WO2018003523A1 - 広義原発開放隅角緑内障の発症リスクの判定方法 - Google Patents
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- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
Definitions
- the present invention relates to a method for determining the risk of developing wide-angle primary open-angle glaucoma, a device for determining the risk of developing wide-angle primary open-angle glaucoma, and a computer program to be executed by the apparatus.
- Glaucoma is a neurodegenerative disease in which retinal ganglion cells are damaged and progress irreversibly and lead to blindness. In addition, it is the leading cause of premature blindness in Japan, and the prevalence rate of 40 years old and over is the primary disease type of broad-angle primary open-angle glaucoma (broad-sense primary open-angle glaucoma, hiroyoshi POAG; narrow-sense primary open-angle glaucoma) And normal-tension glaucoma, IPSJ Journal Vol. 116, No. 1, pp. 15 to 18) accounted for 3.9%, but most of these were potential glaucoma patients without subjective symptoms. Since glaucoma can be prevented from progressing by instillation treatment at the beginning of the onset, if it becomes possible to predict the onset by screening tests, etc., it is possible to maintain visual function throughout life. It has been broken.
- Patent Document 1 a known polymorphic site existing on the genome (autosome) of a glaucoma patient and a non-patient who does not have a glaucoma family history is disclosed in Patent Document 2, and a patient who is a glaucoma patient and progresses slowly.
- SNPs single nucleotide polymorphisms
- the predictive hit rate (sensitivity and specificity) is about 60 to 70% at the maximum, and higher sensitivity, specificity, and positive predictive value (PPV)
- PSV positive predictive value
- An object of the present invention is to provide a method for accurately determining the risk of developing POAG in a broad sense, a device for determining the risk of developing POAG in a broad sense that executes the method, and a computer program for causing the device to execute the method.
- the present inventors have obtained genomes based on genotype information obtained by using a high-density chip using specimens of many glaucoma patients and healthy non-glaucoma patients possessed by the present inventors.
- GWAS genetic-wide association study
- the present invention relates to the following [1] to [3].
- [1] Based on allele information of single nucleotide polymorphism (SNP) in a biological sample collected from a subject, selected from 12 core SNP groups listed in Table 1 and pooled SNP groups listed in Table 2
- An allele measurement step for measuring alleles for at least 30 SNPs in combination with SNP (pool selection SNP group)
- an information acquisition step for acquiring information on the risk of developing wide-angle primary open-angle glaucoma in the subject, and on the basis of the information obtained above.
- a method for assisting diagnosis of a subject's risk of developing open-angle glaucoma in a broad sense including an information providing step for providing information for determining the risk of developing open-angle glaucoma.
- a computer including a processor and a memory under the control of the processor, Based on the allele information of single nucleotide polymorphism (SNP) in the biological sample collected from the subject, the SNP selected from the 12 core SNP groups shown in Table 1 and the pool SNP group shown in Table 2 Allele measurement step for measuring alleles for at least 30 SNPs in combination with (selected SNP group), Based on the measurement result of the allele, an information acquisition step for acquiring information on the risk of developing wide-angle primary open-angle glaucoma in the subject, and on the basis of the information obtained above, A computer program for causing the computer to execute an information providing process for providing information for determining the risk of developing open-angle glaucoma is recorded. Detection device.
- SNP single nucleotide polymorphism
- a computer including a processor and a memory under the control of the processor, Based on the allele information of single nucleotide polymorphism (SNP) in the biological sample collected from the subject, the SNP selected from the 12 core SNP groups shown in Table 1 and the pool SNP group shown in Table 2 Allele measurement step for measuring alleles for at least 30 SNPs in combination with (selected SNP group), Based on the measurement result of the allele, an information acquisition step for acquiring information on the risk of developing wide-angle primary open-angle glaucoma in the subject, and on the basis of the information obtained above, A computer program for executing an information providing step for providing information for determining the risk of developing open-angle glaucoma.
- SNP single nucleotide polymorphism
- the sample provider can take broad POAG precautions or receive appropriate treatment.
- FIG. 1 is a schematic diagram showing an example of a broad-sense POAG onset risk determination apparatus in a subject.
- FIG. 2 is a block diagram showing a hardware configuration of the determination apparatus shown in FIG.
- FIG. 3 is a flowchart for determining the risk of developing POAG in a broad sense using the determination apparatus shown in FIG.
- FIG. 4 is a diagram showing the results of determining the presence or absence of onset risk when the number of SNPs to be measured is 30.
- the left figure is a figure when the top 30 SNPs are used in the GWAS test, and the right figure is a figure when 30 total SNPs shown in Table 1 and SNPs selected from Table 2 are used.
- FIG. 1 is a schematic diagram showing an example of a broad-sense POAG onset risk determination apparatus in a subject.
- FIG. 2 is a block diagram showing a hardware configuration of the determination apparatus shown in FIG.
- FIG. 3 is a flowchart for determining the risk of developing POAG in a
- FIG. 5 shows an example of a graph used to determine the presence or absence of the onset risk when the SNPs listed in Table 1 and the SNPs selected from Table 2 are measured, the number of SNPs is 90, and the measurement step is 1 time. It is a figure.
- Fig. 6 is a graph used to individually determine the risk of onset when the SNPs listed in Table 1 and SNPs selected from Table 2 are measured, the number of SNPs is 90, and the number of measurement steps is 3 It is the figure which showed an example.
- FIG. 6 is a graph used to individually determine the risk of onset when the SNPs listed in Table 1 and SNPs selected from Table 2 are measured, the number of SNPs is 90, and the number of measurement steps is 3 It is the figure which showed an example.
- FIG. 7 is a graph of a graph used to integrally determine whether there is an onset risk when the SNPs listed in Table 1 and the SNPs selected from Table 2 are measured, the number of SNPs is 90, and the number of measurement steps is 3 It is the figure which showed an example.
- Figure 8 shows the results of using Bayes' theorem to determine the risk of onset when the SNPs listed in Table 1 and SNPs selected from Table 2 were measured, the number of SNPs was 90, and the number of measurement steps was 3 It is the figure which showed an example.
- FIG. 9 shows an example of a graph used to determine whether or not there is an onset risk when the SNP shown in Table 1 and the SNP selected from Table 2 are measured, the number of SNPs is 120, and the measurement step is 1 time. It is a figure.
- FIG. 10 is a graph used to individually determine the presence or absence of the onset risk when the SNPs listed in Table 1 and the SNPs selected from Table 2 are measured, the number of SNPs is 120, and the measurement step is 3 times. It is the figure which showed an example.
- FIG. 11 is a graph used for integrated determination of the presence or absence of the onset risk when the SNPs listed in Table 1 and the SNPs selected from Table 2 are measured, the number of SNPs is 120, and the measurement step is 3 times.
- FIG. 12 shows the results of using Bayes' theorem to determine the risk of onset when the SNPs listed in Table 1 and the SNPs selected from Table 2 are measured, the number of SNPs is 120, and the number of measurement steps is 3 It is the figure which showed an example.
- FIG. 13 shows an example of a graph used to determine whether or not there is an onset risk when the SNPs listed in Table 1 and the SNP selected from Table 2 are measured, the number of SNPs is 150, and the measurement step is 1 time. It is a figure.
- FIG. 14 is a graph used to individually determine whether there is an onset risk when the SNPs listed in Table 1 and the SNPs selected from Table 2 are measured, the number of SNPs is 150, and the number of measurement steps is 3 It is the figure which showed an example.
- FIG. 15 is a graph used for integrated determination of the presence or absence of the onset risk when the SNPs listed in Table 1 and the SNPs selected from Table 2 are measured, the number of SNPs is 150, and the measurement step is 3 times. It is the figure which showed an example.
- 16 shows the results of using Bayes' theorem to determine the risk of onset when SNPs listed in Table 1 and SNPs selected from Table 2 are measured, the number of SNPs is 150, and the number of measurement steps is 3 It is the figure which showed an example.
- the present invention may include a step of detecting an allele in vitro for a specific single nucleotide polymorphism (hereinafter also referred to as SNP) in a broad sense primary open angle glaucoma (hereinafter referred to as broad sense POAG). ),
- SNP single nucleotide polymorphism
- broad sense POAG broad sense primary open angle glaucoma
- the above-mentioned allele is measured in a sample derived from a subject, and when the allele is a risk allele, it can be determined that there is a risk of developing POAG using the information. It is a method of providing information and assisting in the diagnosis of the risk of developing broad POAG.
- the present invention sets a measurement object including a specific SNP group that contributes to highly accurate risk determination as a constituent member, counts the total number of risk alleles detected there, and the total number of the risk alleles is a preset threshold. It has a great feature in that it can provide information that there is a risk of developing POAG in a broad sense when exceeding. Thereby, it becomes possible to assist the diagnosis of the onset risk of broad POAG. Therefore, the method for assisting diagnosis of the risk of developing POAG in the broad sense of the present invention is a method for providing information on the risk of developing POAG in a broad sense, and also a method for determining, evaluating, or examining the risk of developing POAG in a broad sense. is there.
- polymorphism or “variant” means that diversity is found in the base sequence and structure (insertion / deletion, inversion, copy number) at a specific position of the genome in a certain organism species.
- a site where a polymorphism exists refers to a site on the genome where a variant such as a single nucleotide polymorphism (SNP) is observed.
- SNP single nucleotide polymorphism
- the term “allele” refers to each type having different bases that can be taken at a certain polymorphic site
- the term “risk allele” refers to a non-broad definition among alleles of the SNP related to the broad sense POAG. An allele that is more frequent in the POAG patient group than in the POAG patient group, and an “non-risk allele” refers to an allele that is not a risk allele.
- “broadly defined POAG risk” is a risk related to broadly defined POAG and refers to the possibility of future broadly defined POAG determined by disease susceptibility.
- risk prediction means that the presence or absence of a future risk is determined at the present time, or the magnitude of the future risk is determined at the present time.
- the method for assisting diagnosis of the onset risk of the broad sense POAG of the present invention An allele measurement process for measuring alleles for a specific SNP, An information acquisition step of acquiring subject information based on the measurement result of the allele, and an information providing step of providing information for determining the onset risk of the subject based on the information.
- the steps will be described step by step, but first, a method for identifying the SNP group related to the onset of broad-sense POAG, which is a measurement target in the present invention, will be described.
- the SNP group related to the onset of broad POAG may be described as the SNP group of the present invention.
- the SNP group related to the development of broad-sense POAG is specifically a glaucoma patient diagnosed with broad-sense POAG (sometimes simply referred to as a patient) and diagnosed as not broad-sense POAG.
- genomic DNA is extracted from each non-glaucoma healthy person (which may be simply described as a non-patient, a control person, or a non-broadly defined POAG patient) that is determined to have no family history of glaucoma through an interview.
- the SNP group related to the broad sense POAG disclosed in the present invention can be identified by the following method.
- Genomic DNA is extracted from blood of each of a patient group and a non-patient group.
- Genomic DNA in blood can be extracted by any known method. For example, DNA eluted by lysing cells is bound to the surface of magnetic beads coated with silica, and separated using magnetism. DNA can be extracted by recovering.
- the means for identifying alleles in the SNP in the extracted DNA sample is not particularly limited, and may be appropriately selected from SNP detection methods and SNP typing methods known in the art.
- GWAS genome-wide association analysis
- a call rate that is a criterion for rejecting SNPs in Quality Control for example, it is desirable to employ SNPs that exhibit a call rate of preferably 85% or higher, more preferably 90% or higher, and even more preferably 95% or higher.
- SNPs with minor allele frequency (MAF) of less than 0.01 and SNPs whose genotype distribution significantly deviates from Hardy-Weinberg equilibrium (HWE) (false (discovery rate is less than 0.001) are excluded from the candidates. It is desirable to exclude.
- the P value is preferably 1 ⁇ 10 ⁇ 3 or less, more preferably 3 ⁇ 10 ⁇ 4 or less, and even more preferably 1 ⁇ 10 ⁇ 4.
- a two-dimensional cluster plot analysis for excluding a genotyping defective SNP for example, visually observing a cluster plot image obtained from genotyping software (Affymetrix, GenotypingtypConsole)
- genotyping software Affymetrix, GenotypingtypConsole
- the SNP selected in this way can be found in the genome location where the SNP exists, sequence information, the gene where the SNP exists, or the vicinity by referring to a known sequence such as GenBank or dbSNP or a database of known SNPs.
- a known sequence such as GenBank or dbSNP or a database of known SNPs.
- information such as intron or exon distinction and its function, homologous gene in other species can be obtained.
- genotype data is digitized and extracted for the marker candidate SNP group obtained above.
- a numerical value 2 is used when the risk allele is homozygous, and a numerical value when the risk allele is heterogeneous. 1 is assigned, and when the non-risk allele is homo, the value 0 is assigned. Then, the obtained numerical values are normalized by the following formula using the average value of the appearance frequency of each allele and the observed frequency to create a numerical genotype data matrix in the selected SNP group .
- the risk allele means an allele that appears frequently in a patient group.
- the risk allele is defined based on the odds ratio.
- the odds ratio is generally the ratio of the ratio of persons with risk factors to the ratio of persons without risk in the patient group, that is, the odds divided by the odds similarly determined in the non-patient group. Often used in case-control studies.
- the odds ratio is obtained based on the allele frequency, and the ratio of the frequency of one allele to the other allele in the patient group is divided by the ratio of the frequencies obtained in the same manner in the non-patient group. it can.
- the appearance frequency of each allele can be recalculated at any time as the data of the sample provider is acquired and the data is additionally updated.
- cluster analysis is performed using the digitized genotype data matrix.
- linkage disequilibrium linkage disequilibrium, LD
- PCA principal component analysis
- PCA principal component analysis
- a known method can be used.
- information contraction is performed on each of the whole genome or chromosome, and factor loadings (principal component and original component are analyzed).
- factor loadings principal component and original component are analyzed.
- the candidate region is determined based on that, and the SNP having the lowest P value in the region is selected as the candidate SNP. decide.
- duplicate SNPs are excluded from calculations from whole genomes and calculations from each chromosome.
- this SNP group is referred to as a core SNP group.
- the core SNP group is selected from the marker SNP group obtained above in about 50 SNP groups in descending order of the P value, and a new SNP group is selected for the selected SNP group. This can be determined by performing a reproduction experiment with a group.
