참조). 만약 모두 T로 변이된 경우(T/T), 절편의 분자량은 2190.4D(7mer)와 3927.6D(13mer)이다.
실시예 3. 인간의 ATP7B 유전자의 c.3809A>G (p.N1270S) 염기 변이 분석
1. PCR 증폭
분석대상이 되는 ATP7B의 주형 DNA의 서열(5'→3')은 하기와 같다.
TCCAGAATAAAGGGAAGAAAGTCGCCATGGTGGGGGATGGGGTCA aTGACTCCCCGGCCTTGGCCCAGGCAGACATGGGTGTGGCCATTGGCACCGGCACGGATGTGGCCATCGAGGCAGCCGACGTCGTCCTTATCAGAAATGATTTGCTGGATGTGGTGGCTAGCATTCACCTTTCCA (서열번호 11)
밑줄친 서열들은 아래의 프라이머 5와 프라이머 6이 결합하는 부위들이다. 소문자로 표기된 염기는 '변이서열'이다.
프라이머 5. 5'- AGAAAGTCGCCATGGTGGGggatgGGGTCA - 3' (30mer) (서열번호 12)
프라이머 6. 5'- TCCGTGCCGGTGCCAATGGCCACA - 3' (24mer) (서열번호 13)
상기 프라이머 5와 6은 각각 포워드 프라이머와 리버스 프라이머이다. FokI 및 BtsCI의 인지서열인 GGATG가 본래의 주형 내에 존재함으로 프라이머 서열에 따로 제한효소인지서열을 삽입하지 않는다. PCR은 실시예 1과 동일한 방법으로 진행하였다.
PCR을 통해 생성되는 단편의 서열은 다음과 같다(5'→3').
프라이머 5와 프라이머 6이 상기 주형을 대상으로 증폭한 생성물은,
AGAAAGTCGCCATGGTGGGggatgGGGTCA[ A/G ]TGACTCCCCGGCCTTGGCCCAGGCAGACATGGGTGTGGCCATTGGCACCGGCACGGA (서열번호 14) 및
TCTTTCAGCGGTACCACCCcctacCCCAGT[ T/C ]ACTGAGGGGCCGGAACCGGGTCCGTCTGTACCCACACCGGTAACCGTGGCCGTGCCT (서열번호 15)이다.
상기 PCR을 통해 생성된 서열에서 소문자로 표시된 부위는 제한효소 인지서열(주형내에 본래 존재함)이고, 밑줄 친 부위는 제한효소에 의한 절단에 의해 생성되는 절편의 서열이며, 대괄호로([]) 표기된 부위는 "변이서열"이다.
2. 제한효소에 의한 절단, 정제 및 탈염
실시예 1과 동일한 방법으로 수행하였다.
3. 말디-토프 매스 스펙트로메트리(MALDI-TOF Mass Spectrometry)
실시예 1과 동일한 방법으로 수행하였으며, 그 결과는 아래와 같다.
인간의 ATP7B 유전자의 c.3809A>G (p.N1270S) 염기가 정상인 경우(A/A), 제 한효소에 의한 절단 후 생성되는 절편의 분자량은 2200.4D(7mer)와 4014.6 D(13mer)이다(도 3의 (a) 참조). 헤테로인 경우(A/G), 생성되는 절편의 분자량은 2200.4D, 2216.4 D(7mer)와 4014.6D, 3999.6D(13mer)이다(도 3의 (b) 참조). 만약 모두 G로 변이된 경우(G/G), 절편의 분자량은 2216.4D(7mer)와 3999.6D(13mer)이다.
전술한 바와 같이 실시예 1 내지 실시예 3의 방법에 따라 500명의 건강한 한국인을 대상으로 검사를 시행한 결과 총 10명에서 돌연변이 대립유전자가 확인되었고, 염기서열분석법을 이용한 결과와 100% 일치하였다. 이 결과를 바탕으로 한국인에서 ATP7B 유전자 돌연변이의 빈도를 추정할 경우 약 50명 중 1명이 한국인에서 흔한 3가지 돌연변이 중 하나를 가지고 있는 보인자로 판단된다. 따라서, 본 발명의 윌슨병 원인 유전자 변이 검출방법을 이용하여 윌슨병 보인자를 선별하는 것이 가능하다. 본 발명의 윌슨병 원인 유전자 변이 검출방법은 대규모 인구집단을 대상으로 한국인에서 흔한 ATP7B 유전자 돌연변이 여부를 확인함으로써 윌슨병 환자 및/또는 보인자 여부를 알 수 있어 윌슨병의 조기진단 및 치료, 유전 상담 등에 이용할 수 있다.
