KR20100016568A - 녹내장 발증 리스크의 판정 방법 - Google Patents

녹내장 발증 리스크의 판정 방법 Download PDF

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KR20100016568A
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시게루 기노시타
게이 다시로
마사카즈 나카노
도모히토 야기
가즈히코 모리
요코 이케다
다카즈미 다니구치
마사아키 가게야마
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산뗀세이야구가부시기가이샤
시게루 기노시타
게이 다시로
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Abstract

피검자 유래의 샘플에 있어서, 배열 번호 203 ∼ 514 로 나타내는 염기 배열로 이루어지는 군에서 선택되는, 적어도 1 개의 염기 배열 또는 그 상보적 배열에 있어서의, 각 염기 배열의 31 번째에 존재하는 1 염기 다형의 아렐 및/또는 유전자형을 in vitro 에서 검출하는 공정 (공정 A), 그리고, 상기 공정 A 에서 검출된 아렐 및/또는 유전자형을, 배열 번호 203 ∼ 514 로 나타내는 염기 배열에 있어서의 하이리스크 아렐을 함유하는 아렐 및/또는 유전자형의 적어도 1 개와 비교하는 공정 (공정 B) 을 포함하는, 녹내장 리스크 유무의 판정 방법. 본 발명의 방법에 의해, 샘플 상의 본 발명의 1 염기 다형의 아렐 또는 유전자형을 분석함으로써, 샘플 제공자의 녹내장의 발증 리스크의 고저를 판정할 수 있고, 이 리스크에 기초하여 샘플 제공자는 녹내장의 예방 조치를 강구하고 또는 적절한 치료를 받을 수 있다.

Description

녹내장 발증 리스크의 판정 방법 {METHOD FOR DETERMINATION OF ONSET RISK OF GLAUCOMA}
본 발명은, 녹내장의 발증에 관련되는 1 염기 다형(多型), 또는 녹내장의 발증 리스크가 높은 1 염기 다형의 존재의 검출 방법, 및 그 검출 방법에 사용하는 키트에 관한 것이다.
녹내장은, 망막 신경절세포사에 의해 특징적인 시신경 유두 함몰과 시야 장해를 초래하는 질환이다. 안압의 상승이 녹내장에서의 유두 함요와 시야 장해의 주요한 원인이 된다. 한편, 안압이 통계적으로 산출된 정상 범위에 머무르는 녹내장도 존재하는데, 이 경우에도 그 개체에 있어서 시야 장해를 일으키기에 충분히 높은 안압이기 때문에 녹내장을 발병한다고 생각된다.
녹내장 치료의 기본은 안압을 낮게 유지하는 것으로서, 안압을 낮게 유지하기 위해서는 고안압을 초래하는 원인을 고려할 필요가 있다. 이로 인해, 녹내장의 진단에는, 안압의 고저 및 그 원인에 따라 녹내장의 타입을 분류하는 것이 중요해진다. 안압 상승을 초래하는 원인으로서는, 안(眼)내를 채우는 방수(房水)의 주요한 배출 경로인 우각의 폐색 유무가 중요하다. 이들의 관점에서 원발성의 녹내장은, 우각(隅角)의 폐색을 수반하는 폐색 우각 녹내장, 우각의 폐색을 수 반하지 않는 개방 우각 녹내장으로 크게 2 분되고, 이 중 개방 우각 녹내장은, 안압 상승을 수반하는 협의의 개방 우각 녹내장, 즉, 원발 개방 우각 녹내장과 안압이 정상 범위에 있는 정상 안압 녹내장으로 분류된다.
녹내장에 유전이 관계하는 것은 예전부터 알려져 있고, 개방 우각 녹내장에서는 5 ∼ 50 % 에 가족력이 있다는 보고도 있고, 일반적으로는 20 ∼ 25 % 가 유전적인 것으로 해석되었다. 이와 같은 보고에 기초하여, 녹내장의 원인 유전자를 탐색하는 연구가 실시되었고, 그 성과로서 마이오실린 (MY0C) 유전자의 변이가 개방 우각 녹내장에 관련되는 것 (특허문헌 1 참조), 옵티뉴린 유전자 (OPTN) 의 변이가 정상 안압 녹내장에 관련되는 것으로 보고되었다 (비특허문헌 1 참조). 그러나, 이들 유전자만으로는 녹내장의 유전적 요인을 모두 설명할 수 없어, 또 다른 미지의 녹내장 관련 유전자의 존재가 예상된다.
한편, 1 염기 다형이란, 개체의 게놈 염기 배열에 있어서, 1 개의 염기가 별도의 염기로 변화되는 치환 변이를 볼 수 있고, 당해 변이가 그 생물종의 집단에 있어서 어느 정도의 빈도, 일반적으로 약 1 % 이상의 빈도로 존재한다. 1 염기 다형은 유전자상의 인트론, 엑손, 혹은 이들 이외의 게놈의 영역 중 어느 것에도 존재한다.
특허문헌 1 : 일본 공개특허공보 2002-306165호
비특허문헌 1 : Rezaie T 외 11 명, Science, 2002 년, Vol.295, No.5557, p1077-1079.
발명의 개시
발명이 해결하고자 하는 과제
일반적으로, 녹내장의 간이 검사로서, 안압이나 안저 사진이 사용되는데, 반드시 이들 검사에서는 녹내장의 확정 진단에는 이르지 않는다. 통상적으로, 이들에 추가로 시야 검사를 하는데, 검사가 장시간이어서 환자에게 부담이 큰 것이나, 검사에 익숙해질 필요가 있기 때문에 첫 회의 검사 결과에 대한 신뢰성이 낮은 등의 문제가 있다.
한편, 상기 서술한 바와 같이, 녹내장의 발증에는 유전적 요인의 관여가 크게 의심되는데, 결정적인 원인 유전자는 동정되어 있지 않다. 한편, 단일한 유전자의 변이 또는 다형으로 질환에 대한 관여를 설명할 수 없어도, 녹내장에 대한 관여가 비교적 온화한 유전자의 변이 또는 다형이 다수 존재하고, 각각이 조합되어 작용함으로써 녹내장 발증에 대한 유전적 요인의 관여를 설명할 수 있는 것으로 생각할 수 있다.
발명자들은, 녹내장에 관련되는 유전자를 알아내기 위해, 게놈상의 다형, 특히 1 염기 다형에 주목하였다.
녹내장의 발증에 관여하는 다형을 알아냄으로써, 당해 다형으로서 녹내장 환자에서 빈도가 높은 형을 갖는 사람은, 발증 전이어도 장래적으로 녹내장의 발증 리스크가 높은 것을 예지하고, 혹은 간이한 녹내장의 판정, 즉, 안압 측정이나 안저 사진과 같은 방법으로는 검출이 곤란하고, 시야 검사를 실시하여 처음으로 진단되는 초기 녹내장의, 시야 검사의 필요 여부의 스크리닝에 대응할 수 있다. 즉, 녹내장 발증 리스크를 앎으로써 샘플 제공자는 녹내장의 발증 예방 조치를 강구할 수 있고, 또한 정밀 검사에 의한 초기의 확정 진단과 치료 개시 등, 시야 협착을 방지하기 위해 필요한 조치를 취할 수 있으므로, 녹내장의 발증에 관여하는 다형을 알아내는 것은 의의가 깊다.
본 발명의 과제는, 녹내장의 발증에 관여하는 1 염기 다형을 검출함으로써, 녹내장의 발증 리스크를 예측하는 방법, 및 그 검출 방법에 사용하는 키트를 제공하는 것에 있다.
과제를 해결하기 위한 수단
발명자들은, 녹내장 환자와 녹내장 가족력을 갖지 않는 비환자의 게놈 (상염색체) 상에 존재하는 공지된 다형 부위를 망라하여 해석하고, 녹내장의 발증에 관련되는 1 염기 다형을 알아내고, 또한 당해 1 염기 다형에 있어서 녹내장 환자에게 고빈도로 확인되는 아렐과 그 대립 아렐, 각 아렐의 조합인 녹내장 환자에게 고빈도로 확인되는 유전자형을 알아냈다. 또한, 이들 녹내장의 발증에 관련되는 1 염기 다형의 복수를 조합하여 판정을 실시함으로써, 보다 고정밀도로 샘플 제공자가 녹내장의 발증을 일으키기 쉬운 사람인지의 여부의 판정이 가능한 것을 알아내어, 본 발명을 완성하였다.
즉, 본 발명은
[1] 피검자 유래의 샘플에 있어서, 배열 번호 203 ∼ 514 로 나타내는 염기 배열로 이루어지는 군에서 선택되는, 적어도 1 개의 염기 배열 또는 그 상보적 배열에 있어서의, 각 염기 배열의 31 번째에 존재하는 1 염기 다형의 아렐 및/또는 유전자형을 in vitro 에서 검출하는 공정 (공정 A), 그리고
상기 공정 A 에서 검출된 아렐 및/또는 유전자형을, 배열 번호 203 ∼ 514 로 나타내는 염기 배열에 있어서의 하이리스크 아렐을 함유하는 아렐 및/또는 유전자형의 적어도 1 개와 비교하는 공정 (공정 B)
을 포함하고,
상기 공정 A 에서 검출된 아렐이 상기 하이리스크 아렐인 경우에 녹내장 리스크가 있는 것으로 판정되고, 혹은, 상기 하이리스크 아렐이 우성 유전 모델에 수반되는 경우, 상기 공정 A 에서 검출된 유전자형이 상기 하이리스크 아렐을 함유하는 유전자형의 호모형 또는 헤테로형인 경우에 녹내장 리스크가 있는 것으로 판정되고, 상기 하이리스크 아렐이 열성 유전 모델에 수반되는 경우, 상기 공정 A 에서 검출된 유전자형이 상기 하이리스크 아렐을 함유하는 유전자형의 호모형인 경우에 녹내장 리스크가 있는 것으로 판정되는, 녹내장 리스크 유무의 판정 방법,
[2] 피검자 유래의 샘플에 있어서, 배열 번호 203 ∼ 514 로 나타내는 염기 배열로 이루어지는 군에서 선택되는, 적어도 1 개의 염기 배열 또는 그 상보적 배열로 이루어지는 핵산 분자에 있어서의, 각 염기 배열의 31 번째에 존재하는 1 염기 다형의 아렐 및/또는 유전자형을 in vitro 에서 검출하는 공정 (공정 C1), 또는 배열 번호 515 ∼ 694 로 나타내는 염기 배열로 이루어지는 군에서 선택되는, 적어도 1 개의 염기 배열 또는 그 상보적 배열로 이루어지는 염기 배열을 포함하는 핵산 분자를 이용하고, 상기 1 염기 다형의 아렐 및/또는 유전자형을 in vitro 에서 검출하는 공정 (공정 C2), 그리고
상기 공정 C1 또는 C2 에서 검출된 아렐 및/또는 유전자형을, 배열 번호 203 ∼ 514 로 나타내는 염기 배열에 있어서의 하이리스크 아렐을 함유하는 아렐 및/또는 유전자형을 함유하는 적어도 1 개의 핵산 분자와 비교하는 공정 (공정 D)
을 포함하고,
상기 공정 C1 또는 C2 에서 검출된 아렐이 상기 하이리스크 아렐인 경우에 녹내장 리스크가 있는 것으로 판정되고, 혹은, 상기 하이리스크 아렐이 우성 유전 모델에 수반되는 경우, 상기 공정 C1 또는 C2 에서 검출된 유전자형이 상기 하이리스크 아렐을 함유하는 유전자형의 호모형 또는 헤테로형인 경우에 녹내장 리스크가 있는 것으로 판정되고, 상기 하이리스크 아렐이 열성 유전 모델에 수반되는 경우, 상기 공정 C1 또는 C2 에서 검출된 유전자형이 상기 하이리스크 아렐을 함유하는 유전자형의 호모형인 경우에 녹내장 리스크가 있는 것으로 판정되는, 녹내장 리스크 유무의 판정 방법,
[3] 배열 번호 203 ∼ 514 로 나타내는 염기 배열로 이루어지는 군에서 선택되는, 적어도 1 개의 염기 배열 혹은 그 상보적 배열 또는 이들의 부분 배열로 이루어지는 핵산 분자로서, 각 염기 배열의 31 번째에 존재하는 1 염기 다형을 함유하는 핵산 분자, 및/또는, 배열 번호 515 ∼ 694 로 나타내는 염기 배열로 이루어지는 군에서 선택되는, 적어도 1 개의 염기 배열 또는 그 상보적 배열로 이루어지는 염기 배열을 포함하는 핵산 분자를 함유하는, 피검자 유래의 샘플에 있어서 상기 1 염기 다형의 아렐 및/또는 유전자형을 in vitro 에서 검출하기 위한, 녹내장 리스크 유무의 판정 키트,
[4] 이하의 공정을 포함하는, 녹내장 리스크 유무의 판정 방법.
공정 (i) : 피검자 유래의 샘플로부터 핵산 분자를 추출하는 공정
공정(ii) : 상기 공정 (i) 에서 추출된 핵산 분자에 대해, 배열 번호 203 ∼ 514 로 나타내는 염기 배열 또는 그 상보적 배열에서 선택되는 적어도 1 개의 염기 배열에 대해, 각 염기 배열의 31 번째에 존재하는 1 염기 다형의 아렐을 검출하는 공정
공정 (iii) : 상기 공정 (ii) 에서 검출된 아렐에 기초하여, 녹내장 리스크의 유무를 판정하는 공정
[5] 배열 번호 203 ∼ 514 로 나타내는 염기 배열로 이루어지는 군에서 선택되는, 적어도 1 개의 염기 배열 혹은 그 상보적 배열 또는 이들의 부분 배열로 이루어지는 핵산 분자로서, 각 염기 배열의 31 번째에 존재하는 1 염기 다형의 아렐 및/또는 유전자형을 함유하는 핵산 분자의, 녹내장 리스크의 판정을 위한 사용,
[6] 피검자 유래의 샘플에 있어서, 배열 번호 203 ∼ 514 로 나타내는 염기 배열로 이루어지는 군에서 선택되는, 적어도 1 개의 염기 배열 또는 그 상보적 배열에 있어서의, 각 염기 배열의 31 번째에 존재하는 1 염기 다형의 아렐 및/또는 유전자형을 in vitro 에서 검출하는 공정 (공정 E), 그리고
상기 공정 E 에서 검출된 아렐 및/또는 유전자형을, 배열 번호 203 ∼ 514 로 나타내는 염기 배열에 있어서의 하이리스크 아렐을 함유하는 아렐 및/또는 유전자형의 적어도 1 개와 비교하는 공정 (공정 F)
을 포함하고,
상기 공정 E 에서 검출된 아렐이 상기 하이리스크 아렐인 경우에 녹내장인 것으로 진단되고, 혹은, 상기 하이리스크 아렐이 우성 유전 모델에 따르는 경우, 상기 공정 E 에서 검출된 유전자형이 상기 하이리스크 아렐을 함유하는 유전자형의 호모형 또는 헤테로형인 경우에 녹내장인 것으로 진단되고, 상기 하이리스크 아렐이 열성 유전 모델에 수반되는 경우, 상기 공정 E 에서 검출된 유전자형이 상기 하이리스크 아렐을 함유하는 유전자형의 호모형인 경우에 녹내장인 것으로 진단되는, 녹내장의 진단 방법, 그리고
[7] 이하의 공정을 포함하는, 녹내장 발증 리스크의 판정 방법.
공정 (I) : 청구항 3 에 기재된 판정 방법을 이용하여, 녹내장 발증 리스크의 유무 판정을 실시하는 공정
공정 (II) : 상기 공정 (I) 에 있어서, 적어도 어느 1 개의 1 염기 다형에 대해 발증 리스크가 있는 것으로 판정된 경우에, 새로운 리스크 판정이 필요한 것으로 판정되는 공정
공정 (III) : 상기 공정 (II) 에 있어서, 더 한층의 리스크 판정이 필요한 것으로 판정된 경우에, 청구항 5 에 기재된 판정 방법을 이용하고, 또한 녹내장 발증 리스크의 유무 판정을 실시하는 공정에 관한 것이다.
발명의 효과
본 발명의 방법에 의해, 샘플 중에 존재하는 게놈 유래의 핵산 분자에 함유되는 본 발명의 1 염기 다형의 아렐 또는 유전자형을 분석함으로써, 샘플 제공자에 있어서의 녹내장의 발증 리스크 유무를 판정하고, 나아가서는, 리스크의 고저를 예측할 수 있다. 이 리스크에 기초하여 샘플 제공자는 녹내장의 예방 조치를 강구하거나 적절한 치료를 받을 수 있다. 또, 본 발명의 방법에 의해, 녹내장 환자에게 고빈도로 확인되는 1 염기 다형을 함유하는 아렐 또는 유전자형을 게놈에 갖는 녹내장이 의심되는 샘플 제공자는, 안압이나 안저 사진으로는 충분히 판별이 어려운 초기의 녹내장 여부의 정밀한 검사를 받고, 녹내장으로 진단된 경우에는 조기에 치료를 개시할 수 있다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
본 발명은, 특정한 염기 배열로 이루어지는 군에서 선택되는 염기 배열 또는 그 상보적 배열에 포함되는 적어도 1 개의 1 염기 다형 (이하, SNP 로 기재하는 경우도 있다) 을 이용하고, 상기 1 염기 다형을 적어도 1 개 갖는 아렐 및/또는 유전자형을 in vitro 에서 검출하는 공정을 포함하는, 녹내장 리스크를 판정하는 방법에 있어서, 피검자 유래의 샘플에 있어서, 상기 공정에 의해 검출된 아렐 및/또는 유전자형을, 특정한 염기 배열에 있어서의 하이리스크 아렐을 함유하는 아렐 및/또는 유전자형의 적어도 1 개와 비교하는 공정을 추가로 포함하고, 상기 검출된 아렐이 상기 하이리스크 아렐인 경우에 녹내장 리스크가 있는 것으로 판정되고, 혹은, 상기 하이리스크 아렐이 우성 유전 모델에 따르는 경우, 상기 검출된 유전자형이 상기 하이리스크 아렐을 함유하는 유전자형의 호모형 또는 헤테로형인 경우에 녹내장 리스크가 있는 것으로 판정되고, 상기 하이리스크 아렐이 열성 유전 모델에 따르는 경우, 상기 검출된 유전자형이 상기 하이리스크 아렐을 함유하는 유전자형의 호모형인 경우에 녹내장 리스크가 있는 것으로 판정되는, 녹내장 리스크 유무의 판정 방법이다. 본 발명은, 녹내장의 발증에 관련되는 1 염기 다형을 알아내고, 또한 당해 1 염기 다형에 있어서 녹내장 환자에게 고빈도로 확인되는 아렐과 그 대립 아렐, 각 아렐의 조합으로서 녹내장 환자에게 고빈도로 확인되는 유전자형을 알아내어, 이들을 사용하는 것에 큰 특징을 갖는다. 또한, 본 명세서에 있어서 다형이란, 어느 생물종에 있어서의 게놈의 특정한 위치의 배열에 다양성이 확인되는 것을 말하고, 다형이 존재하는 부위 (이하, 다형 부위라고도 한다) 는, 1 염기 다형이 확인되는 게놈 상의 부위를 말한다.
또, 본 명세서에 있어서 아렐이란, 어느 다형 부위에 있어서 취할 수 있는, 서로 상이한 염기를 갖는 각각의 형태를 말한다. 본 명세서에 있어서 유전자형이란, 어느 다형 부위에 있어서, 대립하는 아렐의 조합을 말한다. 또한, 어느 다형 부위에 있어서, 대립하는 아렐의 조합인 유전자형에는 3 가지의 형이 있어, 동일한 아렐의 조합을 호모형이라고 하고, 상이한 아렐의 조합을 헤테로형이라고 한다.
본 명세서에 있어서, 대립하는 아렐이란, 어느 1 염기 다형을 구성하는 아렐 중, 특정된 것에 대응하는 다른 아렐을 말한다.
본 발명에 있어서, 녹내장에 관련되는 1 염기 다형이란, 녹내장의 발증에 관련되는 1 염기 다형 또는 녹내장의 진행에 관련되는 1 염기 다형인 것을 말하고, 즉, 녹내장의 발증에 관련되는 1 염기 다형이란, 당해 1 염기 다형에 있어서의 각각의 아렐 또는 유전자형의 빈도가, 녹내장 환자와 비환자에서 통계학적으로 어느 p 값에서 유의하게 상이한 1 염기 다형을 말하고, 녹내장의 진행에 관련되는 1 염기 다형이란, 당해 1 염기 다형에 있어서의 각각의 아렐 또는 유전자형의 빈도가, 녹내장 진행예와 녹내장 비진행예에서 통계학적으로 어느 p 값에서 유의하게 상이한 1 염기 다형을 말한다.
본 발명에 있어서, 하이리스크 아렐이란, 상기 녹내장과 관련되는 1 염기 다형의 각 아렐 중, 녹내장 환자군에 있어서 비환자군보다 빈도가 높은 아렐을 말한다. 한편, 본 발명에 있어서 로우리스크 아렐이란, 어느 다형 부위에 있어서 하이리스크 아렐에 대립하는 아렐을 말한다.
또, 유전자형에 대한 호모형 및 헤테로형은, 하이리스크 아렐과 로우리스크 아렐에 관하여 동일하게 정의된다. 즉, 어느 다형 부위에 있어서, 하이리스크 아렐 또는 로우리스크 아렐끼리의 조합을 호모형이라고 하고, 하이리스크 아렐과 로우리스크 아렐의 조합을 헤테로형이라고 한다.
녹내장 환자군과 비환자군의 아렐 빈도를 통계학적으로 비교하는 양태를 아렐 모델이라고 하고, 유전자형의 빈도를 비교하는 양태를 유전자형 모델이라고 한다. 또한, 유전자형 모델에는, 우성 유전 모델과 열성 유전 모델이 있고, 전자는 하이리스크 아렐의 호모형과 헤테로형이 모두 발증 리스크에 관여하는 양태를 의미하고, 후자는 하이리스크 아렐의 호모형이 발증 리스크에 관여하는 양태를 의미한다.
본 발명에 있어서 녹내장 리스크란, 녹내장에 관한 리스크를 말한다. 녹내장의 발증 리스크란, 질환 감수성에 의해 결정되는 장래적인 녹내장 발증의 가능성을 말한다. 본 발명에 있어서, 리스크의 예측이란, 장래 리스크의 유무를 현시점에서 판정하고, 또는 장래 리스크의 대소를 현시점에서 결정하는 것을 말한다.
또, 본 명세서에 있어서, 녹내장은 바람직하게는 개방 우각 녹내장 (OAG) 또는 정상 안압 녹내장 (NTG) 을 의미하고, 개방 우각 녹내장이란, 특별히 언급없이 사용된 경우 정상 안압 녹내장을 포함하지 않는 협의의 원발 개방 우각 녹내장 (POAG) 을 의미한다.
이하에, 녹내장에 관련되는 1 염기 다형의 동정 방법을 설명한다.
본 발명에 있어서, 녹내장에 관련되는 1 염기 다형은, 구체적으로, 원발 개방 우각 녹내장 또는 정상 안압 녹내장으로 진단된 녹내장 환자, 및, 녹내장이 아닌 것으로 진단되거나, 또한 문진에 의해 녹내장 가족력을 갖지 않는 것으로 판단된 비환자 (대조자로 기재하는 경우도 있다 ) 각각의 혈액으로부터 총 DNA 를 추출하고, 인간 게놈 상의 공지된 1 염기 다형 약 50 만개를 지표로 하여, 개개의 1 염기 다형의 아렐 또는 유전자형의 녹내장 환자 및 비환자에 있어서의 빈도를 비교함으로써, 후보가 되는 1 염기 다형을 선택하였다. 또한, 후보로서 선택된 상기 1 염기 다형에 대해 개개의 1 염기 다형의 아렐 또는 유전자형의 빈도를 상기 서술한 샘플군과 상이한 녹내장 환자군 및 비환자에서 취득하고, 이들의 결과를 통합함으로써, 빈도의 차가 통계학적으로 높은 유의성에서 확인되는 1 염기 다형을 알아내었다. 또한, 녹내장 환자로 이루어지는 군을 녹내장 환자군, 비환자로 이루어지는 군을 비환자군으로 하였다. 이들의 해석에 의해 알아낸 녹내장의 발증에 관련되는 1 염기 다형을 갖는 아렐 또는 유전자형을 사용함으로써, 녹내장의 발증 리스크 유무의 판정 및 발증 리스크 대소의 예측이 가능해진다. 상세한 것은 실시예의 항에서 설명하는데, 이하와 같은 방법에 의해, 본 발명에서 개시된 녹내장에 관련되는 1 염기 다형을 동정할 수 있다.
(녹내장에 관련되는 1 염기 다형의 동정)
먼저, 녹내장으로 진단된 환자, 및, 녹내장 가족력을 갖지 않는 것으로 진단된 비환자, 각각의 혈액으로부터 총 DNA 를 추출한다. 혈액 중의 총 DNA 는 공지된 임의의 방법에 의해 추출할 수 있는데, 예를 들어 세포를 용해시켜 용출시킨 DNA 를, 실리카로 코팅한 자성 비즈의 표면에 결합시키고, 자기를 이용하여 분리, 회수함으로써 DNA 를 추출할 수 있다.
추출한 DNA 샘플 중의 1 염기 다형에 있어서의 염기의 종류, 즉 1 염기 다형을 갖는 아렐의 동정은, 예를 들어 후술하는 고층화 프로브를 사용하는 방법 등, 임의의 방법으로 실시할 수 있다. 그 때, 검출에 사용하는 프로브는, 목적으로 하는 1 염기 다형 및 그 주변의 배열 정보를 기초로 설계할 수 있다. 설계에 있어서는, dbSNP 와 같은 공지된 1 염기 다형의 데이터 베이스를 이용하고, 그곳에서 얻어지는 배열 정보를 참고로 할 수도 있다. 1 염기 다형의 검출에 사용하는 프로브는, 게놈의 센스 사슬에 상보적인 프로브이든, 안티센스 사슬에 상보적인 프로브이든 어느 것에 의해서도 검출할 수 있다. 상세한 것은 후술하는데, 인간의 게놈 상에 존재하는 1 염기 다형을 검출할 수 있는 프로브를 대량으로 고층화(固層化)시켜, 동일 조작으로 다수의 1 염기 다형의 아렐을 결정할 수 있는 키트도 시판되고 있고, 이와 같은 키트를 이용하여 효율적으로 샘플 중의 아렐을 결정할 수도 있다. 또, 이와 같은 키트의 대부분은, 1 개의 샘플에 함유되는 대립하는 각각의 아렐을 동일 조작으로 검출하는 구성으로 되어 있어, 유전자형을 결정할 수 있다.
녹내장에 관련되는 1 염기 다형은, 상기 서술한 바와 같은 방법으로, 녹내장 환자 및 비환자 유래의 DNA 에 존재하는 아렐을 동정해두고, 각 아렐의 빈도 및 유전자형의 빈도를 녹내장 환자군 대 비환자군에서 통계학적으로 비교하여, 아렐 빈도 또는 유전자형 빈도의 적어도 일방에, p 값이 어느 기준에 의해 정해진 유의 수준을 하회하는 차가 생기는지의 여부를 갖고 판정할 수 있다. 차가 생기는 경우에는, 이들의 인자에 대해 아렐 빈도 또는 유전자형 빈도를 녹내장 환자군과 비환자군에서 비교하고, 어느 아렐 또는 유전자형이 녹내장 환자군에서 고빈도로 확인되는지를 결정한다.
통계학적인 해석에는, 예를 들어 카이 제곱 검정을 사용할 수 있다. 또, 비교를 반복하여 실시하는 것에서 기인하는 제１종의 과오는 공지된 보정 방법, 예를 들어 본페로니의 방법에 의해 보정할 수 있고, 본페로니의 보정에 기초하는 경우, 예를 들어 5×10- 2 의 p 값을, 검정의 반복 횟수, 즉, 카이 제곱 검정의 비교 대상이 되는 다형의 개수로 나누어 유의 수준으로 할 수 있다. 이와 같이 하여 구한 유의 수준을 하회하는 1 염기 다형을 보다 바람직한 1 염기 다형으로서 선택할 수 있고, 또, 다른 공지된 다중성의 보정에 사용되는 방법, 예를 들어 FDR 법이나 퍼뮤테이션법도 바람직한 1 염기 다형의 선택에 이용해도 된다. 단, 본페로니의 보정 등, 공지된 다중성의 보정 방법은 반복 해석을 실시하는 사상이 완전 독립을 전제로 한 방법이고, 한편, 후술하는 바와 같이, 1 염기 다형에는 연쇄 불평형이 확인되므로 완전 독립이 아닌 경우가 존재한다. 즉, 이와 같은 경우, 본페로니의 방법으로 보정하면 과잉 보정이 된다고 생각할 수 있다. 특히, 본 발명과 같은 전체 게놈에 걸친 1 염기 다형 해석에 대해서는, 통계적으로 비교해야 하는 요인이 매우 다수이므로, 다중성의 보정을 실시하면 기준이 되는 p 값이 현저하게 저하되어, 질환과의 관련이 있는 1 염기 다형을 간과할 가능성이 높아진다 (Schymick J C et al., Lancet Neurology. 2007 : 6 : 322-8 : Van Steen K et al., Nature Genetics. 2005 : 37 : 683-691). 학술적으로 바람직한 다중성의 보정 방법은 여전히 확립되어 있지 않지만, 다른 보정 방법으로서는, 별도의 공지된 보정 방법에 의한 보정을 실시하거나, 또는 본페로니의 보정에 의한 유의 수준을 하회하지 않는 범위의 임의의 적절한 수준으로 유의 수준을 설정할 수 있다. 임의의 적절한 수준을 설정하는 경우, 예를 들어 50 만개의 1 염기 다형을 반복 해석하는 경우의 유의 수준은 5×10-2 가 이용되고, 1×10-2 가 보다 바람직하고, 1×10-3 이 더욱 바람직하고, 1×10-4 가 더욱 바람직하고, 3×10-5 가 더욱 바람직하고, 1×10-5 가 더욱 바람직하다. 후술과 같이 본 발명에 있어서는 녹내장과의 관련이 확인되는 1 염기 다형이 게놈 상의 어느 영역에 연속하여 존재하는 것이 확인되어 있으므로, 이와 같은 유의 수준의 조정이 유용하다.
또, 일반적으로, 제１종의 과오와 통계학적인 검출력은 반비례하는 것으로 알려져 있다. 제１종의 과오를 저하시키면서 검출력을 유지하는 방법으로서는, 1 염기 다형 해석을 2 단계로 분할하여 실시하는 것을 들 수 있다 (Skol A.D. et al., Nature Genetics. 2006 : 38 : 209-213). 예를 들어, 어느 일정수의 샘플에 대해 1 염기 다형 해석을 실시하는 경우, 먼저, 1 차 해석으로서, 그 일부의 샘플에 대해 전체 게놈에 걸친 다수의 1 염기 다형 해석을 실시하고, 이어서, 2 차 해석으로서, 나머지 샘플에 대해, 1 차 해석인 정도로 한정한 1 염기 다형을 이용하여 해석을 실시한다. 이 경우, 어느 해석에 있어서도 비교적 낮은 p 값, 예를 들어 0.05 가 되는 1 염기 다형을 선택하면 되고, 바람직하게는, 최초의 해석에 있어서 후보가 되는 1 염기 다형을 일정한 유의 수준에서 선택하고, 당해 선택된 1 염기 다형에 대해, 별도의 샘플을 이용하여 추가로 해석하면 된다. 한편, 1 차 해석과 2 차 해석의 결과를 개별적으로 통계 해석하는 것은 아니고, 이들을 통합하여 해석하는 것은 보다 바람직하다. 이와 같은 경우에는, 공지된 메타 해석의 수법, 예를 들어, 만텔 헨젤법 (Mantel N et al., Journal of the National Cancer Institute 1959 : 22 : 719-748) 에 의해, 2 회의 해석 결과를 통합할 수 있다. 만텔 헨젤법 등의 메타 해석의 수법에 의해 해석 결과를 통합할 때에는, 개개의 해석에 있어서의 1 염기 다형의 선택을 실시하는 유의 수준은 본페로니 보정의 수준일 필요는 없고, 한정의 효율 등을 고려하여 설정해도 된다. 한편, 만텔 헨젤법 등의 메타 해석 수법에 의해 통합된 p 값을 이용하고, 의미가 있는지의 여부의 판단을 실시할 때에는, 다중성을 의식한 유의 수준으로 하는 것은 바람직하다. 또한, 만텔 헨젤법이란, 카이 제곱 검정 등을 실시할 때에, 복수회의 해석에 의해 얻어진 결과에 대해 가중을 실시하여, 해석 결과를 통합하는 방법이다. 만텔 헨젤법에 의해 통합되는 통계학적인 파라미터에는, p 값 외에, 후술하는 오즈비 등을 들 수 있다.