- the pool SNP group is a group obtained by removing the core SNP group from the marker SNP group.
- allele identification is performed using DNA collected from a group different from the patient group and the non-patient group used to identify the candidate SNP group of the marker.
- the different group is a group that may be partially overlapped but is preferably completely non-identical.
- mass spectrometry is preferable, and known MassARRAY can be used.
- Quality control may be performed, and as the call rate at that time, for example, preferably, SNP showing a call rate of 85% or more, more preferably 90% or more, and further preferably 95% or more may be adopted. desirable.
- SNPs with minor allele frequency (MAF) of less than 0.01 and SNPs whose genotype distribution significantly deviates from Hardy-Weinberg equilibrium (HWE) (false (discovery rate is less than 0.001) are excluded from the candidates. It is desirable to exclude.
- the identified SNP is subjected to a two-dimensional cluster plot analysis in the same manner as described above to exclude genotyping failure SNPs.
- the SNP satisfying the P value of 3 ⁇ 10 ⁇ 3 or less by the analysis method is defined as the core SNP group (total 12) in the present invention, and the remaining SNP groups not corresponding to the core SNP group (total 471) are pooled SNP.
- the probe sequences containing SNPs in the core SNP group are shown in Table 1, and the probe sequences containing SNPs in the pool SNP group are shown in Table 2 (Tables 2-1 to 2-24). In the table, alleles (alleles) of each SNP are described in parentheses in the probe sequence, the sequence containing the risk allele is SEQ ID NO: A, and the sequence containing the non-risk allele is SEQ ID NO: B.
- the core SNP group is always measured, and the SNP selected from the pool SNP group (pool selected SNP group) is also measured.
- the number of SNPs to be measured is not particularly limited as long as the total including the core SNP group is at least 30.For example, when the number of measurement targets is 30, it consists of 12 core SNPs and 18 pool-selected SNPs. The When there are 40 measurement objects, it consists of 12 core SNPs and 28 pool selection SNPs. When there are 50 measurement targets, it consists of 12 core SNPs and 38 pool selection SNPs. When measuring 90 objects, it consists of 12 core SNPs and 78 pool selection SNPs.
- the present invention may proceed to the next information acquisition step with one measurement result, but from the viewpoint of improving the determination accuracy, it has a plurality of results obtained by performing a plurality of measurement steps. It is possible to proceed to the information acquisition process.
- the 12 core SNP groups can be used as measurement objects without overlapping in any measurement step.
- the number of core SNP groups for each step may be the same or different.
- the number of SNPs to be measured at each step may be the same or different, and there is no particular limitation as long as the total including the core SNP group at each step is at least 30.
- a first measurement step for measuring a group At least 30 SNPs including one or more SNPs (second core SNP group) different from the first core SNP group and a plurality of SNPs selected from the pool SNP group (second pool selected SNP group)
- the process including the 2nd measurement step which measures about the 2nd SNP group is illustrated, and here, the 1st pool selection SNP group and the 2nd pool selection SNP group are nonidentical.
- the number of SNPs to be measured in each measurement step is exemplified.
- the first core SNP group in the first SNP group is six
- the first pool selection SNP group is 24 or more
- the second core SNP group in the second SNP group examples are 6
- the second pool selection SNP group is 24 or more.
- “non-identical” means that they are not completely identical, for example, only one may be different, or all of the constituent SNPs of the pool-selected SNP group may be different. .
- a first SNP that includes at least 30 SNPs including one or more SNPs selected from the core SNP group (first core SNP group) and a plurality of SNPs selected from the pool SNP group (first pool selected SNP group) A first measurement step for measuring a group; At least 30 SNPs including one or more SNPs (second core SNP group) different from the first core SNP group and a plurality of SNPs selected from the pool SNP group (second pool selected SNP group)
- a second measurement step for measuring the second SNP group; At least one SNP (third core SNP group) different from the first core SNP group and the second core SNP group and a plurality of SNPs selected from the pool SNP group (third pool selected SNP group) are combined.
- a process including a third measurement step of measuring a third SNP group including 30 SNPs is exemplified, wherein the first pool selection SNP group, the second pool selection SNP group, and the third pool selection SNP group are Both are non-identical.
- the number of SNPs to be measured in each measurement step is exemplified.
- the first core SNP group in the first SNP group is four
- the first pool selection SNP group is 26 or more
- the second core in the second SNP group examples include 4 SNP groups, 26 or more second pool selection SNP groups, 4 3rd core SNP groups in the 3rd SNP group, and 26 or more 3rd pool selection SNP groups.
- the fourth and subsequent measurements can be performed if necessary.
- the biological sample used in the present invention may be anything as long as it can extract genomic DNA.
- whole blood, whole blood cells, leukocytes, lymphocytes, plasma, serum, lymph, tears, saliva, nasal discharge, cerebrospinal fluid, bone marrow fluid, semen, sweat, mucosal tissue, skin tissue, or hair root are used. Any known method can be adopted as a method for extracting DNA from such a biological sample.
- the allele is determined according to a known method and the measurement result is obtained. Specifically, for example, hybridization is performed using probes (Tables 1 and 2) specific to each allele designed based on the sequence information of the SNP group of the present invention, and each signal is detected by detecting the signal. Alleles can be detected. Examples of the method of hybridizing using a probe include the Taqman method, the Invader (registered trademark) method, the light cycler method, the cyclin probe method, the MPSS method, the bead array method, the DNA chip method, and the microarray method. It is also possible to detect alleles without performing hybridization with a probe. For example, a PCR-RFLP method, an SSCP method, a mass spectrometry method, a next generation sequencing method, a direct sequencing method, or the like can be used. These methods can be performed according to known conditions.
- the measurement result thus obtained is used for the next information acquisition process.
- the allele information may be information about whether or not a variant exists, information about the type of allele that has been measured, or information obtained from the number of alleles. Moreover, it may be calculated as a value (such as a statistical value) correlated with SNP. In particular, in the present invention, from the viewpoint of improving the determination accuracy, it is preferable to determine whether the measured allele is a risk allele and to count the total number of risk alleles.
- risk allele data acquired in advance it is determined whether or not the measured allele is a risk allele, and the total number of alleles determined as risk alleles in the entire SNP group to be measured (risk allele possession) Count).
- risk allele possession Count
- the number of positive and negative values in each measurement result is further certified as the quantitative value of the sample provider, and the following information is obtained: It is preferable to proceed to the providing step.
- Information provision process information for determining the onset risk of the subject based on the obtained information is provided to the subject.
- Aspect 1 Aspect determination of presence / absence of onset risk based on numerical value of risk allele possession
- Aspect 2 Aspect aspect of determining presence / absence risk when multiple risk allele possession is obtained
- Aspect 3 Risk allele possession Of calculating the probability of having an onset risk on the basis of the risk aspect 4: Mode of calculating the probability of having the onset risk with a predetermined probability based on the number of risk alleles held
- a result (number of risk alleles) related to a subject obtained in the information acquisition process is determined in advance by ROC (Receiver Operating Characteristic) analysis based on the SNP used in the allele measuring process.
- ROC Receiveiver Operating Characteristic
- the number of risk alleles held by the sample provider is compared with a preset threshold value.
- the threshold value is an appropriate cutoff value for discriminating between patients and non-patients, and by comparing the threshold value with a quantitative value, it can be determined whether or not there is a risk of developing POAG in a broad sense.
- Threshold value can be set as follows. Using a biological sample collected from a subject who has been previously diagnosed as having the risk of developing POAG for the same SNP group as the SNP group selected as the measurement target when obtaining the quantitative value of the sample provider Then, the number of risk alleles is measured as described above, and the correlation between the two data is analyzed by statistically processing the “presence / absence risk of developing POAG” and the “number of risk alleles”. From the results of analysis, for example, focus on high true positive rate (high sensitivity), high true negative rate (high specificity), or true positive rate and true negative A threshold can be set according to the purpose such as how well the rate is balanced.
- the true positive rate is the probability of correctly determining a person having the risk of developing POAG as a person having the risk of developing a broad POAG, and the true negative rate does not have the risk of developing a broad POAG. It is the probability of correctly determining a person as having no risk of developing POAG in a broad sense.
- the vertical axis represents the true positive rate (sensitivity)
- the horizontal axis represents An ROC curve prepared by taking a true negative rate (1-specificity) is prepared (ROC analysis is performed).
- the point at which the distance from the upper left corner of the graph is minimum may be set as the threshold, and the point farthest from the diagonal line where the area under the ROC curve (AUC) is 0.5 may be set as the threshold.
- a point at which the specificity or sensitivity is obtained may be set as the threshold value.
- a threshold value that gives a result with a sensitivity of 1 and (1 ⁇ specificity) closest to 0, for example, [(1 ⁇ sensitivity) 2 + (1 ⁇ specificity) 2 ] is minimized. Can be set as a threshold value.
- the threshold value may be acquired separately when acquiring the quantitative value of the sample provider, or may be acquired in advance. Moreover, when comparing with the quantitative value of the sample provider, it may be obtained by additionally updating the analysis results obtained so far as needed.
- normalization or weighting may be performed from the viewpoint of improving the determination accuracy.
- a normalization method a method of comparing with a normal distribution curve can be used.
- weighting can be performed in consideration of the odds ratio of each SNP.
- the results (number of possessed risk alleles) in each measurement step regarding the subject obtained by the information acquisition process are A method of providing information on the level of risk that the subject develops POAG broadly using, as an index, whether or not the cut-off value previously determined by ROC analysis based on the SNP group used in the above is determined It is done.
- the presence / absence risk is determined by comparing the number of risk alleles held by the sample provider with a preset threshold for each measurement step.
- the threshold value can be set in the same manner as in aspect 1.
- the result of the presence or absence of the onset risk for every measurement step is integrated. Specifically, for example, when the measurement step is performed three times and “+” is displayed when there is a risk of onset, and “ ⁇ ” is displayed when there is no risk, the first determination result is “+” and the second determination The result is “+”, the third determination result is “+”, the integration result is “++++”, the first determination result is “+”, the second determination result is “+”, and the third determination result.
- the integration result of “ ⁇ ” is “++ ⁇ ”, the first determination result is “+”, the second determination result is “ ⁇ ”, and the third determination result is “+”. -+ ". Therefore, even if the probability of being negative once in the three determinations is the same, “++ ⁇ ” and “++” fall under different classifications. Then, using the obtained integration results, is the risk of developing POAG broadly defined based on the tendency to fall under the same classification on the graph of the group with the risk of onset and the group without the risk of development? Determine if it is low.
- the graph of the group with the risk of onset and the group without the risk of onset can be created as follows. For example, the integrated results are obtained for subjects diagnosed in advance, and the number of people who have a risk of developing POAG in a broad sense is accumulated for each pattern such as “++++”, “++-”, “++-”, etc. You can create it.
- the sample provider has the risk of developing POAG in a broad sense by obtaining the relevant category information from the integration results of the sample provider It can be determined whether or not.
- the probability of having the risk of developing broad POAG may be calculated by applying the Bayes theorem described later.
- a method of calculating the probability of having a risk of developing a broad sense POAG by applying the Bayes' theorem to the result obtained in the information acquisition step can be mentioned.
- the test subject has the risk of developing the disease, and the presence or absence of the risk of developing the disease is estimated from the test results.
- PPV positive predictive value
- NPV negative predictive value
- the positive predictive value is the proportion of people who have a disease when the test result is positive
- the negative predictive value is the proportion of those who have no risk of developing when the test result is negative. It is.
- the probability of having an onset risk is the same as the prevalence, but if a positive result is obtained by the test using the Bayes' theorem method, the test object This means that the probability of risk for a person can be expressed by a positive predictive value.
- positive predictive value prevalence rate ⁇ sensitivity / [prevalence rate ⁇ sensitivity + (1 ⁇ prevalence rate) ⁇ (1 ⁇ specificity)]
- negative predictive value specificity ⁇ (1 ⁇ Prevalence) / [specificity ⁇ (1 ⁇ prevalence) + prevalence ⁇ (1 ⁇ sensitivity)]
- the prevalence is 10% and the sensitivity of the test is 70 %
- Specificity is 70%
- the positive predictive value is calculated as 21%
- the negative predictive value is calculated as 95%. Therefore, since the test subject who has a positive result has an onset risk of 21%, the prevalence is higher than the prevalence rate, and it can be advised to receive further examination.
- the positive predictive value was calculated as 62% and the negative predictive value was calculated as 99%, so the number of risk alleles exceeded the threshold in the third test.
- the test subject can determine that the risk of developing POAG in a broad sense is higher.
- a probability of having an onset risk based on the number of risk alleles is calculated,
- a probability of having a risk of developing a broad sense POAG is calculated,
- a probability of a preset percentage for example, an arbitrary numerical value such as 70%, 80%, 90%, or the like can be set. As the value is larger, the determination can be performed with higher accuracy.
- a probability density function having For example, when calculating a probability of 70% or more, an area having a density in which the probability of having an onset risk that is a continuous random variable is 70 or more from the probability density function is the probability of having an onset risk.
- the risk of developing POAG in the sample provider is determined not only by determining whether or not there is a risk of developing POAG in a broad sense by comparing the total number of risk alleles with a threshold. By calculating the probability, it is possible to provide more detailed information regarding the risk of developing POAG in the broad sense of the sample provider.
- the present invention also provides an apparatus for acquiring information related to the risk of developing POAG in a broad sense.
- the apparatus of the present invention includes a computer having a processor and a memory under the control of the processor, wherein the memory includes the following steps: Based on the allele information of single nucleotide polymorphism (SNP) in the biological sample collected from the subject, the SNP selected from the 12 core SNP groups shown in Table 1 and the pool SNP group shown in Table 2 Allele measurement step for measuring alleles for at least 30 SNPs in combination with (selected SNP group), Based on the measurement result of the allele, the information acquisition step of acquiring information on the risk of developing POAG in the subject in a broad sense, and the risk of developing the broad sense of POAG in the subject based on the information obtained above
- the computer program for making the said computer perform the information provision process which provides the information for determination is recorded.
- the present invention also includes a computer program for causing a computer to determine the risk of developing broad-sense POAG in a subject.