이상 본 발명을 상기 실시예를 들어 설명하였으나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니다. 당업자라면 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 수정, 변경을 할 수 있으며 이러한 수정과 변경 또한 본 발명에 속하는 것임을 알 수 있을 것이다.
도 1의 (a)는 인간의 ATP7B 유전자의 c.2333G>T 염기가 대립유전자 한 쌍 모두에서 G인 야생형(wild type)의 동형접합형(homozygote)에서의 말디-토프 매스 스펙트로메트리 그래프이며, 도 1의 (b)는 대립유전자 중 하나는 G이고 다른 하나는 T인 야생형/돌연변이형(wild/mutant type)의 이형접합형(heterozygote)에서의 말디-토프 매스 스펙트로메트리 그래프이다.
도 2의 (a)는 인간의 ATP7B 유전자의 c.2621C>T 염기가 대립유전자 한 쌍 모두에서 C인 야생형(wild type)의 동형접합형(homozygote)에서의 말디-토프 매스 스펙트로메트리 그래프이며, 도 2의 (b)는 대립유전자 중 하나는 C이고 다른 하나는 T인 야생형/돌연변이형(wild/mutant type)의 이형접합형(heterozygote)에서의 말디-토프 매스 스펙트로메트리 그래프이다.
도 3의 (a)는 인간의 ATP7B 유전자의 c.3809A>G 염기가 대립유전자 한 쌍 모두에서 A인 야생형(wild type)의 동형접합형(homozygote)에서의 말디-토프 매스 스펙트로메트리 그래프이며, 도 3의 (b)는 대립유전자 중 하나는 A이고 다른 하나는 G인 야생형/돌연변이형(wild/mutant type)의 이형접합형(heterozygote)에서의 말디-토프 매스 스펙트로메트리 그래프이다.
<110> GENEMATRIX INC. SAMSUNG LIFE WELFARE FOUNDATION <120> Method for detecting the mutations of genes related to Wilson's disease using restriction fragments mass polymorphism <130> P09-0140KR <160> 15 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 154 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 acattcttcg acacgccccc catgctcttt gtgttcattg ccctgggccg gtggctggaa 60 cacttggcaa agagcaaaac ctcagaagcc ctggctaaac tcatgtctct ccaagccaca 120 gaagccaccg ttgtgaccct tggtgaggac aatt 154 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for human ATP7B gene c.2333G>T <400> 2 cccatgctct ttgtgttcat tg 22 <210> 3 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for human ATP7B gene c.2333G>T <400> 3 gttttgctct ttgccaagtg tggatgccag ccac 34 <210> 4 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Resulting PCR Fragment <220> <221> mutation <222> (32) <400> 4 cccatgctct ttgtgttcat tgccctgggc cngtggctgg catccacact tggcaaagag 60 caaaac 66 <210> 5 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Resulting PCR Fragment <220> <221> mutation <222> (32) <400> 5 gggtacgaga aacacaagta acgggacccg gncaccgacc gtaggtgtga accgtttctc 60 gttttg 66 <210> 6 <211> 158 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 atgccagtca ctaagaaacc cggaagcact gtaattgcgg ggtctataaa tgcacatggc 60 tctgtgctca ttaaagctac ccacgtgggc aatgacacca ctttggctca gattgtgaaa 120 ctggtggaag aggctcagat gtcaaaggca cccattca 158 <210> 7 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for human ATP7B gene c.2621C>T <400> 7 tcactaagaa acccggaagc aggatgtgta attg 34 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for human ATP7B gene c.2621C>T <400> 8 gcacagagcc atgtgcattt atag 24 <210> 9 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Resulting PCR Fragment <220> <221> mutation <222> (35) <400> 9 tcactaagaa acccggaagc aggatgtgta attgnggggt ctataaatgc acatggctct 60 gtgc 64 <210> 10 <211> 64 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Resulting PCR Fragment <220> <221> mutation <222> (35) <400> 10 agtgattctt tgggccttcg tcctacacat taacncccca gatatttacg tgtaccgaga 60 cacg 64 <210> 11 <211> 180 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 tccagaataa agggaagaaa gtcgccatgg tgggggatgg ggtcaatgac tccccggcct 60 tggcccaggc agacatgggt gtggccattg gcaccggcac ggatgtggcc atcgaggcag 120 ccgacgtcgt ccttatcaga aatgatttgc tggatgtggt ggctagcatt cacctttcca 180 180 <210> 12 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for human ATP7B gene c.3809A>G <400> 12 agaaagtcgc catggtgggg gatggggtca 30 <210> 13 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for human ATP7B gene c.3809A>G <400> 13 tccgtgccgg tgccaatggc caca 24 <210> 14 <211> 88 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Resulting PCR fragment <220> <221> mutation <222> (31) <400> 14 agaaagtcgc catggtgggg gatggggtca ntgactcccc ggccttggcc caggcagaca 60 tgggtgtggc cattggcacc ggcacgga 88 <210> 15 <211> 88 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Resulting PCR fragment <220> <221> mutation <222> (31) <400> 15 tctttcagcg gtaccacccc ctaccccagt nactgagggg ccggaaccgg gtccgtctgt 60 acccacaccg gtaaccgtgg ccgtgcct 88

Claims (16)

  1. 포워드 프라이머 및 리버스 프라이머를 이용하여, c.2333G>T (p.R778L), c.2621C>T (p.A874V) 및 c.3809A>G (p.N1270S)로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 ATP7B 유전자의 변이위치 염기를 포함하는 폴리뉴클레오타이드를 증폭하는 단계와,
    상기 증폭된 폴리뉴클레오타이드를 제한효소로 절단하여 절단된 후의 절편의 염기의 수가 2개 내지 32개로 제한된 범위 이내이면서 변이위치 염기를 포함하는 2가지 이상의 단일 가닥의 폴리뉴클레오타이드 절편을 생성하는 단계와,
    상기 절단된 절편의 분자량을 측정함으로써 상기 ATP7B 유전자의 변이위치 염기 쌍이 모두 정상인 야생형인지, 하나만 돌연변이인 헤테로 돌연변이인지, 또는 모두 돌연변이인 호모 돌연변이인지를 분석하는 단계를 포함하는 제한효소 절편 질량다형성법을 이용한 윌슨병 원인 유전자 변이 검출방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 제1항에 있어서,
    상기 포워드 프라이머 또는 상기 리버스 프라이머는 프라이머 결합서열1, 제한효소인지서열 및 프라이머결합서열2를 포함하는 제한효소 절편 질량다형성법을 이용한 윌슨병 원인 유전자 변이 검출방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 포워드 프라이머는 서열번호 2, 7 및 12로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 프라이머이고, 상기 리버스 프라이머는 서열번호 3, 8 및 13으로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 프라이머인 것을 특징으로 하는 제한효소 절편 질량다형성법을 이용한 윌슨병 원인 유전자 변이 검출방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 증폭된 폴리뉴클레오타이드를 2개의 제한효소들이 절단하되, 제1의 제한효소 반응이 진행되는 동안 제2의 제한효소의 반응이 진행되지 않도록 한 후 제2의 제한효소가 반응하도록 하여 상기 증폭된 폴리뉴클레오타이드를 절단하는 것을 특징으로 하는 제한효소 절편 질량다형성법을 이용한 윌슨병 원인 유전자 변이 검출방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 증폭된 폴리뉴클레오타이드를 2개의 제한효소들이 절단하는 단계는 서 로 다른 최적온도를 갖는 2개의 제한효소들을 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 제한효소 절편 질량다형성법을 이용한 윌슨병 원인 유전자 변이 검출방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 2개의 제한효소들은 FokI, BbvI, BsgI, BcgI, BpmI, BseRI, MmelI, AvaII 및 BaeI으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 낮은 최적온도를 갖는 제한효소와, BtsCI, BstF5I, TaqI, BsaBI, BtrI, BstAPI, FauI, BclI, PciI 및 ApoI으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 높은 최적온도를 갖는 제한효소인 것을 특징으로 하는 제한효소 절편 질량다형성법을 이용한 윌슨병 원인 유전자 변이 검출방법.