녹내장에 관련되는 아렐 또는 유전자형의 검출에 사용되는 1 염기 다형은, 예를 들어 50 만개의 1 염기 다형이 1 회의 조작으로 검출되는 마이크로 어레이를 이용하여 1 회의 해석에서 얻어진 결과에 기초하는 경우, 바람직하게는 p 값이 1×10-3 이하인 1 염기 다형이고, 보다 바람직하게는 p 값이 3×10-4 이하인 1 염기 다형이며, 더욱 바람직하게는 p 값이 1×10-4 이하인 1 염기 다형이고, 더욱 바람직하게는, p 값이 3×10-5 이하인 1 염기 다형이다. 만텔 헨젤법 등의 메타 해석 수법에 의해, 복수의 해석 결과를 통합하여 얻은 것인 경우에는, 바람직하게는 p 값이 1×10-2 이하인 1 염기 다형이고, 보다 바람직하게는 p 값이 3×10-3 이하인 1 염기 다형이고, 더욱 바람직하게는 p 값이 1×10-4 이하인 1 염기 다형이며, 더욱 바람직하게는 p 값이 3×10-4 이하인 1 염기 다형이다.
해석에 있어서, 신뢰성이 높은 결과를 얻기 위해서는, 충분한 수의 1 염기 다형을 해석하는 것이 바람직하다. 예를 들어 전체 샘플에 대한 각 1 염기 다형의 판정률, 즉 콜레이트가 낮은 다형 부위는 타이핑 에러가 발생되어 있는 비율이 높아 신뢰성이 높지 않다. 이로 인해, 콜레이트가 충분히 높은 1 염기 다형 부위를 이용하여 해석하는 것이 바람직하다. 1 염기 다형의 채택 여부의 기준으로 하는 콜레이트로서는, 예를 들어 바람직하게는 70 %, 보다 바람직하게는 75 %, 더욱 바람직하게는 80 %, 더욱 바람직하게는 85 %, 더욱 바람직하게는 90 % 이상의 콜레이트를 나타내는 1 염기 다형을 채용하는 것이 바람직하다.
그 밖에, 해석할 때에 고려될 수 있는 인자로서는, 하디 와인버그 평형과 마이너 아렐 빈도가 있다.
하디 와인버그 평형이란, 변이나 도태압이 없고, 임의 교배에 의해 형성된 충분한 개체수를 갖는 유전적으로 균일한 집단에 있어서는, 어느 유전자좌(座)에 있어서의 각 대립 유전자의 분포 빈도는 세대를 거듭해도 일정한 것을 말한다. 하디 와인버그 평형이 성립되어 있는지의 여부는, 수 개의 공지된 방법, 예를 들어 카이 제곱 검정이나 피셔의 직접 확률 계산법에 의해 확인할 수 있다. 충분한 수의 집단에서는, 1 회의 임의 교반에 의해 하디 와인버그 평형이 성립되는, 즉, 근친 교배가 존재하지 않는 한 하디 와인버그 평형은 성립하는 것으로 생각할 수 있다. 이로 인해, 일반적으로는, 모집단에 있어서의 하디 와인버그 평형의 성립을 전제로, 표본의 유전자형 판정의 에러를 검출하는 목적으로 하디 와인버그 평형의 검토가 사용된다. 그러나, 전체로서 하디 와인버그 평형이 성립되어 있었다고 해도, 어느 유전자좌에 있어서 질환군 또는 대조군에 있어서 특정한 유전자형이 치우쳐 존재하는 경우, 예를 들어, 특정한 유전자형이 질환에 대해 지배적인 영향을 갖는 경우 등이 있으므로, 질환 관련 유전자의 탐색을 실시하는 경우에는, 본 검토를 생략할 수도 있다.
마이너 아렐 빈도란, 2 개의 아렐에 함유되는 1 염기 다형의 경우에는, 2 개의 아렐 빈도 중, 빈도가 낮은 편인 아렐 빈도를 말한다. 임계값은 임의로 설정할 수 있다. 상기 서술한 바와 같이 1 염기 다형의 개념은, 마이너 아렐 빈도가 약 1 % 를 상회하는 것이기 때문에, 마이너 아렐 빈도가 1 % 를 하회하는 1 염기 다형은 버리는 것이 바람직하다. 한편, 질환군에 있어서 아렐 빈도가 매우 높은, 또는 매우 낮은 아렐은 질환에 대해 지배적인 영향을 가질 가능성이 있다. 다인자 질환의 원인이 되는 다형의 탐색에 있어서는 질환에 대한 상대적인 관여가 비교적 낮은 다형이 복수개 관여하고 있는 것으로 생각할 수 있으므로, 이와 같은 다형을 탐색하는 목적에서는, 일정 이하의 빈도, 예를 들어 5 % 미만의 마이너 아렐을 제외하고 해석하는 것도 바람직한 수단이 될 수 있다. 반대로, 질환에 지배적 영향을 갖는 다형의 탐색을 실시하려면, 마이너 아렐 빈도에 의한 기각을 실시하지 않는 것도 유효하다.
이와 같이 하여 얻은 녹내장에 관련되는 아렐형 또는 유전자형은, Genbank 와 같은 공지 배열의 데이터 베이스, 또는 dbSNP 와 같은 공지 1 염기 다형의 데이터 베이스를 참조함으로써, 그 1 염기 다형이 존재하는 게놈 상의 위치, 배열 정보, 1 염기 다형이 존재하는 유전자 또는 근방에 존재하는 유전자, 유전자 상에 존재하는 경우에는 인트론 또는 엑손의 구별이나 그 기능, 다른 생물종에 있어서의 상동 유전자 등의 정보를 얻을 수 있고, 이들의 정보를 바탕으로 본 발명에 있어서 사용하는 핵산 분자를 취득하여, 본 발명에 사용하는 프로브 등을 설계할 수 있다.
이와 같이 하여 결정된 녹내장과 관련되는 1 염기 다형에 있어서 리스크의 유무를 판단하는 기준으로서 하이리스크 아렐이 정의된다. 상기 서술한 바와 같이, 본 발명에 있어서, 하이리스크 아렐이란, 녹내장과 관련되는 1 염기 다형의 각 아렐 중, 녹내장 환자군에 있어서 비환자군보다 빈도가 높은 아렐을 말하고, 본 발명에 있어서 로우리스크 아렐이란, 어느 다형 부위에 있어서 하이리스크 아렐에 대립하는 아렐을 말한다.
발증 리스크 유무의 판정은, 아렐 또는 유전자형에 의해 실시할 수 있다.
아렐에 의해 판정을 실시하는 경우, 하이리스크 아렐을 가짐으로써, 당해 1 염기 다형에 대해 발증 리스크를 갖는 것으로 판단된다.
유전자형에 의해 판정을 실시하는 경우에는, 하이리스크 아렐이 우성 유전 모델에 따르거나, 또는 열성 유전 모델에 따르는지를 고려하여 발증 리스크가 판단된다. 어느 다형 부위에 있어서, 하이리스크 아렐의 호모형과 헤테로형의 빈도가 비환자군에 비해 녹내장 환자군에 있어서 유의하게 높은 경우, 이들의 유전자형은 우성 유전 모델에 따른다고 한다. 하이리스크 아렐이 우성 유전 모델에 따르는 경우에는, 하이리스크 아렐의 호모형 또는 헤테로형의 경우에 당해 1 염기 다형에 대해 발증 리스크를 갖는 것으로 판단된다. 한편, 하이리스크 아렐의 호모형의 빈도가 비환자군에 비해 녹내장 환자군에 있어서 유의하게 높은 경우, 이들의 유전자형은 열성 유전 모델에 따른다고 한다. 하이리스크 아렐이 열성 유전 모델에 따르는 경우에는, 하이리스크 아렐의 호모형의 경우에 당해 1 염기 다형에 대해 발증 리스크를 갖는 것으로 판단된다.
발증 리스크의 유무의 판정은, 로우리스크 아렐에 의해서도 실시할 수 있다. 상기 서술한 바와 같이 로우리스크 아렐은, 하이리스크 아렐에 대립하는 아렐이고, 즉, 비환자군에 있어서 고빈도로 확인되는 아렐이다. 아렐에 의해 판정을 실시하는 경우, 로우리스크 아렐을 갖지 않음으로써, 당해 1 염기 다형에 대해 발증 리스크를 갖는 것으로 판단된다.
유전자형의 경우도 동일하게 생각된다. 유전자형에 의해 판정을 실시하는 경우에는, 로우리스크 아렐이 우성 유전 모델에 따르거나, 또는 열성 유전 모델에 따르는지를 고려하여 발증 리스크가 판단된다. 어느 다형 부위에 있어서, 로우리스크 아렐의 호모형와 헤테로형의 빈도가 녹내장 환자군에 비해 비환자군에 있어서 유의하게 높은 경우, 이들의 유전자형은 우성 유전 모델에 따른다고 한다. 로우리스크 아렐이 우성 유전 모델에 따르는 경우에는, 로우리스크 아렐의 호모형 또는 헤테로형이 아닌 경우에 당해 1 염기 다형에 대해 발증 리스크를 갖는 것으로 판단된다. 한편, 로우리스크 아렐의 호모형의 빈도가 녹내장 환자군에 비해 비환자군에 있어서 유의하게 높은 경우, 이들의 유전자형은 열성 유전 모델에 따른다고 한다. 로우리스크 아렐이 열성 유전 모델에 따르는 경우에는, 로우리스크 아렐의 호모형이 아닌 경우에 당해 1 염기 다형에 대해 발증 리스크를 갖는 것으로 판단된다.
아렐, 우성 유전 모델, 열성 유전 모델 중 어느 수법을 이용하여 판정을 실시하는지는, 유의한 것으로 판단된 p 값이 구해진 수법과 동일한 수법을 사용할 수 있다. 유의한 것으로 판단된 p 값이 구해진 수법이 1 개의 1 염기 다형에 대해 복수 존재하는 경우에는, 어느 것을 이용해도 되는데, 바람직하게는 가장 낮은 p 값이 계산된 수법과 동일한 수법을 사용한다.
일반적으로, 질환과 관련되는 1 염기 다형에 있어서, 일방의 아렐 또는 유전자형과 질환의 유무 사이에 어느 정도 깊은 관련이 존재하는지의 지표로서, 상대 위험도 또는 오즈비가 사용된다.
일반적으로 상대 위험도 (relative risk) 란, 위험 인자를 갖는 군에서의 발증률과 위험 인자를 갖지 않는 군에서의 발증률의 비이다. 한편, 오즈비란, 일반적으로 환자군에서의 위험 인자를 갖는 인간의 비율과 갖지 않는 인간의 비율의 비, 즉 오즈를, 비환자군에서 동일하게 구한 오즈로 나눈 것이고, 본 발명과 같은 케이스 컨트롤 연구에 있어서 사용되는 경우가 많다. 본 발명에 있어서 오즈비는 아렐 빈도와 유전자형 빈도에 기초하여 구해진다. 즉, 발증에 관련되는 1 염기 다형의 오즈비란, 녹내장 환자군에 있어서의, 어느 아렐 또는 유전자형의 빈도와 다른 아렐 또는 유전자형의 빈도의 비를, 비환자군에 있어서 동일하게 하여 얻어지는 빈도의 비로 나눈 것이다. 본 발명에 있어서는, 이들의 지표에 의해, 어느 아렐 또는 유전자형을 가지면, 그 이외의 아렐 또는 유전자형을 갖는 경우에 비해, 녹내장이 발증되는 리스크가 어느 정도 증가하는지를 예측할 수 있다. 예를 들어, 어느 1 염기 다형의 특정한 아렐의 오즈비가 1 보다 큰 경우에는, 당해 아렐은 녹내장 환자군에 있어서 고빈도로 확인되는 아렐이며, 오즈비가 클수록 당해 아렐을 갖는 샘플 제공자의 녹내장 발증의 리스크는 높다. 한편, 아렐의 오즈비가 1 보다 작은 경우에는, 당해 아렐은 질환에 있어서 고빈도로 확인되는 아렐의 대립 아렐이고, 오즈비가 작을수록 당해 아렐을 갖는 샘플 제공자의 녹내장 발증의 리스크는 낮다. 유전자형에 대해서도 동일하게 질환의 리스크를 예측할 수 있다.
본 발명에 있어서, 하이리스크 아렐을 기준으로 오즈비를 구함으로써, 오즈비의 값이 항상 1 보다 커진다. 이와 같이 하이리스크 아렐을 갖는 경우에 1 보다 커지도록 오즈비를 정의함으로써, 복수의 1 염기 다형을 조합하여 리스크 예측하는 것이 용이해진다.
상세한 것은 실시예의 항에서 수식으로 나타내는데, 아렐에 대해 오즈비를 구하는 경우, 오즈비는 녹내장 환자군에 있어서의 하이리스크 아렐의 빈도와 로우리스크 아렐의 빈도의 비를, 비환자군에 있어서의 하이리스크 아렐의 빈도와 로우리스크 아렐의 빈도의 비로 나눈 것으로서 구하면 된다. 유전자형에 있어서의 오즈비를 구하려면, 하이리스크 아렐이 우성 유전 모델에 따르거나, 또는 열성 유전 모델에 따르는지를 고려하여 오즈비가 구해진다. 즉, 하이리스크 아렐이 우성 유전 모델에 따르는 경우에는, 하이리스크 아렐의 호모형 및 헤테로형이 위험 인자가 되고, 하이리스크 아렐이 열성 유전 모델에 따르는 경우에는, 하이리스크 아렐의 호모형이 위험 인자가 된다. 따라서, 하이리스크 아렐이 우성 유전 모델에 따르는 경우의 오즈비는 녹내장 환자군에 있어서의 하이리스크 아렐의 호모형의 빈도와 헤테로형의 빈도의 합을 구하고, 상기의 합과 로우리스크 아렐의 호모형의 빈도의 비를, 비환자군에 있어서 동일하게 구한 빈도의 비로 나누어 구하면 된다. 하이리스크 아렐이 열성 유전 모델에 따르는 경우에는, 녹내장 환자군에 있어서의, 로우리스크 아렐의 호모형의 빈도와 헤테로형의 빈도의 합을 구하고 하이리스크 아렐의 호모형의 빈도와 상기 합의 비를, 비환자군에 있어서 동일하게 구한 빈도의 비로 나누어 구하면 된다.
또한, 오즈비를 이용하여, 리스크의 예측에 사용하는 1 염기 다형의 신뢰성을 확인할 수 있다. 상기 서술한 바와 같이, 오즈비가 1 이상과 이하에서는 리스크 예측에 대한 의미가 역전된다. 따라서, 오즈비의 95 % 신뢰 구간을 구하고 그 신뢰 구간에 1 을 포함하는 경우, 그러한 오즈비의 리스크 예측에 대한 신뢰성은 높다고는 할 수 없다.
또, 본 발명의 1 염기 다형의 조합에 의해 녹내장의 발증 리스크를 예측하는 경우에도, 오즈비의 대소를 이용하여 그 리스크의 대소를 예측할 수 있다.
아렐에 의한 오즈비는, 이하의 식에 의해, 2 개 이상의 1 염기 다형을 조합할 때의 오즈비를 구할 수 있다.
(RA1combRA2comb)/(RA3combRA4comb)
단,
RA1comb : 녹내장 환자군에 있어서, 적어도 1 개의 아렐이 하이리스크 아렐인 경우의 아렐 빈도
RA2comb : 녹내장 환자군에 있어서, 어느 아렐도 로우리스크 아렐인 경우의 아렐 빈도
RA3comb : 비환자군에 있어서, RA1comb 에 대응하는 아렐 빈도
RA4comb : 비환자군에 있어서, 어느 아렐도 로우리스크 아렐인 경우의 아렐 빈도
예를 들어, 녹내장의 발증 리스크에 관련되는 2 개의 1 염기 다형을 조합하는 경우를 생각하면, 각각의 1 염기 다형의 하이리스크 아렐을 모두 보유하는, 또는 어느 1 개를 보유하는 녹내장 환자군의 빈도를, 어느 하이리스크 아렐도 보유하지 않는 녹내장 환자군의 빈도로 나눔으로써 오즈가 구해진다. 동일하게 구한 비환자군에 있어서의 오즈와의 비를 산출함으로써, 1 염기 다형의 조합의 경우의 오즈비를 구할 수 있다.
유전자형의 경우의 조합에 의한 오즈비를 구하려면, 단독의 경우와 동일하게, 하이리스크 아렐이 우성 유전 모델에 따르거나, 혹은 열성 유전 모델에 따르는지를 고려하여 오즈비가 구해진다.
우성 유전 모델에 의한 오즈비는, 이하의 식에 의해, 2 개 이상의 1 염기 다형을 조합했을 때의 오즈비를 구할 수 있다.
(RGd1combRCd2comb)/(RGd3combRGd4comb)
단,
RGd1comb : 녹내장 환자군에 있어서, 적어도 1 개의 유전자형이 하이리스크 아렐의 호모형 또는 헤테로형인 빈도
RGd2comb : 녹내장 환자군에 있어서, 어느 유전자형도 로우리스크 아렐이 호모형인 빈도
RGd3comb : 비환자군에 있어서, RGd1comb 에 대응하는 유전자형의 빈도
RGd4comb : 비환자군에 있어서, 어느 유전자형도 로우리스크 아렐이 호모형인 빈도
예를 들어, 2 개의 1 염기 다형의 하이리스크 아렐이 모두 우성 유전 모델에 따르는 경우의 오즈비는, 녹내장 환자군에 있어서, 2 개의 1 염기 다형 중 어느 것이 하이리스크 아렐의 호모형 또는 헤테로형인 빈도와 2 개의 1 염기 다형의 로우리스크 아렐이 모두 호모형인 빈도의 비를, 비환자군에 있어서 동일하게 구한 빈도의 비로 나누어서 구하면 된다.
열성 유전 모델에 의한 오즈비는, 이하의 식에 의해, 2 개 이상의 1 염기 다형을 조합했을 때의 오즈비를 구할 수 있다.
(RGr1combRGr2comb)/(RGr3combRGr4comb)
단,
RGr1comb : 녹내장 환자군에 있어서, 적어도 1 개의 유전자형이 하이리스크 아렐의 호모형인 빈도
RGr2comb : 녹내장 환자군에 있어서, 어느 유전자형도 로우리스크 아렐이 호모형인 빈도
RGr3comb : 비환자군에 있어서, RGr1comb 에 대응하는 유전자형의 빈도
RGr4comb : 비환자군에 있어서, 어느 유전자형도 로우리스크 아렐이 호모형인 빈도
예를 들어, 2 개의 1 염기 다형의 하이리스크 아렐이 모두 열성 유전 모델에 따르는 경우의 오즈비는, 녹내장 환자군에 있어서, 2 개의 1 염기 다형 중 어느 것의 하이리스크 아렐이 호모형인 빈도와 2 개의 1 염기 다형의 로우리스크 아렐이 모두 호모형인 빈도의 비를, 비환자군에 있어서 동일하게 구한 빈도의 비로 나누어서 구하면 된다. 또한, 1 염기 다형의 조합의 오즈비는, 상이한 유전 형식을 갖는 1 염기 다형을 조합하여 산출할 수도 있다.
일반적으로, 2 개 이상의 1 염기 다형을 조합함으로써, 이들을 단독으로 사용한 경우에 비해 오즈비는 증가한다. 따라서, 2 개 이상의 1 염기 다형의 조합에 의해, 녹내장의 발증 리스크의 보다 높은 샘플 제공자를 동정하는 것이 되고, 1 염기 다형을 단독으로 사용한 경우에 비해 예측 정밀도의 향상이 가능해진다.
본 발명의 1 염기 다형의 조합에 의한 녹내장의 발증 리스크의 예측 정밀도의 향상을 확인하기 위해, 다변량 해석법을 사용할 수 있다. 다변량 해석법으로서는, 로지스틱 회귀 분석법, 판별 분석법, 중회귀 분석법, 비례 해저드 분석법 등 당업자에게 주지된 방법을 사용할 수 있는데, 그 중에서도, 녹내장이 발증되는 리스크가 있거나 없는 등의 2 값 변수를 처리하는 경우에는, 로지스틱 회귀 분석법이 유효하다.
로지스틱 회귀 분석법이란, 1 개의 종속 변수 (φ) 를 설명하기 위해 복수의 독립 변수 (Π) 가 어느 정도 기여하는지를 해석하는 방법이다 (알기 쉬운 의학 통계학, p 148-179, 모리자네 토시오, 메디컬트리뷰사). 로지스틱 회귀 분석을 실시함으로써, 각 독립 변수에 대한 회귀 계수 (λ) 를 구할 수 있는데, 이 회귀 계수는 각각의 독립 변수가 종속 변수를 어느 정도 설명하는지를 나타내는 지표로서 이용할 수 있다. 또, 이 회귀 계수를 이하의 식에 대입함으로써, 각 독립 변수가 얻어졌을 때의 종속 변수를 산출할 수 있다.
φ=1/{1+exp[-(λ0+λ1Π1+λ2Π2+λ3Π3+…)]}
또한, 로지스틱 회귀 분석을 실시할 때, 스텝 와이즈법 등을 이용하고, 미리 해석에 사용하는 독립 변수 (Π) 를 한정할 수 있다. 스텝 와이즈법이란, 임의의 독립 변수 (Π) 를 추가함으로써, 회귀 계수가 최대화하도록 독립 변수 (Π) 를 선택하는 수법이다. 요컨대, 임의의 독립 변수 (Π) 를 추가함으로써 회귀 계수가 최대화한 후에는, 또 다른 독립 변수 (Π) 를 첨가해도 동일한 결과가 얻어지는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서는, 녹내장의 발증에 관여한다고 판정된 임의의 1 염기 다형을 2 개 이상 조합함으로써, 각각의 1 염기 다형을 단독으로 사용한 때에 비해, 발증 리스크의 예측 정밀도가 어느 정도 향상되는지를 알 수 있다. 즉, 상기 임의의 2 개 이상의 1 염기 다형의 각각을 독립 변수 (Π) 로 하고 (일방의 아렐의 호모형=0, 헤테로형=1, 대립 아렐의 호모형=2 로 한다), 로지스틱 회귀 분석에 의해 상기의 식을 구한다. 각 샘플에 있어서, 각 1 염기 다형에 대한 변수를 이 식에 대입하여 종속 변수 (Φ) 를 계산한다. 종속 변수 (Φ) 가 일정한 임계값 (예를 들어 0.5) 보다 클 때에 이 샘플의 제공자가 녹내장 환자인 것으로 판단한다. 이 판정 결과와 당해 1 염기 다형을 갖는 샘플 제공자가 실제로 녹내장 환자인지의 여부를 조합(照合)한다. 본 발명의 1 염기 다형의 2 개 이상의 조합에 의해, 일치하는 비율이 향상되는 것을 확인함으로써, 조합에 의한 정밀도 향상을 확인할 수 있다.
또, 충분히 유전적으로 가까운 장소에 존재하는 1 염기 다형 부위끼리는 독립적으로 유전하는 것이 아니고, 연쇄되어 유전하는 경우가 있다. 어느 집단에 있어서, 교배에 의해 재조합되어 있음에도 불구하고 이와 같은 연쇄가 유지되고 있는 상태를 연쇄 불평형이라고 하고, 연쇄가 유지되어 있는 단위를 하프로 타입 블록 또는 LD 블록이라고 한다.
본 발명자들의 실험 결과에서는, 녹내장에 관련되는 1 염기 다형은, 실제로 게놈 상의 비교적 근방에 집중하여 존재하는 경우가 있는 것이 발견되었다. 이들 영역은 녹내장에 관련되는 LD 블록에 속하고 있는 것으로 생각된다. 녹내장에 관련되는 LD 블록을 결정하기 위해서는, 그 영역에 존재하는 1 염기 다형을 가능한 한 다수 상기 서술한 방법으로 해석하고, LD 블록을 결정하기 위한 알고리즘, 예를 들어 EM 알고리즘을 적용함으로써 결정할 수 있다. 또는, 공지된 LD 블록에 본 발명의 녹내장에 관련되는 1 염기 다형이 속해 있는 경우, 그 LD 블록을 녹내장에 관련되는 LD 블록으로 할 수 있다. 공지된 LD 블록은, 캘리포니아 대학 산타클로스교가 인터넷의 웹 상에서 제공하는 Genome Browser 등에서 열람할 수 있다.
녹내장에 관련되는 LD 블록에 속하는 1 염기 다형은, 본 발명자들의 실험에 의해 동정된 녹내장에 관련되는 1 염기 다형과 연쇄되므로, 동일하게 녹내장에 관련되는 1 염기 다형으로 생각할 수 있어, 녹내장의 발증 또는 발증 리스크의 예측에 사용된다. 또, 녹내장에 관련되는 LD 블록 내, 또는 본 발명자들의 실험에 의해 동정된 녹내장에 관련되는 1 염기 다형의 주변의 배열을 재결정함으로써, 당해 1 염기 다형과 연쇄되는, 즉 녹내장의 발증 또는 그 진행과 관련되는 미지의 1 염기 다형이 발견될 가능성도 있다. 발견된 1 염기 다형이 실제로 녹내장의 발증 또는 그 진행과 관련되는지의 여부는, 지금까지의 설명과 동일하게 그 아렐 또는 유전자형의 빈도를 질환군과 대조군으로 비교함으로써 판정할 수 있다.
본 발명에 있어서, 인트론형 1 염기 다형 (iSNP) 은 인트론에 1 염기 다형이 확인되는 것을 말한다. 번역 영역형 1 염기 다형 (cSNP) 이란, 단백질로 번역되는 영역에 1 염기 다형이 존재하는 것 중, 당해 1 염기 다형을 함유하는 코돈이 다른 아미노산을 코드하는 코돈이나 종지 코돈으로 변이되는 등, 아미노산 배열에 변화를 수반하는 것을 말한다. 사일런트형 1 염기 다형 (sSNP) 이란, 번역 영역에 1 염기 다형이 확인되는 것 중, 아미노산 배열의 변화를 수반하지 않는 것을 말한다. 게놈형 1 염기 다형 (gSNP) 이란, 게놈 상의 유전자를 코드하지 않는 영역에 1 염기 다형이 존재하는 것을 말한다. 전사 조절형 다형 (rSNP) 이란, 전사 조절에 관여한다고 생각되는 부위에 존재하는 1 염기 다형을 말한다.
이와 같이, 1 염기 다형은 게놈 상의 어떠한 위치에도 존재하는 경우가 있고, 어느 경우에도 질환과의 관련은 있을 수 있다. 인트론 또는 비번역 영역에 1 염기 다형이 존재하는 경우에는, 유전자 발현 제어에 영향을 미치는 경우나, 유전자의 전사 후에 일어나는 스프라이싱이나 mRNA 의 안정성에 영향을 미치는 경우가 있다. 번역 영역에 1 염기 다형이 존재하는 경우에는, 그 염기의 치환에 의해 어느 아미노산에 대응하는 코돈이 별도의 아미노산에 대응하는 코돈으로 변화하는, 또는 종지 코돈으로 변화하는 등의 변화가 생기고, 이로써 코드되는 단백질의 구조에 변화가 생기는 경우가 있다. 이들의 변화에 의해 유전자가 발현되는 양이나 기능, 나아가서는 당해 유전자가 코드하는 단백의 발현량 또는 기능에 변화가 생겨, 여러 가지 질환의 원인이 될 수 있다. 게놈형 1 염기 다형이 질환과 관련되는 경우에는, 당해 다형 부위를 포함하는 영역이 실제로는 번역되어, 다른 유전자의 발현에 어떠한 영향을 미치고 있을 가능성이 있다. 사일런트형 1 염기 다형이 질환과 관련되어 있는 경우, 그 1 염기 다형의 주변에 질환과 관련되는 별도의 다형이 존재하고, 당해 다형과 사일런트형 1 염기 다형이 연쇄되어 있는 경우에 질환과의 관련이 확인되는 것으로 생각할 수 있다. 동일하게, 사일런트형 1 염기 다형 이외의 1 염기 다형으로서도, 당해 1 염기 다형 자체는 직접적인 녹내장의 원인이 아니고, 주변에 존재하는 녹내장의 진정한 원인인 다형과 연쇄되어 있는 경우에도, 이들의 1 염기 다형과 녹내장의 관련이 확인되는 경우가 있다. 이와 같은 경우에는, 후술과 같이, 본 발명의 1 염기 다형의 주변을 재시퀀스함으로써, 녹내장의 원인인 다형을 발견할 수도 있다. 그러나, 질환의 진정한 원인이 되는지의 여부에 상관없이, 어느 경우에도, 녹내장의 발증 리스크를 예측하는 목적으로 이들의 1 염기 다형을 사용할 수 있다.
(녹내장에 관련되는 아렐을 함유하는 핵산 분자)
본 발명의 어느 양태에서는, 녹내장과 관련되는 1 염기 다형을 함유하는 핵산 분자, 및, 녹내장과 관련되는 1 염기 다형을 함유하는 핵산 분자에 상보적인 배열을 갖는 핵산 분자가 제공된다.
이들 녹내장과 관련되는 1 염기 다형을 함유하는 핵산 분자 또는 당해 핵산 분자에 상보적인 배열을 갖는 핵산 분자는 녹내장 발증 리스크의 고저를 판정하는 마커로서 사용할 수 있다. 또한 이들 핵산 분자는, 당해 1 염기 다형에 있어서의, 녹내장 환자에게서 고빈도로 확인되는 아렐 혹은 그 대립 아렐을 검출하고, 또는 유전자형을 결정하기 위한 프로브로서 사용할 수 있다. 또, 당해 1 염기 다형이 엑손 상 또는 그 근방에 존재하는 경우에는, 이들 핵산 분자는 유전자의 전사물의 검출에 사용할 수 있다.
진핵 생물의 게놈을 구성하는 핵산 분자는 센스 사슬과, 센스 사슬에 상보적인 안티센스 사슬의 2 중 사슬로 구성되어 있다. 즉, 1 염기 다형도 센스 사슬과 안티센스 사슬에 존재하고, 어느 사슬의 1 염기 다형을 검출하는 것도 동일한 의미를 갖기 때문에, 본 발명의 핵산 분자는 이들 모두를 포함한다.
후술하는 표 1 ∼ 2, 표 5 ∼ 25, 표 26 ∼ 28 및 표 29 ∼ 51 에 기재된 1 염기 다형 중 어느 하나를 함유하는 핵산 분자, 후술하는 표 3 ∼ 4 에 기재된 연쇄 불평형 데이터 등을 기초로 결정된 영역 또는 유전자 상에 존재하는 임의의 1 염기 다형을 함유하는 핵산 분자, 및, 이들 핵산 분자에 상보적인 핵산 분자는 전부 본 발명의 핵산 분자에 포함된다.
본 발명의 어느 양태에서는, 바람직하게는, 본 발명의 핵산 분자는, 후술하는 표 1 ∼ 2, 표 26 ∼ 28 또는 표 52 ∼62 에 기재된 1 염기 다형을 함유하는 핵산 분자 또는 그 상보적인 핵산 분자이고, 또한 당해 1 염기 다형이 gSNP 인 경우에는, 센스 사슬의 상류측의 공지된 1 염기 다형의 다음 염기로부터 하류측의 공지된 1 염기 다형의 1 염기 전의 염기까지의 배열로 이루어지는 핵산 분자 또는 그 상보적 배열로 이루어지는 핵산 분자이고, 당해 1 염기 다형이 iSNP, sSNP 또는 cSNP 인 경우에는, 당해 1 염기 다형을 함유하는 게놈 상의 유전자 전체 길이로 이루어지는 핵산 분자, 그 상보적 배열로 이루어지는 핵산 분자, 당해 1 염기 다형을 함유하는 상보 DNA (cDNA) 분자 또는 그 상보적 배열로 이루어지는 핵산 분자이고, 당해 1 염기 다형이 rSNP 인 경우에는, 센스 사슬의 상류측의 공지된 1 염기 다형의 다음 염기로부터, 당해 1 염기 다형이 존재하는 프로모터 영역의 하류에 존재하는 유전자 전체 길이로 이루어지는 핵산 분자 또는 그 상보적 배열로 이루어지는 핵산 분자이다.