- a computer program for causing a computer to determine the risk of developing broad-sense POAG in a subject.
- An example of such a computer program is as follows.
- a computer program recorded on a computer readable medium comprising the following steps: Based on the allele information of single nucleotide polymorphism (SNP) in the biological sample collected from the subject, the SNP selected from the 12 core SNP groups shown in Table 1 and the pool SNP group shown in Table 2 Allele measurement step for measuring alleles for at least 30 SNPs in combination with (selected SNP group), Based on the measurement result of the allele, the information acquisition step of acquiring information on the risk of developing POAG in the subject in a broad sense, and the risk of developing the broad sense of POAG in the subject based on the information obtained above The information provision process which provides the information for determining is performed, and the broad sense POAG onset risk in a subject is determined.
- SNP single nucleotide polymorphism
- the medium may be a medium in which the computer program is recorded temporarily and is readable by a computer.
- FIG. 1 is a schematic diagram showing an example of a broad-sense POAG onset risk determination apparatus in a subject.
- the determination device 10 shown in FIG. 1 includes a measurement device 20 and a computer system 30 connected to the measurement device 20.
- the measuring device 20 is a scanner or a mass spectrometer that detects a signal based on DNA bound to a probe on a microarray.
- the signal is optical information such as a fluorescent signal or a mass spectrometry result.
- the measurement apparatus 20 acquires optical information or mass spectrometry results based on nucleic acid derived from the biological sample of the subject that is bound to the probe on the microarray. Then, the obtained optical information or mass analysis result is transmitted to the computer system 30.
- the scanner is not particularly limited as long as it can detect a signal based on DNA bound to the probe on the microarray. Since the signal varies depending on the labeling substance used for labeling the DNA derived from the biological sample of the subject, the scanner can be appropriately selected according to the type of the labeling substance. For example, when the labeling substance is a fluorescent substance, a microarray scanner capable of detecting fluorescence generated from the fluorescent substance is used as the measuring device 20.
- the measuring device 20 may be a device including a DNA amplification device and a sequence analysis device.
- a reaction solution containing a measurement sample, an enzyme for DNA amplification, a primer, and the like is set in the measurement device 20, and the DNA in the reaction solution is amplified by the DNA amplification method.
- the measuring device 20 analyzes the base sequence of the amplification product to acquire sequence information, and transmits the obtained sequence information to the computer system 30.
- the computer system 30 includes a computer main body 300, an input unit 301, and a display unit 302 that displays sample information and determination results.
- the computer system 30 receives optical information, mass analysis results, or sequence information from the measuring device 20.
- the processor of the computer system 30 executes a program for determining the risk of developing a broad sense POAG in the subject based on the optical information, the mass spectrometry result, or the sequence information.
- the computer system 30 may be a device separate from the measuring device 20 as shown in FIG. 1 or may be a device that includes the measuring device 20. In the latter case, the computer system 30 may itself become the determination device 10.
- the computer main body 300 includes a CPU (Central Processing Unit) 310, a ROM (Read Only Memory) 311, a RAM (Random Access Memory) 312, a hard disk 313, an input / output interface 314, A reading device 315, a communication interface 316, and an image output interface 317 are provided.
- the CPU 310, ROM 311, RAM 312, hard disk 313, input / output interface 314, reading device 315, communication interface 316, and image output interface 317 are connected by a bus 318 so that data communication is possible.
- the measuring device 20 is connected to the computer system 30 through a communication interface 316 so as to be communicable.
- the CPU 310 can execute a program stored in the ROM 311 and a program loaded in the RAM 312.
- the CPU 310 calculates the validity prediction value, reads the discriminant stored in the ROM 311, and determines the validity.
- the CPU 310 outputs the determination result and causes the display unit 302 to display the determination result.
- the ROM 311 is configured by a mask ROM, PROM, EPROM, EEPROM, or the like.
- the ROM 311 records a program executed by the CPU 310 and data used for the program as described above.
- a predetermined threshold value or the like may be recorded in the ROM 311.
- the RAM 312 is configured by SRAM, DRAM, or the like.
- the RAM 312 is used for reading programs recorded in the ROM 311 and the hard disk 313.
- the RAM 312 is also used as a work area for the CPU 310 when executing these programs.
- the hard disk 313 is installed with an operating system to be executed by the CPU 310, a computer program such as an application program (computer program for determining the risk of developing POAG in a broad sense), and data used for executing the computer program.
- a predetermined threshold value or the like may be recorded on the hard disk 313.
- the input / output interface 314 includes, for example, a serial interface such as USB, IEEE 1394, RS-232C, a parallel interface such as SCSI, IDE, IEEE 1284, and an analog interface including a D / A converter, an A / D converter, and the like. It is configured.
- An input unit 301 such as a keyboard and a mouse is connected to the input / output interface 314. The operator can input various commands to the computer main body 300 through the input unit 301.
- the communication interface 316 is, for example, an Ethernet (registered trademark) interface.
- the computer main body 300 can also transmit print data to a printer or the like via the communication interface 316.
- the image output interface 317 is connected to a display unit 302 configured with an LCD, a CRT, or the like. Accordingly, the display unit 302 can output a video signal corresponding to the image data given from the CPU 310.
- the display unit 302 displays an image (screen) according to the input video signal.
- step S ⁇ b> 101 CPU 310 of determination apparatus 10 acquires fluorescence information from measurement apparatus 20.
- step S ⁇ b> 102 the CPU 310 calculates fluorescence intensity from the acquired fluorescence information and stores it in the RAM 312.
- step S ⁇ b> 103 the CPU 310 determines the presence / absence and type of each variant from the fluorescence intensity stored in the RAM 312, and calculates the risk allele total number according to the allele data stored in the ROM 311 or the hard disk 313.
- step S104 the CPU 310 determines the level of risk of developing broad POAG in the subject using the calculated effectiveness prediction value and a predetermined threshold value stored in the ROM 311 or the hard disk 313.
- the process proceeds to step S105, and the CPU 310 stores in the RAM 312 a determination result indicating that the risk of developing a broad sense POAG in the subject is low.
- the process proceeds to step S106, and the CPU 310 determines that the risk of developing broad POAG in the subject is increased.
- the determination result indicating high is stored in the RAM 312.
- step S107 the CPU 310 outputs the determination result and displays it on the display unit 302 or causes the printer to print it. Thereby, it is possible to provide a doctor or the like with information that assists in determining whether or not the risk of developing broad POAG in the subject is high.
- Test example 1 Selection of marker SNP (core SNP + pool SNP) 824 patients diagnosed with broad-opening primary open-angle glaucoma (broadly defined POAG patients) and not diagnosed with glaucoma Total DNA was extracted from the blood of each of 686 non-patients judged to have no using a commercially available automated nucleic acid extractor. Total DNA was extracted according to the instruction manual of the instrument and kit. By this method, about 5 ⁇ g of total DNA was obtained from 350 ⁇ L of blood sample.
- SNP analysis was performed using a commercially available microarray SNP analysis kit DNA microarray (Genome-Wide Human SNP Array 6.0) capable of analyzing about 900,000 known SNPs on the human genome. And 653,519 high-precision SNP data were selected using a QC filter (Call Rate, ⁇ 0.95; MAF, ⁇ 0.01; HWE, ⁇ 0.001). Furthermore, 787 SNP marker candidate groups were extracted by the following process. (1) P ⁇ 0.001 was used as an extraction condition in genome-wide association analysis (chi 2 test with allele data). (2) Based on the 2D cluster plot image obtained from the Affymetrix Genotyping Software (Genotyping Console) for all extracted SNPs, SNPs with poor clusters were excluded by visual inspection of three examiners.
- Genome-Wide Human SNP Array 6.0 capable of analyzing about 900,000 known SNPs on the human genome.
- 653,519 high-precision SNP data were selected using a QC filter (Call Rate,
- the marker SNP is composed of 12 core SNPs and 471 pool SNPs.
- Genotyping data was encoded (numerical conversion) and normalized by the following procedure.
- (b) For numerical conversion the numerical values were normalized according to the above-mentioned formulas using the average value and the observed allele frequency in each group of the POAG patient group and the healthy non-glaucoma group.
- the combination of SNP marker candidate groups considering linkage disequilibrium (LD) was calculated by cluster analysis using principal component analysis (PCA).
- a group obtained by removing the core SNP from the marker SNP was defined as a pool SNP.
- Example 1 and Comparative Example 1 For 680 patients in the broad sense POAG group and 680 patients in the healthy non-glaucoma group, blood was collected and genomic DNA was extracted in the same manner as in Test Example 1, and Example 1 (Table 3) and Comparative Example 1 (Tables 4-1 to 4-1) Using the probes shown in Table 4-2), allele data was obtained by hybridization, and the total number of risk alleles was counted.
- the probes used in Example 1 are the 12 probes listed in Table 1 and 18 probes selected from Table 2.
- the probes used in Comparative Example 1 are the top 30 in the test. .
- the frequency distribution chart with the total number of risk alleles on the horizontal axis was created and the results of ROC analysis are shown in FIG.
- the sensitivity is 54.3% and the specificity is 65.4%, and the AUC is about 0.641 when the cutoff value is 42.
- the sensitivity is 70.1% and the specificity is 71.2%.
- the cut-off value is 37, the AUC is as high as 0.784, and it can be seen from the frequency distribution chart that there is a distinction between the group with onset risk and the group without onset risk.
- Example 2 Data acquisition was performed in the same manner as in Example 1 except that the probe used in Example 1 was different. Specifically, the probes shown in Table 5 below were used.
- FIG. 5 shows the result of creating a frequency distribution diagram with the total number of risk alleles on the horizontal axis and performing ROC analysis. From Fig. 5, when the cut-off value with sensitivity 83.1% and specificity 82.1% is 108, AUC is 0.908, and the frequency distribution chart also distinguishes between the group with onset risk and the group without onset risk I can see that
- the frequency distribution chart and ROC curve of the risk allele were obtained in the same manner as described above.
- the results are shown in FIG. From Fig. 6, the result of the first measurement is 36 cutoff values with a sensitivity of 69.1% and a specificity of 71.2%, and the result of the second measurement is a cutoff value of 74.1% with a sensitivity of 66.5%.
- FIG. 7 shows the result of integrating the determination results of the three measurements. That is, the result of classifying the determination results of the three measurements is shown for each group having the onset risk and each group having no onset risk. From this, it can be seen that there is a distinction between the group with onset risk and the group without onset risk.
- the analysis using the Bayes theorem was performed according to the following procedure.
- the prior distribution ⁇ ( ⁇ ) is a uniform distribution (no information prior distribution). The prior distribution adopted the beta distribution.
- Likelihood is randomly selected from all specimens in the patient group and non-patient group, selecting 680 patient groups and 680 non-patient groups. Number). The binomial distribution was adopted as the distribution.
- the posterior distribution was calculated from Bayes' theorem (posterior distribution ⁇ ( ⁇
- the posterior distribution was calculated from Bayes' theorem (posterior distribution ⁇ ( ⁇
- the average risk of onset (%), 95% confidence interval (%), and the probability of having the risk of onset (%) were calculated.
- Example 3 Data acquisition was performed in the same manner as in Example 1 except that the probes used in Examples 1 and 2 were different. Specifically, the probes shown in Table 6-1 to Table 6-2 below were used.
- FIG. 9 shows the frequency distribution chart of risk alleles and the results of ROC analysis performed in the same manner as in Example 1. From Fig. 9, when the cutoff value is 141 with sensitivity of 84.4% and specificity of 85.3%, the AUC is 0.929, and the frequency distribution chart also distinguishes between the group with onset risk and the group without onset risk. I can see that
- the frequency distribution chart and ROC curve of the risk allele were obtained in the same manner as described above.
- the results are shown in FIG. From Fig. 10, the first measurement result shows a cutoff value of 44 with a sensitivity of 74.4% and a specificity of 72.6%, and the second measurement result shows a cutoff value of 76.8% with a sensitivity of 69.7% and a specificity of 69.7%.
- the result of the third measurement is a sensitivity of 69.6%
- the cutoff value is 50 with a specificity of 76.3%, and it was found that the determination result in each measurement can be obtained.
- FIG. 11 shows the result of integrating the determination results of the three measurements. That is, the result of classifying the determination results of the three measurements is shown for each group having the onset risk and each group having no onset risk. From this, it can be seen that there is a distinction between the group with onset risk and the group without onset risk.
- Example 4 Data acquisition was performed in the same manner as in Example 1 except that the probes used in Examples 1 to 3 were different. Specifically, the probes shown in Tables 7-1 to 7-2 below were used.
- FIG. 13 shows the frequency distribution chart of risk alleles and the results of ROC analysis performed in the same manner as in Example 1. From FIG. 13, when the cut-off value with sensitivity 89.0% and specificity 84.9% is 170, AUC is 0.940, and the frequency distribution chart also distinguishes between the group with onset risk and the group without onset risk. I can see that
- the frequency distribution chart and ROC curve of the risk allele were obtained in the same manner as described above.
- the results are shown in FIG. From Fig. 14, the result of the first measurement is 53 cut-off values with sensitivity of 75.3% and specificity of 74.3%, and the result of the second measurement is cut-off value with sensitivity of 69.6% and specificity of 78.4%. There were 62, and the result of the third measurement was a sensitivity of 75.6%, and the cut-off value at a specificity of 70.4% was 57. It was found that the determination result in each measurement was obtained.
- FIG. 15 shows the result of integrating the determination results of the three measurements. That is, the result of classifying the determination results of the three measurements is shown for each group having the onset risk and each group having no onset risk. From this, it can be seen that there is a distinction between the group with onset risk and the group without onset risk.
- the SNP allele of the present invention By analyzing the SNP allele of the present invention on the DNA derived from the subject by the method of the present invention, it is possible to determine whether the subject has a high risk of developing broad-angle primary open-angle glaucoma. Based on this risk, subjects can take preventive measures for broad-sense open-angle glaucoma or receive appropriate treatment, including preemptive medicine.
- subjects can take preventive measures for broad-sense open-angle glaucoma or receive appropriate treatment, including preemptive medicine.
- using the SNP of the present invention by selecting a person with a high risk of developing wide-angle primary open-angle glaucoma and conducting a clinical trial of a glaucoma therapeutic drug, the period of the clinical trial of the glaucoma therapeutic drug can be shortened, Useful.