  9. c.2333G>T (p.R778L), c.2621C>T (p.A874V) 및 c.3809A>G (p.N1270S)로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 ATP7B 유전자의 변이위치 염기를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 주형을 증폭하되, 증폭된 폴리뉴클레오타이드를 제한효소로 절단할 경우 절단된 후의 절편의 염기의 수가 2개 내지 32개로 제한된 범위 이내이면서 변이위치 염기를 포함하는 2가지 이상의 단일 가닥의 폴리뉴클레오타이드 절편을 생성하도록 하는 프라이머로서,
    서열번호 2, 7 및 12로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 프라이머와,
    서열번호 3, 8 및 13으로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 프라이머를 포함하는 윌슨병 원인 유전자 변이 검출용 프라이머.
  10. 삭제
  11. 제9항에 있어서,
    프라이머결합서열1, 제한효소인지서열 및 프라이머결합서열2를 포함하는 윌슨병 원인 유전자 변이 검출용 프라이머.
  12. 서열번호 2, 7 및 12로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 프라이머와, 서열번호 3, 8 및 13으로 구성된 군으로부터 선택된 하나의 프라이머와, 상기 프라이머들에 의해 증폭되고 c.2333G>T (p.R778L), c.2621C>T (p.A874V) 및 c.3809A>G (p.N1270S)로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 ATP7B 유전자의 변이위치 염기를 포함하는 폴리뉴클레오타이드 주형과, DNA 중합효소와, dNTPs와, 완충용액을 포함하고,
    상기 프라이머들에 의해 증폭된 폴리뉴클레오타이드 단편은 상기 ATP7B 유전자의 변이위치 염기, 프라이머결합서열1, 제한효소인지서열 및 프라이머결합서열2를 포함하며,
    상기 제한효소인지서열을 인지하는 적어도 2개의 제한효소에 의해 절단된 폴리뉴클레오타이드 절편은 염기의 수가 2개 내지 32개로 제한된 범위 이내이면서 상기 ATP7B 유전자의 변이위치 염기를 포함하는 것을 특징으로 하는 윌슨병 원인 유전자 변이 검출용 키트.
  13. 삭제
  14. 제12항에 있어서,
    상기 증폭된 폴리뉴클레오타이드 단편을 2개의 제한효소들이 절단하되, 제1의 제한효소 반응이 진행되는 동안 제2의 제한효소의 반응이 진행되지 않도록 한 후 제2의 제한효소가 반응하도록 하여 상기 증폭된 폴리뉴클레오타이드 단편을 절단하는 것을 특징으로 하는 윌슨병 원인 유전자 변이 검출용 키트.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 증폭된 폴리뉴클레오타이드 단편을 2개의 제한효소들이 절단하는 단계는 서로 다른 최적온도를 갖는 2개의 제한효소들을 이용하여 수행되는 것을 특징으로 하는 윌슨병 원인 유전자 변이 검출용 키트.
  16. 제15항에 있어서,
    상기 2개의 제한효소들은 FokI, BbvI, BsgI, BcgI, BpmI, BseRI, MmelI, AvaII 및 BaeI으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 낮은 최적온도를 갖는 제한효소와, BtsCI, BstF5I, TaqI, BsaBI, BtrI, BstAPI, FauI, BclI, PciI 및 ApoI으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 높은 최적온도를 갖는 제한효소인 것을 특징으로 하는 윌슨병 원인 유전자 변이 검출용 키트.
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Korean J Hepatol, Vol. 10, No. 4, pp260-270 (2004.12.)
Mol Cell Biochem, Vol. 294, No. 1-2, pp1-10 (2006.12.08.)

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