본 발명에 있어서의 핵산 분자는, 데옥시리보 핵산, 리보 핵산, 또는 펩티드 핵산인지에 상관없이, 이들 혼합 배열을 포함하는 핵산 분자도 또한 본 발명에 포함된다. 본 발명의 핵산 분자에 리보 핵산을 사용하는 경우에는, 본 발명의 핵산 분자의 배열 (상보적 배열을 포함한다) 에 있어서, 티민은 우라실로 재판독해도 되는 것으로 한다. 또, 이들 핵산 분자에, 본 발명에 사용하기 위한 기능을 해치지 않는 범위에서, 필요에 따라 화학 수식을 실시할 수 있다. 이 경우의 기능이란, 핵산 분자를 사용하는 목적을 달성하는 기능을 말한다.
본 발명에 있어서의 핵산 분자는, 본 명세서에 개시된 배열 정보, 또는 본 명세서에 개시된 정보를 데이터 베이스로 검색하여 얻어지는 배열 정보에 기초하여, 공지된 방법, 예를 들어 포스포로아미다이트법을 이용하여 합성할 수 있다. 시판되는 DNA 합성기를 이용하여 합성할 수도 있다. 또, 본 발명의 핵산 분자는 인간 유래의 DNA 를 함유하는 샘플로부터, PCR 법 등의 공지된 방법에 의해, 또는 일부의 핵산 분자에 대해서는 인간 유래의 RNA 를 함유하는 샘플로부터, RT-PCR 법 등의 공지된 방법에 의해 취득할 수 있다. 취득에 필요한 프라이머는 당업자이면 본 명세서에 개시된 배열 정보, 또는 본 명세서에 개시된 데이터 베이스의 ID 로부터 검색할 수 있는 배열 정보에 기초하여 설계할 수 있다. 예를 들어 PCR 법을 사용하는 경우에는, 목적으로 하는 핵산 분자의 일부의 배열과 상동한 배열을 갖는 약 10 ∼ 30 염기의 프라이머를 사용할 수 있고, RT-PCR 법을 사용하는 경우에는, 올리고 dT 프라이머, 또는 랜덤 헥사머 등을 이용하고, 역전사 반응을 실시하여 cDNA 를 제조하고, 당해 cDNA 중의 목적으로 하는 배열을 상기 서술한 PCR 법으로 증폭함으로써 얻을 수 있다.
핵산 분자는, 바람직하게는 16 ∼ 55 염기, 보다 바람직하게는 23 ∼ 27 염기 또는 47 ∼ 53 염기의 길이를 갖고, 또한 상기 서술한 다형 부위와 그 주변의 배열, 또는 이것에 상보적인 배열을 포함하는 핵산 분자인 것이 바람직하다.
녹내장의 발증에 관련되는 1 염기 다형을 함유하는 핵산 분자를 선택하는 경우, 본 발명에 있어서의 핵산 분자는, 예를 들어 50 만개의 핵산 분자가 1 회의 조작으로 검출되는 마이크로 어레이를 이용하여 1 회의 해석에서 얻어진 결과에 기초하는 경우, 바람직하게는 p 값이 1×10-3 이하인 핵산 분자이고, 보다 바람직하게는 p 값이 3×10-4 이하인 핵산 분자이며, 더욱 바람직하게는 p 값이 1×10-4 이하인 핵산 분자이고, 더욱 바람직하게는, p 값이 3×10-5 이하인 핵산 분자이다. 만텔 헨젤법 등의 메타 해석 수법에 의해, 복수의 해석 결과를 통합하여 얻은 것인 경우에는, 바람직하게는 p 값이 1×10-2 이하인 핵산 분자이고, 보다 바람직하게는 p 값이 3×10-3 이하인 핵산 분자이며, 더욱 바람직하게는 p 값이 1×10-3 이하인 핵산 분자이고, 더욱 바람직하게는 p 값이 3×10-4 이하인 핵산 분자이며, 더욱 바람직하게는 p 값이 1×10-4 이하인 핵산 분자이다.
바람직한 핵산 분자를 선택하는 별도의 수단으로는, 공지된 다중성의 보정 방법에 의해 유의 수준을 설정하고, 바람직한 핵산 분자를 선택할 수 있다. 예를 들어, 본페로니의 보정에 기초하는 경우, 5×10- 2 의 p 값을, 검정의 반복 횟수, 즉, 카이 제곱 검정의 비교 대상이 되는 다형의 개수로 나누어 유의 수준으로 할 수 있다. 이와 같이 하여 구한 유의 수준을 밑도는 1 염기 다형을 갖는 핵산 분자를 보다 바람직한 핵산 분자로서 선택해도 된다. 그 때, 만텔 헨젤법 등의 메타 해석 수법에 의해 통합된 p 값을 이용하여 메타 해석의 대상으로 한 1 염기 다형의 개수를 이용하여 본페로니를 보정해도 된다. 다른 공지된 다중성의 보정에 사용되는 방법, 예를 들어 FDR 법이나 퍼뮤테이션법을 바람직한 핵산 분자의 선택에 이용해도 된다.
(녹내장에 관련되는 1 염기 다형의 검출 방법 및 녹내장의 발증 리스크의 예측 방법)
본 발명의 다른 양태에서는, 게놈 유래의 핵산 분자를 함유하는 샘플 중에, 녹내장 환자군에 있어서 빈도가 높은 아렐 또는 유전자형을 갖는지의 여부의 검출 방법이 제공된다. 샘플로서는, 게놈 유래의 핵산 분자를 추출할 수 있는 것이면 무엇이든 좋으나, 예를 들어, 혈액, 백혈구, 모근, 모발, 타액, 구강 점막 세포, 피부, 생체 검사에 의해 얻은 근육 또는 장기 등의 조직 등이 사용된다.
상기 서술한 바와 같이, 진핵 생물의 게놈을 구성하는 핵산 분자는 서로 상보적인 센스 사슬과 안티센스 사슬로 구성되어 있고, 본 발명의 1 염기 다형의 아렐의 결정은, 당해 다형 부위의 센스 사슬, 안티센스 사슬의 어느 염기를 검출함으로써도 실시할 수 있다.
상기 서술한 바와 같이, 핵산 분자를 함유하는 샘플 중에 당해 아렐 또는 유전자형이 함유되는지의 여부의 판정 방법은 어떠한 것이라도 이용할 수 있는데, 예를 들어 본 발명에서 개시된 배열 정보에 기초하여 설계한, 각 아렐에 특이적인 프로브, 바람직하게는 후술하는 본 발명의 프로브를 이용하여 하이브리다이즈하고, 그 시그널을 검출함으로써 각각의 아렐을 검출할 수 있다. 또, 대립하는 각각의 아렐, 즉, 어느 1 염기 다형에 대해 질환과의 관련이 높은 아렐 및 낮은 아렐에 각각 상이한 표지를 하고, 그것들을 다형 부위에 하이브리다이즈시키는 프로브 또는, 대립하는 각각의 아렐을 고층화시킨 마이크로 어레이 등의 고층화 프로브를 사용함으로써, 동일 샘플에 함유되는 대립하는 각각의 아렐을 검출할 수 있다. 이와 같은 구성에서는, 샘플의 아렐뿐만 아니라 유전자형을 결정할 수도 있다. 또, 대립하는 각각의 아렐을 동일 담체 상에 고층화시킨 마이크로 어레이 등의 고층화 프로브를 사용하는 경우에는, 동일 조작으로 하이브리다이즈를 실시하고, 동일 조작으로 검출하는 구성으로 할 수도 있다.
그 밖의 본 발명의 1 염기 다형을 검출하는 방법으로서는, 다음과 같은 것을 이용할 수 있다. 프로브를 이용하여 하이브리다이즈하는 방법의 예로서는 태크맨법, 인베이더 (Invader (등록상표)) 법, 라이트사이클러법, 사이클린 프로브법, MPSS 법, 비즈 어레이법 등이 있고, 이들 모두 이용할 수 있다. 동일한 아렐을 검출하기 위한 프로브로서도, 검출에 사용하는 방법에 의해 보다 바람직한 프로브가 상이한 경우가 있다. 본 발명의 1 염기 다형의 아렐 또는 유전자형의 판정은 검출 방법에 의존하지 않는데, 검출 방법에 따라 적합한 프로브를 사용하는 것이 바람직하다.
태그맨법이란, 5' 측에 형광 물질을 결합시키고, 그 3' 측에는 소광(消光) 물질을 결합시킨 임의의 길이의 올리고 프로브를 사용함으로써 유전자 다형을 검출하는 방법이다. 목적으로 하는 다형을 갖는 핵산 분자에 프로브가 하이브리다이즈하고, PCR 반응에 의해 5' 측의 프로브의 일부가 절리되어, 형광 물질이 발하는 형광량을 측정함으로써 다형의 유무를 판정한다.
인베이더법이란, 다형을 갖는 핵산 분자의 3' 측과 공통 배열을 갖는데, 5' 측의 배열이 완전히 상이한 프로브 (리포터) 와, 5' 측의 공통 배열만을 갖는 프로브 (인베이더) 를 이용하여 유전자 다형을 검출하는 방법이다. 목적으로 하는 핵산 분자와 이들의 2 개의 프로브를 하이브리다이즈시킨 후, 뉴클레아제로 처리하고, 잘린 리포터 프로브의 일부가 형광 물질과 소광 물질을 갖는 검출용 프로브와 하이브리다이즈시킨 후에 뉴클레아제로 처리하면 형광 물질이 유리되므로, 이 형광량에 의해 다형의 유무를 판정한다.
라이트사이클러법이란, 형광 물질을 갖는 다형 검출 프로브 및 소광 물질을 갖는 앵커 프로브를, 미리 PCR 로 증폭시킨 다형을 갖는 핵산 분자에 하이브리다이즈시킴으로써 다형을 검출하는 방법이다. 하이브리다이즈된 DNA 에 서서히 열을 가하면, 어느 일정한 온도가 되면 다형 검출 프로브가 유리되므로, 이 형광량을 측정함으로써 다형의 유무를 판정한다.
사이클린 프로브법이란, 목적으로 하는 핵산 분자의 다형 부위와 상보적인 배열을 갖는 RNA 배열의 양단을 사이에 오도록 DNA 배열을 결합시키고, 각각의 DNA 단에 형광 물질 또는 소광 물질을 갖는 프로브 (DRD 프로브) 를 이용한 다형 해석법이다. 미리 PCR 등으로 증폭시킨 목적으로 하는 핵산 분자에 DRD 프로브를 하이브리다이즈시키고, 이 복합체에 RNase 를 작용시키면 형광 색소가 유리되므로, 이 형광량을 측정시킴으로써 다형의 유무를 판정한다.
MPSS 법이란, 인코드 어댑터 및 디코더 프로브를 이용하여 다형 해석을 실시하는 방법이다. 인코드 어댑터 프로브란, 5' 측에 4 염기의 돌출 말단, 그것에 이어서 제한 효소인 BbvI 의 인식 배열, 그리고 3' 측에 디코더 프로브가 결합하는 1 개 사슬 배열을 갖는 올리고 DNA 이다. 한편, 디코더 프로브는, 3' 측에 형광 물질을 갖는 1 개 사슬 올리고 DNA 이고, 4 종류의 상이한 배열로 이루어지고, 각 배열이 1 개의 인코드 어댑터 프로브와 특이적으로 하이브리다이즈된다. 다형을 갖는 핵산 분자를 비즈에 고정시켜 두고, BbvI 의 인식 배열을 포함하는 개시 어댑터를 결합시켜, BbvI 로 4 염기 돌출 말단이 되도록 소화시킨다. 돌출된 4 염기의 3' 말단으로부터 순서대로 인코드 어댑터 프로브와 라이게이션시키고, 결합된 인코드 어댑터의 배열을 특정한 디코더 프로브로 검출한다.
비즈 어레이법이란, 아렐 검출용 프로브, 및, 아렐 검출용 프로브에 의해 검출되는 시그널의 어레이 상의 위치 정보를 특정하는 올리고 뉴클레오티드 (어드레스 배열) 가 결합된 비즈를 조합하여 유전자형 판정을 실시하는 방법이다. 예를 들어, 일루미나사의 어드레스 배열 (23 염기) 만이 고정된 비즈를 사용하는 골든 게이트 어세이, 및, 어드레스 배열 (30 염기) 에 아렐 검출용 프로브 (50 염기) 가 결합한 비즈를 사용하는 Infinium (등록상표) 어세이가 있다. 어느 방법에서도, 어드레스 배열을 기초로, 어레이 상에 임의로 배치된 각각의 비즈에 대해, 아렐 검출용 프로브가 어레이 상의 어느 위치에 결합되어 있는지를 알 수 있다.
골든 게이트 어세이 방법을 이하에 나타낸다. 1 염기 다형의 검출에는, 각 아렐에 특이적으로 하이브리다이즈되는 2 종의 프로브 (아렐 특이적 프로브), 및 1 염기 다형의 3' 측의 1 ∼ 20 염기 하류의 배열에 특이적으로 하이브리다이즈되는 프로브 (하류 배열 인식 프로브) 를 사용한다. 하류 배열 인식 프로브에는, 어레이 상의 위치 특정용 어드레스 배열이 부여되어 있다. 또, 이들 3 개의 프로브에는 후술하는 유니버설 프라이머가 결합하는 배열이 포함되어 있다. 3 개의 프로브를 게놈 DNA 에 어닐링시킨 후, DNA 폴리머라아제와 리가아제를 첨가한다. 신장 반응과 라이게이션 반응에 의해, 아렐 특이적 프로브와 하류 배열 인식 프로브 사이의 갭을 연결하는 아렐 특이적인 산물이 생성된다. 이 아렐 특이적 산물을 주형(鑄型)으로 하고, 각 아렐에 특이적인 2 종의 형광 표지 유니버설 프라이머와 하류 배열 인식 프로브에 결합하는 유니버설 프라이머를 이용하여 PCR 반응을 실시한다. 표지된 PCR 산물을 비즈 상에 고정시킨 올리고 뉴클레오티드와 어드레스 배열을 개재하여 하이브리다이즈한다. 비즈 상의 형광을 모두 초점 레이저 스캐너로 검출함으로써 아렐과 유전자형의 판정을 실시한다.
Infinium 어세이 방법을 이하에 기재한다. 후술하는 일루미나사의 어레이 [일루미나사 iSelecTM Genotyping BeadChip] 는 본 수법에 따르고 있다. 본 어레이에 의한 아렐의 검출에는 2 가지의 방법이 존재한다. 첫 번째의 방법에는, 3' 말단이 1 염기 다형을 검출하는 부위인 3' 말단의 염기만 상이한 2 종의 프로브 (50 염기의 아렐 검출용 프로브, Infinium I 타입) 를 사용한다. 미리, 게놈 DNA 의 전체 게놈 증폭을 실시하고, 효소로 단편화한다. 프로브와 단편화 게놈 DNA 의 하이브리다이즈 후, 아렐 특이적 신장 반응이 일어나고, 1 종류의 형광 색소로 표지된 다형 부위의 1 염기분 하류 (3' 측) 의 염기가 프로브에 대응하여 투입된다. 또 다른 방법으로는, 프로브 내에 1 염기 다형의 아렐 특이적인 배열을 갖지 않는 1 종의 프로브를 사용한다 (50 염기의 아렐 검출용 프로브, Infinium II 타입). 이 프로브의 3' 말단은 다형 부위로부터 1 염기분 상류 (5' 측) 까지의 배열로 되어 있다. 프로브와 단편화 게놈 DNA 를 하이브리다이즈시키고, 1 염기 신장 반응에 의해, 2 종류의 형광 색소 중 어느 1 개로 표지된 염기가 목적으로 하는 1 염기 다형 부위에 대응하여 투입된다. 어느 방법으로도, 형광을 모두 초점 레이저 스캐너로 검출함으로써 아렐과 유전자형의 판정을 실시한다.
또한, 상기의 하이브리다이즈 방법으로 사용되는 프로브의 길이나 수식 등의 특성의 상세한 것에 대해서는 후술한다.
또, 프로브에 의한 하이브리다이즈를 실시하지 않는 방법으로서는, PCR-RFLP법, SSCP 법, 질량 분석법 및 다이렉트 시퀀스법을 들 수 있다.
PCR-RFLP 법이란, 다형을 갖는 핵산 분자에 있어서, 다형이 제한 효소의 절단 부위에 존재하기 때문에, 효소 소화에 의해 상이한 DNA 단편이 생성되고, 그 전기 영동 패턴의 차이로부터 다형의 유무를 판정하는 방법이다. 목적으로 하는 핵산 분자를 PCR 로 증폭시키고, 이 증폭 단편을 제한 효소로 절단하여, 전기 영동으로 생성한 단편을 해석한다. 증폭되는 다형을 함유하는 핵산 분자의 길이는, 통상적으로 50 ∼ 10,000 염기쌍이고, 바람직하게는 100 ∼ 1,000 염기쌍이다.
SSCP 법이란, 다형을 갖는 핵산 분자를 PCR 로 증폭시키고, 1 개 사슬 DNA 로 한 후 전기 영동을 실시하고, 그 전기 영동 패턴의 차이로부터 다형의 유무를 판정하는 방법이다. 목적으로 하는 핵산 분자를 PCR 로 증폭시키고, 이 증폭 단편을 열이나 알칼리 처리에 의해 1 개 사슬 DNA 로 한다. 이 1 개 사슬 DNA 는 염기 배열 특이적인 고차 구조를 형성하므로, 이들 증폭 단편을 전기 영동하면, 그 구조의 차이에 의해 전기 영동도에 차가 확인된다. PCR 에 사용하는 프라이머는, 방사성 동위 원소 또는 형광 물질로 표지되어 있다. 또, 증폭되는 다형을 함유하는 핵산 분자의 길이는, 통상적으로 50 ∼ 10,000 염기쌍이고, 바람직하게는 100 ∼ 1,000 염기쌍이다.
질량 분석법이란, 고분자를 매트릭스와 레이저 등으로 이온화시키고, 고전계장(高電界場) 중을 가속하여 검출기까지 비행시키고, 그 비행 시간의 차이 등에 의해 질량을 동정하는 방법이다. 이 질량 분석법을, 상기의 프라이머 익스텐션법 등과 조합하여 다형을 검출한다. 구체적으로는, 다형을 갖는 핵산 분자의 다형 부위의 1 염기 상류까지의 배열과 상보적인 프라이머, 4 종의 디데옥시리보뉴클레오티드 중 어느 것, 및, 그것에 대응하는 것 이외의 데옥시리보 핵산을 이용하여 1 염기의 신장 반응을 실시하고, 3' 말단에 투입된 배열이 상이한 핵산 생성물의 질량 차이를 측정함으로써 다형을 동정할 수 있다.
다이렉트 시퀀스법이란, 다형을 갖는 핵산 분자의 염기 배열을 직접 판독하는 방법이다. 대표적인 방법은, 생어법 (디데옥시법) 이라고 한다. 무표지, 또는 방사성 동위 원소 혹은 형광 물질로 표지한 프라이머를 목적으로 하는 핵산 분자에 결합시켜, 크레노 효소 등에 의한 신장 반응을, 무표지, 또는 방사성 동위 원소 혹은 형광 물질로 표지한 4 종의 디데옥시리보뉴클레오티드로 정지시킨 후, 제한 효소로 소화시켜, 발생된 DNA 단편을 전기 영동으로 분리한다. 전기 영동 이미지를 기초로, 저분자량의 단편으로부터 순서대로 3' 말단의 염기 배열을 판독함으로써, 다형을 포함하는 전후의 염기 배열을 결정한다. 이 변법으로서 프라이머 익스텐션법으로 불리는 경우가 있다. 이것은, 다형을 갖는 핵산 분자의 다형 부위의 1 염기 상류까지의 배열과 상보적인 프라이머를 이용하여 1 염기의 신장 반응을 실시하고, 3' 말단에 투입된 4 종의 디데옥시리보뉴클레오티드 중 어느 것의 배열을 판독하는 방법이다. 이 디데옥시리보뉴클레오티드의 동정에는 여러 가지 방법이 있는데, 예를 들어, 4 종의 뉴클레오티드를 상이한 형광 물질로 표지하고, 전기 영동에 의해 분리·동정한다. 또, 신장 반응시에 생성되는 피로인산을 ATP 로 변환시키고, 그 ATP 를 루시페라아제의 발광에 의해 동정하는 수법도 사용된다. 신장 반응에 사용하는 프라이머의 길이는, 통상적으로 10 ∼ 300 염기쌍이고, 바람직하게는 15 ∼ 25 염기쌍이다.
본 발명에 있어서, 하이브리다이즈란, 어느 배열을 갖는 핵산 분자와, 그 핵산 분자의 적어도 일부분에 대해 상보적인 핵산 분자가 서로 상보적인 염기 배열에 기초하여 수소 결합을 개재하여 회합하는 것을 의미한다. 원래의 핵산 분자와 회합하는 상보적인 핵산 분자의 종류는 동일해도 되고 상이해도 되고, 이들 핵산 분자를 구성하는 핵산은 데옥시리보 핵산, 리보 핵산 또는 펩티드 핵산일 수 있다. 이들 핵산 분자에 있어서, 리보 핵산에 대해 언급하는 경우에는, 핵산 분자의 배열 (상보적 배열을 포함한다) 에 있어서, 티민은 우라실로 재판독해도 되는 것으로 한다.
본 발명에 있어서 스트린젠트한 조건이란, 어느 배열을 갖는 핵산 분자에, 상기 핵산 분자의 부분 배열과 상보적인 배열을 갖는 핵산 분자가 특이적으로 하이브리다이즈되는 조건을 의미한다 (Fred M.Ausuble et al., Current Protocols in Molecular Biology, p2.10.1-2.10.16, John Wiley and Sons, Inc). 이와 같은 조건의 구체예로서는, 어느 배열을 갖는 핵산 분자와, 당해 핵산 분자에 하이브리다이즈시키는 상보적인 핵산 분자의 복합체의 융해 온도 (Tm) 보다 바람직하게는 약 5 ∼ 약 30 ℃, 보다 바람직하게는 약 10 ℃ ∼ 약 25 ℃ 낮은 온도, 0.01 ∼ 6 배 농도의 SSC (염화 나트륨, 구연산 나트륨 혼합 용액), SSPE (염화 나트륨, 인산 2 수소 나트륨 및 EDTA 혼합 용액) 또는 MES (2-(N-Morpholino) ethanesulfonic Acid 및 염화 테트라메틸암모늄 혼합 용액) 완충액과 같은 하이브리다이즈용 반응 용액, 및, pH 6 ∼ 8 의 수소 이온 농도와 같은 조건을 들 수 있다. 예를 들어, 25 bp 의 DNA 프로브를 고층화시킨 고층화 프로브의 경우의 스트린젠트한 조건은, 1 배 농도의 MES 완충액 중 (수소 이온 농도는 6.5 ∼ 6.7) 49 ℃ 에서 하이브리다이즈하고, 6 배 농도의 SSC (수소 이온 농도는 8.0), 25 ℃, 이어서 0.6 배 농도의 SSC (수소 이온 농도는 8.0), 45 ℃ 에서 순서대로 세정하는 조건을 들 수 있다.
본 발명에 있어서 아렐 특이적 (또는, 아렐에 특이적) 이란, 당해 다형 부위를 함유하는 게놈 유래의 배열 혹은 조제된 핵산 분자에 있어서 당해 아렐을 함유하는 것, 또는 어느 핵산 분자가 당해 다형 부위에 있어서, 당해 아렐을 함유하는 배열을 갖는 핵산 분자에 스트린젠트한 조건 하에서 특이적으로, 즉, 당해 아렐과 대립하는 아렐을 식별할 수 있도록 하이브리다이즈시키는 것을 말한다.
본 발명에서 개시된, 녹내장의 발증에 관련되는 1 염기 다형을 포함하는 61 염기 길이의 핵산 배열은, 그 중앙 (즉, 31 번째) 의 염기만이 상이한 2 세트의 염기 배열의 세트 (배열 번호가 홀수 번째와 짝수 번째의 세트) 로 이루어지고, 당해 31 번째의 염기가 다형 부위이다. 다형 부위에 있어서의 하이리스크 아렐은 후술하는 표 1 ∼ 2 또는 표 52 ∼ 63 에 기재되어 있다. 이들 임의의 1 염기 다형에 대해, 녹내장 환자에서 고빈도로 존재하는 아렐의 존재를 판정하는 경우, 샘플 중의 하이리스크 아렐을 검출함으로써, 녹내장의 환자에게 고빈도로 존재하는 아렐의 존재를 판정할 수 있다.
또, 상기에서 동정한 임의의 녹내장의 발증에 관련되는 1 염기 다형에 대해, 1 개의 샘플에 함유되는 대립하는 각각의 아렐의 유무를 검출하여, 유전자형을 결정할 수 있다. 즉, 어느 아렐만이 검출되는 경우에는 당해 아렐의 호모형이고, 2 개의 아렐이 검출되는 경우에는 당해 2 개의 아렐을 갖는 헤테로형이다. 이들 1 염기 다형의 적어도 1 개에 대해, 유전자형을 검출함으로써, 샘플 중에, 비환자군보다도 녹내장 환자군에서 고빈도로 확인되는 유전자형이 존재하는지의 여부를 판정할 수 있다. 즉, 상기 1 염기 다형에 있어서, 하이리스크 아렐이 우성 유전 모델에 따르는 경우, 하이리스크 아렐의 호모형 또는 헤테로형이 비환자군보다도 녹내장 환자군에서 고빈도로 확인되는 유전자형이고, 하이리스크 아렐이 열성 유전 모델에 따르는 경우, 하이리스크 아렐의 호모형이 비환자군보다도 녹내장 환자군에서 고빈도로 확인되는 유전자형이다. 대립하는 각각의 아렐을 동일 조작으로 측정하는 것은, 판정의 오차를 저감시키는 관점에서도 바람직하다.
이와 같이 하여 샘플의 분석을 실시하고, 샘플 중에 비환자군보다도 녹내장 환자군에서 고빈도로 확인되는 아렐 또는 유전자형이 존재하는 경우, 당해 샘플을 제공한 현시점에서 녹내장으로 이환되지 않은 사람은 녹내장의 발증 리스크가 높은 것으로 예측되고, 또, 시야 검사 등의 녹내장의 정밀 검사가 필요한 것으로 판정되어, 당해 샘플을 제공한 녹내장이 의심되는 사람은 녹내장으로 진단되어야 하는 개연성이 높다.
본 발명의 녹내장에 관련되는 1 염기 다형의 검출 방법 및 녹내장의 발증 리스크의 예측 방법에 있어서, 검출에 사용되는 1 염기 다형은, 배열 번호 203 ∼ 514 로 나타내는 염기 배열로 이루어지는 군에서 선택되는, 적어도 1 개의 염기 배열 또는 그 상보적 배열에 있어서, 각 염기 배열의 31 번째에 존재하는 1 염기 다형이고,
보다 바람직하게는, 배열 번호 203 ∼ 238 로 나타내는 염기 배열로 이루어지는 군에서 선택되는, 적어도 1 개의 염기 배열 또는 그 상보적 배열에 있어서, 각 염기 배열의 31 번째에 존재하는 1 염기 다형이고,
더욱 바람직하게는, 이하의, 1 염기 다형을 포함하는 염기 배열의 세트로 이루어지는 군에서 선택되는, 적어도 1 개의 염기 배열 또는 그 상보적 배열에 있어서, 각 염기 배열의 31 번째에 존재하는 1 염기 다형이다. (여기에서, 상기 서술한 바와 같이, a ∼ r 로 나타내는 배열 번호의 세트에 있어서, 각각의 배열의 세트가 1 개의 1 염기 다형에 대응하고 있고, 각각의 염기 배열은 상기 1 염기 다형의 서로 대립하는 아렐을 31 번째의 염기에 포함하는 염기 배열이다)
a : 배열 번호 203 및/또는 배열 번호 204,
b : 배열 번호 205 및/또는 배열 번호 206,
c : 배열 번호 207 및/또는 배열 번호 208,
d : 배열 번호 209 및/또는 배열 번호 210,
e : 배열 번호 211 및/또는 배열 번호 212,
f : 배열 번호 213 및/또는 배열 번호 214,
g : 배열 번호 215 및/또는 배열 번호 216,
h : 배열 번호 217 및/또는 배열 번호 218,
i : 배열 번호 219 및/또는 배열 번호 220,
j : 배열 번호 221 및/또는 배열 번호 222,
k : 배열 번호 223 및/또는 배열 번호 224,
l : 배열 번호 225 및/또는 배열 번호 226,
m : 배열 번호 227 및/또는 배열 번호 228,
n : 배열 번호 229 및/또는 배열 번호 230,
o : 배열 번호 231 및/또는 배열 번호 232,
p : 배열 번호 233 및/또는 배열 번호 234,
q : 배열 번호 235 및/또는 배열 번호 236, 그리고,
r : 배열 번호 237 및/또는 배열 번호 238
상기 중 어느 것의 1 염기 다형을 사용하는 경우, 그 중에서도, 이하의 1 염기 다형을 포함하는 염기 배열로 이루어지는 군에서 선택되는, 적어도 1 개의 염기 배열 또는 그 상보적 배열에 있어서, 각 염기 배열의 31 번째에 존재하는 1 염기 다형의 아렐을 사용하는 것이 바람직하다.
배열 번호 203, 배열 번호 206, 배열 번호 208, 배열 번호 209, 배열 번호 211, 배열 번호 214, 배열 번호 216, 배열 번호 218, 배열 번호 219, 배열 번호 221, 배열 번호 224, 배열 번호 226, 배열 번호 228, 배열 번호 229, 배열 번호 231, 배열 번호 234, 배열 번호 235, 배열 번호 238
또한, 이들은 각각의 다형 부위에 있어서, 하이리스크 아렐을 포함하는 배열이다.
또한, 1 개의 샘플을 이용하고, 본 발명의 녹내장에 관련되는 아렐 또는 유전자형의 2 개 이상을 조합하여 검출함으로써, 장래적인 녹내장의 발증 리스크 판정의 정밀도를 향상시킬 수도 있다.
조합하는 1 염기 다형은, 본 발명의 1 염기 다형이면 사용되는데, 바람직하게는 p 값이 낮은 1 염기 다형이고, 보다 바람직하게는 상기 서술한 만텔 헨젤법 등의 메타 해석법에 의해 2 회의 해석에서 얻어진 결과를 통합하여 얻어진 p 값에 대해 본페로니 보정 수준 하에서도 유의한 것으로 판단되는 1 염기 다형이다. 또, 다른 관점에서는, 후술하는 로지스틱 회귀 분석에 의해, 조합에 의한 리스크 예측 정밀도의 향상에 기여하는 것이 확인되는 1 염기 다형을 사용하는 것도 바람직하다. 한편, 상기 서술한 연쇄 불평형 상태에 있는 1 염기 다형은 동일한 거동을 나타냄으로써, 연쇄 불평형 상태에 있는 1 염기 다형을 복수 조합하는 경우에는, 동일한 영역에 기초하는 녹내장 리스크를 필요 이상으로 무겁게 평가하는 경우가 있다. 본 발명의 1 염기 다형을 조합하여 질환의 리스크 예측을 실시하는 경우로서, 모든 리스크를 균등한 가중으로 평가하고자 하는 경우에는, 상기 서술한 연쇄 불평형 상태에 있는 1 염기 다형이 복수 함유되는 경우, 당해 연쇄 불평형 상태에 있는 1 염기 다형 중 어느 1 개만을 이용하여 예측을 실시하는 것도 바람직하다.
본 발명의 임의의 2 개 이상의 1 염기 다형의 조합에 의해 리스크 예측을 실시하는 경우, 로지스틱 회귀 분석에 의해 구해지는 회귀식을 이용하여 녹내장의 발증 리스크를 예측할 수 있다. 즉, 상기 임의의 2 개 이상의 1 염기 다형의 각각을 독립 변수 (Π) 로 하고 (일방의 아렐의 호모형=0, 헤테로형=1, 대립 아렐의 호모형=2 로 한다), 로지스틱 회귀 분석에 의해 회귀식을 구한다. 각 샘플에 있어서, 각 1 염기 다형에 대응하는 값을 이 식에 대입하여 종속 변수 (Φ) 를 계산한다. 종속 변수 (Φ) 가 일정한 임계값 (예를 들어 0.5) 보다 클 때 이 샘플의 제공자가 발증 리스크를 갖는 것으로 판단할 수 있다.