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Abstract
被検者から採取した生体試料における一塩基多型(SNP)のアレル情報に基づいて、表1に記載の12個のコアSNP群と、表2に記載のプールSNP群から選ばれるSNP(プール選抜SNP群)とを合わせて少なくとも30個のSNPについて、アレルを測定するアレル測定工程、前記アレルの測定結果に基づいて、前記被検者における広義原発開放隅角緑内障の発症リスクに関する情報を取得する情報取得工程、及び前記で得られた情報に基づいて、前記被検者の広義原発開放隅角緑内障の発症リスクを判定するための情報を提供する情報提供工程を含む、被検者の広義原発開放隅角緑内障の発症リスクの診断を補助する方法。本発明の方法により、サンプル中に存在する本発明のSNP群について分析することにより、サンプル提供者における広義POAGの発症リスクの有無を判定し、さらには、リスクの高低を予測することができる。
Description
本発明は、広義原発開放隅角緑内障の発症リスクを判定する方法、広義原発開放隅角緑内障の発症リスク判定装置、及び該装置に実行させるためのコンピュータプログラムに関する。
緑内障は、網膜神経節細胞が障害され、不可逆的に進行し失明に至る神経変性疾患である。また、日本における中途失明原因の第1位であり、40歳以上の有病率は主病型である広義原発開放隅角緑内障(広義primary open-angle glaucoma, 広義POAG;狭義原発開放隅角緑内障と正常眼圧緑内障,日眼会誌116巻1号15頁から18頁)では3.9%にもなるが、この内の大半が自覚症状のない潜在的な緑内障患者である。緑内障は発症初期の点眼治療により進行を抑制することが可能であるため、スクリーニング検査等で発症予測が可能となれば、生涯にわたり視機能を維持することが可能であることから、各種検討が行われている。
例えば、特許文献1では緑内障患者と緑内障家族歴を有さない非患者のゲノム(常染色体)上に存在する公知の多型部位を、特許文献2では緑内障患者であって進行が早い患者と遅い患者のゲノム上に存在する公知の多型部位を、それぞれ網羅的に解析することで、緑内障の発症/進行に関連する一塩基多型(SNP)を見出し、それらを複数組み合わせて判定を行うことにより、より高精度にサンプル提供者が緑内障を発症しやすい者であるか否か、進行しやすい者であるか否かの判定を行う方法が開示されている。
しかしながら、特許文献1、2に記載の方法では判定の的中率(感度と特異度)が最大でも60~70%程度であり、より高精度な感度、特異度、陽性的中率(PPV)、及び陰性的中率(NPV)を提供し得る更なる改良技術が求められている。
本発明の課題は、広義POAGの発症リスクを高精度に判定する方法、当該方法を実行する広義POAGの発症リスク判定装置、及び当該装置に実行させるためのコンピュータプログラムを提供することである。
本発明者らは、前記課題を解決せんと鋭意検討した結果、本発明者らが保有する多数の緑内障患者と非緑内障健常人の検体を用いて高密度チップにより取得したジェノタイプ情報に基づくゲノムワイド関連解析(genome-wide association study, GWAS)を実施することで、広義POAGの発症リスクマーカーSNP群を同定し、その中でも、高精度な判定に寄与する特定のSNP群を見出し、当該SNP群と残りのSNPから選択されるSNP群とを組み合わせたSNP集団に関して、サンプル中のリスクアレルの総数を測定することにより、広義POAG発症リスクを高精度に判定できることを見出し、本発明を完成するに至った。
即ち、本発明は、下記〔1〕~〔3〕に関する。
〔1〕 被検者から採取した生体試料における一塩基多型(SNP)のアレル情報に基づいて、表1に記載の12個のコアSNP群と、表2に記載のプールSNP群から選ばれるSNP(プール選抜SNP群)とを合わせて少なくとも30個のSNPについて、アレルを測定するアレル測定工程、
前記アレルの測定結果に基づいて、前記被検者における広義原発開放隅角緑内障の発症リスクに関する情報を取得する情報取得工程、及び
前記で得られた情報に基づいて、前記被検者の広義原発開放隅角緑内障の発症リスクを判定するための情報を提供する情報提供工程
を含む、被検者の広義原発開放隅角緑内障の発症リスクの診断を補助する方法。
〔2〕 プロセッサ及び前記プロセッサの制御下にあるメモリを含むコンピュータを備え、前記メモリには、
被検者から採取した生体試料における一塩基多型(SNP)のアレル情報に基づいて、表1に記載の12個のコアSNP群と、表2に記載のプールSNP群から選ばれるSNP(プール選抜SNP群)とを合わせて少なくとも30個のSNPについて、アレルを測定するアレル測定工程、
前記アレルの測定結果に基づいて、前記被検者における広義原発開放隅角緑内障の発症リスクに関する情報を取得する情報取得工程、及び
前記で得られた情報に基づいて、前記被検者の広義原発開放隅角緑内障の発症リスクを判定するための情報を提供する情報提供工程
を前記コンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムが記録されている、広義原発開放隅角緑内障の発症リスクを有する被検者の検出装置。
〔3〕 プロセッサ及び前記プロセッサの制御下にあるメモリを含むコンピュータであって、
被検者から採取した生体試料における一塩基多型(SNP)のアレル情報に基づいて、表1に記載の12個のコアSNP群と、表2に記載のプールSNP群から選ばれるSNP(プール選抜SNP群)とを合わせて少なくとも30個のSNPについて、アレルを測定するアレル測定工程、
前記アレルの測定結果に基づいて、前記被検者における広義原発開放隅角緑内障の発症リスクに関する情報を取得する情報取得工程、及び
前記で得られた情報に基づいて、前記被検者の広義原発開放隅角緑内障の発症リスクを判定するための情報を提供する情報提供工程
を実行させる、コンピュータプログラム。
〔1〕 被検者から採取した生体試料における一塩基多型(SNP)のアレル情報に基づいて、表1に記載の12個のコアSNP群と、表2に記載のプールSNP群から選ばれるSNP(プール選抜SNP群)とを合わせて少なくとも30個のSNPについて、アレルを測定するアレル測定工程、
前記アレルの測定結果に基づいて、前記被検者における広義原発開放隅角緑内障の発症リスクに関する情報を取得する情報取得工程、及び
前記で得られた情報に基づいて、前記被検者の広義原発開放隅角緑内障の発症リスクを判定するための情報を提供する情報提供工程
を含む、被検者の広義原発開放隅角緑内障の発症リスクの診断を補助する方法。
〔2〕 プロセッサ及び前記プロセッサの制御下にあるメモリを含むコンピュータを備え、前記メモリには、
被検者から採取した生体試料における一塩基多型(SNP)のアレル情報に基づいて、表1に記載の12個のコアSNP群と、表2に記載のプールSNP群から選ばれるSNP(プール選抜SNP群)とを合わせて少なくとも30個のSNPについて、アレルを測定するアレル測定工程、
前記アレルの測定結果に基づいて、前記被検者における広義原発開放隅角緑内障の発症リスクに関する情報を取得する情報取得工程、及び
前記で得られた情報に基づいて、前記被検者の広義原発開放隅角緑内障の発症リスクを判定するための情報を提供する情報提供工程
を前記コンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムが記録されている、広義原発開放隅角緑内障の発症リスクを有する被検者の検出装置。
〔3〕 プロセッサ及び前記プロセッサの制御下にあるメモリを含むコンピュータであって、
被検者から採取した生体試料における一塩基多型(SNP)のアレル情報に基づいて、表1に記載の12個のコアSNP群と、表2に記載のプールSNP群から選ばれるSNP(プール選抜SNP群)とを合わせて少なくとも30個のSNPについて、アレルを測定するアレル測定工程、
前記アレルの測定結果に基づいて、前記被検者における広義原発開放隅角緑内障の発症リスクに関する情報を取得する情報取得工程、及び
前記で得られた情報に基づいて、前記被検者の広義原発開放隅角緑内障の発症リスクを判定するための情報を提供する情報提供工程
を実行させる、コンピュータプログラム。
本発明の方法により、サンプル中に存在する本発明のSNP群について分析することにより、サンプル提供者における広義POAGの発症リスクの有無を判定し、さらには、リスクの高低を予測することができる。このリスクに基づきサンプル提供者は広義POAGの予防措置を講じ、又は適切な治療を受けることができる。
本発明は、特定の一塩基多型(以下、SNPと記載することもある)についてアレルをin vitroで検出する工程を含む、広義原発開放隅角緑内障(以下、広義POAGと記載することもある)の発症リスクを判定する方法であって、被検者由来のサンプルにおいて前記したアレルを測定し、当該アレルがリスクアレルである場合に、その情報を用いて広義POAG発症リスクがあると判定できる情報を提供する、広義POAGの発症リスクの診断を補助する方法である。即ち、本発明は、高精度なリスク判定に寄与する特定のSNP群を構成メンバーとして含む測定対象を設定し、そこで検出したリスクアレルの総数を数え、当該リスクアレルの総数が予め設定された閾値を上回る場合に広義POAGの発症リスクがあるとする情報を提供できることに大きな特徴を有する。これにより、広義POAGの発症リスクの診断を補助することが可能となる。よって、本発明の広義POAGの発症リスクの診断を補助する方法とは、広義POAGの発症リスクに関する情報を提供する方法でもあり、また、広義POAGの発症リスクを判定、評価、又は検査する方法でもある。なお、本明細書において、「多型」または「バリアント」とは、ある生物種におけるゲノムの特定の位置の塩基配列や構造(挿入・欠失、逆位、コピー数)に多様性が認められることを言い、多型が存在する部位(以下、多型部位ともいう)とは一塩基多型(SNP)等のバリアントが認められるゲノム上の部位を言う。
本発明において、「アレル」とは、ある多型部位において取りうる、互いに異なる塩基を有するそれぞれの型を言い、「リスクアレル」とは、広義POAGと関連するSNPの各アレルのうち、非広義POAG患者群より広義POAG患者群において頻度が高いアレルを言い、「非リスクアレル」とは、リスクアレルではないアレルを言う。
本発明において、「広義POAG発症リスク」とは、広義POAGに関するリスクであり、疾患感受性によって決まる将来的な広義POAG発症の可能性を言う。本発明において、リスクの予測とは、将来のリスクの有無を現時点で判定し、又は、将来のリスクの大小を現時点で決定することを言う。
本発明の広義POAGの発症リスクの診断を補助する方法は、
特定のSNPについてアレルを測定するアレル測定工程、
前記アレルの測定結果に基づいて被検者の情報を取得する情報取得工程、及び
前記情報に基づいて被検者の発症リスクを判定するための情報を提供する情報提供工程
を含む。以下に工程ごとに順を追って説明するが、先に、本発明において測定対象となる、広義POAGの発症に関連するSNP群を同定した方法を説明する。なお、広義POAGの発症に関連するSNP群のことを、本発明のSNP群と記載することもある。
特定のSNPについてアレルを測定するアレル測定工程、
前記アレルの測定結果に基づいて被検者の情報を取得する情報取得工程、及び
前記情報に基づいて被検者の発症リスクを判定するための情報を提供する情報提供工程
を含む。以下に工程ごとに順を追って説明するが、先に、本発明において測定対象となる、広義POAGの発症に関連するSNP群を同定した方法を説明する。なお、広義POAGの発症に関連するSNP群のことを、本発明のSNP群と記載することもある。
(広義POAGの発症に関連するSNP群の同定)
本発明において、広義POAGの発症に関連するSNP群は、具体的には、先ず、広義POAGと診断された緑内障患者(単に、患者と記載することもある)、及び、広義POAGではないと診断され、かつ、問診によって緑内障家族歴を有さないと判断された非緑内障健常者(単に、非患者、対照者又は非広義POAG患者と記載することもある)からゲノムDNAをそれぞれ抽出する。そして、ヒトゲノム上の公知のSNP約20万~500万個を指標として、個々のSNPにおけるアレル頻度を患者群と非患者群において比較し種々解析することにより、頻度の差が統計学的に高い有意性で認められるマーカー候補のSNP群を見出す。次いで、この候補群から更に解析を行うことで、本発明で用いるSNP群(マーカーSNP群)を決定し、その中から、より高精度な判定結果を与える特定のSNP群(コアSNP群)と残りのSNP群(プールSNP群)を設定し、これらを組み合わせて用いることにより、広義POAGの発症リスクの有無の判定及び広義POAGの発症リスクの大小の予測が可能となる。なお、詳細は実施例の項にて説明するが、以下のような方法により、本発明で開示された広義POAGに関連するSNP群を同定することができる。
本発明において、広義POAGの発症に関連するSNP群は、具体的には、先ず、広義POAGと診断された緑内障患者(単に、患者と記載することもある)、及び、広義POAGではないと診断され、かつ、問診によって緑内障家族歴を有さないと判断された非緑内障健常者(単に、非患者、対照者又は非広義POAG患者と記載することもある)からゲノムDNAをそれぞれ抽出する。そして、ヒトゲノム上の公知のSNP約20万~500万個を指標として、個々のSNPにおけるアレル頻度を患者群と非患者群において比較し種々解析することにより、頻度の差が統計学的に高い有意性で認められるマーカー候補のSNP群を見出す。次いで、この候補群から更に解析を行うことで、本発明で用いるSNP群(マーカーSNP群)を決定し、その中から、より高精度な判定結果を与える特定のSNP群(コアSNP群)と残りのSNP群(プールSNP群)を設定し、これらを組み合わせて用いることにより、広義POAGの発症リスクの有無の判定及び広義POAGの発症リスクの大小の予測が可能となる。なお、詳細は実施例の項にて説明するが、以下のような方法により、本発明で開示された広義POAGに関連するSNP群を同定することができる。
(1) マーカー候補のSNP群を見出す方法
患者群と非患者群、それぞれの血液からゲノムDNAを抽出する。血液中のゲノムDNAは公知の任意の方法によって抽出することができるが、例えば細胞を溶解して溶出させたDNAを、シリカでコーティングした磁性ビーズの表面に結合させ、磁気を利用して分離、回収することによってDNAを抽出することができる。
患者群と非患者群、それぞれの血液からゲノムDNAを抽出する。血液中のゲノムDNAは公知の任意の方法によって抽出することができるが、例えば細胞を溶解して溶出させたDNAを、シリカでコーティングした磁性ビーズの表面に結合させ、磁気を利用して分離、回収することによってDNAを抽出することができる。
抽出したDNAサンプル中のSNPにおけるアレルの同定手段は特に限定されず、当該技術において公知のSNP検出方法及びSNPタイピング方法から適宜選択すればよい。
ここでは、ゲノムワイド関連解析(GWAS)を用いる手法について説明する。具体的には、例えば、ゲノム全領域に分布するSNPを含むDNAマイクロアレイ(アフィメトリクス社、Genome-Wide Human SNP Array 6.0)を用いて行うことができる。その際に、Quality controlを行うことで、抽出するSNPを選択してもよい。
Quality controlにおけるSNP採否の基準となるコールレートとしては、例えば、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、更に好ましくは95%以上のコールレートを示すSNPを採用することが望ましい。また、その他に、マイナーアレル頻度(MAF)が0.01未満のSNP、及び遺伝子型の分布がハーディー・ワインバーグ平衡(HWE)から有意に(false discovery rateが0.001未満)逸脱したSNPについては、候補から除外することが望ましい。
Quality controlで選択されたSNPについては、更に絞り込みを行う。具体的には、例えば、統計ソフトウェアを用いてカイ二乗検定を行うことで、P値が好ましくは1×10-3以下、より好ましくは3×10-4以下、更に好ましくは1×10-4以下を満たすSNPを選択する。
次に、前記抽出されたSNPについては、ジェノタイピング不良SNPを除外するための2次元クラスタープロット解析、例えば、ジェノタイピングソフトウェア(アフィメトリクス社、Genotyping Console)から得られるクラスタープロット画像を目視で観察することによって、ジェノタイピング不良のSNPを除外して、マーカー候補のSNP群を決定する。
このようにして選択されたSNPは、GenBankやdbSNPのような公知配列や公知SNPのデータベースを参照することにより、そのSNPが存在するゲノム上の位置、配列情報、SNPが存在する遺伝子又は近傍に存在する遺伝子、遺伝子上に存在する場合にはイントロン又はエキソンの区別やその機能、他の生物種における相同遺伝子などの情報を得ることができる。
(2) マーカーSNP群を見出す方法
次に、前記で得られたマーカー候補のSNP群について、ジェノタイプデータを数値化して抽出する。
次に、前記で得られたマーカー候補のSNP群について、ジェノタイプデータを数値化して抽出する。
数値化においては、ジェノタイプデータ及びリスクアレルデータベースを参照して、例えばジェノタイプデータに含まれる所定のアレルにおいて、リスクアレルがホモの場合には数値2を、リスクアレルがヘテロの場合には数値1を、非リスクアレルがホモの場合には数値0を、それぞれ付与する。そして、得られた数値を、各アレルの出現頻度の平均値と観測される頻度を用いて以下の数式により正規化を行って、選択されたSNP群における数値化したジェノタイプデータ行列を作成する。
なお、リスクアレルとは、患者群に高頻度に出現するアレルをいう。本発明で、リスクアレルはオッズ比に基づいて規定される。オッズ比とは、一般に患者群における危険因子を持つ人の割合と持たない人の割合の比、即ちオッズを、非患者群において同様に求めたオッズで除したものであり、本発明のようなケース・コントロール研究において用いられることが多い。本発明においてオッズ比はアレル頻度に基づいて求められ、患者群における、あるアレルの頻度と他のアレルの比を、非患者群において同様にして得られる頻度の比で除して算出することができる。なお、各アレルの出現頻度は、例えば、サンプル提供者のデータを取得するに伴って、そのデータが追加更新されて随時再算出可能なものである。
次いで、数値化したジェノタイプデータ行列を用いて、クラスター解析を行う。具体的には、例えば、SNP間の連鎖不平衡(linkage disequilibrium, LD)を考慮し、独立性が高いと思われるSNPを主成分分析(principal component analysis, PCA)により決定する。主成分分析の方法としては、公知の方法を用いることが出来るが、例えば、前記で選択されたSNPについて、全ゲノム又は染色体のそれぞれにおいて情報縮約を行って因子負荷量(主成分と元の変数との間の相関係数に相当)を算出し、それに基づいて候補領域を決定し、当該領域内でP値が最も低いSNPを候補SNPとして選択することで、本発明のマーカーSNP群を決定する。但し、全ゲノムからの計算と染色体のそれぞれからの計算から重複したSNPは除く。
次に、本発明のマーカーSNP群から、高精度な判定に寄与する特定のSNP群を更に選定する方法について説明する。以降、かかるSNP群のことを、コアSNP群と記載する。
(3) コアSNP群とプールSNP群を見出す方法
コアSNP群は、前記で得られたマーカーSNP群からP値が低い順に50個程度のSNP群を選択し、選択されたSNP群について新たな集団による再現実験を行うことで決定することができる。また、プールSNP群は、マーカーSNP群からコアSNP群を除いた群とする。
コアSNP群は、前記で得られたマーカーSNP群からP値が低い順に50個程度のSNP群を選択し、選択されたSNP群について新たな集団による再現実験を行うことで決定することができる。また、プールSNP群は、マーカーSNP群からコアSNP群を除いた群とする。
より詳しくは、前記のようにして選択されたSNP群について、マーカー候補のSNP群を同定する際に用いた患者群と非患者群とは別の集団から、採取したDNAを用いてアレルの同定を行う。ここで、別集団とは、一部に重複が生じていてもよいが、完全非同一が好ましい集団である。解析方法としては、例えば、質量分析法が好ましく、公知のMassARRAYを用いることができる。なお、Quality controlを行ってもよく、その際のコールレートとしては、例えば、好ましくは85%以上、より好ましくは90%以上、更に好ましくは95%以上のコールレートを示すSNPを採用することが望ましい。また、その他に、マイナーアレル頻度(MAF)が0.01未満のSNP、及び遺伝子型の分布がハーディー・ワインバーグ平衡(HWE)から有意に(false discovery rateが0.001未満)逸脱したSNPについては、候補から除外することが望ましい。
次いで、前記同定されたSNPについて、前記と同様にして2次元クラスタープロット解析を行って、ジェノタイピング不良SNPを除外する。
このようにして選択されたSNPについて、例えば、ジェノタイピングソフトウェアを用いてカイ二乗検定を行うことで、P値が好ましくは1×10-3以下、より好ましくは3×10-4以下、更に好ましくは1×10-4以下を満たすSNPを選択する。
選択されたSNP群については、2回の解析結果を統合して判断することが好ましいことから、公知のメタ解析の手法、例えば、コクラン・マンテル・ヘンツェル法によって解析結果を統合して評価することができる。そして、当該解析手法によりP値が3×10-3以下を満たすSNPを本発明におけるコアSNP群(計12個)とし、コアSNP群に該当しない残りのSNP群(計471個)をプールSNP群とする。以下に、コアSNP群におけるSNPを含むプローブ配列を表1に、プールSNP群におけるSNPを含むプローブ配列を表2(表2-1~表2-24)にそれぞれ示す。表中、各SNPの対立遺伝子(アレル)はプローブ配列における括弧内に記載し、リスクアレルを含む配列を配列番号A、非リスクアレルを含む配列を配列番号Bとする。
かくして選択された本発明のSNP群を用いて、以下の各工程を行う。
〔アレル測定工程〕
アレル測定工程では、前記コアSNP群について必ず測定を行い、かつ、プールSNP群から選ばれるSNP(プール選抜SNP群)についても測定を行う。測定対象のSNP数は、コアSNP群を含めた合計が少なくとも30個であれば特に限定はなく、例えば、測定対象が30個の場合は、コアSNP 12個とプール選抜SNP 18個で構成される。測定対象が40個の場合は、コアSNP 12個とプール選抜SNP 28個で構成される。測定対象が50個の場合は、コアSNP 12個とプール選抜SNP 38個で構成される。測定対象が90個の場合は、コアSNP 12個とプール選抜SNP 78個で構成される。
アレル測定工程では、前記コアSNP群について必ず測定を行い、かつ、プールSNP群から選ばれるSNP(プール選抜SNP群)についても測定を行う。測定対象のSNP数は、コアSNP群を含めた合計が少なくとも30個であれば特に限定はなく、例えば、測定対象が30個の場合は、コアSNP 12個とプール選抜SNP 18個で構成される。測定対象が40個の場合は、コアSNP 12個とプール選抜SNP 28個で構成される。測定対象が50個の場合は、コアSNP 12個とプール選抜SNP 38個で構成される。測定対象が90個の場合は、コアSNP 12個とプール選抜SNP 78個で構成される。
また、本発明では、1回の測定結果を持って次の情報取得工程に進んでもよいが、判定精度を向上させる観点から、複数回の測定ステップを行って得られた複数の結果を持って情報取得工程に進むことができる。この場合、12個のコアSNP群についてはいずれかの測定ステップで、重複せずに、かつ、12個全てが測定対象として用いられ得る。ステップ毎のコアSNP群の数は同一であっても、異なっていてもよい。また、ステップ毎の測定対象SNP数も同一であっても、異なっていてもよく、各ステップにおいてコアSNP群を含めた合計が少なくとも30個であれば特に限定はない。
具体的には、例えば、アレル測定工程が2回の測定ステップを含む場合は、
コアSNP群から選ばれる1個以上のSNP(第1コアSNP群)と、プールSNP群から選ばれる複数のSNP(第1プール選抜SNP群)とを合わせて少なくとも30個のSNPを含む第1SNP群について測定を行う第1測定ステップと、
第1コアSNP群とは異なる1個以上のSNP(第2コアSNP群)と、プールSNP群から選ばれる複数のSNP(第2プール選抜SNP群)とを合わせて少なくとも30個のSNPを含む第2SNP群について測定を行う第2測定ステップ
を含む工程が例示され、ここで、前記第1プール選抜SNP群と第2プール選抜SNP群とは非同一である。各測定ステップにおける測定対象のSNP数を例示すると、例えば、第1SNP群における第1コアSNP群は6個、第1プール選抜SNP群が24個以上であり、第2SNP群における第2コアSNP群は6個、第2プール選抜SNP群が24個以上の例が挙げられる。なお、本明細書において「非同一」とは完全同一ではないことを意味し、例えば、1個のみ異なる場合であってもよく、プール選抜SNP群の構成SNPが全て異なる場合であってもよい。
コアSNP群から選ばれる1個以上のSNP(第1コアSNP群)と、プールSNP群から選ばれる複数のSNP(第1プール選抜SNP群)とを合わせて少なくとも30個のSNPを含む第1SNP群について測定を行う第1測定ステップと、
第1コアSNP群とは異なる1個以上のSNP(第2コアSNP群)と、プールSNP群から選ばれる複数のSNP(第2プール選抜SNP群)とを合わせて少なくとも30個のSNPを含む第2SNP群について測定を行う第2測定ステップ
を含む工程が例示され、ここで、前記第1プール選抜SNP群と第2プール選抜SNP群とは非同一である。各測定ステップにおける測定対象のSNP数を例示すると、例えば、第1SNP群における第1コアSNP群は6個、第1プール選抜SNP群が24個以上であり、第2SNP群における第2コアSNP群は6個、第2プール選抜SNP群が24個以上の例が挙げられる。なお、本明細書において「非同一」とは完全同一ではないことを意味し、例えば、1個のみ異なる場合であってもよく、プール選抜SNP群の構成SNPが全て異なる場合であってもよい。
また、アレル測定工程が3回の測定ステップを含む場合は、
コアSNP群から選ばれる1個以上のSNP(第1コアSNP群)と、プールSNP群から選ばれる複数のSNP(第1プール選抜SNP群)とを合わせて少なくとも30個のSNPを含む第1SNP群について測定を行う第1測定ステップと、
第1コアSNP群とは異なる1個以上のSNP(第2コアSNP群)と、プールSNP群から選ばれる複数のSNP(第2プール選抜SNP群)とを合わせて少なくとも30個のSNPを含む第2SNP群について測定を行う第2測定ステップと、
第1コアSNP群及び第2コアSNP群とは異なる1個以上のSNP(第3コアSNP群)と、プールSNP群から選ばれる複数のSNP(第3プール選抜SNP群)とを合わせて少なくとも30個のSNPを含む第3SNP群について測定を行う第3測定ステップ
を含む工程が例示され、ここで、前記第1プール選抜SNP群と第2プール選抜SNP群と第3プール選抜SNP群とはいずれも非同一である。また、各測定ステップにおける測定対象のSNP数を例示すると、例えば、第1SNP群における第1コアSNP群は4個、第1プール選抜SNP群が26個以上であり、第2SNP群における第2コアSNP群は4個、第2プール選抜SNP群が26個以上であり、第3SNP群における第3コアSNP群は4個、第3プール選抜SNP群が26個以上である例が挙げられる。
コアSNP群から選ばれる1個以上のSNP(第1コアSNP群)と、プールSNP群から選ばれる複数のSNP(第1プール選抜SNP群)とを合わせて少なくとも30個のSNPを含む第1SNP群について測定を行う第1測定ステップと、
第1コアSNP群とは異なる1個以上のSNP(第2コアSNP群)と、プールSNP群から選ばれる複数のSNP(第2プール選抜SNP群)とを合わせて少なくとも30個のSNPを含む第2SNP群について測定を行う第2測定ステップと、
第1コアSNP群及び第2コアSNP群とは異なる1個以上のSNP(第3コアSNP群)と、プールSNP群から選ばれる複数のSNP(第3プール選抜SNP群)とを合わせて少なくとも30個のSNPを含む第3SNP群について測定を行う第3測定ステップ
を含む工程が例示され、ここで、前記第1プール選抜SNP群と第2プール選抜SNP群と第3プール選抜SNP群とはいずれも非同一である。また、各測定ステップにおける測定対象のSNP数を例示すると、例えば、第1SNP群における第1コアSNP群は4個、第1プール選抜SNP群が26個以上であり、第2SNP群における第2コアSNP群は4個、第2プール選抜SNP群が26個以上であり、第3SNP群における第3コアSNP群は4個、第3プール選抜SNP群が26個以上である例が挙げられる。
なお、本発明においては、必要により、4回目以降の測定を行うこともできる。
本発明で用いられる生体試料としては、ゲノム由来のDNAを抽出可能なものであれば何でも良い。例えば、全血、全血球、白血球、リンパ球、血漿、血清、リンパ液、涙液、唾液、鼻汁、脳脊髄液、骨髄液、精液、汗、粘膜組織、皮膚組織、又は毛根等が用いられる。かかる生体試料からのDNA抽出方法としては、公知の任意の方法を採用することができる。