본 발명의 녹내장에 관련되는 1 염기 다형의 검출 방법 및 녹내장의 발증 리스크의 예측 방법에 있어서, 임의의 2 개 이상의 1 염기 다형을 조합하는 경우, 검출에 사용되는 1 염기 다형은, 바람직하게는 배열 번호 203 ∼ 514 로 나타내는 염기 배열로 이루어지는 군에서 선택되는, 2 개 이상의 상이한 1 염기 다형을 포함하는 염기 배열 또는 그 상보적 배열에 있어서, 각 염기 배열의 31 번째에 존재하는 1 염기 다형이고,
보다 바람직하게는, 배열 번호 203 ∼ 238 로 나타내는 염기 배열로 이루어지는 군에서 선택되는, 2 개 이상의 상이한 1 염기 다형을 포함하는 염기 배열 또는 그 상보적 배열에 있어서, 각 염기 배열의 31 번째에 존재하는 1 염기 다형이고,
더욱 바람직하게는, 이하의, 1 염기 다형을 포함하는 염기 배열의 세트로 이루어지는 군에서 선택되는, 2 개 이상의 상이한 1 염기 다형을 포함하는 염기 배열 또는 그 상보적 배열에 있어서, 각 염기 배열의 31 번째에 존재하는 1 염기 다형이며, (여기에서, 상기 서술한 바와 같이, a ∼ r 로 나타내는 배열 번호의 세트에 있어서, 각각의 배열의 세트가 1 개의 1 염기 다형에 대응하고 있고, 각각의 염기 배열은 상기 1 염기 다형의 서로 대립하는 아렐을 31 번째의 염기에 포함하는 염기 배열이다)
a : 배열 번호 203 및/또는 배열 번호 204,
b : 배열 번호 205 및/또는 배열 번호 206,
c : 배열 번호 207 및/또는 배열 번호 208,
d : 배열 번호 209 및/또는 배열 번호 210,
e : 배열 번호 211 및/또는 배열 번호 212,
f : 배열 번호 213 및/또는 배열 번호 214,
g : 배열 번호 215 및/또는 배열 번호 216,
h : 배열 번호 217 및/또는 배열 번호 218,
i : 배열 번호 219 및/또는 배열 번호 220,
j : 배열 번호 221 및/또는 배열 번호 222,
k : 배열 번호 223 및/또는 배열 번호 224,
l : 배열 번호 225 및/또는 배열 번호 226,
m : 배열 번호 227 및/또는 배열 번호 228,
n : 배열 번호 229 및/또는 배열 번호 230,
o : 배열 번호 231 및/또는 배열 번호 232,
p : 배열 번호 233 및/또는 배열 번호 234,
q : 배열 번호 235 및/또는 배열 번호 236, 그리고,
r : 배열 번호 237 및/또는 배열 번호 238
더욱 바람직하게는, 상기 1 염기 다형을 포함하는 염기 배열의 세트로 이루어지는 군에서 선택되는, 10 개 이상의 상이한 1 염기 다형을 포함하는 염기 배열 또는 그 상보적 배열에 있어서, 각 염기 배열의 31 번째에 존재하는 1 염기 다형이고,
더욱 바람직하게는, 상기 1 염기 다형을 포함하는 염기 배열의 세트로 이루어지는 군에서 선택되는, 모든 상이한 1 염기 다형을 포함하는 염기 배열 또는 그 상보적 배열에 있어서, 각 염기 배열의 31 번째에 존재하는 1 염기 다형이다.
또, 조합에 사용하는 1 염기 다형은 연쇄 불평형 상태에 없는 것을 사용하는 것이 바람직하고, 이 관점에서는 상기 조합의 모든 양태에 있어서,
a : 배열 번호 203 및/또는 배열 번호 204, 그리고
b : 배열 번호 205 및/또는 배열 번호 206
으로 이루어지는 군에 속하는 염기 배열 또는 그 상보적 배열에 있어서, 각 염기 배열의 31 번째에 존재하는 1 염기 다형으로 이루어지는 군을 군 1 의 1 염기 다형으로 하고,
c : 배열 번호 207 및/또는 배열 번호 208, 그리고
d : 배열 번호 209 및/또는 배열 번호 210
으로 이루어지는 군에 속하는 염기 배열 또는 그 상보적 배열에 있어서, 각 염기 배열의 31 번째에 존재하는 1 염기 다형으로 이루어지는 군을 군 2 의 1 염기 다형으로 하고,
j : 배열 번호 221 및/또는 배열 번호 222,
k : 배열 번호 223 및/또는 배열 번호 224, 그리고
l : 배열 번호 225 및/또는 배열 번호 226
으로 이루어지는 군에 속하는 염기 배열 또는 그 상보적 배열에 있어서, 각 염기 배열의 31 번째에 존재하는 1 염기 다형으로 이루어지는 군을 군 3 의 1 염기 다형으로 하고,
o : 배열 번호 231 및/또는 배열 번호 232,
p : 배열 번호 233 및/또는 배열 번호 234,
q : 배열 번호 235 및/또는 배열 번호 236, 그리고,
r : 배열 번호 237 및/또는 배열 번호 238
로 이루어지는 군에 속하는 염기 배열 또는 그 상보적 배열에 있어서, 각 염기 배열의 31 번째에 존재하는 1 염기 다형으로 이루어지는 군을 군 4 의 1 염기 다형으로 하고,
군 1 에 속하는 1 염기 다형을 사용하는 경우에는, 군 1 중 어느 1 개의 1 염기 다형을,
군 2 에 속하는 1 염기 다형을 사용하는 경우에는, 군 2 중 어느 1 개의 1 염기 다형을,
군 3 에 속하는 1 염기 다형을 사용하는 경우에는, 군 3 중 어느 1 개의 1 염기 다형을, 및/또는,
군 4 에 속하는 1 염기 다형을 사용하는 경우에는, 군 4 중 어느 1 개의 1 염기 다형을 사용하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 조합의 모든 양태에 있어서, 이하의 1 염기 다형을 포함하는 염기 배열로 이루어지는 군에서 선택되는, 2 개 이상의 상이한 1 염기 다형을 포함하는 염기 배열 또는 그 상보적 배열에 있어서, 각 염기 배열의 31 번째에 존재하는 1 염기 다형의 아렐이 바람직하다.
배열 번호 203, 배열 번호 206, 배열 번호 208, 배열 번호 209, 배열 번호 211, 배열 번호 214, 배열 번호 216, 배열 번호 218, 배열 번호 219, 배열 번호 221, 배열 번호 224, 배열 번호 226, 배열 번호 228, 배열 번호 229, 배열 번호 231, 배열 번호 234, 배열 번호 235, 및 배열 번호 238
또한, 이들의 염기 배열은 각각의 다형 부위에서 하이리스크 아렐을 갖는 염기 배열이다.
(녹내장에 관련되는 아렐을 검출할 수 있는 프로브)
본 발명의 다른 양태에서는, 녹내장에 관련되는 아렐을 검출할 수 있는 아렐 특이적인 핵산 분자 또는 프로브 (이하, 프로브로 기재), 및, 상기 프로브를 이용하여 녹내장에 관련되는 아렐 또는 유전자형을 검출하는 방법이 제공된다.
프로브는, 본 발명의 녹내장에 관련되는 1 염기 다형의 다형 부위에 있어서의, 아렐 특이적인 배열과 스트린젠트한 조건으로 하이브리다이즈시킬 수 있는 것이면 어떠한 것이라도 사용된다. 다형 부위의 아렐의 결정은, 게놈의 센스 사슬, 안티센스 사슬의 어느 다형 부위를 검출함으로써도 실시할 수 있기 때문에, 본 발명의 프로브는 센스 사슬의 아렐에 특이적인 배열의 상보적 배열 및 안티센스 사슬의 아렐의 특이적인 배열에 상보적 배열, 즉 센스 사슬의 아렐에 특이적인 배열이 모두 포함된다. 본 발명의 프로브는 본 발명의 1 염기 다형을 함유하는 cDNA 또는 mRNA 의 검출에 사용할 수 있다. cDNA 또는 mRNA 의 검출에 사용하는 경우, 당해 1 염기 다형은 엑손 또는 그 근방에 존재하는 것이 사용된다.
후술하는 표 1 ∼ 2, 표 5 ∼ 25, 표 26 ∼ 28, 표 29 ∼ 51 또는 표 52 ∼ 62 에 기재된 1 염기 다형의 각 아렐 또는 그 상보 사슬을 검출할 수 있는 프로브, 및 후술하는 표 3 ∼ 4 또는 표 63 ∼ 70 에 기재된 녹내장에 관련되는 영역에 존재하는 임의의 1 염기 다형의 각 아렐 또는 그 상보 사슬을 특이적으로 검출할 수 있는 프로브는 모두 본 발명의 프로브에 포함된다. 본 발명의 프로브는, 예를 들어 50 만개의 1 염기 다형의 각 아렐 또는 그 상보 사슬을 특이적으로 검출할 수 있는 프로브가 1 회의 조작으로 검출되는 마이크로 어레이를 사용하여 1 회의 해석에서 얻어진 결과에 기초하는 경우, 바람직하게는 p 값이 1×10-3 이하인 1 염기 다형의 각 아렐 또는 그 상보 사슬을 특이적으로 검출할 수 있는 프로브이고, 보다 바람직하게는 p 값이 3×10-4 이하인 1 염기 다형의 각 아렐 또는 그 상보 사슬을 특이적으로 검출할 수 있는 프로브이고, 더욱 바람직하게는 p 값이 1×10-4 이하인 1 염기 다형의 각 아렐 또는 그 상보 사슬을 특이적으로 검출할 수 있는 프로브이고, 더욱 바람직하게는 p 값이 3×10-5 이하인 1 염기 다형의 각 아렐 또는 그 상보 사슬을 특이적으로 검출할 수 있는 프로브이다. 만텔 헨젤법 등의 메타 해석 수법에 의해, 복수의 해석 결과를 통합하여 얻은 것인 경우에는, 바람직하게는 p 값이 1×10-2 이하인 1 염기 다형의 각 아렐 또는 그 상보 사슬을 특이적으로 검출할 수 있는 프로브이고, 보다 바람직하게는 p 값이 3×10-3 이하인 1 염기 다형의 각 아렐 또는 그 상보 사슬을 특이적으로 검출할 수 있는 프로브이고, 더욱 바람직하게는 p 값이 1×10-3 이하인 1 염기 다형의 각 아렐 또는 그 상보 사슬을 특이적으로 검출할 수 있는 프로브이고, 더욱 바람직하게는 p 값이 3×10-4 이하인 1 염기 다형의 각 아렐 또는 그 상보 사슬을 특이적으로 검출할 수 있는 프로브이고, 더욱 바람직하게는 p 값이 1×10-4 이하인 1 염기 다형의 각 아렐 또는 그 상보 사슬을 특이적으로 검출할 수 있는 프로브이다.
본 발명에 있어서의 프로브는, 바람직하게는 아렐 특이적인 배열 또는 그 상보 사슬을 포함하고, 더욱 바람직하게는 본 발명에 있어서의 프로브에 있어서, 아렐 특이적인 하이브리다이즈에 기여하는 배열은 아렐 특이적인 배열 또는 그 상보 사슬만으로 이루어진다. 본 발명에 있어서의 프로브에는, 아렐 특이적인 배열과 스트린젠트한 조건으로 하이브리다이즈할 수 있는 범위에 있어서, 말단에 스페이서 또는 안정화 등에 제공하는 목적으로 당해 배열에서 유래하지 않는 임의의 수 염기의 배열을 부가할 수 있다. 부가되는 배열은, 바람직하게는 헤어핀 구조 등의 3 차원 구조를 취하지 않는 배열이다.
프로브에는 검출에 사용하기 위한 임의의 표지를 실시할 수 있다. 프로브에 실시하는 표지는 통상적으로 사용되는 어떠한 것이라도 이용할 수 있는데, 일반적으로는 FITC 나 Cy3 등의 형광 표지, 비오틴, 또는 알카리포스포타아제나 서양 와사비 페록시다아제 등의 효소 표지 등이 사용된다. 비오틴 표지를 사용하는 경우에는, 비오틴에 특이적으로 결합하는 스트렙토아비딘에 추가로 검출할 수 있는 표지를 실시해두고, 당해 표지 스트렙토아비딘을 2 차 표지로서 사용한다. 표지 스트렙토아비딘 대신에 표지 항비오틴 항체를 사용할 수도 있다. 프로브에 표지를 실시하는 방법은 공지된 어떤 방법이라도 이용되고, 그 방법은 당업자에게서 주지된 사실이다. 프로브에 상기 서술한 스페이서가 되는 임의의 배열을 부가하고, 스페이서에 표지를 실시할 수도 있다. 프로브의 표지화용 시약, 표지 스트렙토아비딘, 표지 항비오틴 항체 등은 시약으로서 시판되고 있어 구입할 수도 있다.
본 발명에 있어서의 프로브는, 목적으로 하는 아렐을 갖는 핵산 분자에 특이적으로 하이브리다이즈할 수 있는 한, 데옥시리보 핵산, 리보 핵산, 또는 펩티드 핵산인지에 상관없이, 이들 혼합 배열을 포함하는 프로브도 또한 본 발명에 포함된다. 여기에서, 본 발명의 프로브에 리보 핵산을 함유하는 프로브를 사용하는 경우에는, 본 발명의 프로브의 배열 (상보적 배열을 포함한다) 에 있어서, 티민은 우라실로 재판독해도 되는 것으로 한다. 또, 본 발명에 있어서의 프로브에는, 목적으로 하는 아렐을 갖는 핵산 분자에 스트린젠트한 조건 하에서 특이적으로 하이브리다이즈시킬 수 있는 한, 필요에 따라 화학 수식을 실시할 수도 있다. 화학 표지를 실시하는 방법은 공지된 어떠한 방법도 사용된다.
검출용 프로브는, 용액 상태에서 샘플과 반응시켜 공지된 방법으로 검출하는 것도, 미리 담체 상에 고층화해두는 것도 가능하다. 수 개 내지 수십만 개의 상이한 1 염기 다형의 각각의 아렐에 대응하는 프로브를, 하나의 1 염기 다형당 1 개 내지 수십 개씩 미리 고체의 담체 상의 정해진 위치에 고층화시켜두고, 샘플을 이것에 반응시켜, 하이브리다이즈된 프로브에서 발생되는 시그널을 스캔하여 컴퓨터를 이용하여 해석하는 고층화 프로브, 이른바 마이크로 어레이의 형태를 취할 수도 있다. 고층화 프로브의 형태를 취하는 경우에는, 고층화되는 프로브의 최대수는 프로브의 고층화 밀도와 고층화 부위의 면적에 의해 제한된다.
이와 같은 고층화 프로브의 형태를 취하는 경우, 샘플 중의 핵산 분자를 공지된 방법으로 표지화시켜두고, 고층화된 본 발명의 비표지 프로브와 결합시킴으로써, 또는 검출해야 하는 아렐을 갖는 핵산 분자를 고층화된 본 발명의 비표지 프로브와 결합시킨 후에 공지된 방법으로 표지화시킴으로써, 표지된 표적 아렐을 갖는 핵산 분자 유래의 고층 상의 시그널을 검출할 수 있다.
고층화는 공지된 어떠한 방법에 의해서도 실시할 수 있는데, 예를 들어 합성 올리고 프린트, 스포팅 포토리소그래피 등의 방법을 사용할 수 있다. 또, 담체의 재질에는 제한이 없고, 일반적으로 사용되는 재질, 예를 들어 폴리카보네이트나 폴리스티렌 등의 고분자, 유리, 실리콘 결정 등이 사용된다. 또, 핵산의 접착력을 높이기 위해, 고층화 전에 담체에 미리 양이온화 등의 코팅을 실시해도 된다. 또, 비특이적인 핵산의 담체에 대한 흡착을 방지하기 위해 고층화를 실시한 후에 공지된 블로킹제에 의해 블로킹을 실시할 수도 있다. 이와 같은 블로킹제로는, 비특이적인 핵산의 담체에 대한 흡착을 억제할 수 있는 것이면 무엇이든지 사용할 수 있는데, 예를 들어 연어 정자 DNA, 덴하르트 용액, 인간 태반에서 추출한 Cot-I DNA, 도데실 황산나트륨 등의 음이온성 계면 활성제, 폴리옥시에틸렌소르비탄모노라우레이트 등의 비이온성 계면 활성제 등을 사용할 수 있다.
또, 프로브를 고층화시키는 경우에는, 동일 담체 상에 대립하는 각각의 아렐에 특이적인 프로브를 고층화시킴으로써, 1 개의 샘플 중에 함유되는 대립하는 각각의 아렐을 동일 조작으로 검출하는 구성으로 할 수도 있다. 이와 같은 구성에서는, 샘플의 아렐뿐만 아니라 유전자형을 결정할 수도 있다.
아렐의 검출에 사용하는 프로브는, 바람직하게는 16 ∼ 55 염기, 보다 바람직하게는 23 ∼ 27 염기 또는 47 ∼ 53 염기, 더욱 바람직하게는 상기 서술한 다형 부위와 그 전후계 25 염기의 길이를 갖고, 또한 상기 서술한 다형 부위와 그 주변의 배열, 혹은 이것에 상보적인 배열을 포함하는 프로브인 것, 상기 서술한 다형 부위와 그 5' 상류측, 바람직하게는 49 염기의 배열 (50 염기의 배열) 을 갖고, 또한 상기 서술한 다형 부위와 그 주변의 배열, 혹은 이것에 상보적인 배열을 포함하는 프로브인 것, 또는 상기 서술한 다형 부위의 5' 상류측 50 염기의 배열을 갖고, 또한 상기 서술한 다형 부위에 인접하는 배열, 혹은 이것에 상보적인 배열을 포함하는 프로브인 것이 바람직하다.
아렐의 검출에 사용하는 더욱 바람직한 프로브는,
1) 상기 서술한 다형 부위와 그 전후 각 12 염기의 배열, 즉, 25 염기의 길이를 갖고, 또한 상기 서술한 다형 부위와 그 주변의 배열, 혹은 이것에 상보적인 배열을 포함하는, 당해 1 염기 다형의 아렐을 특이적으로 검출할 수 있는 프로브, 또는
2a) 상기 서술한 다형 부위와 그 5' 상류측 49 염기의 배열 (50 염기의 배열) 을 갖고, 또한 상기 서술한 다형 부위를 포함하는 배열 혹은 이것에 상보적인 배열로 이루어지는, 당해 1 염기 다형의 아렐을 특이적으로 검출할 수 있는 프로브, 혹은,
2b) 상기 서술한 다형 부위의 5' 상류측 50 염기의 배열을 갖고, 또한 상기 서술한 다형 부위에 인접하는 배열, 또는 이것에 상보적인 배열로 이루어지는, 당해 1 염기 다형의 아렐을 특이적으로 검출할 수 있는 프로브이다.
본 발명의 녹내장에 관련되는 1 염기 다형의 검출 방법 및 녹내장의 발증 리스크의 예측 방법에 있어서, 검출에 사용되는 프로브는, 배열 번호 203 ∼ 514 로 나타내는 염기 배열로 이루어지는 군에서 선택되는, 적어도 1 개의 염기 배열 혹은 그 상보적 배열 또는 이들의 부분 배열로 이루어지는 염기 배열에 있어서, 각 염기 배열의 31 번째에 존재하는 1 염기 다형을 함유하는 프로브, 및/또는, 배열 번호 515 ∼ 694 로 나타내는 염기 배열로 이루어지는 군에서 선택되는, 적어도 1 개의 염기 배열 또는 그 상보적 배열을 포함하는 염기 배열로 이루어지는 프로브이고,
보다 바람직하게는, 배열 번호 203 ∼ 238 로 나타내는 염기 배열로 이루어지는 군에서 선택되는, 적어도 1 개의 염기 배열 혹은 그 상보적 배열 또는 이들의 부분 배열로 이루어지는 염기 배열에 있어서, 각 염기 배열의 31 번째에 존재하는 1 염기 다형을 함유하는 프로브, 및/또는, 배열 번호 515 ∼ 535 로 나타내는 염기 배열로 이루어지는 군에서 선택되는, 적어도 1 개의 염기 배열 또는 그 상보적 배열을 포함하는 염기 배열로 이루어지는 프로브이고, 더욱 바람직하게는, 이하의 a ∼ r 의 1 염기 다형을 포함하는 염기 배열의 세트로 이루어지는 군 A 에서 선택되는, 적어도 1 개의 염기 배열 혹은 그 상보적 배열 또는 이들의 부분 배열로 이루어지는 염기 배열에 있어서, 각 염기 배열의 31 번째에 존재하는 1 염기 다형을 함유하는 프로브, 및/또는, aa ∼ rr 의 염기 배열 혹은 염기 배열의 세트로 이루어지는 군 B 에서 선택되는, 적어도 1 개의 염기 배열 혹은 염기 배열의 세트 또는 이들의 상보적 배열을 포함하는 배열로 이루어지는 프로브이다.
(여기에서, a ∼ r 로 나타내는 배열 번호의 세트에 있어서, 각각의 배열의 세트가 1 개의 1 염기 다형에 대응하고 있고, 각각의 염기 배열은 상기 1 염기 다형의 서로 대립하는 아렐을 31 번째의 염기에 포함하는 염기 배열이고,
aa ∼ rr 로 나타내는 배열 번호 또는 배열 번호의 세트에 있어서, 각각의 염기 배열 또는 염기 배열의 세트가 1 개의 1 염기 다형의 검출에 사용되는 프로브의 배열 또는 프로브의 배열의 세트이고,
a 와 aa, b 와 bb, c 와 cc, d 와 dd, e 와 ee, f 와 ff, g 와 gg, h 와 hh, i 와 ii, j 와 jj, k 와 kk, l 과 ll, m 과 mm, n 과 nn, o 와 oo, p 와 pp, q 와 qq, 및 r 과 rr 이 각각 동일한 1 염기 다형에 대응한다)
군 A
a : 배열 번호 203 및/또는 배열 번호 204,
b : 배열 번호 205 및/또는 배열 번호 206,
c : 배열 번호 207 및/또는 배열 번호 208,
d : 배열 번호 209 및/또는 배열 번호 210,
e : 배열 번호 211 및/또는 배열 번호 212,
f : 배열 번호 213 및/또는 배열 번호 214,
g : 배열 번호 215 및/또는 배열 번호 216,
h : 배열 번호 217 및/또는 배열 번호 218,
i : 배열 번호 219 및/또는 배열 번호 220,
j : 배열 번호 221 및/또는 배열 번호 222,
k : 배열 번호 223 및/또는 배열 번호 224,
l : 배열 번호 225 및/또는 배열 번호 226,
m : 배열 번호 227 및/또는 배열 번호 228,
n : 배열 번호 229 및/또는 배열 번호 230,
o : 배열 번호 231 및/또는 배열 번호 232,
p : 배열 번호 233 및/또는 배열 번호 234,
q : 배열 번호 235 및/또는 배열 번호 236, 그리고,
r : 배열 번호 237 및/또는 배열 번호 238
군 B
aa : 배열 번호 515, 및/또는, 배열 번호 533,
bb : 배열 번호 516,
cc : 배열 번호 517,
dd : 배열 번호 518, 및/또는, 배열 번호 534,
ee : 배열 번호 519,
ff : 배열 번호 520,
gg : 배열 번호 521,
hh : 배열 번호 522,
ii : 배열 번호 523,
jj : 배열 번호 524,
kk : 배열 번호 525,
ll : 배열 번호 526,
mm : 배열 번호 527,
nn : 배열 번호 528,
oo : 배열 번호 529,
pp : 배열 번호 530, 및/또는, 배열 번호 535,
qq : 배열 번호 531, 그리고
rr : 배열 번호 532
상기 중 어느 것의 1 염기 다형을 사용하는 경우, 그 중에서도, 군 A 에 있어서는 이하의 1 염기 다형을 포함하는 염기 배열로 이루어지는 군에서 선택되는, 적어도 1 개의 염기 배열 혹은 그 상보적 배열 또는 이들의 부분 배열로 이루어지는 염기 배열에 있어서, 각 염기 배열의 31 번째에 존재하는 1 염기 다형의 아렐을 함유하는 프로브를 사용하는 것이 바람직하고,
배열 번호 203, 배열 번호 206, 배열 번호 208, 배열 번호 209, 배열 번호 211, 배열 번호 214, 배열 번호 216, 배열 번호 218, 배열 번호 219, 배열 번호 221, 배열 번호 224, 배열 번호 226, 배열 번호 228, 배열 번호 229, 배열 번호 231, 배열 번호 234, 배열 번호 235, 및 배열 번호 238
군 B 에 있어서는, 이하의 염기 배열로 이루어지는 군에서 선택되는, 적어도 1 개의 염기 배열 또는 그 상보적 배열을 포함하는 염기 배열로 이루어지는 프로브가 바람직하다.
배열 번호 533, 배열 번호 516, 배열 번호 517, 배열 번호 518, 배열 번호 519, 배열 번호 520, 배열 번호 521, 배열 번호 522, 배열 번호 523, 배열 번호 524, 배열 번호 525, 배열 번호 526, 배열 번호 527, 배열 번호 528, 배열 번호 529, 배열 번호 535, 배열 번호 531, 및 배열 번호 532
또한, 이들의 염기 배열은 하이리스크 아렐의 검출에 사용되는 프로브에 대응하는 배열이다.
본 발명의 녹내장에 관련되는 1 염기 다형의 검출 방법 및 녹내장의 발증 리스크의 예측 방법에 있어서, 임의의 2 개 이상의 1 염기 다형을 조합하는 경우, 검출에 사용되는 프로브는, 바람직하게는 배열 번호 203 ∼ 514 로 나타내는 염기 배열로 이루어지는 군에서 선택되는, 1 염기 다형을 포함하는 염기 배열 혹은 그 상보적 배열 또는 이들의 부분 배열로 이루어지는 염기 배열에 있어서, 각 염기 배열의 31 번째에 존재하는 1 염기 다형을 함유하는 프로브, 및/또는, 배열 번호 515 ∼ 694 로 나타내는 염기 배열로 이루어지는 군에서 선택되는, 염기 배열 또는 그 상보적 배열을 포함하는 염기 배열로 이루어지는 프로브로서, 이들 중 2 개 이상의 상이한 1 염기 다형에 대응하는 프로브이고,
보다 바람직하게는, 배열 번호 203 ∼ 238 로 나타내는 염기 배열로 이루어지는 군에서 선택되는, 1 염기 다형을 포함하는 염기 배열 혹은 그 상보적 배열 또는 이들의 부분 배열로 이루어지는 염기 배열에 있어서, 각 염기 배열의 31 번째에 존재하는 1 염기 다형을 함유하는 프로브, 및/또는, 배열 번호 515 ∼ 535 로 나타내는 염기 배열로 이루어지는 군에서 선택되는, 염기 배열 또는 그 상보적 배열을 포함하는 염기 배열로 이루어지는 프로브로서, 이들 중 2 개 이상의 상이한 1 염기 다형에 대응하는 프로브이고,
더욱 바람직하게는, 이하의 a ∼ r 의 1 염기 다형을 포함하는 염기 배열의 세트로 이루어지는 군 A 에서 선택되는, 1 염기 다형을 포함하는 염기 배열 혹은 그 상보적 배열 또는 이들의 부분 배열로 이루어지는 염기 배열에 있어서, 각 염기 배열의 31 번째에 존재하는 1 염기 다형을 함유하는 프로브, 및/또는, aa ∼ rr 의 염기 배열 혹은 염기 배열의 세트로 이루어지는 군 B 에서 선택되는, 2 개 이상의 상이한 염기 배열 혹은 염기 배열의 세트 또는 이들의 상보적 배열을 포함하는 배열로 이루어지는 프로브이고,
(여기에서, a ∼ r 로 나타내는 배열 번호의 세트에 있어서, 각각의 배열의 세트가 1 개의 1 염기 다형에 대응하고 있고, 각각의 염기 배열은 상기 1 염기 다형의 서로 대립하는 아렐을 31 번째의 염기에 포함하는 염기 배열이고,
aa ∼ rr 로 나타내는 배열 번호 또는 배열 번호의 세트에 있어서, 각각의 염기 배열 또는 염기 배열의 세트가 1 개의 1 염기 다형의 검출에 사용되는 프로브의 배열 또는 프로브의 배열의 세트이고,
a 와 aa, b 와 bb, c 와 cc, d 와 dd, e 와 ee, f 와 ff, g 와 gg, h 와 hh, i 와 ii, j 와 jj, k 와 kk, l 과 ll, m 과 mm, n 와 nn, o 와 oo, p 와 pp, q 와 qq, 및, r 과 rr 이 각각 동일한 1 염기 다형에 대응한다)
군 A
a : 배열 번호 203 및/또는 배열 번호 204,
b : 배열 번호 205 및/또는 배열 번호 206,
c : 배열 번호 207 및/또는 배열 번호 208,
d : 배열 번호 209 및/또는 배열 번호 210,
e : 배열 번호 211 및/또는 배열 번호 212,
f : 배열 번호 213 및/또는 배열 번호 214,
g : 배열 번호 215 및/또는 배열 번호 216,
h : 배열 번호 217 및/또는 배열 번호 218,
i : 배열 번호 219 및/또는 배열 번호 220,
j : 배열 번호 221 및/또는 배열 번호 222,
k : 배열 번호 223 및/또는 배열 번호 224,
l : 배열 번호 225 및/또는 배열 번호 226,
m : 배열 번호 227 및/또는 배열 번호 228,
n : 배열 번호 229 및/또는 배열 번호 230,
o : 배열 번호 231 및/또는 배열 번호 232,
p : 배열 번호 233 및/또는 배열 번호 234,
q : 배열 번호 235 및/또는 배열 번호 236, 그리고,
r : 배열 번호 237 및/또는 배열 번호 238
군 B
aa : 배열 번호 515, 및/또는, 배열 번호 533,
bb : 배열 번호 516,
cc : 배열 번호 517,
dd : 배열 번호 518, 및/또는, 배열 번호 534,
ee : 배열 번호 519,
ff : 배열 번호 520,
gg : 배열 번호 521,
hh : 배열 번호 522,
ii : 배열 번호 523,
jj : 배열 번호 524,
kk : 배열 번호 525,
ll : 배열 번호 526,
mm : 배열 번호 527,
nn : 배열 번호 528,
oo : 배열 번호 529,
pp : 배열 번호 530, 및/또는, 배열 번호 535,
qq : 배열 번호 531, 그리고
rr : 배열 번호 532
더욱 바람직하게는, 상기 1 염기 다형을 포함하는 염기 배열의 세트로 이루어지는 군 A 에서 선택되는, 1 염기 다형을 포함하는 염기 배열 혹은 그 상보적 배열 또는 이들의 부분 배열로 이루어지는 염기 배열에 있어서, 각 염기 배열의 31 번째에 존재하는 1 염기 다형을 함유하는 프로브, 및/또는, 상기 염기 배열의 세트로 이루어지는 군 B 에서 선택되는 염기 배열 또는 그 상보적 배열을 포함하는 염기 배열로 이루어지는 프로브로서, 이들 중 10 개 이상의 상이한 1 염기 다형에 대응하는 프로브이고,
더욱 바람직하게는, 상기 1 염기 다형을 포함하는 염기 배열의 세트로 이루어지는 군 A 에서 선택되는, 1 염기 다형을 포함하는 염기 배열 혹은 그 상보적 배열 또는 이들의 부분 배열로 이루어지는 염기 배열에 있어서, 각 염기 배열의 31 번째에 존재하는 1 염기 다형을 함유하는 프로브, 및/또는, 상기 염기 배열의 세트로 이루어지는 군 B 에서 선택되는 염기 배열 또는 그 상보적 배열을 포함하는 염기 배열로 이루어지는 프로브로서, 이들의 모든 상이한 1 염기 다형에 대응하는 프로브이다.
또, 조합에 사용하는 1 염기 다형은 연쇄 불평형 상태가 아닌 것을 사용하는 것이 바람직하고, 이 관점에서는, 상기 조합의 모든 양태에 있어서,
상기 군 A 에 대해서는,
a : 배열 번호 203 및/또는 배열 번호 204, 그리고
b : 배열 번호 205 및/또는 배열 번호 206
으로 이루어지는 군에 속하는 염기 배열 혹은 그 상보적 배열 또는 이들의 부분 배열로 이루어지는 염기 배열에 있어서, 각 염기 배열의 31 번째에 존재하는 1 염기 다형을 포함하는 염기 배열로 이루어지는 군을 군 1 의 염기 배열로 하고,
c : 배열 번호 207 및/또는 배열 번호 208, 그리고
d : 배열 번호 209 및/또는 배열 번호 210
으로 이루어지는 군에 속하는 염기 배열 혹은 그 상보적 배열 또는 이들의 부분 배열로 이루어지는 염기 배열에 있어서, 각 염기 배열의 31 번째에 존재하는 1 염기 다형을 포함하는 염기 배열로 이루어지는 군을 군 2 의 염기 배열로 하고,
j : 배열 번호 221 및/또는 배열 번호 222,
k : 배열 번호 223 및/또는 배열 번호 224, 그리고
l : 배열 번호 225 및/또는 배열 번호 226
으로 이루어지는 군에 속하는 염기 배열 혹은 그 상보적 배열 또는 이들의 부분 배열로 이루어지는 염기 배열에 있어서, 각 염기 배열의 31 번째에 존재하는 1 염기 다형을 포함하는 염기 배열로 이루어지는 군을 군 3 의 염기 배열로 하고,
o : 배열 번호 231 및/또는 배열 번호 232,
p : 배열 번호 233 및/또는 배열 번호 234,
q : 배열 번호 235 및/또는 배열 번호 236, 그리고,
r : 배열 번호 237 및/또는 배열 번호 238
로 이루어지는 군에 속하는 염기 배열 혹은 그 상보적 배열 또는 이들의 부분 배열로 이루어지는 염기 배열에 있어서, 각 염기 배열의 31 번째에 존재하는 1 염기 다형을 포함하는 염기 배열로 이루어지는 군을 군 4 의 염기 배열로 하고,
상기 군 B 에 대해서는,
aa : 배열 번호 515, 및/또는, 배열 번호 533, 그리고,
bb : 배열 번호 516
으로 이루어지는 군에 속하는 염기 배열 또는 그 상보적 배열을 포함하는 염기 배열로 이루어지는 군을 군 1 의 염기 배열로 하고,
cc : 배열 번호 517, 그리고,
dd : 배열 번호 518, 및/또는, 배열 번호 534
로 이루어지는 군에 속하는 염기 배열 또는 그 상보적 배열을 포함하는 염기 배열로 이루어지는 군을 군 2 의 염기 배열로 하고,
jj : 배열 번호 524,
kk : 배열 번호 525, 및
ll : 배열 번호 526,
으로 이루어지는 군에 속하는 염기 배열 또는 그 상보적 배열을 포함하는 염기 배열로 이루어지는 군을 군 3 의 염기 배열로 하고,
oo : 배열 번호 529,
pp : 배열 번호 530, 및/또는, 배열 번호 535,
qq : 배열 번호 531, 그리고
rr : 배열 번호 532
로 이루어지는 군에 속하는 염기 배열 또는 그 상보적 배열을 포함하는 염기 배열로 이루어지는 군을 군 4 의 염기 배열로 하고,
군 1 에 속하는 염기 배열을 사용하는 경우에는, 군 1 중 어느 1 개의 염기 배열을 포함하는 프로브를 이용하고,
군 2 에 속하는 염기 배열을 사용하는 경우에는, 군 2 중 어느 1 개의 염기 배열을 포함하는 프로브를 이용하고,
군 3 에 속하는 염기 배열을 사용하는 경우에는, 군 3 중 어느 1 개의 염기 배열을 포함하는 프로브를 이용하고, 및/또는,
군 4 에 속하는 염기 배열을 사용하는 경우에는, 군 4 중 어느 1 개의 염기 배열을 포함하는 프로브를 이용하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 조합의 모든 양태에 있어서, 군 A 에 있어서는, 이하의 1 염기 다형을 포함하는 염기 배열로 이루어지는 군에서 선택되는, 1 염기 다형을 포함하는 염기 배열 혹은 그 상보적 배열 또는 이들의 부분 배열로 이루어지는 염기 배열에 있어서, 각 염기 배열의 31 번째에 존재하는 1 염기 다형의 아렐을 함유하는 프로브가 바람직하고,
배열 번호 203, 배열 번호 206, 배열 번호 208, 배열 번호 209, 배열 번호 211, 배열 번호 214, 배열 번호 216, 배열 번호 218, 배열 번호 219, 배열 번호 221, 배열 번호 224, 배열 번호 226, 배열 번호 228, 배열 번호 229, 배열 번호 231, 배열 번호 234, 배열 번호 235, 및 배열 번호 238
군 B 에 있어서는, 이하의 염기 배열로 이루어지는 군에서 선택되는 염기 배열 또는 그 상보적 배열을 포함하는 염기 배열로 이루어지는 프로브가 바람직하다.
배열 번호 533, 배열 번호 516, 배열 번호 517, 배열 번호 518, 배열 번호 519, 배열 번호 520, 배열 번호 521, 배열 번호 522, 배열 번호 523, 배열 번호 524, 배열 번호 525, 배열 번호 526, 배열 번호 527, 배열 번호 528, 배열 번호 529, 배열 번호 535, 배열 번호 531, 및, 배열 번호 532
또한, 이들의 염기 배열은 하이리스크 아렐의 검출에 사용되는 프로브에 대응하는 배열이다.
아렐의 검출에 태그맨법을 사용하는 경우의 프로브는, 통상적으로, 바람직하게는 10 ∼ 300 염기의 길이를 갖고, 또한 상기 서술한 다형 부위와 그 주변의 배열, 또는 이것에 상보적인 배열을 포함하고, 또한 형광 물질 및 소광 물자를 함유한다. 보다 바람직하게는 20 ∼ 60 염기의 길이를 갖고, 또한 상기 서술한 다형 부위와 그 주변의 배열, 또는 이것에 상보적인 배열을 포함하고, 또한 형광 물질 및 소광 물자를 함유한다.
아렐의 검출에 인베이더법을 사용하는 경우의 프로브는, 상기 서술한 다형 부위의 3' 측과 공통 배열을 갖는데, 5' 측의 배열이 완전히 상이한 프로브 (리포터) 와, 5' 측의 공통 배열만을 갖는 프로브 (인베이더) 로 이루어진다. 이들의 프로브는, 통상적으로, 바람직하게는 10 ∼ 300 염기의 길이를 갖고, 보다 바람직하게는 20 ∼ 60 염기의 길이를 갖는다.
아렐의 검출에 라이트사이클러법을 사용하는 경우의 프로브는, 통상적으로, 바람직하게는 10 ∼ 300 염기의 길이를 갖고, 또한 상기 서술한 다형 부위와 그 주변의 배열, 또는 이것에 상보적인 배열을 포함하고, 또한 형광 물질 및 소광 물자를 함유한다. 보다 바람직하게는 20 ∼ 60 염기의 길이를 갖고, 또한 상기 서술한 다형 부위와 그 주변의 배열, 또는 이것에 상보적인 배열을 포함하고, 또한 형광 물질 및 소광 물자를 함유한다.
아렐의 검출에 사이클린 프로브법을 사용하는 경우의 프로브는, 상기 서술한 다형 부위와 그 주변의 배열, 또는 이것에 상보적인 배열을 갖는 RNA 배열의 양단을 사이에 오도록 DNA 배열을 결합시키고, 각각의 DNA 단에 형광 물질 또는 소광 물질을 갖는다. 이들의 프로브는, 통상적으로, 바람직하게는 10 ∼ 300 염기의 길이를 갖고, 또한 상기 서술한 다형 부위와 그 주변의 배열, 또는 이것에 상보적인 배열을 포함한다. 보다 바람직하게는 20 ∼ 60 염기의 길이를 갖고, 또한 상기 서술한 다형 부위와 그 주변의 배열, 또는 이것에 상보적인 배열을 포함한다.
아렐의 검출에 MPSS 법을 사용하는 경우의 프로브는, 5' 측에 4 염기의 돌출 말단, 그것에 이어서 제한 효소인 BbvI 의 인식 배열, 그리고 3' 측에 디코더 프로브가 결합하는 1 개 사슬 배열을 갖는 올리고 DNA (인코드 어댑터 프로브), 그리고, 3' 측에 형광 물질을 갖는 1 개 사슬 올리고 DNA 이고, 4 종류의 상이한 배열로 이루어지고, 각 배열이 1 개의 인코드 어댑터 프로브와 특이적으로 하이브리다이즈되는 올리고 DNA (디코더 프로브) 이다. 상기 서술한 다형 부위와 그 주변의 배열, 또는 이것에 상보적인 배열을 갖는 RNA 배열의 양단을 사이에 오도록 DNA 배열을 결합시키고, 각각의 DNA 단에 형광 물질 또는 소광 물질을 갖는다. 인코드 어댑터 프로브의 길이는, 통상적으로, 바람직하게는 10 ∼ 300 염기쌍이고, 보다 바람직하게는 15 ∼ 40 염기쌍이다. 또, 디코더 프로브의 길이는, 통상적으로, 바람직하게는 10 ∼ 300 염기쌍이고, 보다 바람직하게는 5 ∼ 30 염기쌍이다.
(녹내장에 관련되는 아렐을 검출하기 위한 키트)
본 발명의 다른 양태에서는, 녹내장에 관련되는 1 염기 다형을 검출하기 위한 키트가 제공된다.
본 발명의 키트 (또는 리스크 예측용의 조성물) 에는, 샘플 중의 핵산 분자에 본 발명에서 개시된 녹내장에 관련되는 어느 1 개의 1 염기 다형의 아렐 또는 유전자형을 검출할 수 있는 것이면 모두 포함된다. 상기 서술한 바와 같이, 본 발명의 키트는 1 염기 다형의 센스 사슬, 안티센스 사슬 중 어느 1 개의 염기를 검출하는 것이어도 되고, 이들의 양자를 검출하는 것이어도 된다. 본 발명의 키트는, 예를 들어 50 만개의 1 염기 다형에 대해 녹내장에 관련되는 아렐 또는 유전자형을 검출하는 키트가 1 회의 조작으로 검출되는 마이크로 어레이를 이용하여 1 회의 해석에서 얻어진 결과에 기초하는 경우, 바람직하게는 후술하는 표 1 ∼ 2 에 기재된 p 값이 1×10-4 이하인 1 염기 다형에 대해 녹내장에 관련되는 아렐 또는 유전자형을 검출하는 키트이고, 보다 바람직하게는 p 값이 3×10-4 이하인 1 염기 다형에 대해 녹내장에 관련되는 아렐 또는 유전자형을 검출하는 키트이고, 더욱 바람직하게는 p 값이 1×10-4 이하인 1 염기 다형에 대해 녹내장에 관련되는 아렐 또는 유전자형을 검출하는 키트이고, 더욱 바람직하게는, p 값이 3×10-5 이하인 1 염기 다형에 대해 녹내장에 관련되는 아렐 또는 유전자형을 검출하는 키트이다. 만텔 헨젤법 등의 메타 해석 수법에 의해, 복수의 해석 결과를 통합하여 얻은 것인 경우에는, 바람직하게는 후술하는 표 52 ∼ 62 에 기재된 p 값이 1×10-2 이하인 1 염기 다형에 대해 녹내장에 관련되는 아렐 또는 유전자형을 검출하는 키트이고, 보다 바람직하게는 p 값이 3×10-3 이하인 1 염기 다형에 대해 녹내장에 관련되는 아렐 또는 유전자형을 검출하는 키트이고, 더욱 바람직하게는 p 값이 1×10-3 이하인 1 염기 다형에 대해 녹내장에 관련되는 아렐 또는 유전자형을 검출하는 키트이고, 더욱 바람직하게는 p 값이 3×10-4 이하인 1 염기 다형에 대해 녹내장에 관련되는 아렐 또는 유전자형을 검출하는 키트이고, 더욱 바람직하게는 p 값이 1×10-4 이하인 1 염기 다형에 대해 녹내장에 관련되는 아렐 또는 유전자형을 검출하는 키트이다.
상기 서술한 녹내장 환자군에 있어서 고빈도로 인정되는 아렐과, 당해 아렐과 대립하는 아렐의 양방을 검출하는 키트도 본 발명의 실시형태의 하나이다. 이와 같은 키트를 사용하는 경우, 이미 설명한 바와 같이 각 아렐의 유전자형을 결정할 수도 있다.
본 발명의 키트를 이용하여, 샘플 중에 녹내장 환자군에 있어서 고빈도로 확인되는 아렐 또는 유전자형이 존재하는 것을 검출함으로써, 현시점에서 녹내장에 이환되어 있지 않은 사람의 장래적인 녹내장의 발증 리스크를 예측하고, 녹내장의 정밀한 시야 검사를 필요로 하는지의 여부를 판단하고, 또는 녹내장의 의심이 있는 사람의 녹내장을 진단할 수 있다.
또, 상기 서술한 바와 같이, 대립하는 아렐에 각각 특이적인 프로브를 이용하고, 또한 프로브의 표지를 상이하게 함으로써, 또는 상기 서술한 마이크로 어레이 혹은 비즈 어레이의 형태로 함으로써, 대립하는 아렐을 동일 조작으로 측정하는 키트로 할 수도 있다.
1 개의 샘플을 이용하여 이들의 아렐 또는 유전자형의 복수를 검출하는 구성의 키트로 함으로써, 녹내장의 발증 리스크의 예측이나 정밀한 시야 검사의 요부 판정의 정밀도를 향상시킬 수도 있다. 이와 같은 구성에 있어서도, 상이한 표지를 실시한 프로브 또는 상기 서술한 마이크로 어레이 혹은 비즈 어레이의 형태로 함으로써, 검출을 동일 조작으로 실시하는 구성으로 할 수도 있다.
본 발명의 녹내장에 관련되는 1 염기 다형의 검출 방법 및 녹내장의 발증 리스크의 예측 방법에 있어서, 검출 또는 리스크 예측에 사용되는 키트는, 배열 번호 203 ∼ 514 로 나타내는 염기 배열로 이루어지는 군에서 선택되는, 적어도 1 개의 염기 배열 혹은 그 상보적 배열 또는 이들의 부분 배열로 이루어지는 염기 배열에 있어서, 각 염기 배열의 31 번째에 존재하는 1 염기 다형을 함유하는 핵산 분자를 이용하여 녹내장의 발증에 관련되는 1 염기 다형을 검출 또는 녹내장의 발증 리스크의 예측을 실시하는 키트, 및/또는, 배열 번호 515 ∼ 694 로 나타내는 염기 배열로 이루어지는 군에서 선택되는, 적어도 1 개의 염기 배열 또는 그 상보적 배열을 포함하는 염기 배열로 이루어지는 핵산 분자를 이용하여 녹내장의 발증에 관련 하는 1 염기 다형을 검출 또는 녹내장의 발증 리스크의 예측을 실시하는 키트이고,
보다 바람직하게는, 배열 번호 203 ∼ 238 로 나타내는 염기 배열로 이루어지는 군에서 선택되는, 적어도 1 개의 염기 배열 혹은 그 상보적 배열 또는 이들의 부분 배열로 이루어지는 염기 배열에 있어서, 각 염기 배열의 31 번째에 존재하는 1 염기 다형을 함유하는 핵산 분자를 이용하여 녹내장의 발증에 관련되는 1 염기 다형을 검출 또는 녹내장의 발증 리스크의 예측을 실시하는 키트, 및/또는, 배열 번호 515 ∼ 535 로 나타내는 염기 배열로 이루어지는 군에서 선택되는, 적어도 1 개의 염기 배열 또는 그 상보적 배열을 포함하는 염기 배열로 이루어지는 핵산 분자를 이용하여 녹내장의 발증에 관련되는 1 염기 다형을 검출 또는 녹내장의 발증 리스크의 예측을 실시하는 키트이고,
더욱 바람직하게는, 이하의 a ∼ r 의 1 염기 다형을 포함하는 염기 배열의 세트로 이루어지는 군 A 에서 선택되는, 적어도 1 개의 염기 배열 혹은 그 상보적 배열 또는 이들의 부분 배열로 이루어지는 염기 배열에 있어서, 각 염기 배열의 31 번째에 존재하는 1 염기 다형을 함유하는 핵산 분자를 이용하여 녹내장의 발증에 관련되는 1 염기 다형을 검출 또는 녹내장의 발증 리스크의 예측을 실시하는 키트, 및/또는, aa ∼ rr 의 염기 배열 혹은 염기 배열의 세트로 이루어지는 군 B 에서 선택되는, 적어도 1 개의 염기 배열 혹은 염기 배열의 세트 또는 이들의 상보적 배열을 포함하는 염기 배열로 이루어지는 핵산 분자를 이용하여 녹내장의 발증에 관련되는 1 염기 다형을 검출 또는 녹내장의 발증 리스크의 예측을 실시하는 키트이다.
(여기에서, a ∼ r 로 나타내는 배열 번호의 세트에 있어서, 각각의 배열의 세트가 1 개의 1 염기 다형에 대응하고 있고, 각각의 염기 배열은 상기 1 염기 다형의 서로 대립하는 아렐을 31 번째의 염기에 포함하는 염기 배열이고,
aa ∼ rr 로 나타내는 배열 번호 또는 배열 번호의 세트에 있어서, 각각의 염기 배열 또는 염기 배열의 세트가 1 개의 1 염기 다형의 검출에 사용되는 핵산 분자의 배열 또는 핵산 분자의 배열의 세트이며,
a 와 aa, b 와 bb, c 와 cc, d 와 dd, e 와 ee, f 와 ff, g 와 gg, h 와 hh, i 와 ii, j 와 jj, k 와 kk, l 과 ll, m 과 mm, n 과 nn, o 와 oo, p 와 pp, q 와 qq, 및 r 과 rr 이 각각 동일한 1 염기 다형에 대응한다)
군 A
a : 배열 번호 203 및/또는 배열 번호 204,
b : 배열 번호 205 및/또는 배열 번호 206,
c : 배열 번호 207 및/또는 배열 번호 208,
d : 배열 번호 209 및/또는 배열 번호 210,
e : 배열 번호 211 및/또는 배열 번호 212,
f : 배열 번호 213 및/또는 배열 번호 214,
g : 배열 번호 215 및/또는 배열 번호 216,
h : 배열 번호 217 및/또는 배열 번호 218,
i : 배열 번호 219 및/또는 배열 번호 220,
j : 배열 번호 221 및/또는 배열 번호 222,
k : 배열 번호 223 및/또는 배열 번호 224,
l : 배열 번호 225 및/또는 배열 번호 226,
m : 배열 번호 227 및/또는 배열 번호 228,
n : 배열 번호 229 및/또는 배열 번호 230,
o : 배열 번호 231 및/또는 배열 번호 232,
p : 배열 번호 233 및/또는 배열 번호 234,
q : 배열 번호 235 및/또는 배열 번호 236, 그리고,
r : 배열 번호 237 및/또는 배열 번호 238
군 B
aa : 배열 번호 515, 및/또는, 배열 번호 533,
bb : 배열 번호 516,
cc : 배열 번호 517,
dd : 배열 번호 518, 및/또는, 배열 번호 534,
ee : 배열 번호 519,
ff : 배열 번호 520,
gg : 배열 번호 521,
hh : 배열 번호 522,
ii : 배열 번호 523,
jj : 배열 번호 524,
kk : 배열 번호 525,
ll : 배열 번호 526,
mm : 배열 번호 527,
nn : 배열 번호 528,
oo : 배열 번호 529,
pp : 배열 번호 530, 및/또는, 배열 번호 535,
qq : 배열 번호 531, 그리고
rr : 배열 번호 532
상기 중 어느 것의 1 염기 다형을 사용하는 경우, 그 중에서도, 군 A 에 있어서는, 이하의 1 염기 다형을 포함하는 염기 배열로 이루어지는 군에서 선택되는, 적어도 1 개의 염기 배열 혹은 그 상보적 배열 또는 이들의 부분 배열로 이루어지는 염기 배열에 있어서, 각 염기 배열의 31 번째에 존재하는 1 염기 다형의 아렐을 함유하는 핵산 분자를 이용하여 녹내장의 발증에 관련되는 1 염기 다형을 검출 또는 녹내장의 발증 리스크의 예측을 실시하는 키트가 바람직하고,
배열 번호 203, 배열 번호 206, 배열 번호 208, 배열 번호 209, 배열 번호 211, 배열 번호 214, 배열 번호 216, 배열 번호 218, 배열 번호 219, 배열 번호 221, 배열 번호 224, 배열 번호 226, 배열 번호 228, 배열 번호 229, 배열 번호 231, 배열 번호 234, 배열 번호 235, 및 배열 번호 238
군 B 에 있어서는, 이하의 염기 배열로 이루어지는 군에서 선택되는 염기 배열 또는 그 상보적 배열을 포함하는 염기 배열로 이루어지는 핵산 분자를 이용하여 녹내장의 발증에 관련되는 1 염기 다형을 검출 또는 녹내장의 발증 리스크의 예측을 실시하는 키트가 바람직하다.
배열 번호 533, 배열 번호 516, 배열 번호 517, 배열 번호 518, 배열 번호 519, 배열 번호 520, 배열 번호 521, 배열 번호 522, 배열 번호 523, 배열 번호 524, 배열 번호 525, 배열 번호 526, 배열 번호 527, 배열 번호 528, 배열 번호 529, 배열 번호 535, 배열 번호 531, 및, 배열 번호 532
또한, 이들의 염기 배열은 하이리스크 아렐의 검출에 사용되는 핵산 분자에 대응하는 배열이다.
본 발명의 녹내장에 관련되는 1 염기 다형의 검출 방법 및 녹내장의 발증 리스크의 예측 방법에 있어서, 임의의 2 개 이상의 1 염기 다형을 조합하는 경우, 검출 또는 리스크 예측에 사용되는 키트는, 바람직하게는 배열 번호 203 ∼ 514 로 나타내는 염기 배열로 이루어지는 군에서 선택되는, 1 염기 다형을 포함하는 염기 배열 혹은 그 상보적 배열 또는 이들의 부분 배열로 이루어지는 염기 배열에 있어서, 각 염기 배열의 31 번째에 존재하는 1 염기 다형을 함유하는 핵산 분자를 이용하여 녹내장의 발증에 관련되는 1 염기 다형을 검출 또는 녹내장의 발증 리스크의 예측을 실시하는 키트, 및/또는, 배열 번호 515 ∼ 694 로 나타내는 염기 배열로 이루어지는 군에서 선택되는, 염기 배열 또는 그 상보적 배열을 포함하는 염기 배열로 이루어지는 핵산 분자를 이용하여 녹내장의 발증에 관련되는 1 염기 다형을 검출 또는 녹내장의 발증 리스크의 예측을 실시하는 키트로서, 이들 중 2 개 이상의 상이한 1 염기 다형에 대응하는 키트이고,
보다 바람직하게는, 배열 번호 203 ∼ 218 로 나타내는 염기 배열로 이루어지는 군에서 선택되는, 1 염기 다형을 포함하는 염기 배열 혹은 그 상보적 배열 또는 이들의 부분 배열로 이루어지는 염기 배열에 있어서, 각 염기 배열의 31 번째에 존재하는 1 염기 다형을 함유하는 핵산 분자를 이용하여 녹내장의 발증에 관련되는 1 염기 다형을 검출 또는 녹내장의 발증 리스크의 예측을 실시하는 키트, 및/또는, 배열 번호 515 ∼ 535 로 나타내는 염기 배열로 이루어지는 군에서 선택되는, 염기 배열 또는 그 상보적 배열을 포함하는 염기 배열로 이루어지는 핵산 분자를 이용하여 녹내장의 발증에 관련되는 1 염기 다형을 검출 또는 녹내장의 발증 리스크의 예측을 실시하는 키트로서, 이들 중 2 개 이상의 상이한 1 염기 다형에 대응하는 키트이고,
더욱 바람직하게는, 이하의 1 염기 다형을 포함하는 염기 배열의 세트로 이루어지는 군에서 선택되는, 1 염기 다형을 포함하는 염기 배열 혹은 그 상보적 배열 또는 이들의 부분 배열로 이루어지는 염기 배열에 있어서, 각 염기 배열의 31 번째에 존재하는 1 염기 다형을 함유하는 핵산 분자를 이용하여 녹내장의 발증에 관련되는 1 염기 다형을 검출 또는 녹내장의 발증 리스크의 예측을 실시하는 키트, 및/또는, aa ∼ rr 의 염기 배열 혹은 염기 배열의 세트로 이루어지는 군 B 에서 선택되는, 염기 배열 혹은 염기 배열의 세트 또는 이들의 상보적 배열을 포함하는 염기 배열로 이루어지는 핵산 분자를 이용하여 녹내장의 발증에 관련되는 1 염기 다형을 검출 또는 녹내장의 발증 리스크의 예측을 실시하는 키트로서, 이들 중 2 개 이상의 상이한 1 염기 다형에 대응하는 키트이고,
(여기에서, a ∼ r 로 나타내는 배열 번호의 세트에 있어서, 각각의 배열의 세트가 1 개의 1 염기 다형에 대응하고 있고, 각각의 염기 배열은 상기 1 염기 다형의 서로 대립하는 아렐을 31 번째의 염기에 포함하는 염기 배열이고,
aa ∼ rr 로 나타내는 배열 번호 또는 배열 번호의 세트에 있어서, 각각의 염기 배열 또는 염기 배열의 세트가 1 개의 1 염기 다형의 검출에 사용되는 핵산 분자의 배열 또는 핵산 분자의 배열의 세트이며,
a 와 aa, b 와 bb, c 와 cc, d 와 dd, e 와 ee, f 와 ff, g 와 gg, h 와 hh, i 와 ii, j 와 jj, k 와 kk, l 과 ll, m 과 mm, n 과 nn, o 와 oo, p 와 pp, q 와 qq, 및, r 과 rr 이 각각 동일한 1 염기 다형에 대응한다)
군 A
a : 배열 번호 203 및/또는 배열 번호 204,
b : 배열 번호 205 및/또는 배열 번호 206,
c : 배열 번호 207 및/또는 배열 번호 208,
d : 배열 번호 209 및/또는 배열 번호 210,
e : 배열 번호 211 및/또는 배열 번호 212,
f : 배열 번호 213 및/또는 배열 번호 214,
g : 배열 번호 215 및/또는 배열 번호 216,
h : 배열 번호 217 및/또는 배열 번호 218,
i : 배열 번호 219 및/또는 배열 번호 220,
j : 배열 번호 221 및/또는 배열 번호 222,
k : 배열 번호 223 및/또는 배열 번호 224,
l : 배열 번호 225 및/또는 배열 번호 226,
m : 배열 번호 227 및/또는 배열 번호 228,
n : 배열 번호 229 및/또는 배열 번호 230,
o : 배열 번호 231 및/또는 배열 번호 232,
p : 배열 번호 233 및/또는 배열 번호 234,
q : 배열 번호 235 및/또는 배열 번호 236, 그리고,
r : 배열 번호 237 및/또는 배열 번호 238
군 B
aa : 배열 번호 515, 및/또는, 배열 번호 533,
bb : 배열 번호 516,
cc : 배열 번호 517,
dd : 배열 번호 518, 및/또는, 배열 번호 534,
ee : 배열 번호 519,
ff : 배열 번호 520,
gg : 배열 번호 521,
hh : 배열 번호 522,
ii : 배열 번호 523,
jj : 배열 번호 524,
kk : 배열 번호 525,
ll : 배열 번호 526,
mm : 배열 번호 527,
nn : 배열 번호 528,
oo : 배열 번호 529,
pp : 배열 번호 530, 및/또는, 배열 번호 535,
qq : 배열 번호 531, 그리고
rr : 배열 번호 532
더욱 바람직하게는, 상기 1 염기 다형을 포함하는 염기 배열의 세트로 이루어지는 군 A 에서 선택되는, 1 염기 다형을 포함하는 염기 배열 혹은 그 상보적 배열 또는 이들의 부분 배열로 이루어지는 염기 배열에 있어서, 각 염기 배열의 31 번째에 존재하는 1 염기 다형을 함유하는 핵산 분자를 이용하여 녹내장의 발증에 관련되는 1 염기 다형을 검출 또는 녹내장의 발증 리스크의 예측을 실시하는 키트, 및/또는, 상기 배열의 세트로 이루어지는 군 B 에서 선택되는 염기 배열 또는 그 상보적 배열을 포함하는 염기 배열로 이루어지는 핵산 분자를 이용하여 녹내장의 발증에 관련되는 1 염기 다형을 검출 또는 녹내장의 발증 리스크의 예측을 실시하는 키트로서, 이들 중 10 개 이상의 상이한 1 염기 다형에 대응하는 키트이고,
더욱 바람직하게는, 상기 1 염기 다형을 포함하는 염기 배열의 세트로 이루어지는 군 A 에서 선택되는, 1 염기 다형을 포함하는 염기 배열 혹은 그 상보적 배열 또는 이들의 부분 배열로 이루어지는 염기 배열에 있어서, 각 염기 배열의 31 번째에 존재하는 1 염기 다형을 함유하는 핵산 분자를 이용하여 녹내장의 발증에 관련되는 1 염기 다형을 검출 또는 녹내장의 발증 리스크의 예측을 실시하는 키트 및/또는, 상기 배열의 세트로 이루어지는 군 B 에서 선택되는 염기 배열 또는 그 상보적 배열을 포함하는 염기 배열로 이루어지는 핵산 분자를 이용하여 녹내장의 발증에 관련되는 1 염기 다형을 검출 또는 녹내장의 발증 리스크의 예측을 실시하는 키트로서, 이들 모든 상이한 1 염기 다형에 대응하는 키트이다.