測定対象のSNP群に関しては、公知の方法に従って、そのアレルを決定して測定結果を得る。具体的には、例えば、本発明のSNP群の配列情報に基づき設計した、各アレルに特異的なプローブ(表1~表2)を用いてハイブリダイズさせ、そのシグナルを検出することによりそれぞれのアレルを検出することができる。プローブを用いてハイブリダイズさせる方法の例としてはタックマン法、インベーダー(Invader(登録商標))法、ライトサイクラー法、サイクリンプローブ法、MPSS法、ビーズアレイ法、DNAチップ法、マイクロアレイ法などがある。また、プローブによるハイブリダイズを行わずにアレルを検出することも可能であり、例えば、PCR-RFLP法、SSCP法、質量分析法、次世代シークエンス法、ダイレクトシークエンス法などを用いることができる。これらの方法は公知の条件に従って行うことができる。
かくして得られた測定結果を次の情報取得工程に供する。
〔情報取得工程〕
情報取得工程では、測定対象のアレルに基づいて広義POAGの発症リスクに関する情報を取得する。アレルの情報としては、バリアントが存在するか否かについての情報や測定されたアレルの種類についての情報であってもよく、その数を取得したものであってもよい。また、SNPと相関する値(統計値など)として算出されたものであってもよい。なかでも、本発明では、判定精度を向上する観点から、測定されたアレルがリスクアレルであるか否かを判別し、リスクアレルの総数をカウントしたものであることが好ましい。即ち、予め取得したリスクアレルデータに基づいて、測定されたアレルがリスクアレルであるか否かの判別を行って、測定対象のSNP群全体においてリスクアレルと判定されたアレルの総数(リスクアレル保有数ともいう)を数える。また、複数回の測定ステップを行う場合には、各測定においてリスクアレルの総数があらかじめ設定した所定の閾値を超えるかどうかで、陽性か陰性かを判定し、それらの数をカウントする。このようにして得られたリスクアレルの総数と、複数回の測定ステップを行う場合には、更に、各測定結果の陽性、陰性の個数をサンプル提供者の定量値として認定して、次の情報提供工程に進むことが好ましい。
情報取得工程では、測定対象のアレルに基づいて広義POAGの発症リスクに関する情報を取得する。アレルの情報としては、バリアントが存在するか否かについての情報や測定されたアレルの種類についての情報であってもよく、その数を取得したものであってもよい。また、SNPと相関する値(統計値など)として算出されたものであってもよい。なかでも、本発明では、判定精度を向上する観点から、測定されたアレルがリスクアレルであるか否かを判別し、リスクアレルの総数をカウントしたものであることが好ましい。即ち、予め取得したリスクアレルデータに基づいて、測定されたアレルがリスクアレルであるか否かの判別を行って、測定対象のSNP群全体においてリスクアレルと判定されたアレルの総数(リスクアレル保有数ともいう)を数える。また、複数回の測定ステップを行う場合には、各測定においてリスクアレルの総数があらかじめ設定した所定の閾値を超えるかどうかで、陽性か陰性かを判定し、それらの数をカウントする。このようにして得られたリスクアレルの総数と、複数回の測定ステップを行う場合には、更に、各測定結果の陽性、陰性の個数をサンプル提供者の定量値として認定して、次の情報提供工程に進むことが好ましい。
〔情報提供工程〕
情報提供工程では、得られた情報に基づいて被検者の発症リスクを判定するための情報を被検者に提供する。
情報提供工程では、得られた情報に基づいて被検者の発症リスクを判定するための情報を被検者に提供する。
発症リスクを判定する方法としては、例えば、前記工程により得られる情報がリスクアレル保有数である場合、具体的には、4つの態様が挙げられる。
態様1:リスクアレル保有数の数値によって発症リスクの有無を判定する態様
態様2:複数のリスクアレル保有数が得られる場合の発症リスクの有無を統合して判定する態様
態様3:リスクアレル保有数に基づいて発症リスクを有する確率を算出する態様
態様4:リスクアレル保有数に基づいて所定の確率で発症リスクを有する確率を算出する態様
態様1:リスクアレル保有数の数値によって発症リスクの有無を判定する態様
態様2:複数のリスクアレル保有数が得られる場合の発症リスクの有無を統合して判定する態様
態様3:リスクアレル保有数に基づいて発症リスクを有する確率を算出する態様
態様4:リスクアレル保有数に基づいて所定の確率で発症リスクを有する確率を算出する態様
態様1の方法としては、例えば、情報取得工程により得られた被検者に関する結果(リスクアレル保有数)が、アレル測定工程で用いられたSNPに基づいて予めROC(Receiver Operating Characteristic)分析により定められたカットオフ値を、上回る場合は前記被検者が広義POAGを発症するリスクが高く、下回る場合は当該リスクが低いとの情報を提供する方法が挙げられる。
より詳しくは、先ず、サンプル提供者のリスクアレル保有数を予め設定された閾値と対比する。閾値とは患者と非患者とを識別する適切なカットオフ値のことであり、当該閾値と定量値を対比することにより、広義POAGの発症リスクを有するか否かを判定できる。
閾値は以下のようにして設定することができる。サンプル提供者の定量値を取得する際に測定対象として選定されたSNP群と同じSNP群に関して、予め広義POAGの発症リスクを有するか否かを診断された被検者から採取した生体試料を用いて、上述のようにしてリスクアレル数を測定し、「広義POAGの発症リスクの有無」と「リスクアレル数」を統計的に処理することにより、両データ間の相関を解析する。解析された結果から、例えば、真陽性率の高さ(感度の高さ)を重視するか、真陰性率の高さ(特異度の高さ)を重視するか、又は真陽性率と真陰性率をどの程度でバランスさせるか等の目的に応じて、閾値を設定することができる。即ち、測定対象のSNP群が異なれば、そこに存在するリスクアレルも当然異なることから、測定対象のSNP群によって閾値は変動する。ここで、真陽性率とは、広義POAGの発症リスクを有する者を正しく広義POAGの発症リスクを有する者として判定する確率のことであり、真陰性率とは、広義POAGの発症リスクを有しない者を正しく広義POAGの発症リスクを有しない者として判定する確率のことである。
具体的な閾値の設定方法としては、先ず、サンプル提供者の定量値を取得する際に測定対象として選択されたSNP群と同じSNP群に関して、縦軸に真陽性率(感度)、横軸に真陰性率(1-特異度)をとって作成したROC曲線を作成する(ROC分析を実施する)。次に、グラフの左上隅からの距離が最小となる点を閾値としてもよく、ROC曲線下面積(Area Under the Curve, AUC)が0.5となる斜線から最も離れた点を閾値としてもよく、任意の特異度や感度になるような点を閾値として設定してもよい。本発明では、感度が1、(1-特異度)が0に最も近い結果を与える閾値を設定することが好ましく、例えば、〔(1-感度)2+(1-特異度)2〕が最少となる値を閾値と設定することができる。
なお、閾値は、サンプル提供者の定量値を取得する際に別途同時に取得してもよく、事前に取得しておいたものであってもよい。また、サンプル提供者の定量値と比較する際に、それまでに得られた解析結果を随時追加更新して、取得されたものであってもよい。
また、閾値の設定においては、判定精度の向上の観点から、正規化や重み付けを行ってもよい。具体的には、例えば、正規化の方法としては、正規分布曲線と比較する方法を用いることができる。また、重み付けの方法としては、各SNPのオッズ比を考慮して重み付けを行うことができる。
こうして予め設定された閾値とサンプル提供者の定量値とを対比することで、サンプル提供者が広義POAGの発症リスクを有するか否かを判定することができる。
態様2の方法としては、例えば、アレル測定工程が複数の測定ステップを含む場合、情報取得工程により得られた被検者に関する各測定ステップでの結果(各リスクアレル保有数)が、各測定ステップで用いられたSNP群に基づいて予めROC分析により定められたカットオフ値を上回るか否かを指標として、前記被検者が広義POAGを発症するリスクの高低についての情報を提供する方法が挙げられる。
より詳しくは、先ず、サンプル提供者のリスクアレル保有数を、測定ステップ毎に、予め設定された閾値と対比して発症リスクの有無を判定する。閾値は態様1と同様にして設定することができる。次に、測定ステップ毎の発症リスクの有無の結果を統合する。具体的には、例えば、測定ステップを3回行って、発症リスクがある場合を「+」、ない場合を「-」として表示する場合、1回目の判定結果が「+」、2回目の判定結果が「+」、3回目の判定結果が「+」の統合結果は「+++」であり、1回目の判定結果が「+」、2回目の判定結果が「+」、3回目の判定結果が「-」の統合結果は「++-」であり、1回目の判定結果が「+」、2回目の判定結果が「-」、3回目の判定結果が「+」の統合結果は「+-+」に分類される。よって、3回の判定において1回陰性であるという確率としては同じであっても、「++-」と「+-+」は異なる分類に該当することになる。そして、得られた統合結果を用いて、予め判明している発症リスクを有する群・発症リスクを有さない群のグラフ上において同じ分類に該当する傾向に基づいて広義POAGの発症リスクが高いか低いかを判定する。
発症リスクを有する群・発症リスクを有さない群のグラフは以下のようにして作成することができる。例えば、予め診断された被検者について統合結果を得て、「+++」、「++-」、「+-+」等のパターン毎に、広義POAGの発症リスクを有するか否かの人数を集積することで作成することができる。
こうして予め作成された発症リスクを有する群・発症リスクを有さない群のグラフにおいて、サンプル提供者の統合結果から該当する区分の情報を得ることで、サンプル提供者が広義POAGの発症リスクを有するか否かを判定することができる。
なお、態様2において、後述するベイズ定理を当てはめて、広義POAGの発症リスクを有する確率を算出してもよい。
態様3の方法としては、例えば、情報取得工程で得られた結果にベイズ定理を当てはめて、広義POAGを発症するリスクを有する確率を算出する方法が挙げられる。一般に、臨床現場においては、検査対象者がその疾患の発症リスクを有するか否かは不明であり、検査結果から疾患の発症リスクの有無を推定することになるので、検査方法の陽性的中率(PPV)や陰性的中率(NPV)が高いことも望まれている。ここで、陽性的中率とは、検査結果が陽性の場合に疾患を有する者の割合であり、陰性的中率とは、検査結果が陰性の場合に発症リスクを有していない者の割合である。広義POAG発症リスクを有する確率として提示することで当該確率が高いほど、広義POAGを発症するリスクの高い群に分類されることがより容易に理解されることになる。
具体的な広義POAGの発症リスクを有する確率算出方法としては、情報取得工程で得られた結果(リスクアレル保有数)を態様1と同様にして閾値と対比することで、広義POAGの発症リスクの有無を判断し、その結果にベイズ定理の方法を当てはめて発症リスクを有する確率を算出する。ベイズ定理の方法においては、事前確率(有病率)に、前述した感度と特異度を組み合わせて事後確率(陽性的中率、陰性的中率)を求めることができることから、本発明においては、広義POAGの発症リスクの確率が事後確率として表される。言い換えると、ベイズ定理の方法を用いない場合は、発症リスクを有する確率は有病率と同じであるけれども、ベイズ定理の方法を用いることにより、検査により陽性結果が出た場合は、その検査対象者の発症リスクの確率は陽性的中率により表すことができることを意味する。具体的には、陽性的中率=有病率×感度/〔有病率×感度+(1-有病率)×(1-特異度)〕、陰性的中率=特異度×(1-有病率)/〔特異度×(1-有病率)+有病率×(1-感度)〕により求めることができ、例えば、有病率が10%であって、検査の感度が70%、特異度が70%の場合、陽性的中率は21%、陰性的中率は95%と算出される。よって、陽性結果が出た検査対象者の発症リスクは21%であることから、有病率よりも高く、更なる診察を受けるように助言することができる。また、前記検査を3回組み合わせて行った場合には、陽性的中率は62%、陰性的中率は99%と算出されることから、3回目の検査においてリスクアレル数が閾値を超えた検査対象者は、広義POAGの発症リスクがより高いと判定することができる。
こうして検査対象者の全体バックグラウンドとして、有病率の影響も含めた判定が行なえることで、サンプル提供者の広義POAGの発症リスクの確率として提示することが可能となる。
態様4の方法としては、例えば、情報取得工程で得られた結果にベイズ定理を当てはめて、リスクアレル保有数に基づく発症リスクを有する確率(平均発症リスク、95%信用区間)を算出し、更に予め設定されたパーセント(%)以上の確率で広義POAGを発症するリスクを有する確率を算出する方法が挙げられる。ここで、設定されるパーセントとしては、例えば、70%、80%、90%等の任意の数値を設定することができ、値が大きい程、高精度で判定を行うことができる。
より詳しくは、例えば、態様2で用いた予め診断された被験者から得られた統合結果「+++」、「++-」、「+-+」等のパターン毎に、ベイズ定理により広義POAGの発症リスクを有する確率密度関数を算出する。例えば70%以上の確率を算出する場合、確率密度関数から連続確率変数である発症リスクを有する確率が70以上となる密度を範囲とする面積が発症リスクを有する確率となる。
かくして、本発明においては、サンプル提供者の広義POAGの発症リスクを、リスクアレル数の合計数を閾値と対比することで、広義POAGの発症リスクを有するか否かを判定するだけでなく、その確率を算出することによって、サンプル提供者の広義POAGの発症リスクに関する情報をより詳細に提供することができる。
本発明はまた、広義POAGの発症リスクに関する情報を取得する装置を提供する。
本発明の装置としては、プロセッサおよび前記プロセッサの制御下にあるメモリを備えたコンピュータを含み、前記メモリには、下記の工程:
被検者から採取した生体試料における一塩基多型(SNP)のアレル情報に基づいて、表1に記載の12個のコアSNP群と、表2に記載のプールSNP群から選ばれるSNP(プール選抜SNP群)とを合わせて少なくとも30個のSNPについて、アレルを測定するアレル測定工程、
前記アレルの測定結果に基づいて、前記被検者における広義POAGの発症リスクに関する情報を取得する情報取得工程、及び
前記で得られた情報に基づいて、前記被検者の広義POAGの発症リスクを判定するための情報を提供する情報提供工程
を前記コンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムが記録されている。
被検者から採取した生体試料における一塩基多型(SNP)のアレル情報に基づいて、表1に記載の12個のコアSNP群と、表2に記載のプールSNP群から選ばれるSNP(プール選抜SNP群)とを合わせて少なくとも30個のSNPについて、アレルを測定するアレル測定工程、
前記アレルの測定結果に基づいて、前記被検者における広義POAGの発症リスクに関する情報を取得する情報取得工程、及び
前記で得られた情報に基づいて、前記被検者の広義POAGの発症リスクを判定するための情報を提供する情報提供工程
を前記コンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムが記録されている。
また、本発明には、被検者における広義POAGの発症リスクの判定をコンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムも含まれる。そのようなコンピュータプログラムとしては、例えば、次のとおりである。
コンピュータに読み取り可能な媒体に記録されているコンピュータプログラムであって、下記の工程:
被検者から採取した生体試料における一塩基多型(SNP)のアレル情報に基づいて、表1に記載の12個のコアSNP群と、表2に記載のプールSNP群から選ばれるSNP(プール選抜SNP群)とを合わせて少なくとも30個のSNPについて、アレルを測定するアレル測定工程、
前記アレルの測定結果に基づいて、前記被検者における広義POAGの発症リスクに関する情報を取得する情報取得工程、及び
前記で得られた情報に基づいて、前記被検者の広義POAGの発症リスクを判定するための情報を提供する情報提供工程
を実行させて、被検者における広義POAG発症リスクの判定を行わせる。
被検者から採取した生体試料における一塩基多型(SNP)のアレル情報に基づいて、表1に記載の12個のコアSNP群と、表2に記載のプールSNP群から選ばれるSNP(プール選抜SNP群)とを合わせて少なくとも30個のSNPについて、アレルを測定するアレル測定工程、
前記アレルの測定結果に基づいて、前記被検者における広義POAGの発症リスクに関する情報を取得する情報取得工程、及び
前記で得られた情報に基づいて、前記被検者の広義POAGの発症リスクを判定するための情報を提供する情報提供工程
を実行させて、被検者における広義POAG発症リスクの判定を行わせる。
上記の媒体は、上記のコンピュータプログラムが非一時的に記録され、且つコンピュータに読取可能な媒体であってもよい。
以下に、本発明の方法を実施するのに好適な装置の一例を、図面を参照して説明する。しかし、本実施形態は、この例のみに限定されるものではない。図1は、被検者における広義POAG発症リスクの判定装置の一例を示した概略図である。図1に示された判定装置10は、測定装置20と、該測定装置20と接続されたコンピュータシステム30とを含んでいる。
本実施形態において、測定装置20は、マイクロアレイ上のプローブと結合したDNAに基づくシグナルを検出するスキャナーもしくは質量分析機である。本実施形態において、シグナルは、蛍光シグナルなどの光学的情報もしくは質量分析結果である。測定用試料と接触させたマイクロアレイを測定装置20にセットすると、測定装置20は、マイクロアレイ上のプローブに結合した、被検者の生体試料由来の核酸に基づく光学的情報もしくは質量分析結果を取得し、得られた光学的情報もしくは質量分析結果をコンピュータシステム30に送信する。
スキャナーは、マイクロアレイ上のプローブに結合したDNAに基づくシグナルの検出が可能であれば特に限定されない。シグナルは、被検者の生体試料由来のDNAの標識に用いられた標識物質によって異なることから、スキャナーは、標識物質の種類に応じて適宜選択することができる。例えば、標識物質が蛍光物質である場合、測定装置20として、当該蛍光物質から生じる蛍光を検出可能なマイクロアレイスキャナーが用いられる。
なお、SNPを次世代シークエンス法やダイレクトシークエンス法により検出する場合、測定装置20は、DNA増幅装置及びシークエンス解析装置からなる装置であってもよい。この場合、測定用試料、DNA増幅用の酵素及びプライマーなどを含む反応液を測定装置20にセットし、DNA増幅法によって反応液中のDNAを増幅させる。そして、測定装置20は、増幅産物の塩基配列を解析して配列情報を取得し、得られた配列情報をコンピュータシステム30に送信する。
コンピュータシステム30は、コンピュータ本体300と、入力部301と、検体情報や判定結果などを表示する表示部302とを含む。コンピュータシステム30は、測定装置20から光学的情報もしくは質量分析結果もしくは配列情報を受信する。そして、コンピュータシステム30のプロセッサは、光学的情報もしくは質量分析結果もしくは配列情報に基づいて、被検者における広義POAGの発症リスクを判定するプログラムを実行する。なお、コンピュータシステム30は、図1に示されるように測定装置20とは別個の機器であってもよいし、測定装置20を内包する機器であってもよい。後者の場合、コンピュータシステム30は、それ自体で判定装置10となってもよい。
コンピュータ本体300は、図2に示されるように、CPU(Central Processing Unit)310と、ROM(Read Only Memory)311と、RAM(Random Access Memory)312と、ハードディスク313と、入出力インターフェイス314と、読出装置315と、通信インターフェイス316と、画像出力インターフェイス317とを備えている。CPU310、ROM311、RAM312、ハードディスク313、入出力インターフェイス314、読出装置315、通信インターフェイス316及び画像出力インターフェイス317は、バス318によってデータ通信可能に接続されている。また、測定装置20は、通信インターフェイス316により、コンピュータシステム30と通信可能に接続されている。
CPU310は、ROM311に記憶されているプログラム及びRAM312にロードされたプログラムを実行することが可能である。CPU310は、有効性予測値を算出し、ROM311に格納されている判別式を読み出し、有効性を判定する。CPU310は、判定結果を出力して表示部302に表示させる。
ROM311は、マスクROM、PROM、EPROM、EEPROMなどによって構成されている。ROM311には、前述のようにCPU310によって実行されるプログラム及びこれに用いるデータが記録されている。ROM311には、所定の閾値などが記録されていてもよい。
RAM312は、SRAM、DRAMなどによって構成されている。RAM312は、ROM311及びハードディスク313に記録されているプログラムの読み出しに用いられる。RAM312はまた、これらのプログラムを実行するときに、CPU310の作業領域として利用される。
ハードディスク313は、CPU310に実行させるためのオペレーティングシステム、アプリケーションプログラム(広義POAGの発症リスクの判定のためのコンピュータプログラム)などのコンピュータプログラム及び当該コンピュータプログラムの実行に用いるデータがインストールされている。ハードディスク313には、所定の閾値などが記録されていてもよい。
読出装置315は、フラッシュメモリ、フレキシブルディスクドライブ、CD-ROMドライブ、DVDROMドライブなどによって構成されている。読出装置315は、可搬型記録媒体40に記録されたプログラム又はデータを読み出すことができる。読取装置と記載することもある。
入出力インターフェイス314は、例えば、USB、IEEE1394、RS-232Cなどのシリアルインターフェイスと、SCSI、IDE、IEEE1284などのパラレルインターフェイスと、D/A変換器、A/D変換器などからなるアナログインターフェイスとから構成されている。入出力インターフェイス314には、キーボード、マウスなどの入力部301が接続されている。操作者は、当該入力部301により、コンピュータ本体300に各種の指令を入力することが可能である。
通信インターフェイス316は、例えば、Ethernet(登録商標)インターフェイスなどである。コンピュータ本体300は、通信インターフェイス316により、プリンタなどへの印刷データの送信も可能である。
画像出力インターフェイス317は、LCD、CRTなどで構成される表示部302に接続されている。これにより、表示部302は、CPU310から与えられた画像データに応じた映像信号を出力できる。表示部302は、入力された映像信号にしたがって画像(画面)を表示する。
次に、判定装置10による、広義POAGの発症リスクの高低を判定する処理手順を説明する。ここでは、マイクロアレイ上のプローブに結合した、被検者の生体試料由来のDNAに基づく蛍光情報からリスクアレル情報を取得し、得られた測定値を用いて判定を行なう場合を例として説明する。しかし、本実施形態は、この例のみに限定されるものではない。
図3を参照して、ステップS101において、判定装置10のCPU310は、測定装置20から蛍光情報を取得する。次に、ステップS102において、CPU310は、取得した蛍光情報から蛍光強度を算出し、RAM312に記憶する。そして、ステップS103において、CPU310は、RAM312に記憶された前記蛍光強度から各バリアントの有無及びその種類を決定し、ROM311又はハードディスク313に記憶されたアレルデータにしたがって、リスクアレル総数を算出する。
その後、ステップS104において、CPU310は、算出された有効性予測値と、ROM311又はハードディスク313に記憶された所定の閾値とを用いて、被検者における広義POAGの発症リスクの高低を判定する。ここで、リスクアレル総数が所定の閾値よりも小さいとき、処理は、ステップS105に進行し、CPU310は、被検者における広義POAGの発症リスクが低いことを示す判定結果をRAM312に記憶する。一方、リスクアレル総数が所定の閾値よりも低くないとき(すなわち、リスクアレル総数が閾値以上であるとき)、処理は、ステップS106に進行し、CPU310は、被検者における広義POAGの発症リスクが高いことを示す判定結果をRAM312に記憶する。
そして、ステップS107において、CPU310は、判定結果を出力し、表示部302に表示させたり、プリンタに印刷させたりする。これにより、被検者における広義POAGの発症リスクが高いか否かの判定を補助する情報を医師などに提供することができる。
以下、実施例を示して本発明を具体的に説明する。この実施例は、単なる本発明の例示であり、何ら限定を意味するものではない。なお、以下の実施例では、特に詳細な説明がない一般的に用いられる分子生物学的手法については、モレキュラークローニング (Joseph Sambrook et al., Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 3rd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)などの成書に記載された方法及び条件が用いられる。
試験例1 マーカーSNP(コアSNP+プールSNP)の選択
広義の原発開放隅角緑内障と診断された患者(広義POAG患者群)824例、及び、緑内障ではないと診断され、かつ、問診によって緑内障家族歴を有さないと判断された非患者686例、それぞれの血液から、市販の自動核酸抽出機を使用して、総DNAを抽出した。総DNAの抽出は機器及びキットの取扱説明書に従い実施した。本方法により、血液検体350μLから約5μgの総DNAを得た。
広義の原発開放隅角緑内障と診断された患者(広義POAG患者群)824例、及び、緑内障ではないと診断され、かつ、問診によって緑内障家族歴を有さないと判断された非患者686例、それぞれの血液から、市販の自動核酸抽出機を使用して、総DNAを抽出した。総DNAの抽出は機器及びキットの取扱説明書に従い実施した。本方法により、血液検体350μLから約5μgの総DNAを得た。
SNPの分析は、ヒトゲノム上の公知のSNP約90万個の分析が可能な市販のマイクロアレイ型のSNP分析キットDNAマイクロアレイ(Genome-Wide Human SNP Array 6.0)を用いて906,600個のSNPのジェノタイプデータを取得し、QCフィルター (Call Rate, ≧0.95; MAF, ≧0.01; HWE, ≧0.001) を用いて653,519個の高精度なSNPデータを選択した。さらに、以下の過程により787個のSNPマーカー候補群を抽出した。
(1) ゲノムワイド関連解析(アレルデータによるχ2検定)でP<0.001を抽出条件とした。
(2) 抽出された全SNPについて、アフィメトリクス社のジェノタイピングソフトウェア (Genotyping Console) から得られる2Dクラスタープロット画像に基づき、3人の検者の目視による判定によってクラスター不良のSNPを除外した。
(1) ゲノムワイド関連解析(アレルデータによるχ2検定)でP<0.001を抽出条件とした。
(2) 抽出された全SNPについて、アフィメトリクス社のジェノタイピングソフトウェア (Genotyping Console) から得られる2Dクラスタープロット画像に基づき、3人の検者の目視による判定によってクラスター不良のSNPを除外した。
マーカーSNPはSNPマーカー候補群から以下の手順により483個を選択した。なお、マーカーSNPはコアSNP 12個とプールSNP 471個から構成される。
(1) ジェノタイピングデータを、以下の手順でコード化(数値変換)および正規化を行った。
(a) Risk Allele Homo: 2、Risk Allele Hetero: 1、Other Allele Homo: 0とした。
(b) 数値変換は広義POAG患者群および非緑内障健常群の各群で、平均値および観測アレル頻度を用いて、前述の数式に従って数値の正規化を行った。
(2) 連鎖不平衡(linkage disequilibrium, LD)を考慮したSNPマーカー候補群の組合せを主成分分析(principle component analysis, PCA)を用いたクラスター解析により算出した。
(a) SNPマーカー候補群を用いて、広義POAG群および非緑内障健常群の全検体をPCAに供し、検体で情報縮約(Cluster SNP)することで得られる因子負荷量(主成分と元の変数との間の相関係数に相当)を算出した。次に、各SNPの最も高い因子負荷量の絶対値を示す主成分を基準とするクラスターにより候補領域を決定し、各候補領域内で最小のP値を得たSNPをマーカーSNPの候補とした。
(b) 「各染色体」でのSNPマーカー候補群を用いて、(a) と同様に各染色体で候補領域を決定し、マーカーSNPの候補とした。
(c) (a) と (b) のマーカーSNP候補を組み合わせて、重複を除いた。
(1) ジェノタイピングデータを、以下の手順でコード化(数値変換)および正規化を行った。
(a) Risk Allele Homo: 2、Risk Allele Hetero: 1、Other Allele Homo: 0とした。