또, 조합에 사용하는 1 염기 다형은 연쇄 불평형 상태가 아닌 것을 사용하는 것이 바람직하고, 이 관점에서는, 상기 조합의 모든 양태에 있어서,
상기 군 A 에 대해서는,
a : 배열 번호 203 및/또는 배열 번호 204, 그리고
b : 배열 번호 205 및/또는 배열 번호 206
으로 이루어지는 군에 속하는 염기 배열 혹은 그 상보적 배열 또는 이들의 부분 배열로 이루어지는 염기 배열에 있어서, 각 염기 배열의 31 번째에 존재하는 1 염기 다형을 포함하는 염기 배열로 이루어지는 군을 군 1 의 염기 배열로 하고,
c : 배열 번호 207 및/또는 배열 번호 208, 그리고
d : 배열 번호 209 및/또는 배열 번호 210
으로 이루어지는 군에 속하는 염기 배열 혹은 그 상보적 배열 또는 이들의 부분 배열로 이루어지는 염기 배열에 있어서, 각 염기 배열의 31 번째에 존재하는 1 염기 다형을 포함하는 염기 배열로 이루어지는 군을 군 2 의 염기 배열로 하고,
j : 배열 번호 221 및/또는 배열 번호 222,
k : 배열 번호 223 및/또는 배열 번호 224, 그리고
l : 배열 번호 225 및/또는 배열 번호 226
으로 이루어지는 군에 속하는 염기 배열 혹은 그 상보적 배열 또는 이들의 부분 배열로 이루어지는 염기 배열에 있어서, 각 염기 배열의 31 번째에 존재하는 1 염기 다형을 포함하는 염기 배열로 이루어지는 군을 군 3 의 염기 배열로 하고,
o : 배열 번호 231 및/또는 배열 번호 232,
p : 배열 번호 233 및/또는 배열 번호 234,
q : 배열 번호 235 및/또는 배열 번호 236, 그리고,
r : 배열 번호 237 및/또는 배열 번호 238
로 이루어지는 군에 속하는 염기 배열 혹은 그 상보적 배열 또는 이들의 부분 배열로 이루어지는 염기 배열에 있어서, 각 염기 배열의 31 번째에 존재하는 1 염기 다형을 포함하는 염기 배열로 이루어지는 군을 군 4 의 염기 배열로 하고,
상기 군 B 에 대해서는,
aa : 배열 번호 515, 및/또는, 배열 번호 533, 그리고,
bb : 배열 번호 516
으로 이루어지는 군에 속하는 염기 배열 또는 그 상보적 배열을 포함하는 염기 배열로 이루어지는 군을 군 1 의 염기 배열로 하고,
cc : 배열 번호 517, 그리고,
dd : 배열 번호 518, 및/또는, 배열 번호 534
로 이루어지는 군에 속하는 염기 배열 또는 그 상보적 배열을 포함하는 염기 배열로 이루어지는 군을 군 2 의 염기 배열로 하고,
jj : 배열 번호 524,
kk : 배열 번호 525, 및
ll : 배열 번호 526
으로 이루어지는 군에 속하는 염기 배열 또는 그 상보적 배열을 포함하는 염기 배열로 이루어지는 군을 군 3 의 염기 배열로 하고,
oo : 배열 번호 529,
pp : 배열 번호 530, 및/또는, 배열 번호 535,
qq : 배열 번호 531, 그리고
rr : 배열 번호 532
로 이루어지는 군에 속하는 염기 배열 또는 그 상보적 배열을 포함하는 염기 배열로 이루어지는 군을 군 4 의 염기 배열로 하고,
군 1 에 속하는 염기 배열을 사용하는 경우에는, 군 1 중 어느 1 개의 염기 배열을 포함하는 핵산 분자를 이용하여 녹내장의 발증에 관련되는 1 염기 다형을 검출 또는 녹내장의 발증 리스크의 예측을 실시하는 키트를 이용하고,
군 2 에 속하는 염기 배열을 사용하는 경우에는, 군 2 중 어느 1 개의 염기 배열을 포함하는 핵산 분자를 이용하여 녹내장의 발증에 관련되는 1 염기 다형을 검출 또는 녹내장의 발증 리스크의 예측을 실시하는 키트를 이용하고,
군 3 에 속하는 염기 배열을 사용하는 경우에는, 군 3 중 어느 1 개의 염기 배열을 포함하는 핵산 분자를 이용하여 녹내장의 발증에 관련되는 1 염기 다형을 검출 또는 녹내장의 발증 리스크의 예측을 실시하는 키트를 이용하고, 및/또는,
군 4 에 속하는 염기 배열을 사용하는 경우에는, 군 4 중 어느 1 개의 염기 배열을 포함하는 핵산 분자를 이용하여 녹내장의 발증에 관련되는 1 염기 다형을 검출 또는 녹내장의 발증 리스크의 예측을 실시하는 키트를 이용하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 모든 조합에 있어서, 군 A 에 있어서는, 이하의 1 염기 다형을 포함하는 염기 배열로 이루어지는 군에서 선택되는, 1 염기 다형을 포함하는 염기 배열 혹은 그 상보적 배열 또는 이들의 부분 배열로 이루어지는 염기 배열에 있어서, 각 염기 배열의 31 번째에 존재하는 1 염기 다형의 아렐을 함유하는 핵산 분자를 이용하여 녹내장의 발증에 관련되는 1 염기 다형을 검출 또는 녹내장의 발증 리스크의 예측을 실시하는 키트가 바람직하고,
배열 번호 203, 배열 번호 206, 배열 번호 208, 배열 번호 209, 배열 번호 211, 배열 번호 214, 배열 번호 216, 배열 번호 218, 배열 번호 219, 배열 번호 221, 배열 번호 224, 배열 번호 226, 배열 번호 228, 배열 번호 229, 배열 번호 231, 배열 번호 234, 배열 번호 235, 및 배열 번호 238
군 B 에 있어서는, 이하의 염기 배열로 이루어지는 군에서 선택되는 염기 배열 또는 그 상보적 배열을 포함하는 염기 배열로 이루어지는 핵산 분자를 이용하여 녹내장의 발증에 관련되는 1 염기 다형을 검출 또는 녹내장의 발증 리스크의 예측을 실시하는 키트가 바람직하다.
배열 번호 533, 배열 번호 516, 배열 번호 517, 배열 번호 518, 배열 번호 519, 배열 번호 520, 배열 번호 521, 배열 번호 522, 배열 번호 523, 배열 번호 524, 배열 번호 525, 배열 번호 526, 배열 번호 527, 배열 번호 528, 배열 번호 529, 배열 번호 535, 배열 번호 531, 및, 배열 번호 532
또한, 이들의 염기 배열은 하이리스크 아렐의 검출에 사용되는 핵산 분자에 대응하는 배열이다.
(2 단계 또는 다단계로 리스크 예측을 실시하는, 녹내장 발증 리스크의 예측 방법)
본 발명의 1 염기 다형을 이용하여 녹내장의 발증 리스크의 예측을 실시할 때에, 녹내장 발증 리스크의 정밀한 예측이 필요한 것으로 생각되는 후보자를 선택하고, 이어서 상기 후보자에게 상세한 리스크 예측을 실시하는, 2 단계 또는 그 이상의 다단계의 리스크 예측을 실시할 수 있다.
2 단계 또는 그 이상의 다단계의 리스크 예측을 실시하는 경우, 먼저, 본 발명의 1 염기 다형의 적어도 1 개, 바람직하게는 어느 1 개 내지 수 개에 대해 상기 서술한 녹내장의 발증 리스크 예측을 실시하고, 이어서, 상기 서술한 본 발명의 1 염기 다형의 조합을 이용하여 상세한 리스크 예측을 실시하면 된다. 필요에 따라 추가로 조합의 개수를 증가시켜, 리스크 예측의 정밀도를 향상시킬 수도 있다. 이와 같이 2 단계 또는 그 이상의 다단계로 리스크 예측을 실시함으로써, 리스크 예측에 실시하는 비용의 저감화와 고정밀도의 리스크 예측의 양립이 가능해진다.
최초 단계의 리스크 예측은, 간편한 리스크 예측 방법이면 된다. 예를 들어, 본 발명의 1 염기 다형의 적어도 1 개를 검출할 수 있도록, 상기 1 염기 다형의 적어도 1 개, 바람직하게는 어느 1 개 내지 수 개를 검출할 수 있는 프로브를 고층화시킨 고층화 프로브를 사용하는 리스크 예측 방법은 간편하고, 저비용으로 실현될 수 있다. 또한, 이 경우의 핵산 추출 방법은, 공지 기술로 실현할 수 있는, 또는 시판되는 간편한 핵산 추출 키트를 사용할 수 있다. 이와 같은 리스크 예측에 사용하는 고층화 프로브는, 예를 들어 효소 표지한 프로브를 이용하고, 비색법(比色法)으로 검출하는 방법이 간편하다. 검출에 사용하는 샘플도, 타액, 구강 점막 세포, 오줌, 모근, 혈액 또는 백혈구 등의 비교적 저침습에서 얻어지는 것이 바람직하다.
다음 단계의 리스크 예측은, 정밀도를 중시하는 리스크의 예측 방법이 좋다. 예를 들어, 상기 서술한 본 발명의 1 염기 다형의 2 개 또는 그 이상을 조합하여 녹내장의 발증에 관련되는 1 염기 다형의 검출을 실시하고, 고정밀도의 리스크 예측을 실시하면 된다.
이와 같이 2 단계 또는 다단계로 리스크 예측을 실시함으로써, 비용을 저감시키고, 또는 최초의 단계에서의 피험자의 부담을 최저한으로 하면서, 리스크 예측의 정밀도를 향상시킬 수 있다.
본 발명의 방법에 의해, 본 발명에서 개시된 녹내장 환자에게서 고빈도로 확인되는 아렐 또는 유전자형을 게놈 상에 갖는 사람은, 장래적으로 녹내장을 발증시키는 리스크가 높고, 녹내장 환자에게 고빈도로 확인되는 아렐 또는 유전자형을 갖지 않는 사람은, 장래적으로 녹내장을 발증시키는 리스크가 낮은 것으로 판단하는 것이 가능해진다.
또한, 본 발명에서 개시된 녹내장 환자에게서 고빈도로 확인되는 아렐 또는 유전자형을 게놈 상에 갖는 사람은, 간략한 녹내장의 판정법, 예를 들어 안압 측정이나 안저 검사에서는 검출이 곤란하고, 시야 검사를 실시하고 처음으로 진단받는 초기의 녹내장을 발증시킬 우려가 있으므로, 본 발명의 1 염기 다형의 검출을 실시함으로써, 시야 검사의 필요 여부를 스크리닝할 수 있다. 한편, 녹내장의 의심이 있는 사람이 본 발명의 녹내장에 관련되는 아렐 또는 유전자형을 게놈 상에 갖는 경우, 당해 녹내장의 의심이 있는 사람은 녹내장으로 진단하게 될 개연성이 높다.
이하에 실시예를 들어 본 발명을 설명하는데, 실시예는 본 발명을 보다 잘 이해하기 위해 예시된 것으로서, 본 발명의 범위가 이들의 실시예에 한정되는 것을 의도하는 것은 아니다. 또한, 이하의 실시예에서는, 특히 상세한 설명이 없는 일반적으로 사용되는 분자 생물학적 수법에 대해서는, 몰레큘러 클로닝 (Joseph Sambrook et al., Molecular Cloning-A Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001) 등의 성서에 기재된 방법 및 조건이 사용된다.
본 발명에서는, 녹내장으로 진단된 환자, 및, 녹내장이 아닌 것으로 진단되 고, 또한 문진에 의해 녹내장 가족력을 갖지 않는 것으로 판단된 비환자 각각의 혈액으로부터 총 DNA 를 추출하고, 인간 게놈 상의 공지된 1 염기 다형 약 50 만개를 지표로 하여 질환에 관련되는 유전자좌를 해석하여, 질환과의 관련을 확인하였다. 또, 녹내장의 발증이 빠른 환자, 즉 녹내장 발증예와 녹내장의 발증이 늦은 환자, 즉 녹내장 비진행예에 대해서도 동일하게 1 염기 다형의 동정과 진행과의 관련을 확인하였다.
실시예 1 검체로부터의 DNA 의 추출
검체로부터의 DNA 의 추출은 시판되는 자동 핵산 추출기 (키아겐 (QUIAGEN) 사, 바이오 로봇 (BIOROBOT (등록상표)) EZ1) 를 사용하고, 동 추출기에 적합한, 자기 비즈에 흡착시킨 핵산을 자기에 의해 회수하는 핵산 추출 키트 (EZ1 DNA Blood 350 ㎕ Kit) 를 사용하였다. 총 DNA 의 추출은 기기 및 키트의 취급 설명서에 따라 실시하였다. 본 방법에 의해, 혈액 검체 350 ㎕ 로부터 약 5 ㎍ 의 총 DNA 를 얻었다.
실시예 2 1 염기 다형의 분석
1 염기 다형의 분석은, 인간 게놈 상의 공지된 1 염기 다형 약 50 만개의 분석이 가능한 시판되는 마이크로 어레이형의 1 염기 다형 분석 키트 (아피매트릭스사 GeneChip (등록상표) Human Mapping 500K) (이하, 마이크로 어레이로 기재) 를 사용하였다. 1 염기 다형의 검출은 동 키트에 적합한 스캔 장치 (아피매트릭스사 GeneChip (등록상표) Scanner 3000) 를 사용하였다. 1 염기 다형의 분석은 전용 분석 소프트웨어 (아피매트릭스사 GTYPE (상표)) 를 사용하였다.
실시예 1 에서 추출한 총 DNA 를 키트 및 기기의 설명서에 따라 처리하고, 마이크로 어레이 상에 적용하여 검체로부터 추출한 DNA 에 존재하는 1 염기 다형을 해석하였다. 간단하게 설명하면, 총 DNA 250 ng 를 제한 효소 NspI 로 처리한 샘플과 StyI 처리한 샘플을 조제하고, 각각의 샘플의 돌출 말단에 어댑터를 결합시켜, PCR 법으로 증폭시켰다. PCR 산물을 회수하여 DNaseI 로 단편화시키고, 키트에 포함되는 라벨링 시약을 이용하여, 단편화시킨 PCR 산물의 말단을 비오틴 표지하였다. 표지가 완료된 양단편화가 완료된 PCR 산물에 하이브리다이제이션용 완충액을 첨가하고, 99 ℃ 에서 10 분간 열처리한 후, 49 ℃ 에서 1 분간 인큐베이트하고, 처음에 처리한 제한 효소에 따라 NspI 처리 샘플용 마이크로 어레이 또는 StyI 처리 샘플용 마이크로 어레이 상에 주입하여, 49 ℃ 에서 16 ∼ 18 시간 하이브리다이즈하였다. 하이브리다이즈 종료 후 마이크로 어레이를 스트렙토아비딘-피코에리트린에 의해 염색하였다. 상기 서술한 스캔 장치를 이용하여, 고층화된 아렐 특이적 프로브와 하이브리다이즈된 샘플 중의 DNA 말단에 비오틴 및 스트렙토아비딘을 개재하여 결합한 피코에리트린에서 유래하는 형광을 판독 입력하고, 상기 서술한 소프트웨어로 해석하였다. NspI 처리 샘플용 마이크로 어레이 및 StyI 처리 샘플용 마이크로 어레이에는 각각 약 25 만개의 1 염기 다형에 대응하는 프로브가 미리 고층화되어 있고, 양자의 결과를 통합하여 1 샘플당 약 50 만개의 1 염기 다형에 대한 해석 결과로 하였다. 본 방법에 의해, 각각의 1 염기 다형의 대립하는 아렐이 동일 조작으로 판독되므로, 이 결과로부터 유전자형을 결정하였다. 이 경우, 1 염기 다형을 구성하는 각각의 아렐 양방의 시그널이 검출되면 헤테로, 어느 일방의 시그널만이 검출되면 당해 검출된 아렐을 호모에 갖는 유전자형으로 하였다.
또한, 동 키트의 설명서에 의하면, 동 키트에 고층화되어 있는 프로브는, 게놈의 센스 사슬에 대한 프로브 또는 안티센스 사슬에 대한 프로브가 사용되고 있다. 또, 동 키트의 데이터 시트에 의하면, HapMap 프로젝트에서 보고된 1 염기 다형과 본 키트에서 중복되는 1 염기 다형에 대해, 270 샘플을 이용하여 본 키트의 판정 결과와 HapMap 의 판정 결과를 비교한 결과, 99 % 이상의 일치율을 나타내는 것이 기재되어 있다.
실시예 3 녹내장 환자와 비환자 1 염기 다형의 비교
질환 관련 1 염기 다형의 비교는, 클라인이 가령 황반 변성증의 원인 유전자 검토에 사용한 방법 (Science, 308 권, 385 페이지, 2005 년) 에 준하여 실시하였다.
녹내장 학회 가이드 라인에 기초하여 진단된 원발 개방 우각 녹내장 환자 및 정상 안압 녹내장 환자를 녹내장 환자군, 문진에 의해 녹내장 가족력이 없는 것을 확인한 정상인을 비환자군에게 할당하였다. 녹내장 환자군 418 예, 비환자군 300 예로부터, 연구 내용에 대해 충분히 설명한 후에 참가자의 자유 의지로 얻은 동의하에 제공된 혈액을 검체로 하고, 실시예 1 에 기재된 방법으로 총 DNA 를 추출하여, 실시예 2 에 기재된 방법으로 1 염기 다형의 분석을 실시하였다. 각각의 환자에 대해 얻어진 1 염기 다형의 분석 결과는 리레이셔널 데이터 베이스를 채용한 Laboratory Information Management System (월드 퓨전사, LaboServer) 에 저 장하였다. 그 시스템 내에 1 염기 다형의 해석 전용 프로그램을 제작, 실장하고, 이하에 서술하는 해석을 실시하였다. 즉, 녹내장 환자군 및 비환자군 중 어느 것에 있어서도 콜레이트가 90 % 미만인 1 염기 다형, 녹내장 환자군과 비환자군의 콜레이트의 차가 5 % 이상인 1 염기 다형, 마이너 아렐 빈도가 5 % 미만인 1 염기 다형, 및, 카이 제곱 검정에 의해 p 값 1×10-4 이하로 하디 와인버그 평형이 성립되지 않는 것으로 판정되는 1 염기 다형을 버림으로써, 실험적인 신뢰성이 높다고 생각되는 1 염기 다형을 추출하고, 당해 1 염기 다형에 대해, 군간의 아렐 빈도 및 유전자형의 빈도를 비교하였다. 아렐 빈도 및 유전자형의 빈도는 카이 제곱 검정에 의해 통계학적으로 비교를 실시하였다. p 값 1×10-3 이하를 나타낸 1 염기 다형에 대해서는, 유전자형 판정의 기초가 되는 클러스터 화상의 확인을 실시하였다. 클러스터의 분리가 불명료함에도 불구하고 유전자형 판정이 이루어진 경우에는 그 1 염기 다형은 해석 대상 외로 하였다. 즉, 유전자형 판정의 오류를 본 작업에 의해 제외하였다. 클러스터의 평가에 있어서, 1 염기 다형명(名) 및 위험률의 값은 보이지 않게 하고 실시하였다. p 값 1×10-4 이하, 즉 -logP 가 4 이상이고 아렐 또는 유전자형이 녹내장과의 관련을 나타내는 1 염기 다형을 표 1 ∼ 2 에 나타낸다. 또한, 각 표에 있어서의 각각의 아렐과 질환의 관련의 오즈비, 유전자형과 질환의 관련의 오즈비는 이하의 식 (1) ∼ (5) 에 기초하여 산출하였다.
아렐 빈도=그 군에 있어서의 당해 아렐의 검출수/그 군에 있어서의 전체 아 렐 검출수 식 (1)
유전자형 빈도=그 군에 있어서의 당해 유전자형의 검출수/그 군에 있어서의 전체 유전자형의 검출수 식 (2)
아렐의 오즈비=[(녹내장 환자군에 있어서의, 녹내장 환자군에서 고빈도로 확인되는 아렐의 검출수)/(녹내장 환자군에 있어서의, 녹내장 환자군에서 고빈도로 확인되는 아렐과 대립하는 아렐의 검출수)]/[(비환자군에 있어서의, 녹내장 환자군에서 고빈도로 확인되는 아렐의 검출수)/(비환자군에 있어서의, 녹내장 환자군에서 고빈도로 확인되는 아렐과 대립하는 아렐의 검출수)] 식 (3)
호모형의 유전자형의 오즈비=[(녹내장 환자군에 있어서의, 녹내장 환자군에서 고빈도로 확인되는 아렐을 호모로 갖는 유전자형의 검출수)/(녹내장 환자군에 있어서의, 비환자군에서 고빈도로 확인되는 아렐을 호모로 갖는 유전자형의 검출수)]/[(비환자군에 있어서의, 녹내장 환자군에서 고빈도로 확인되는 아렐을 호모로 갖는 유전자형의 검출수)/(비환자군에 있어서의, 비환자군에서 고빈도로 확인되는 아렐을 호모로 갖는 유전자형의 검출수)] 식 (4)
헤테로형의 유전자형의 오즈비=[(녹내장 환자군에 있어서의, 헤테로형의 유전자형의 검출수)/(녹내장 환자군에 있어서의, 비환자군에서 고빈도로 확인되는 아렐을 호모로 갖는 유전자형의 검출수)]/[(비환자군에 있어서의, 헤테로형의 유전자형의 검출수)/(비환자군에 있어서의, 비환자군에서 고빈도로 확인되는 아렐을 호모로 갖는 유전자형의 검출수)] 식 (5)
Figure 112009070121914-PCT00001
Figure 112009070121914-PCT00002
표 1 및 2 에 얻어진 공지된 1 염기 다형을 특정하는 dbSNP ID 번호 또는 아피매트릭스 어레이 ID 번호, 아렐 1 및 아렐 2 를 구성하는 각각의 염기, 엑손·인트론 정보 (1 염기 다형이 유전자 상에 존재하는 경우에는 유전자명 및 SNP 가 존재하는 엑손 또는 인트론을 나타내고, 1 염기 다형이 유전자 상에 존재하지 않는 경우에는, 근방 유전자 및 당해 유전자와 당해 1 염기 다형 사이의 거리를 나타낸다), 1 염기 다형이 존재하는 염색체 번호, 1 염기 다형의 물리적 위치, 아렐의 카이 제곱 검정에 의한 p 값 (-logP), 녹내장 환자군 및 비환자군의 하이리스크 아렐 빈도, 하이리스크 아렐의 타입 (하이리스크 아렐이 아렐 1 인지 아렐 2 인지를 나타낸다), 아렐의 오즈비, 유전자형의 카이 제곱 검정에 의한 p 값 (-logP), 호모형 및 헤테로형의 유전자형의 오즈비, 그리고, 각각의 다형 부위에 있어서의 아렐 1 을 포함하는 배열의 배열 번호 및 아렐 2 를 포함하는 배열의 배열 번호를 나타낸다. 또한, 상기 dbSNP ID 번호 또는 아피매트릭스 어레이 D 번호보다, 당업자는 이들의 번호로부터 당해 1 염기 다형의 배열이나 아렐의 정보를 입수할 수 있다.
표 1 ∼ 2 에 기재한 아렐 또는 유전자형의 빈도는, 가족력이 없는 비환자와 녹내장 환자를 비교하면 통계학적으로 차가 확인되었다. 이들의 1 염기 다형의 어느 1 개에 대해, 그 아렐을 결정함으로써, 샘플 중에, 비환자군보다도 녹내장 환자군에서 고빈도로 확인되는 아렐이 존재하는지의 여부를 판정할 수 있다.
구체적으로, 표 1 ∼ 2 에 기재된 최초의 1 염기 다형을 예로 설명하면, 서로 상동인 유전자좌를 차지하는 배열 번호 1 또는 2 로 나타내는 핵산 분자에는 1 지점의 다형 부위가 존재한다. 즉, 31 번째의 염기가 A (아렐 1) 또는 G (아렐 2) 중 어느 1 개인 1 염기 다형이 녹내장의 발증에 관련되며, 하이리스크 아렐로서 표시되어 있는 아렐 1, 즉, 당해 1 염기 다형의 A 인 아렐이 녹내장 환자군에 있어서 고빈도로 확인된다. 또한, 아렐의 오즈비, 호모 및 헤테로형의 유전자형의 오즈비를 이용하고, 당해 아렐 또는 유전자형을 갖는 경우에 질환 리스크가 얼마나 상승되는지를 예측할 수 있다. 동일하게, 표 1 ∼ 2 에 개시되는 배열은 모두 그 배열 중에 녹내장과 관련되는 다형 부위를 갖고, 당해 다형 부위에 있어서의 1 개의 아렐 또는 적어도 1 개의 유전자형이 녹내장 환자군에 있어서 고빈도로 확인된다.
상기 검토에 의해 아렐 또는 유전자형과 녹내장의 관련이 p 값 1×10-4 이하가 되는 1 염기 다형을 40 개, 게놈 상의 비교적 근접한 영역에 집단으로 존재하는 21 개의 영역을 알아냈다.
표 1 ∼ 2 에 기재된 1 염기 다형에 대해, 녹내장 환자군에 있어서 고빈도로 확인되는 아렐 또는 유전자형은 녹내장의 발증 리스크가 높은 것을 나타내는 마커로서 사용할 수 있게 된다. 한편, 당해 아렐에 대립하는 아렐 또는 당해 유전자형 이외의 유전자형은 녹내장의 발증 리스크가 낮은 것을 나타내는 마커로서 사용할 수 있게 된다.
다음으로, 표 1 ∼ 2 에 나타낸 1 염기 다형의 주변 영역 및/또는 유전자를, HapMap 프로젝트에서 제공되는 데이터 베이스를 참고로 결정하였다. 즉, HapMap 프로젝트의 일본인과 중국인을 합친 연쇄 불평형 데이터를 기초로, 표 1 ∼ 2 에 나타낸 1 염기 다형과 연쇄 불평형에 있는 것으로 생각되는 1 염기 다형이 존재하는 영역을 결정하였다.
또, 표 1 ∼ 2 에 나타낸 1 염기 다형이 유전자를 포함하는 연쇄 불평형 영역에 있는 경우, 당해 영역의 물리적 위치와 유전자명을 결정하였다. 한편, 표 1 ∼ 2 에 나타낸 1 염기 다형이 유전자를 함유하지 않는 연쇄 불평형 영역에 존재하는 경우, 당해 영역의 물리적 위치만을 결정하였다. 또, 표 1 ∼ 2 에 나타낸 1 염기 다형이 연쇄 불평형 영역을 초과하는 1 개의 유전자 상에 존재하는 경우에는, 당해 유전자명만을 결정하였다.
각 영역에 대해 p 값이 최저가 되는 1 염기 다형을 그 영역을 대표하는 1 염기 다형으로 하고, 표 3 ∼ 4 에, 각 영역을 대표하는 1 염기 다형, 당해 영역이 존재하는 염색체 번호, 당해 영역의 물리적 위치 (개시점 및 종점) 그리고 영역에 포함되는 유전자명을 나타낸다.
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Figure 112009070121914-PCT00004
표 3 ∼ 4 에 기재한 영역은, 표 3 ∼ 4 중에 기재된 본 발명의 녹내장에 관련되는 1 염기 다형과 연쇄되어 있는 것으로 생각할 수 있는 영역 또는 유전자이고, 이들의 영역 또는 유전자 중에 존재하는 1 염기 다형은 본 발명의 1 염기 다형과 연쇄되어 있는 것으로 생각할 수 있다. 즉 이들의 영역 중에 존재하는 임의의 1 염기 다형은 당해 영역 내에 존재하는 표 3 ∼ 4 에 기재된 1 염기 다형과 연쇄되어 있고, 이들의 임의의 1 염기 다형에 대해서도 동일하게 녹내장의 리스크 예측에 사용할 수 있다.
또, 동일하게, p 값 1×10-3 이하, 즉 -logP 가 3 이상이고 아렐 또는 유전자형이 녹내장과의 관련을 나타내는 1 염기 다형을 표 5 ∼ 25 에 나타낸다.
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표 5 ∼ 25 에는, 얻어진 공지된 1 염기 다형을 특정하는 dbSNp ID 번호 또는 아피매트릭스 어레이 ID 번호, 엑손·인트론 정보 (1 염기 다형이 유전자 상에 존재하는 경우에는 유전자명 및 SNP 가 존재하는 엑손 또는 인트론을 나타내고, 1 염기 다형이 유전자 상에 존재하지 않는 경우에는, 근방 유전자 및 당해 유전자와 당해 1 염기 다형 사이의 거리를 나타낸다), 당해 1 염기 다형이 존재하는 염색체 번호, 당해 1 염기 다형의 물리적 위치, 아렐의 카이 제곱 검정에 의한 p 값 (-logP), 녹내장 환자군 및 비환자군의 하이리스크 아렐의 빈도, 아렐의 오즈비, 유전자형의 카이 제곱 검정에 의한 p 값 (-logP), 그리고, 호모형 및 헤테로형의 유전자형의 오즈비를 나타낸다. 또한, 표 중에서 오즈비가 ND 로 표시되어 있는 지점은, 분모가 되는 검출수 중 어느 것이 0 으로서 오즈비를 산출할 수 없는 것을 나타낸다.
상기 검토에 의해 아렐 또는 유전자형과 녹내장의 관련이 p 값 1×10-3 이하가 되는 1 염기 다형 413 개를 알아냈다.
표 5 ∼ 25 에 기재된 아렐 또는 유전자형의 빈도는, 가족력이 없는 비환자와 녹내장 환자를 비교하면 통계학적으로 차가 확인되었다. 이들의 1 염기 다형 중 어느 1 개에 대해, 그 아렐을 결정함으로써, 샘플 중에, 비환자군보다도 녹내장 환자군에서 고빈도로 확인되는 아렐이 존재하는지의 여부를 판정할 수 있다.
실시예 4 녹내장 진행예와 녹내장 비진행예의 1 염기 다형의 비교
실시예 3 과 동일하게 하고, 녹내장 진행예와 녹내장 비진행예의 1 염기 다형의 비교를 실시하였다.
즉, 녹내장 학회 가이드 라인에 기초하여 진단된 원발 개방 우각 녹내장 환자 및 정상 안압 녹내장 환자 중, 일정 기간 내에 안압 하강약이나 수술 등의 안압 하강 치료에도 불구하고 시야 결손이 진행된 환자 210 예 (녹내장 진행예), 진행되지 않은 환자 175 예 (녹내장 비진행예) 로부터, 연구 내용에 대해 충분히 설명한 후 참가자의 자유 의지로 얻은 동의하에 제공된 혈액을 검체로 하고, 실시예 3 과 동일하게 해석하여 군간의 아렐 빈도 및 유전자형의 빈도를 비교하였다. 아렐 빈도 및 유전자형의 빈도도 동일하게 카이 제곱 검정에 의해 통계학적으로 비교하였다. p 값 1×10-4 이하, 즉 -logP 가 4 이상이고 아렐 또는 유전자형이 녹내장의 진행의 관련을 나타내는 1 염기 다형을 표 26 ∼ 28 에 나타낸다. 또한, 각 표에 있어서의 각각의 아렐과 녹내장의 진행과의 관련의 오즈비, 유전자형과 녹내장의 진행과의 관련의 오즈비를 이하의 식 (6) ∼ (8) 에 기초하여 산출하였다.
아렐의 오즈비=[(녹내장 진행군에 있어서의, 녹내장 진행군에서 고빈도로 확인되는 아렐의 검출수)/(녹내장 진행군에 있어서의, 녹내장 진행군에서 고빈도로 확인되는 아렐과 대립하는 아렐의 검출수)]/[(녹내장 비진행군에 있어서의, 녹내장 진행군에서 고빈도로 확인되는 아렐의 검출수)/(녹내장 비진행군에 있어서의, 녹내장 진행군에서 고빈도로 확인되는 아렐과 대립하는 아렐의 검출수)] 식 (6)
호모형의 유전자형의 오즈비=[(녹내장 진행군에 있어서의, 녹내장 진행군에서 고빈도로 확인되는 아렐을 호모로 갖는 유전자형의 검출수)/(녹내장 진행군에 있어서의, 녹내장 비진행군에서 고빈도로 확인되는 아렐을 호모로 갖는 유전자형의 검출수)]/[(녹내장 비진행군에 있어서의, 녹내장 진행군에서 고빈도로 확인되는 아렐을 호모로 갖는 유전자형의 검출수)/(녹내장 비진행군에 있어서의, 녹내장 비진행군에서 고빈도로 확인되는 아렐을 호모로 갖는 유전자형의 검출수)] 식 (7)
헤테로형의 유전자형의 오즈비=[(녹내장 진행군에 있어서의, 헤테로형의 유전자형의 검출수)/(녹내장 진행군에 있어서의, 녹내장 비진행군에서 고빈도로 확인되는 아렐을 호모로 갖는 유전자형의 검출수)]/[(녹내장 비진행군에 있어서의, 헤테로형의 유전자형의 검출수)/(녹내장 비진행군에 있어서의, 녹내장 비진행군에서 고빈도로 확인되는 아렐을 호모로 갖는 유전자형의 검출수)] 식 (8)
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Figure 112009070121914-PCT00027
Figure 112009070121914-PCT00028
표 26 ∼ 28 에 얻어진 공지된 1 염기 다형을 특정하는 dbSNP ID 번호 또는 아피매트릭스 어레이 ID 번호, 아렐 1 및 아렐 2 를 구성하는 각각의 염기, 엑손·인트론 정보 (1 염기 다형이 유전자 상에 존재하는 경우에는 유전자명 및 SNP 가 존재하는 엑손 또는 인트론을 나타내고, 1 염기 다형이 유전자 상에 존재하지 않는 경우에는, 근방 유전자 및 당해 유전자와 당해 1 염기 다형 사이의 거리를 나타낸다), 당해 1 염기 다형이 존재하는 염색체 번호, 당해 1 염기 다형의 물리적 위치, 아렐의 카이 제곱 검정에 의한 p 값 (-logP), 녹내장 환자군 및 비환자군의 하이리스크 아렐 빈도, 하이리스크 아렐의 타입 (하이리스크 아렐이 아렐 1 인지 아렐 2 인지를 나타낸다), 아렐의 오즈비, 유전자형의 카이 제곱 검정에 의한 p 값 (-logP), 호모형의 유전자형의 오즈비, 헤테로형의 유전자형의 오즈비, 그리고 각각의 다형 부위에 있어서의 아렐 1 을 포함하는 배열의 배열 번호 및 아렐 2 를 포함하는 배열의 배열 번호를 나타낸다. 또한, 표 중에서 오즈비가 ND 로 표시되어 있는 지점은, 분모가 되는 검출수 중 어느 것이 0 으로서 오즈비를 산출할 수 없는 것을 나타낸다.
상기 검토에 의해 아렐 또는 유전자형과 녹내장의 진행과의 관련이 p 값 1×10-4 이하가 되는 1 염기 다형 61 개를 알아냈다.
표 26 ∼ 28 에 기재한 아렐 또는 유전자형의 빈도는, 녹내장 진행예와 녹내장 비진행예 사이에서 통계학적인 차가 확인되었다. 이들 1 염기 다형의 어느 1 개에 대해, 그 아렐을 결정함으로써, 샘플 중에, 녹내장 비진행군보다도 녹내장 진행군에서 고빈도로 확인되는 아렐이 존재하는지의 여부를 판정할 수 있다.
또, 표 26 ∼ 28 에 기재된 1 염기 다형에 대해, 녹내장 진행군에 있어서 고빈도로 확인되는 아렐 또는 유전자형은 녹내장의 진행 리스크가 높은 것을 나타내는 마커로서 사용할 수 있게 된다. 한편, 당해 아렐에 대립하는 아렐 또는 당해 유전자형 이외의 유전자형은 녹내장의 진행 리스크가 낮은 것을 나타내는 마커로서 사용할 수 있게 된다.
또, 동일하게, p 값 1×10-3 이하, 즉, -logP 가 3 이상이고 아렐 또는 유전자형이 녹내장의 진행과의 관련을 나타내는 1 염기 다형을 표 29 ∼ 51 에 나타낸다.
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표 29 ∼ 51 에는, 얻어진 공지된 1 염기 다형을 특정하는 dbSNP ID 번호 또는 아피매트릭스 어레이 ID 번호, 엑손·인트론 정보 (1 염기 다형이 유전자 상에 존재하는 경우에는 유전자명 및 SNP 가 존재하는 엑손 또는 인트론을 나타내고, 1 염기 다형이 유전자 상에 존재하지 않는 경우에는, 근방 유전자 및 당해 유전자와 당해 1 염기 다형 사이의 거리를 나타낸다), 당해 1 염기 다형이 존재하는 염색체 번호, 당해 1 염기 다형의 물리적 위치, 아렐의 카이 제곱 검정에 의한 p 값 (-logP), 녹내장 진행군 및 녹내장 비진행군의 하이리스크 아렐 빈도, 아렐의 오즈비, 유전자형의 카이 제곱 검정에 의한 p 값 (-logP), 그리고, 호모형 및 헤테로형의 유전자형의 오즈비를 나타낸다. 또한, 표 중에서 오즈비가 ND 로 표시되어 있는 지점은, 분모가 되는 검출수 중 어느 것이 0 으로서 오즈비를 산출할 수 없는 것을 나타낸다.
상기 검토에 의해 아렐 또는 유전자형과 녹내장의 진행과의 관련이 p 값 1×10-3 이하가 되는 1 염기 다형 480 개를 알아냈다.
표 29 ∼ 51 에 기재한 아렐 또는 유전자형의 빈도는, 녹내장 진행예와 녹내장 비진행예 사이에서 통계학적인 차가 확인되었다. 이들의 1 염기 다형 중 어느 1 개에 대해, 그 아렐을 결정함으로써 샘플 중에 녹내장 비진행군보다도 녹내장 진행군에서 고빈도로 확인되는 아렐이 존재하는지의 여부를 판정할 수 있다.
실시예 5 특정된 1 염기 다형의 주변의 배열 결정법에 의한 신규 1 염기 다형의 확인
표 1 ∼ 2 또는 표 26 ∼ 28 에 기재된 1 염기 다형 주변의 재시퀀스를 실시하고, 각 1 염기 다형이 검출되는 것의 확인, 및 존재할 가능성이 있는 미지의 1 염기 다형의 동정을 실시할 수 있다. 재시퀀스는 공지된 어떤 방법에서도 실시할 수 있는데, 예를 들어 다이렉트 시퀀스법에 의해 실시할 수 있다.
실시예 6
실시예 3 또는 4 에서 동정된 녹내장에 관련되는 1 염기 다형, 또는 표 1 ∼ 51 에 기재된 1 염기 다형의 주변에 존재하는 공지된 1 염기 다형의 아렐 그리고 유전자형을 판정하기 위해 고층화 프로브를 제조할 수 있다. 공지된 1 염기 다형은 예를 들어, dbSNP 나 J SNP 의 데이터 베이스로부터 인용할 수 있다. 고층화 프로브에는, 예를 들어 수 개 내지 수십만 개 정도의 감도, 특이성, 재현성을 최대화시키도록 디자인된 뉴클레오티드 프로브를 탑재할 수 있다. 고층화 프로브는, 예를 들어, 고체의 담체 상에서 올리고 뉴클레오티드 합성하는 방법이나, 올리고 뉴클레오티드를 합성한 후에 고체의 담체 상에 고밀도로 고정시키는 방법 등으로 제조할 수 있다.
실시예 7
실시예 6 에서 제조한 고층화 프로브를 사용하여, 녹내장 발증의 유무를 고정밀도로 판정할 수 있다. 질환에 관련되는 1 염기 다형을 검출하는 프로브를 복수 조합함으로써, 녹내장을 발증시키는 리스크가 어느 정도 증가하는지를 평가한다. 어느 임계값을 초과하는 경우에는, 녹내장이 발증되는 것으로 판정한다.
또, 실시예 6 에서 제조한 고층화 프로브를 사용하여, 녹내장 환자와 비녹내장 환자의 게놈에 존재하는 1 염기 다형을 비교할 수 있다. 거리가 가까운 장소에 존재하는 1 염기 다형끼리는, 연쇄 불평형에 의해 연쇄되어 유전되어 있을 가능성이 있다. 고층화 프로브에 의해 표 1 ∼ 2 또는 표 26 ∼ 28 에 나타낸 1 염기 다형과 연쇄되어 있는 1 염기 다형을 동정할 수 있을 가능성이 있고, 더욱 녹내장과 관련성이 있는 1 염기 다형을 알아내는 것을 기대할 수 있다.
실시예 8 커스텀 어레이의 설계
제１종의 과오를 저하시키면서 검출력을 유지하기 위해, 실시예 3 의 1 차 해석에서 동정된 녹내장 발증 관련 후보 1 염기 다형에 대해, 독자적으로 설계한 1 염기 다형 해석용 어레이 (이하, 커스텀 어레이) 를 이용해도 별도 수집한 샘플의 1 염기 다형의 2 차 해석을 실시하였다.
커스텀 어레이에는, 일루미나사의 시판되는 1 염기 다형 분석 키트 (일루미나사 iSelectTM Genotyping BeadChip) 를 사용하였다. 실시예 4 에서 p 값이 1×10-3 이하를 나타낸 녹내장 발증 관련 1 염기 다형 446 개에 대해, 이들의 1 염기 다형을 특이적으로 검출하는 프로브의 설계를 시도하였다. 이들의 프로브는 비즈를 개재하여 기판 상에 임의로 고정시키므로, 비즈의 위치를 특정하는 공정 (디코팅) 이 필요하다. 디코딩의 과정에서 위치의 특정이 불가능한 1 염기 다형 검출용 프로브에 대해서는 해석 대상으로부터 제외하였다. 그 결과, 446 개의 1 염기 다형 중, 412 개의 1 염기 다형이 타이핑할 수 있는 커스텀 어레이의 제조가 가능하고, 상기 커스텀 어레이를 후술하는 1 염기 다형의 분석에 사용하였다. 또한, 비즈 어레이법의 Infinium (등록상표) 어세이의 항에서 기재한 바와 같이, 본 어세이법에는 1 종류의 프로브를 사용하는 방법과 2 종류의 프로브를 사용하는 방법의 2 가지의 방법이 있다. 기본적으로 1 개의 1 염기 다형의 검출에 1 종류의 프로브의 사용인데, 일부의 1 염기 다형에 대해서는 2 개의 프로브를 사용하였다.
실시예 9 커스텀 어레이를 사용한 1 염기 다형의 분석
실험은, 일루미나사의 커스텀 어레이 키트 및 해석 기기의 설명서에 따라, 키트에 포함되는 전용 시약을 이용하여 실시하였다. 이하에, 간단하게 실험 순서를 설명한다. 실시예 1 에서 추출한 총 DNA 150 ∼ 300 ng 에 게놈 처리 전용 시약과 수산화 나트륨 용액을 첨가하였다. 이어서, 전체 게놈 증폭 효소를 첨가하고, 37 ℃ 에서 20 ∼ 24 시간 인큐베이션하여 전체 게놈을 증폭시켰다. 또한, 단편화 효소를 첨가하고 37 ℃ 에서 1 시간 인큐베이션하였다. 이소프로판올에 의해 DNA 를 침전시킨 후, 가용화 시약을 첨가하여, 48 ℃, 1 시간 현탁시켰다. 95 ℃ 에서 20 분간 열변성시키고, 커스텀 어레이에 이 용액을 주입하여 48 ℃ 에서 16 ∼ 24 시간 하이브리다이즈시켰다.
하이브리다이즈 종료 후, 각 프로브에 대해 아렐 특이적 신장 반응 또는 1 염기 신장 반응을 실시하고, 형광 시그널의 증폭을 실시하였다. 시그널은, 동 키트에 적합한 스캔 장치 (일루미나사 BeadArray Reader) 에 의해 판독한다. 또, 1 염기 다형의 분석에는 전용 소프트웨어 (일루미나사 BeadStudio 3.1) 를 사용하였다. 본 분석 방법에 의해, 각 1 염기 다형의 대립하는 아렐을 동시에 판정할 수 있고, 이 분석 결과를 기초로 유전자형을 결정하였다. 각 1 염기 다형을 구성하는 각각의 아렐의 시그널이 양방 검출되면 헤테로, 어느 일방의 시그널만이 검출되면, 당해 검출된 아렐의 호모형으로 하였다.
일루미나사의 해석 매뉴얼인 Infinium (등록상표) Genotyping Data Analysis 에 따라, 해석 대상이 되는 모든 1 염기 다형에 대해, 형광 시그널의 분포를 나타내는 클러스터 화상을 기본으로 유전자형 판정의 정확성을 확인하였다. 정확히 결정된 1 염기 다형의 유전자형에 대해서는, 형광 시그널은 각각이 완전히 분리된 3 개의 클러스터 (2 종의 호모형와 헤테로형) 가 되어 화상상에 표시된다. 한편, 정확하게 판정되지 않은 1 염기 다형에 대해서는, 3 개의 클러스터의 경계 선은 불명료해진다. 해석 소프트웨어에 의해 클러스터 분리도가 높지 않은 것으로 판정된 경우, 그 1 염기 다형의 클러스터 화상을 다시 확인하였다. 클러스터가 불명료함에도 상관없이 유전자형의 판정이 이루어지고 있는 경우에는 그 샘플은 이후의 해석 작업에서 제외하였다. 또한, 클러스터 화상을 확인할 때에는, 마스킹 하에서, 즉 1 염기 다형명 그리고 p 값을 당해 1 염기 다형과 조합할 수 없는 상태에서 실시하였다. 또한, 2 차 해석에 사용한 본 커스텀 어레이와 1 차 해석에 사용한 아피매트릭스사 진칩 휴먼 매핑 500K 에서 중복되는 1 염기 다형에 대해, 104 샘플을 이용하여 유전자형 판정의 일치율을 비교한 결과, 99 % 이상의 일치율을 나타냈다.
실시예 10 녹내장 환자와 비환자의 유전자형 판정
녹내장 학회 가이드 라인에 기초하여 진단된 원발 개방 우각 녹내장 환자 및 정상 안압 녹내장 환자를 녹내장 환자군, 문진에 의해 녹내장 가족력이 없는 것을 확인한 건강하고 정상인 사람을 비환자군으로 나누었다. 본 해석에 대해서는, 1 차 해석으로서 실시한 실시예 3 에서 사용한 동일한 샘플을 이용하지 않고, 새로운 샘플을 수집하였다. 실시예 3 과는 상이한 녹내장 환자군 409 예, 비환자군 448 예로부터, 연구 내용에 대해 충분히 설명한 후에 참가자의 자유 의지로 얻은 동의하에 제공된 혈액을 샘플로 하고, 실시예 1 에 기재된 방법으로 총 DNA 를 추출하고, 실시예 9 에 기재된 방법으로 1 염기 다형의 분석을 실시하였다. 각각의 샘플에 대해 얻어진 1 염기 다형의 분석 결과는 리레이셔널 데이터 베이스를 채용한 Laboratory Information Management System (월드 퓨전사, LaboSelver) 에 저장하였다. 그 시스템 내에 1 염기 다형의 해석 전용 프로그램을 제작, 실장하여, 이하에 서술하는 해석을 실시하였다. 즉, 녹내장 환자군 및 비환자군 중 어느 것에 있어서도 콜레이트가 90 % 미만인 1 염기 다형, 마이너 아렐 빈도가 5 % 미만인 1 염기 다형을 기각함으로써, 실험적인 신뢰성이 높은 것으로 생각되는 1 염기 다형을 추출하였다.
실시예 11 메타 해석
메타 해석에는 만텔 헨젤법을 사용하였다 (알기 쉬운 의학 통계학, p48-80, 모리자네 토시오, 메디컬트리뷰사). 즉, 실시예 3 과 실시예 10 에 기재한 방법의 양방에서 실험적인 신뢰성이 높다고 생각할 수 있는 402 개의 1 염기 다형에 대해, 아렐 빈도와 2 개의 유전자형 빈도 (우성 유전 모델, 열성 유전 모델) 를 만텔 헨젤 카이 제곱 검정을 이용하여 통계학적으로 비교를 실시하였다. p 값이 1.2×10-4 이하 (402 회의 다중 비교를 실시했을 때의 p<5×10-2 에 상당하는 본페로니 보정의 수준), 즉 -logP 가 3.91 이상이고 아렐 모델, 우성 유전 모델, 열성 유전 모델 중 어느 것으로 녹내장 발증과의 관련을 나타내는 1 염기 다형을 표 52 에 나타낸다.
만텔 헨젤 카이 제곱 검정, 그리고, 이들의 1 염기 다형에 대한 만텔 헨젤법의 오즈비, 및, 95 % 신뢰 구간의 산출은 이하의 순서대로 실시하였다.
아렐 모델, 우성 유전 모델, 열성 유전 모델에 대해, 만텔 헨젤 카이 제곱값을 구하고, 자유도 1 의 카이 제곱 분포와 비교하여, p 값을 산출하였다.
아렐 모델의 만텔 헨젤 카이 제곱값 (χAMH 2) 는, 이하의 식에 따라 계산하였다.
Figure 112009070121914-PCT00052
우성 유전 모델의 만텔 헨젤 카이 제곱값 (χDMH 2) 는, 이하의 식에 따라
계산하였다.
Figure 112009070121914-PCT00053
열성 유전 모델의 만텔 헨젤 카이 제곱값 (χRMH 2) 은, 이하의 식에 따라
계산하였다.
Figure 112009070121914-PCT00054
아렐 모델, 우성 유전 모델, 열성 유전 모델에 대해, 만텔 헨젤 검정의 오즈비를 계산하였다.
아렐 모델의 만텔 헨젤 검정의 오즈비 (ORaMH) 는, 이하의 식에 따라 계산하였다.
Figure 112009070121914-PCT00055
우성 유전 모델의 만텔 헨젤 검정의 오즈비 (ORdMH) 는, 이하의 식에
따라 계산하였다.
Figure 112009070121914-PCT00056
열성 유전 모델의 만텔 헨젤 검정의 오즈비 (ORrMH) 는, 이하의 식에 따라 계산하였다.
Figure 112009070121914-PCT00057
아렐 모델, 우성 유전 모델, 열성 유전 모델에 대해, 만텔 헨젤 검정의 오즈비의 95 % 신뢰 구간을 계산하였다.
아렐 모델의 95 % 신뢰 구간 (95 % CIA) 은, 이하의 식에 따라 계산하였다.
Figure 112009070121914-PCT00058
우성 유전 모델의 95 % 신뢰 구간 (95 % CId) 은, 이하의 식에 따라 계산하였다.
Figure 112009070121914-PCT00059
열성 유전 모델의 95 % 신뢰 구간 (95 % CIr) 은, 이하의 식에 따라 계산하였다.
Figure 112009070121914-PCT00060
Figure 112009070121914-PCT00061
표 52 에 얻어진 공지된 1 염기 다형을 특정하는 dbSNP ID, 1 염기 다형이 존재하는 염색체 번호, 1 염기 다형의 물리적 위치, 엑손·인트론 정보 (1 염기 다형이 유전자 상에 존재하는 경우에는 유전자명 및 1 염기 다형이 존재하는 엑손 또는 인트론을 나타내고, 1 염기 다형이 유전자 상에 존재하지 않는 경우에는, 근방 유전자 및 당해 유전자와 당해 1 염기 다형 사이의 거리를 나타낸다), 연쇄 불평형 상태의 정보 (동일한 연쇄 불평형 영역에 존재하는 1 염기 다형에 대해, LD1 ∼ LD4 의 번호를 부여하였다), 아렐 1 및 아렐 2 를 구성하는 각각의 염기, 하이리스크 아렐의 염기, 녹내장 환자군 및 비환자군의 하이리스크 아렐 빈도, 3 종류의 만텔 헨젤 검정 (아렐 빈도, 우성 유전 모델, 열성 유전 모델) 중에서 가장 p 값이 낮은 검정 방법에서의 p 값, 그 검정 종류, 오즈비, 95 % 신뢰 구간, 각각의 다형 부위에 있어서의 아렐 1 을 포함하는 배열의 배열 번호 및 아렐 2 를 포함하는 배열의 배열 번호, 그리고, 2 차 해석시에 사용한 프로브의 핵산 배열을 나타내는 배열 번호 (기본적으로 동일 프로브에 의해 양방의 아렐을 검출하는데, 2 종류의 프로브를 이용하여 아렐을 식별하는 경우에는 2 개의 배열 번호를 병기) 를 나타낸다. 또한, 상기 dbSNP ID 번호보다, 당업자는 이들의 번호로부터 당해 1 염기 다형의 배열이나 아렐의 정보를 입수할 수 있다.
표 52 의 1 염기 다형의 아렐 또는 유전자형의 빈도는, 비환자와 녹내장 환자를 비교하면, 만텔 헨젤 카이 제곱 검정에 의해 통계학적으로 차가 확인되었다. 실시예 3 의 경우와 동일하게 이들 1 염기 다형 중 어느 1 개에 대해, 그 아렐을 결정함으로써, 샘플 중에, 비환자군보다도 녹내장 환자군에서 고빈도로 확인되는 아렐이 존재하는지의 여부를 판정할 수 있다.
상기 검토에 의해 아렐 또는 유전자형과 녹내장의 관련이 p 값 1.2×10-4 이하가 되는 1 염기 다형을 18 개, 게놈 상의 비교적 근접한 영역에 집단으로 존재하는 11 개의 영역을 알아냈다.
표 52 에 기재된 1 염기 다형에 대해, 녹내장 환자군에 있어서 고빈도로 확인되는 아렐 (즉 하이리스크 아렐) 또는 유전자형 (즉, 하이리스크 아렐이 우성 유전 모델에 따르는 경우, 하이리스크 아렐의 호모형 또는 헤테로형, 하이리스크 아렐이 열성 유전 모델에 따르는 경우에는 하이리스크 아렐의 호모형) 은 녹내장의 발증 리스크가 높은 것을 나타내는 마커로서 사용할 수 있게 된다. 한편, 당해 아렐에 대립하는 아렐 또는 당해 유전자형 이외의 유전자형은 녹내장의 발증 리스크가 낮은 것을 나타내는 마커로서 사용할 수 있게 된다.
동일하게, p 값 1×10-2 이하, 즉 -logP 가 2 이상으로 아렐 또는 유전자형이 녹내장 발증과의 관련을 나타내는 1 염기 다형을 표 53 ∼ 62 에 나타낸다.
Figure 112009070121914-PCT00062
Figure 112009070121914-PCT00063
Figure 112009070121914-PCT00064
Figure 112009070121914-PCT00065
Figure 112009070121914-PCT00066
Figure 112009070121914-PCT00067
Figure 112009070121914-PCT00068
Figure 112009070121914-PCT00069
Figure 112009070121914-PCT00070
Figure 112009070121914-PCT00071
표 53 ∼ 62 에 기재된 1 염기 다형에 대해서도, 동일하게 녹내장의 발증 리스크를 예측하기 위한 마커로서 사용할 수 있다.
다음으로, 표 52 에 나타낸 1 염기 다형의 주변 영역 및/또는 유전자를, HapMap 프로젝트로부터 제공되는 데이터 베이스를 참고로 결정하였다. 즉, HapMap 프로젝트의 일본인과 중국인을 합친 연쇄 불평형 데이터를 기본으로, 표 52에 나타낸 1 염기 다형과 연쇄 불평형에 있다고 생각할 수 있는 1 염기 다형이 존재하는 영역을 결정하였다.
또, 표 52 에 나타낸 1 염기 다형이 유전자를 포함하는 연쇄 불평형 영역에 있는 경우, 당해 영역의 물리적 위치와 유전자명을 결정하였다. 한편, 표 52 에 나타낸 1 염기 다형이 유전자를 함유하지 않는 연쇄 불평형 영역에 존재하는 경우, 당해 영역의 물리적 위치만을 결정하였다. 또, 표 52 에 나타낸 1 염기 다형이 연쇄 불평형 영역을 초과하는 1 개의 유전자 상에 존재하는 경우에는, 당해 유전자명 그리고 그 유전자의 물리적 위치를 결정하였다.
각 영역에 대해 p 값이 최소가 되는 1 염기 다형을 그 영역을 대표하는 1 염기 다형으로 하고, 표 63 ∼ 70 에, 각 영역을 대표하는 1 염기 다형, 당해 영역이 존재하는 염색체 번호, 당해 영역의 물리적 위치 (개시점 및 종점) 그리고 영역에 포함되는 유전자명을 나타낸다.
Figure 112009070121914-PCT00072
Figure 112009070121914-PCT00073
Figure 112009070121914-PCT00074
Figure 112009070121914-PCT00075
Figure 112009070121914-PCT00076
Figure 112009070121914-PCT00077
Figure 112009070121914-PCT00078
Figure 112009070121914-PCT00079
표 63 ∼ 70 에 기재한 영역은, 표 53 ∼ 62 중에 기재된 본 발명의 녹내장 발증에 관련되는 1 염기 다형과 연쇄되어 있다고 생각할 수 있는 영역 또는 유전자이고, 이들의 영역 또는 유전자 중에 존재하는 1 염기 다형은 본 발명의 1 염기 다형과 연쇄되어 있다고 생각할 수 있다. 즉 이들의 영역 중에 존재하는 임의의 1 염기 다형은 당해 영역 내에 존재하는 표 53 ∼ 62 에 기재된 1 염기 다형과 연쇄되어 있고, 이들의 임의의 1 염기 다형에 대해서도 동일하게 녹내장의 발증 리스크 예측에 사용할 수 있다.
실시예 11 로지스틱 회귀 분석
본 발명에 있어서는, 녹내장의 발증에 관여하는 것으로 판정된 임의의 1 염기 다형을 2 개 이상 조합함으로써, 각각의 1 염기 다형을 단독으로 사용했을 때에 비해, 질환 위험성의 예측 정밀도가 어느 정도 향상되는지에 대해 로지스틱 회귀 분석을 이용하여 검토하였다. 본 해석에는, 아렐 혹은 유전자형의 빈도를 통계적으로 비교함으로써, 녹내장의 발증에 유의하게 관련되는 것으로 판정된 상기의 1 염기 다형 중, 임의의 조합을 사용할 수 있다. 그 일례로서 본페로니의 보정을 실시해도 유의차를 나타낸 17 개의 1 염기 다형에 대해 로지스틱 회귀 분석을 실시하였다.
먼저, 본페로니의 보정에서 유의하였던 17 개의 1 염기 다형 중에서, 스텝와이즈법에 의해 로지스틱 회귀 분석에 사용하는 1 염기 다형을 더욱 국한시켰다. 스텝와이즈법 그 때의 변수 도입·변수 제거 기준으로서 0.01 을 채용하였다. 또, 스텝와이즈법의 적용에 있어서, 동일한 LD 블록에 속하는 1 염기 다형 (표 52 에 있어서, 연쇄 불평형의 란에 동일한 기재가 있는 것) 에 대해서는, 각 LD 블록에 속하는 어느 1 개의 1 염기 다형으로 대표하는 것으로 하고, 상기 어느 1 개의 1 염기 다형이 도입 대상이 되도록 설정하였다. 국한된 1 염기 다형의 각각을 독립 변수 (Π) 로 하고 (일방의 아렐의 호모형=0, 헤테로형=1, 대립 아렐의 호모형=2 로 한다), 로지스틱 회귀 분석에 의해 각 회귀 계수 (λ) 를 구하여 하기의 식 (18) 을 결정하였다.
식 (18)
Φ=1/{1+exp[-(λ0+λ1Π1+λ2Π2+λ3Π3+…)]
다음으로, 각 샘플에 있어서, 각각의 1 염기 다형에 대응하는 변수를 이 식에 대입하여 리스크 예측값 (Φ) 을 계산하였다. Φ 가 0.5 보다 클 때 이 샘플의 제공자가 발증 리스크가 있는 것으로 판단하였다. 이 판정 결과와 당해 1 염기 다형을 갖는 샘플 제공자가 실제로 녹내장 환자인지의 여부를 조합(照合)함으로써 일치율을 산출하였다. 또한, 도입된 각각의 1 염기 다형 단독, 및, 2 개 이상의 임의의 1 염기 다형의 모든 조합에 대해, 상기 일치율을 구하고, 조합에 사용한 1 염기 다형의 개수마다 일치율의 평균값과 표준 편차를 구하였다. 표 71 에, 단독 및 임의의 개수의 1 염기 다형의 조합, 임의의 개수를 조합할 때의 조합수, 그리고, 일치율의 평균값 및 표준 편차의 관계를 나타낸다. 또한, 모든 계산은, SAS Institute Japan 주식회사의, Windows (등록상표) 판 SAS 9.1.3 을 이용하였다.
표 71 에 나타내는 바와 같이, 스텝와이즈법에 의해 17 개의 1 염기 다형 중, 동일 LD 블록에 속하는 것끼리를 각각 1 개로 생각하고 10 개 전부가 선택되었다 (rs7081455, rs693421, rs9358578, rs7961953, rs16935718, rs11123034, rs13110551, rs7559118, rs10517556, rs6451268). 그들 10 개의 1 염기 다형 중, 각각 단독 혹은 임의의 2 개 이상의 조합에 대해, 로지스틱 회귀식을 이용하여 개개의 증례의 리스크 예측값 (Φ) 을 산출하였다. 리스크 예측값에 대한 컷오프값을 0.5 로 하면, 각 1 염기 다형을 단독으로 사용한 경우의 일치율의 평균값±표준 편차는 54.7±1.4 % 였다. 이 일치율은 조합에 사용하는 1 염기 다형의 수가 증대됨에 따라 증가하고, 10 개 전부를 조합했을 때에 최대값인 59.9 % 에 이르렀다.
Figure 112009070121914-PCT00080
이와 같이, 1 염기 다형에 의한 녹내장 발증 리스크의 판정은, 각 1 염기 다형을 단독으로 사용해도 양호한 일치율이 얻어지는데, 이들을 조합함으로써 추가로 진단 정밀도를 향상시킬 수 있는 것이 명백해졌다.
이상, 본 발명에서 개시된 녹내장 환자군에서 고빈도로 확인되는 아렐 또는 유전자형을 게놈 상에 갖는 사람은, 장래적으로 녹내장이 발증될 리스크가 높고, 녹내장 환자군에서 고빈도로 확인되는 아렐 또는 유전자형을 갖지 않는 사람은, 장래적으로 녹내장이 발증될 리스크가 낮다.
본 발명의 방법에 의해, 샘플 상의 본 발명의 1 염기 다형의 아렐 또는 유전자형을 분석함으로써, 샘플 제공자의 녹내장의 발증 리스크의 고저를 판정할 수 있다. 이 리스크에 기초하여 샘플 제공자는 녹내장의 예방 조치를 강구하고, 또는 적절한 치료를 받을 수 있다. 또, 본 발명의 1 염기 다형의 녹내장 환자에게 고빈도로 확인되는 아렐 또는 유전자형을 게놈에 갖는 샘플 제공자는, 안압이나 안저 사진으로는 충분히 판별하기 어려운 초기의 녹내장인지의 여부의 정밀한 검사 를 받고, 녹내장이라고 진단된 경우에는 초기에 치료를 개시할 수 있으므로 유용하다.
SEQUENCE LISTING <110> Kinoshita, Shigeru Tashiro, Kei Santen Pharmaceutical Co.,Ltd. <120> Determination method of risik for developing glaucoma <130> 08-017-PCTJP <150> JP 2007-108688 <151> 2007-04-17 <160> 694 <170> PatentIn version Ver. 3.3 <210> 1 <211> 61 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 cggtgctgca ccgtggatgt gagtccttgc acagtggtga aatgtagtag aggagtgatc 60 t 61 <210> 2 <211> 61 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 cggtgctgca ccgtggatgt gagtccttgc gcagtggtga aatgtagtag aggagtgatc 60 t 61 <210> 3 <211> 61 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 ccggagtatc ccgctttctt tggaggaaac aaccgcatca gatctgcgct gcggcagagg 60 c 61 <210> 4 <211> 61 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 ccggagtatc ccgctttctt tggaggaaac caccgcatca gatctgcgct gcggcagagg 60 c 61 <210> 5 <211> 61 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 tcagcaccct gcaccagtcc aagtacatga cagataccac agggaaggag ttcagaactg 60 t 61 <210> 6 <211> 61 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 tcagcaccct gcaccagtcc aagtacatga tagataccac agggaaggag ttcagaactg 60 t 61 <210> 7 <211> 61 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 ttctccatca tcctctttct ctattctcca gacattaggc acccactgtg tgcccagcac 60 a 61 <210> 8 <211> 61 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 ttctccatca tcctctttct ctattctcca tacattaggc acccactgtg tgcccagcac 60 a 61 <210> 9 <211> 61 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 gtttccagaa ctctttttgg ccaggctcca agctaagctc tgtaggaagc ttgatgatgg 60 g 61 <210> 10 <211> 61 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10 gtttccagaa ctctttttgg ccaggctcca ggctaagctc tgtaggaagc ttgatgatgg 60 g 61 <210> 11 <211> 61 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11 cctgcagagg ggatttgctt tgctaaagga gtcaccacag agcacccgag agtaacaggt 60 t 61 <210> 12 <211> 61 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 12 cctgcagagg ggatttgctt tgctaaagga ttcaccacag agcacccgag agtaacaggt 60 t 61 <210> 13 <211> 61 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 13 gagtgggcag ttggaaacag ctatgaaacc agcatttagt gatggggcag tagggctggg 60 g 61 <210> 14 <211> 61 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 14 gagtgggcag ttggaaacag ctatgaaacc ggcatttagt gatggggcag tagggctggg 60 g 61 <210> 15 <211> 61 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 15 aaccccatgc ctacatccat tatcaaccta cgcctatgct aaagcttgtt acaatgagca 60 g 61 <210> 16 <211> 61 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 16 aaccccatgc ctacatccat tatcaaccta tgcctatgct aaagcttgtt acaatgagca 60 g 61 <210> 17 <211> 61 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 17 ttccctgact cttgaagagg acagtggaca atgctgttta atggtggaca cagaaggatc 60 a 61 <210> 18 <211> 61 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 18 ttccctgact cttgaagagg acagtggaca gtgctgttta atggtggaca cagaaggatc 60 a 61 <210> 19 <211> 61 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 19 tatggaagca ctgtgaaaga caaactactc cgaatactga aagtttcttt tacaaaaaca 60 t 61 <210> 20 <211> 61 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 20 tatggaagca ctgtgaaaga caaactactc tgaatactga aagtttcttt tacaaaaaca 60 t 61 <210> 21 <211> 61 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 21 ataacacctg ccactgacct tccatgagca gtgactatgt ggtttcaaca ttggtcccac 60 c 61 <210> 22 <211> 61 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 22 ataacacctg ccactgacct tccatgagca ttgactatgt ggtttcaaca ttggtcccac 60 c 61 <210> 23 <211> 61 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 23 gccactgcca ccactcctgc agattgttcc agctgtgtta ctaaatacag gttgcttttc 60 t 61 <210> 24 <211> 61 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 24 gccactgcca ccactcctgc agattgttcc cgctgtgtta ctaaatacag gttgcttttc 60 t 61 <210> 25 <211> 61 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 25 gtgagccacc atgcccagcc ctgtcatcta cctttctgag agcagcttct acccatctga 60 a 61 <210> 26 <211> 61 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 26 gtgagccacc atgcccagcc ctgtcatcta tctttctgag agcagcttct acccatctga 60 a 61 <210> 27 <211> 61 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 27 cttgtcttca agagcagatg cagattatcc cgagcccagg ggacctatgt gagggagctt 60 c 61 <210> 28 <211> 61 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 28 cttgtcttca agagcagatg cagattatcc tgagcccagg ggacctatgt gagggagctt 60 c 61 <210> 29 <211> 61 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 29 agtgggaccc tgtgaggcaa acatcaccac aaggctggga acagcaggac tcaggcactg 60 c 61 <210> 30 <211> 61 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 30 agtgggaccc tgtgaggcaa acatcaccac gaggctggga acagcaggac tcaggcactg 60 c 61 <210> 31 <211> 61 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 31 tatataataa agacatctga taacatgaca gctaaggctc cttctaggta taaaacgtta 60 t 61 <210> 32 <211> 61 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 32 tatataataa agacatctga taacatgaca tctaaggctc cttctaggta taaaacgtta 60 t 61 <210> 33 <211> 61 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 33 atggcagggg ccagggtgag tggagaatac cgcttgatga gagaacccca aggcggagag 60 g 61 <210> 34 <211> 61 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 34 atggcagggg ccagggtgag tggagaatac tgcttgatga gagaacccca aggcggagag 60 g 61 <210> 35 <211> 61 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 35 cccttttctt tcttgttctt tttaagactc aatctcaaat ctgcaaccta cctaccataa 60 g 61 <210> 36 <211> 61 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 36 cccttttctt tcttgttctt tttaagactc gatctcaaat ctgcaaccta cctaccataa 60 g 61 <210> 37 <211> 61 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 37 tttctggctt agaattattc ataggtacaa 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agaagctccc gcatttctca ccttttacaa gtataatgac agaactagac gctgtcctct 60 a 61 <210> 145 <211> 61 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 145 accttaatca gaaatttcca gtttccaaaa attgtattat actcaggttg gccctaggtt 60 t 61 <210> 146 <211> 61 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 146 accttaatca gaaatttcca gtttccaaaa gttgtattat actcaggttg gccctaggtt 60 t 61 <210> 147 <211> 61 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 147 accaaagtgg gtaggatttg ttttcagtgg ccacatatca agcccatttt taaattattg 60 a 61 <210> 148 <211> 61 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 148 accaaagtgg gtaggatttg ttttcagtgg gcacatatca agcccatttt taaattattg 60 a 61 <210> 149 <211> 61 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 149 ctagctaaag gactaagaac ggggcagcct aacaaaatga aggcttttag acaataacca 60 c 61 <210> 150 <211> 61 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 150 ctagctaaag gactaagaac ggggcagcct cacaaaatga aggcttttag acaataacca 60 c 61 <210> 151 <211> 61 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 151 cccttctctg taataacact acgctaggtc acgatagatc tttagggggt gtatatttgg 60 a 61 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atctaagtaa ggttagaaat gcttcggcct gtatgacttt ttaacctggt acacttaaac 60 c 61 <210> 213 <211> 61 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 213 gatttaaaaa cttatcaagg tcactagtta atcactgctg gagccagaac tggagcccat 60 g 61 <210> 214 <211> 61 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 214 gatttaaaaa cttatcaagg tcactagtta gtcactgctg gagccagaac tggagcccat 60 g 61 <210> 215 <211> 61 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 215 gcaaaaccag taaatctaac tgcaattgtg attgatggca aatctacaga gtgaacaatc 60 a 61 <210> 216 <211> 61 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 216 gcaaaaccag taaatctaac tgcaattgtg gttgatggca aatctacaga gtgaacaatc 60 a 61 <210> 217 <211> 61 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 217 ttcagatggg tagaagctgc tctcagaaag atagatgaca gggctgggca tggtggctca 60 c 61 <210> 218 <211> 61 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 218 ttcagatggg tagaagctgc tctcagaaag gtagatgaca gggctgggca tggtggctca 60 c 61 <210> 219 <211> 61 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 219 gctgtatata atatttgaaa atgacactga acaagcgaag attacagtgg tttttcttct 60 t 61 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<210> 592 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 592 acttcttttc ttttgtgtac actctcttct tcggctatgc tgtgctctaa 50 <210> 593 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 593 ctccctcaaa gcacaaacat ctgtgaaagc agaggctcga gggaccattc 50 <210> 594 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 594 aggaatttta agacagtgcg agaatcattc tttctccttc ctactccttc 50 <210> 595 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 595 ccagttccca acaagttcct catctccacc tgagaacgtc ttatcctgaa 50 <210> 596 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 596 atgttatgtc ctctttacta acacagaact atagaatgca tgggccagaa 50 <210> 597 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 597 aatgaggcag catttgggta tttcttgtaa taaagttcct ctgcattgca 50 <210> 598 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 598 tctctgtcta tcttaacaga aagctgacct gtgagggctt ctttagggtc 50 <210> 599 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 599 acccacgtgg caaagaactg taggtggttt gtaggagttg agagcctcag 50 <210> 600 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 600 acctgttggg aaatatctct cccttgtatt acacatgaat tattatttgg 50 <210> 601 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 601 gctaaataat agcatgtaat tactttttta attagaataa tactgccagc 50 <210> 602 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 602 taactttctc tcttggtcca attggaatta taacaagcaa gacccctggc 50 <210> 603 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 603 cctctgtttt gtattattac aatttaaaat gaggaaagct atgtagtcat 50 <210> 604 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 604 taacagctaa cacgtgctct gggccttggt ttccaaagct ttcttacatc 50 <210> 605 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 605 aaattctttt ggcttttgta tgtctaaaaa gggtccctgt tttgccttcc 50 <210> 606 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 606 agatgtaccc aagtgtaaaa tatacactga attttgaaga tgtggtttca 50 <210> 607 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 607 cccggccgcc tttttcaata atatttctct gaactgcctg cagcttttac 50 <210> 608 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 608 agtttagggc cagtcagcat aaaggtggtc gataaaaccg tcagtgtaaa 50 <210> 609 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 609 ttctttaggc aggtcaatgt ggggagtgtt gtgatggata ttctagtgca 50 <210> 610 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 610 gggccccttt ccaatgttat tttccaaata tcctttctcc agtgctttat 50 <210> 611 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 611 aattttatct ttcttccctg tgccccaaag cctttaactt ggatgatcta 50 <210> 612 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 612 gggctatcca caggccaagg aatacttgag agttttctaa tctgtcattt 50 <210> 613 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 613 gtaggtgcca tctttttcta tagaagtgac tatgagttcc atcaaatagg 50 <210> 614 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 614 gtctaaaaaa ctgttaatga gaaaacttat gctactagac ttttaagggt 50 <210> 615 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 615 ctctttcttg ctggaccctg agtgagacag tatattttca ggaaacgtac 50 <210> 616 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 616 gggtataggg gaaggaacaa acttctatta cattcacagc taaatatggc 50 <210> 617 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 617 gcttttcttt atgctaggca tgctctcgcc ccgcatctgt gcactgactc 50 <210> 618 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 618 gtatccttaa atatccattg gctaaaatca atagccattg aagctccact 50 <210> 619 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 619 tgagcaagtt tgcttcccct ccccagccct actgccccat cactaaatgc 50 <210> 620 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 620 tgaagacact ctattgagag tagccctcta agtattgttc aaattccctc 50 <210> 621 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 621 aaacttcttt aaacttggaa atgtttttgt aaaagaaact ttcagtattc 50 <210> 622 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 622 gtcacgatag tagcacaccc tagctacagg cagagcacct agaaagaaac 50 <210> 623 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 623 cagcacgctg agatgggatg aaagacagag tgctgtttga acctagagaa 50 <210> 624 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 624 aatatctgcc ccagtatctg cagcaatacc ttaagatagt ccctttgcct 50 <210> 625 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 625 tccttccaca ttagtttaaa tgtgaatggc tgcttggaac acagtgttga 50 <210> 626 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 626 caaatgactc ttttaagttg atgtctcctc cccaggtcat cagaataatc 50 <210> 627 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 627 catttaatta cttcttgctt caatcttatc ccacactctg gtcatacaac 50 <210> 628 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 628 gatgtggaat atgctagctt gttagaaagt cagcctcaac atgttgtggt 50 <210> 629 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 629 ctaaattaca gccagacctc tggctgcaga ggagtctgag acatgtatga 50 <210> 630 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 630 atcatcataa ataacgtgga gcagatggaa gatgccgggc ttttcatttc 50 <210> 631 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 631 aagcattagg gacaattggt gtgcatccta aaagcagtga caggttagac 50 <210> 632 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 632 gaggaggagg taaaggagag gacctcagta aatatgttga tggtccagac 50 <210> 633 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 633 ggtagttccc caaggactcg agtgggaccc tgtgaggcaa acatcaccac 50 <210> 634 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 634 aggtcttgca gccctgggag acttttgggt tgtagctgcc tatagctgcc 50 <210> 635 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 635 aaaagagtga ccattgggct taccttctgt taaaacttct ttgtctggct 50 <210> 636 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 636 aaaggaaatt tattttttct cctgaaaaag taagcaatct atctaagttg 50 <210> 637 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 637 gtaatagcat tctccattcc acatgtttta agatgttttc ttgagagctt 50 <210> 638 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 638 catctgtgaa ctgggagtaa caatttgacc ttcttcacag ggctgcttgg 50 <210> 639 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 639 tccagtttct ggttaactgt gggtcttggt taatctgcca attgtgagat 50 <210> 640 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 640 gactgtgccc tgtgtgtatc aaaggaaggg tctctccagc ttgtggacaa 50 <210> 641 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 641 atgctgaaga accttaagca tacttaagca gcacgtgctc ttcatttcaa 50 <210> 642 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 642 ttgtgggatg aaaagatggt cacagctgag ctgtgggagg gcagaagtga 50 <210> 643 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 643 ggggaaagag aaaagaaaga ttcgaaactc catgaaactg acattcccat 50 <210> 644 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 644 atctgtagag acttgccaga tatgttaaaa tgtggaggga aaagaaagcc 50 <210> 645 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 645 cacagcatga gagttgctcc agatcactcc tctactacat ttcaccactg 50 <210> 646 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 646 tcacaggcag ggcacaccta aacacctctt tccacctgca gacccgttct 50 <210> 647 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 647 gagatgaccc caaaggttaa ttaatgtctc actgagattt tatgacatgc 50 <210> 648 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 648 gaaaaaggct ttgacttcca actctacttc cttcctgttt aactgtacca 50 <210> 649 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 649 gtgaatgggc aaggcattct aaccccatgc ctacatccat tatcaaccta 50 <210> 650 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 650 tatattgtaa aaagaagaag tccaggttca cccttctgta tacgtctaac 50 <210> 651 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 651 ccccaatagt ccttgtctct taactgcctc agcctgaagg agacgcatta 50 <210> 652 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 652 actgtgccca aaacatagca aactcttaat aaacattcac tgttcaatgg 50 <210> 653 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 653 gttaaaacac agattgccag gccgttctca gggtttctga tttagtaagt 50 <210> 654 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 654 gccacaactt acagaattta gcatgttggg gttggagact taaaaatcac 50 <210> 655 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 655 ttttttgaga gaagaagggg cttatggtag gtaggttgca gatttgagat 50 <210> 656 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 656 tttcacagtg gagttgctat taggtagggc aagtaccatc tgattatgat 50 <210> 657 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 657 aatccaaaac acccagcatt atgggtaatt tggacaatgg tctaaaagct 50 <210> 658 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 658 gcagggagac agcatgtgtg tgaggctgtc ttgagacttg actgatagaa 50 <210> 659 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 659 acacctctgt ttagcagtga agtatggata tatatgtgtg atctgtgtta 50 <210> 660 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 660 cccagaaatc aacccataca atgtagtcaa ctgatttatg aaaaacacag 50 <210> 661 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 661 atcactgtaa gctgctcctt gtcactcagt gagcaagagg ttgatttttt 50 <210> 662 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 662 agcaagcttg ctgaaatcgt gaataacaga agaatgcaca cacattccaa 50 <210> 663 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 663 gggaaattta tttaaagaca atagatgtag tatccagttc tgatgtcagg 50 <210> 664 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 664 gatgtactaa tattatttgg ctagtattct cttagtggac atttctgttg 50 <210> 665 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 665 tttgtactcc aggaaagaga ggaggaggta gcttgaacta ggatgacggc 50 <210> 666 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 666 tggccagaaa agatgaaata tttgaactta tccagcacac gaatacacag 50 <210> 667 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 667 tttattgtca ctgagatact actttgtgtt caccagtgag gatgtaggaa 50 <210> 668 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 668 ggcacctggg agaagcaaat ataaatactc tctggaaaaa tctaccttca 50 <210> 669 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 669 cagacaaatg caaaagatta tttgagacat tctctaagtt ggatagctag 50 <210> 670 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 670 agaagacatg agactactaa acagcaaaag cagatggaag ggaggttaat 50 <210> 671 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 671 aagccctgta gatgagagct tctcttttcc tggaaactcc accaggaagc 50 <210> 672 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 672 atcgtgtgct cataaccaca agtggactct ggcttcatgt aaccacaagc 50 <210> 673 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 673 atacgcaggt ggaatggtct gcaaacagat gaattcagcc cctccaaacc 50 <210> 674 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 674 gataagggac ctcccacaca ccccaaaagt ggtttataaa acattgactg 50 <210> 675 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 675 tttataaaac attgactcca catcactgta gttaacccaa accaaaagag 50 <210> 676 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 676 ctgacagcct aggggacagg gccatggctg agttgactgg gttcagattg 50 <210> 677 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 677 ttcaccttga agattgcagt tggcttccaa ctggcctcta aactctaatg 50 <210> 678 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 678 acgtacagaa tgggattctt aagagagcct ctaggttagc gccgctgaag 50 <210> 679 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 679 tactacagga gataccactt tccccttatc agactggcaa atagccaaat 50 <210> 680 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 680 tcttgaaaag gacattacgt tcctggcaat taagtcaaac cttaagctag 50 <210> 681 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 681 acagtgcgga aagaggcaac tattccagga ggcagggggt atagagtggc 50 <210> 682 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 682 agagtgagaa tttgagccaa aatatctctg aatctagacc ttgagctgta 50 <210> 683 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 683 tatagatgca taactacaat attttcctct gtcttcaccc ggcattcccc 50 <210> 684 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 684 tctctgtcta tcttaacaga aagctgacct gtgagggctt ctttagggtg 50 <210> 685 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 685 cctctgtttt gtattattac aatttaaaat gaggaaagct atgtagtcaa 50 <210> 686 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 686 gtctaaaaaa ctgttaatga gaaaacttat gctactagac ttttaaggga 50 <210> 687 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 687 gcttttcttt atgctaggca tgctctcgcc ccgcatctgt gcactgactg 50 <210> 688 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 688 catttaatta cttcttgctt caatcttatc ccacactctg gtcatacaag 50 <210> 689 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 689 aagcattagg gacaattggt gtgcatccta aaagcagtga caggttagag 50 <210> 690 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 690 ggggaaagag aaaagaaaga ttcgaaactc catgaaactg acattcccaa 50 <210> 691 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 691 tttcacagtg gagttgctat taggtagggc aagtaccatc tgattatgaa 50 <210> 692 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 692 aatccaaaac acccagcatt atgggtaatt tggacaatgg tctaaaagca 50 <210> 693 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 693 cccagaaatc aacccataca atgtagtcaa ctgatttatg aaaaacacac 50 <210> 694 <211> 50 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 694 cagacaaatg caaaagatta tttgagacat tctctaagtt ggatagctac 50

Claims (34)

  1. 피검자 유래의 샘플에 있어서, 배열 번호 203 ∼ 514 로 나타내는 염기 배열로 이루어지는 군에서 선택되는, 적어도 1 개의 염기 배열 또는 그 상보적 배열에 있어서의, 각 염기 배열의 31 번째에 존재하는 1 염기 다형의 아렐 및/또는 유전자형을 in vitro 에서 검출하는 공정 (공정 A), 그리고
    상기 공정 A 에서 검출된 아렐 및/또는 유전자형을, 배열 번호 203 ∼ 514 로 나타내는 염기 배열에 있어서의 하이리스크 아렐을 함유하는 아렐 및/또는 유전자형의 적어도 1 개와 비교하는 공정 (공정 B)
    을 포함하고,
    상기 공정 A 에서 검출된 아렐이 상기 하이리스크 아렐인 경우에 녹내장 리스크가 있는 것으로 판정되고, 혹은, 상기 하이리스크 아렐이 우성 유전 모델에 수반되는 경우, 상기 공정 A 에서 검출된 유전자형이 상기 하이리스크 아렐을 함유하는 유전자형의 호모형 또는 헤테로형인 경우에 녹내장 리스크가 있는 것으로 판정되고, 상기 하이리스크 아렐이 열성 유전 모델에 수반되는 경우, 상기 공정 A 에서 검출된 유전자형이 상기 하이리스크 아렐을 함유하는 유전자형의 호모형인 경우에 녹내장 리스크가 있는 것으로 판정되는, 녹내장 리스크 유무의 판정 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    녹내장 리스크가 녹내장의 발증 리스크인 판정 방법.
  3. 제 2 항에 있어서,
    염기 배열이 배열 번호 203 ∼ 238 로 나타내는 염기 배열로 이루어지는 군에서 선택되는 판정 방법.
  4. 제 3 항에 있어서,
    공정 B 에 있어서의 비교를, 배열 번호 203 ∼ 238 로 나타내는 염기 배열에 있어서의 하이리스크 아렐을 함유하는 아렐 및/또는 유전자형을 임의로 2 개 이상 선택하여 조합하여 실시하고, 공정 A 에서 검출된 아렐이 공정 B 에서 비교용으로 선택한 상기 어느 것의 아렐인 경우에 녹내장 리스크가 있는 것으로 판정되고, 혹은, 상기 하이리스크 아렐이 우성 유전 모델에 따르는 경우, 공정 A 에서 검출된 유전자형이 공정 B 에서 비교용으로 선택한 상기 어느 것의 유전자형의 호모형 또는 헤테로형인 경우에 녹내장 리스크가 있는 것으로 판정되고, 상기 하이리스크 아렐이 열성 유전 모델에 따르는 경우, 공정 A 에서 검출된 유전자형이 공정 B 에서 비교용으로 선택한 상기 어느 하나의 유전자형의 호모형인 경우에 녹내장 리스크가 있는 것으로 판정되는 판정 방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    공정 B 에 있어서의 비교를, 배열 번호 203 ∼ 238 로 나타내는 염기 배열에 있어서의 하이리스크 아렐을 함유하는 아렐 및/또는 유전자형을 전부 선택하여 조 합하여 실시하고, 공정 A 에서 검출된 아렐이 공정 B 에서 비교용으로 선택한 상기 어느 것의 아렐인 경우에 녹내장 리스크가 있는 것으로 판정되고, 혹은, 상기 하이리스크 아렐이 우성 유전 모델에 따르는 경우, 공정 A 에서 검출된 유전자형이 공정 B 에서 비교용으로 선택한 상기 어느 것의 유전자형의 호모형 또는 헤테로형인 경우에 녹내장 리스크가 있는 것으로 판정되고, 상기 하이리스크 아렐이 열성 유전 모델에 따르는 경우, 공정 A 에서 검출된 유전자형이 공정 B 에서 비교용으로 선택한 상기 어느 것의 유전자형의 호모형인 경우에 녹내장 리스크가 있는 것으로 판정되는 판정 방법.
  6. 제 2 항에 있어서,
    추가로, 발증 리스크의 대소의 예측을 실시하는 공정을 포함하는 판정 방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    녹내장이 원발 개방 우각 녹내장 (POAG) 또는 정상 안압 녹내장 (NTG) 인 판정 방법.
  8. 피검자 유래의 샘플에 있어서, 배열 번호 203 ∼ 514 로 나타내는 염기 배열로 이루어지는 군에서 선택되는, 적어도 1 개의 염기 배열 또는 그 상보적 배열로 이루어지는 핵산 분자에 있어서의, 각 염기 배열의 31 번째에 존재하는 1 염기 다형의 아렐 및/또는 유전자형을 in vitro 에서 검출하는 공정 (공정 C1), 또는 배열 번호 515 ∼ 694 로 나타내는 염기 배열로 이루어지는 군에서 선택되는, 적어도 1 개의 염기 배열 또는 그 상보적 배열로 이루어지는 염기 배열을 포함하는 핵산 분자를 이용하고, 상기 1 염기 다형의 아렐 및/또는 유전자형을 in vitro 에서 검출하는 공정 (공정 C2), 그리고
    상기 공정 C1 또는 C2 에서 검출된 아렐 및/또는 유전자형을, 배열 번호 203 ∼ 514 로 나타내는 염기 배열에 있어서의 하이리스크 아렐을 함유하는 아렐 및/또는 유전자형을 함유하는 적어도 1 개의 핵산 분자와 비교하는 공정 (공정 D)
    을 포함하고,
    상기 공정 C1 또는 C2 에서 검출된 아렐이 상기 하이리스크 아렐인 경우에 녹내장 리스크가 있는 것으로 판정되고, 혹은, 상기 하이리스크 아렐이 우성 유전 모델에 수반되는 경우, 상기 공정 C1 또는 C2 에서 검출된 유전자형이 상기 하이리스크 아렐을 함유하는 유전자형의 호모형 또는 헤테로형인 경우에 녹내장 리스크가 있는 것으로 판정되고, 상기 하이리스크 아렐이 열성 유전 모델에 수반되는 경우, 상기 공정 C1 또는 C2 에서 검출된 유전자형이 상기 하이리스크 아렐을 함유하는 유전자형의 호모형인 경우에 녹내장 리스크가 있는 것으로 판정되는, 녹내장 리스크 유무의 판정 방법.
  9. 제 8 항에 있어서,
    녹내장 리스크가 녹내장의 발증 리스크인 판정 방법.
  10. 제 9 항에 있어서,
    공정 C1 및 D 에 있어서의 염기 배열이 배열 번호 203 ∼ 238 로 나타내는 염기 배열로 이루어지는 군에서 선택되거나, 또는, 공정 C2 에 있어서의 염기 배열이 배열 번호 515 ∼ 535 로 나타내는 염기 배열로 이루어지는 군에서 선택되는 판정 방법.
  11. 제 10 항에 있어서,
    공정 D 에 있어서의 비교를, 배열 번호 203 ∼ 238 로 나타내는 염기 배열에 있어서의 하이리스크 아렐을 함유하는 아렐 및/또는 유전자형을 함유하는 핵산 분자를 임의로 2 개 이상 선택하여 조합하여 실시하고, 공정 C1 또는 C2 에서 검출된 아렐이 공정 D 에서 비교용으로 선택한 상기 어느 것의 핵산 분자에 있어서의 하이리스크 아렐인 경우에 녹내장 리스크가 있는 것으로 판정되고, 혹은, 상기 하이리스크 아렐이 우성 유전 모델에 따르는 경우, 공정 C1 또는 C2 에서 검출된 유전자형이 공정 D 에서 비교용으로 선택한 상기 어느 것의 핵산 분자에 있어서의 유전자형의 호모형 또는 헤테로형인 경우에 녹내장 리스크가 있는 것으로 판정되고, 상기 하이리스크 아렐이 열성 유전 모델에 따르는 경우, 공정 C1 또는 C2 에서 검출된 유전자형이 공정 D 에서 비교용으로 선택한 상기 어느 것의 핵산 분자에 있어서의 유전자형의 호모형인 경우에 녹내장 리스크가 있는 것으로 판정되는 판정 방법.
  12. 제 11 항에 있어서,
    공정 D 에 있어서의 비교를, 배열 번호 203 ∼ 238 로 나타내는 염기 배열에 있어서의 하이리스크 아렐을 함유하는 아렐 및/또는 유전자형을 함유하는 핵산 분자를 전부 선택하여 조합하여 실시하고, 공정 C1 또는 C2 에서 검출된 아렐이 공정 D 에서 비교용으로 선택한 상기 어느 것의 핵산 분자에 있어서의 하이리스크 아렐인 경우에 녹내장 리스크가 있는 것으로 판정되고, 혹은, 상기 하이리스크 아렐이 우성 유전 모델에 따르는 경우, 공정 C1 또는 C2 에서 검출된 유전자형이 공정 D 에서 비교용으로 선택한 상기 어느 것의 핵산 분자에 있어서의 유전자형의 호모형 또는 헤테로형인 경우에 녹내장 리스크가 있는 것으로 판정되고, 상기 하이리스크 아렐이 열성 유전 모델에 따르는 경우, 공정 C1 또는 C2 에서 검출된 유전자형이 공정 D 에서 비교용으로 선택한 상기 어느 것의 핵산 분자에 있어서의 유전자형의 호모형인 경우에 녹내장 리스크가 있는 것으로 판정되는 판정 방법.
  13. 제 9 항에 있어서,
    추가로, 발증 리스크의 대소의 예측을 실시하는 공정을 포함하는 판정 방법.
  14. 제 8 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서,
    핵산 분자를 프로브로서 사용하는 판정 방법.
  15. 제 14 항에 있어서,
    핵산 분자가 23 염기 ∼ 55 염기인 판정 방법.
  16. 제 14 항에 있어서,
    프로브가 고정화되어 이루어지는 판정 방법.
  17. 제 8 항에 있어서,
    녹내장이 원발 개방 우각 녹내장 (POAG) 또는 정상 안압 녹내장 (NTG) 인 판정 방법.
  18. 배열 번호 203 ∼ 514 로 나타내는 염기 배열로 이루어지는 군에서 선택되는, 적어도 1 개의 염기 배열 혹은 그 상보적 배열 또는 이들의 부분 배열로 이루어지는 핵산 분자로서, 각 염기 배열의 31 번째에 존재하는 1 염기 다형을 함유하는 핵산 분자, 및/또는, 배열 번호 515 ∼ 694 로 나타내는 염기 배열로 이루어지는 군에서 선택되는, 적어도 1 개의 염기 배열 또는 그 상보적 배열로 이루어지는 염기 배열을 포함하는 핵산 분자를 함유하는, 피검자 유래의 샘플에 있어서 상기 1 염기 다형의 아렐 및/또는 유전자형을 in vitro 에서 검출하기 위한, 녹내장 리스크 유무의 판정 키트.
  19. 제 18 항에 있어서,
    녹내장 리스크가 녹내장의 발증 리스크인 키트.
  20. 제 19 항에 있어서,
    염기 배열이 배열 번호 203 ∼ 238 로 나타내는 염기 배열로 이루어지는 군, 및/또는, 배열 번호 515 ∼ 535 로 이루어지는 군에서 선택되는 키트.
  21. 제 20 항에 있어서,
    배열 번호 203 ∼ 238 로 나타내는 염기 배열 혹은 그 상보적 배열 또는 이들의 부분 배열로 이루어지는 핵산 분자를 임의로 2 개 이상, 및/또는, 배열 번호 515 ∼ 535 로 나타내는 염기 배열 또는 그 상보적 배열로 이루어지는 핵산 분자를 임의로 2 개 이상 함유하는 키트.
  22. 제 21 항에 있어서,
    배열 번호 203 ∼ 238 로 나타내는 염기 배열 혹은 그 상보적 배열 또는 이들의 부분 배열로 이루어지는 핵산 분자를 전부, 및/또는, 배열 번호 515 ∼ 535 로 나타내는 염기 배열 또는 그 상보적 배열로 이루어지는 핵산 분자를 전부 함유하는 키트.
  23. 제 19 항에 있어서,
    발증 리스크의 대소의 예측을 추가로 실시하기 위한 키트.
  24. 제 18 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서,
    핵산 분자를 프로브로서 사용하는 키트.
  25. 제 24 항에 있어서,
    핵산 분자가 23 염기 ∼ 55 염기인 키트.
  26. 제 24 항에 있어서,
    프로브가 고정화되어 이루어지는 키트.
  27. 제 18 항에 있어서,
    녹내장이 원발 개방 우각 녹내장 (POAG) 또는 정상 안압 녹내장 (NTG) 인 키트.
  28. 이하의 공정을 포함하는, 녹내장 리스크 유무의 판정 방법.
    공정 (i) : 피검자 유래의 샘플로부터 핵산 분자를 추출하는 공정
    공정 (ii) : 상기 공정 (i) 에서 추출된 핵산 분자에 대해, 배열 번호 203 ∼ 514 로 나타내는 염기 배열 또는 그 상보적 배열에서 선택되는 적어도 1 개의 염기 배열에 대해, 각 염기 배열의 31 번째에 존재하는 1 염기 다형의 아렐을 검출하는 공정
    공정 (iii) : 상기 공정 (ii) 에서 검출된 아렐에 기초하여, 녹내장 리스크의 유무를 판정하는 공정.
  29. 제 28 항에 있어서,
    공정 (iii) 이, 공정 (ii) 에서 검출된 아렐에 기초하고, 유전자형을 결정하는 공정을 포함하는 판정 방법.
  30. 제 28 항 또는 제 29 항에 있어서,
    공정 (iii) 이, 공정 (ii) 에서 검출된 아렐이 하이리스크 아렐인지의 여부를 판정하는 공정을 포함하는 판정 방법.
  31. 제 30 항에 있어서,
    공정 (iii) 이, 공정 (ii) 에서 검출된 아렐이 하이리스크 아렐인 경우에, 녹내장 리스크가 높은 것으로 판정되는 공정을 포함하는 판정 방법.
  32. 배열 번호 203 ∼ 514 로 나타내는 염기 배열로 이루어지는 군에서 선택되는, 적어도 1 개의 염기 배열 혹은 그 상보적 배열 또는 이들의 부분 배열로 이루어지는 핵산 분자로서, 각 염기 배열의 31 번째에 존재하는 1 염기 다형의 아렐 및/또는 유전자형을 함유하는 핵산 분자의, 녹내장 리스크의 판정을 위한 사용,
  33. 피검자 유래의 샘플에 있어서, 배열 번호 203 ∼ 514 로 나타내는 염기 배열로 이루어지는 군에서 선택되는, 적어도 1 개의 염기 배열 또는 그 상보적 배열에 있어서의, 각 염기 배열의 31 번째에 존재하는 1 염기 다형의 아렐 및/또는 유전자형을 in vitro 에서 검출하는 공정 (공정 E), 그리고
    상기 공정 E 에서 검출된 아렐 및/또는 유전자형을, 배열 번호 203 ∼ 514 로 나타내는 염기 배열에 있어서의 하이리스크 아렐을 함유하는 아렐 및/또는 유전자형의 적어도 1 개와 비교하는 공정 (공정 F)
    을 포함하고,
    상기 공정 E 에서 검출된 아렐이 상기 하이리스크 아렐인 경우에 녹내장인 것으로 진단되고, 혹은, 상기 하이리스크 아렐이 우성 유전 모델에 따르는 경우, 상기 공정 E 에서 검출된 유전자형이 상기 하이리스크 아렐을 함유하는 유전자형의 호모형 또는 헤테로형인 경우에 녹내장인 것으로 진단되고, 상기 하이리스크 아렐이 열성 유전 모델에 수반되는 경우, 상기 공정 E 에서 검출된 유전자형이 상기 하이리스크 아렐을 함유하는 유전자형의 호모형인 경우에 녹내장인 것으로 진단되는, 녹내장의 진단 방법.
  34. 이하의 공정을 포함하는, 녹내장 발증 리스크의 판정 방법.
    공정 (I) : 제 3 항에 기재된 판정 방법을 이용하여, 녹내장 발증 리스크의 유무 판정을 실시하는 공정
    공정 (II) : 상기 공정 (I) 에 있어서, 적어도 어느 1 개의 1 염기 다형에 대해 발증 리스크가 있는 것으로 판정된 경우에, 더 한층의 리스크 판정이 필요한 것으로 판정되는 공정
    공정 (III) : 상기 공정 (II) 에 있어서, 더 한층의 리스크 판정이 필요한 것으로 판정된 경우에, 제 5 항에 기재된 판정 방법을 이용하여, 추가로 녹내장 발증 리스크의 유무 판정을 실시하는 공정.
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