(b) 数値変換は広義POAG患者群および非緑内障健常群の各群で、平均値および観測アレル頻度を用いて、前述の数式に従って数値の正規化を行った。
(2) 連鎖不平衡(linkage disequilibrium, LD)を考慮したSNPマーカー候補群の組合せを主成分分析(principle component analysis, PCA)を用いたクラスター解析により算出した。
(a) SNPマーカー候補群を用いて、広義POAG群および非緑内障健常群の全検体をPCAに供し、検体で情報縮約(Cluster SNP)することで得られる因子負荷量(主成分と元の変数との間の相関係数に相当)を算出した。次に、各SNPの最も高い因子負荷量の絶対値を示す主成分を基準とするクラスターにより候補領域を決定し、各候補領域内で最小のP値を得たSNPをマーカーSNPの候補とした。
(b) 「各染色体」でのSNPマーカー候補群を用いて、(a) と同様に各染色体で候補領域を決定し、マーカーSNPの候補とした。
(c) (a) と (b) のマーカーSNP候補を組み合わせて、重複を除いた。
コアSNPの取得
マーカーSNPの上位51個を用いて、別集団の広義POAG患者1,492例と非緑内障健常者1,052例を用いてマスアレイによる再現実験を実施した。QCフィルター (Call Rate, ≧0.9; MAF, ≧0.01; HWE, ≧0.001)を通過したSNP群を用いて関連解析(アレルデータによるχ2検定)を実施した。ゲノムワイド関連解析とマスアレイによる再現実験の再現性について、コクラン・マンテル・ヘンツェル検定結果(P<0.003)を基準とした12個のSNPをコアSNPとした。
マーカーSNPの上位51個を用いて、別集団の広義POAG患者1,492例と非緑内障健常者1,052例を用いてマスアレイによる再現実験を実施した。QCフィルター (Call Rate, ≧0.9; MAF, ≧0.01; HWE, ≧0.001)を通過したSNP群を用いて関連解析(アレルデータによるχ2検定)を実施した。ゲノムワイド関連解析とマスアレイによる再現実験の再現性について、コクラン・マンテル・ヘンツェル検定結果(P<0.003)を基準とした12個のSNPをコアSNPとした。
プールSNPの取得
マーカーSNPからコアSNPを除いた群をプールSNPとした。
マーカーSNPからコアSNPを除いた群をプールSNPとした。
実施例1及び比較例1
広義POAG群680例と非緑内障健常者群680例について、試験例1と同様にして血液を採取してゲノムDNAを抽出し、実施例1(表3)及び比較例1(表4-1~表4-2)についてそれぞれ示すプローブを用いて、ハイブリダイゼーションでアレルデータを取得し、リスクアレルの総数をカウントした。なお、実施例1で用いたプローブは、表1に記載の12個のプローブ及び表2から選択された18個のプローブであり、比較例1で用いたプローブは、検定上位の30個である。
広義POAG群680例と非緑内障健常者群680例について、試験例1と同様にして血液を採取してゲノムDNAを抽出し、実施例1(表3)及び比較例1(表4-1~表4-2)についてそれぞれ示すプローブを用いて、ハイブリダイゼーションでアレルデータを取得し、リスクアレルの総数をカウントした。なお、実施例1で用いたプローブは、表1に記載の12個のプローブ及び表2から選択された18個のプローブであり、比較例1で用いたプローブは、検定上位の30個である。
リスクアレルの総数を横軸にした度数分布図を作成し、ROC分析を行った結果を図4に示す。図4より、比較例1では感度54.3%、特異度65.4%であるカットオフ値が42個の場合にAUCが0.641程度であるのに対し、実施例1では感度70.1%、特異度71.2%であるカットオフ値が37個の場合にAUCが0.784と高く、度数分布図からも発症リスクを有する群と発症リスクを有さない群で区別がつくことが分かる。
実施例2
実施例1と用いるプローブが異なる以外は、実施例1と同様にしてデータ取得を行った。具体的には、下記表5に示すプローブを用いた。
実施例1と用いるプローブが異なる以外は、実施例1と同様にしてデータ取得を行った。具体的には、下記表5に示すプローブを用いた。
(態様1)
上記表5に示す90個のプローブ(コアSNP群12個、プールSNP群78個)全てを一度に用いて測定を行い、リスクアレルの総数をカウントした。リスクアレルの総数を横軸にした度数分布図を作成し、ROC分析を行った結果を図5に示す。図5より、感度83.1%、特異度82.1%であるカットオフ値が108個の場合にAUCが0.908であり、度数分布図からも発症リスクを有する群と発症リスクを有さない群で区別がつくことが分かる。
上記表5に示す90個のプローブ(コアSNP群12個、プールSNP群78個)全てを一度に用いて測定を行い、リスクアレルの総数をカウントした。リスクアレルの総数を横軸にした度数分布図を作成し、ROC分析を行った結果を図5に示す。図5より、感度83.1%、特異度82.1%であるカットオフ値が108個の場合にAUCが0.908であり、度数分布図からも発症リスクを有する群と発症リスクを有さない群で区別がつくことが分かる。
(態様2)
次に、前記態様1で用いたプローブを30個ずつに分けて、測定ステップを測定ステップ1、測定ステップ2、測定ステップ3の3グループに分けて行い、リスクアレルの総数をカウントした。
次に、前記態様1で用いたプローブを30個ずつに分けて、測定ステップを測定ステップ1、測定ステップ2、測定ステップ3の3グループに分けて行い、リスクアレルの総数をカウントした。
得られた結果について、前記と同様にして、リスクアレルの度数分布図とROC曲線を取得した。結果を図6に示す。図6より、第1測定での結果が感度69.1%、特異度71.2%でのカットオフ値が36個であり、第2測定での結果が感度74.1%、特異度66.5%でのカットオフ値が37個であり、第3測定での結果が感度68.8%、特異度75.4%でのカットオフ値が36個であり、それぞれの測定における判定結果が得られることが分かった。
また、図7に、前記3測定の判定結果を統合した結果を示す。即ち、発症リスクを有する群・発症リスクを有さない群毎に、前記3測定の判定結果を分類した結果を示す。これより、発症リスクを有する群と発症リスクを有さない群で区別がつくことが分かる。
(態様3及び4)
態様2と同様にして、個々のグループでの判定結果を得た上で、ベイズ定理を用いてリスクアレル保有数に基づく発症リスクを有する数確率(平均発症リスク、95%信用区間)を算出した。また、ベイズ定理を用いた確率密度関数の発症リスクを有する確率が70以上となる密度を範囲とする面積を算出し、70%以上の確率で発症するリスクの確率を示した。結果を図8に示す。
態様2と同様にして、個々のグループでの判定結果を得た上で、ベイズ定理を用いてリスクアレル保有数に基づく発症リスクを有する数確率(平均発症リスク、95%信用区間)を算出した。また、ベイズ定理を用いた確率密度関数の発症リスクを有する確率が70以上となる密度を範囲とする面積を算出し、70%以上の確率で発症するリスクの確率を示した。結果を図8に示す。
なお、ベイズ定理を用いた解析は、以下の手順に従って行った。
(a) 事前分布π(θ)は一様分布(無情報事前分布)とした。事前分布は、ベータ分布を採用した。
(b) 尤度は患者群および非患者群の全検体からランダムに、患者群680例と非患者群680例を選び、各リスクアレル保有数でのデータ数(観察数)と患者数(陽性数)から算出した。分布は二項分布を採用した。
(c) 事後分布は、ベイズの定理(事後分布π(θ|D)∝事前分布×尤度)より算出した。
(d) 事後分布から、平均発症リスク(%)、95%信用区間(%)、発症リスクを有する確率(%)を算出した。
(a) 事前分布π(θ)は一様分布(無情報事前分布)とした。事前分布は、ベータ分布を採用した。
(b) 尤度は患者群および非患者群の全検体からランダムに、患者群680例と非患者群680例を選び、各リスクアレル保有数でのデータ数(観察数)と患者数(陽性数)から算出した。分布は二項分布を採用した。
(c) 事後分布は、ベイズの定理(事後分布π(θ|D)∝事前分布×尤度)より算出した。
(d) 事後分布から、平均発症リスク(%)、95%信用区間(%)、発症リスクを有する確率(%)を算出した。
実施例3
実施例1及び2と用いるプローブが異なる以外は、実施例1と同様にしてデータ取得を行った。具体的には、下記表6-1~表6-2に示すプローブを用いた。
実施例1及び2と用いるプローブが異なる以外は、実施例1と同様にしてデータ取得を行った。具体的には、下記表6-1~表6-2に示すプローブを用いた。
(態様1)
上記表6-1~表6-2に示す120個のプローブ(コアSNP群12個、プールSNP群108個)全てを一度に用いて測定を行い、リスクアレルの総数をカウントした。実施例1と同様にして、リスクアレルの度数分布図とROC分析を行った結果を図9に示す。図9より、感度84.4%、特異度85.3%であるカットオフ値が141個の場合にAUCが0.929であり、度数分布図からも発症リスクを有する群と発症リスクを有さない群で区別がつくことが分かる。
上記表6-1~表6-2に示す120個のプローブ(コアSNP群12個、プールSNP群108個)全てを一度に用いて測定を行い、リスクアレルの総数をカウントした。実施例1と同様にして、リスクアレルの度数分布図とROC分析を行った結果を図9に示す。図9より、感度84.4%、特異度85.3%であるカットオフ値が141個の場合にAUCが0.929であり、度数分布図からも発症リスクを有する群と発症リスクを有さない群で区別がつくことが分かる。
(態様2)
次に、前記態様1で用いたプローブを40個ずつに分けて、測定ステップを測定ステップ1、測定ステップ2、測定ステップ3の3グループに分けて行い、リスクアレルの総数をカウントした。
次に、前記態様1で用いたプローブを40個ずつに分けて、測定ステップを測定ステップ1、測定ステップ2、測定ステップ3の3グループに分けて行い、リスクアレルの総数をカウントした。
得られた結果について、前記と同様にして、リスクアレルの度数分布図とROC曲線を取得した。結果を図10に示す。図10より、第1測定での結果が感度74.4%、特異度72.6%でのカットオフ値が44個であり、第2測定での結果が感度76.8%、特異度69.7%でのカットオフ値が48個であり、第3測定での結果が感度69.6%、特異度76.3%でのカットオフ値が50個であり、それぞれの測定における判定結果が得られることが分かった。
また、図11に、前記3測定の判定結果を統合した結果を示す。即ち、発症リスクを有する群・発症リスクを有さない群毎に、前記3測定の判定結果を分類した結果を示す。これより、発症リスクを有する群と発症リスクを有さない群で区別がつくことが分かる。
(態様3及び4)
態様2と同様にして、個々のグループでの判定結果を得た上で、実施例2と同様にして、平均発症リスク(%)、95%信用区間(%)、発症リスクを有する確率(%)を算出した。結果を図12に示す。これより、発症リスクを有する群と発症リスクを有さない群で区別がつくことが分かる。
態様2と同様にして、個々のグループでの判定結果を得た上で、実施例2と同様にして、平均発症リスク(%)、95%信用区間(%)、発症リスクを有する確率(%)を算出した。結果を図12に示す。これより、発症リスクを有する群と発症リスクを有さない群で区別がつくことが分かる。
実施例4
実施例1~3と用いるプローブが異なる以外は、実施例1と同様にしてデータ取得を行った。具体的には、下記表7-1~表7-2に示すプローブを用いた。
実施例1~3と用いるプローブが異なる以外は、実施例1と同様にしてデータ取得を行った。具体的には、下記表7-1~表7-2に示すプローブを用いた。
(態様1)
上記表7-1~表7-2に示す150個のプローブ(コアSNP群12個、プールSNP群138個)全てを一度に用いて測定を行い、リスクアレルの総数をカウントした。実施例1と同様にして、リスクアレルの度数分布図とROC分析を行った結果を図13に示す。図13より、感度89.0%、特異度84.9%であるカットオフ値が170個の場合にAUCが0.940であり、度数分布図からも発症リスクを有する群と発症リスクを有さない群で区別がつくことが分かる。
上記表7-1~表7-2に示す150個のプローブ(コアSNP群12個、プールSNP群138個)全てを一度に用いて測定を行い、リスクアレルの総数をカウントした。実施例1と同様にして、リスクアレルの度数分布図とROC分析を行った結果を図13に示す。図13より、感度89.0%、特異度84.9%であるカットオフ値が170個の場合にAUCが0.940であり、度数分布図からも発症リスクを有する群と発症リスクを有さない群で区別がつくことが分かる。
(態様2)
次に、前記態様1で用いたプローブを50個ずつに分けて、測定ステップを測定ステップ1、測定ステップ2、測定ステップ3の3グループに分けて行い、リスクアレルの総数をカウントした。
次に、前記態様1で用いたプローブを50個ずつに分けて、測定ステップを測定ステップ1、測定ステップ2、測定ステップ3の3グループに分けて行い、リスクアレルの総数をカウントした。
得られた結果について、前記と同様にして、リスクアレルの度数分布図とROC曲線を取得した。結果を図14に示す。図14より、第1測定での結果が感度75.3%、特異度74.3%でのカットオフ値が53個であり、第2測定での結果が感度69.6%、特異度78.4%でのカットオフ値が62個であり、第3測定での結果が感度75.6%、特異度70.4%でのカットオフ値が57個であり、それぞれの測定における判定結果が得られることが分かった。
また、図15に、前記3測定の判定結果を統合した結果を示す。即ち、発症リスクを有する群・発症リスクを有さない群毎に、前記3測定の判定結果を分類した結果を示す。これより、発症リスクを有する群と発症リスクを有さない群で区別がつくことが分かる。
(態様3及び4)
態様2と同様にして、個々のグループでの判定結果を得た上で、実施例2と同様にして、平均発症リスク(%)、95%信用区間(%)、発症リスクを有する確率(%)を算出した。結果を図16に示す。これより、発症リスクを有する群と発症リスクを有さない群で区別がつくことが分かる。
態様2と同様にして、個々のグループでの判定結果を得た上で、実施例2と同様にして、平均発症リスク(%)、95%信用区間(%)、発症リスクを有する確率(%)を算出した。結果を図16に示す。これより、発症リスクを有する群と発症リスクを有さない群で区別がつくことが分かる。
実施例5 ベイズ流アプローチによるマーカーSNPフィードバック改善ループ
実施例2又は実施例3又は実施例4の判定後の追跡研究により、広義POAGの発症および陰性の結果を得ることで、データの蓄積と更新(追加学習)を行う。追加学習は、追跡研究によって新たに得られた分類結果を用いてベイズの事前分布π(θ)を更新する。
・追跡研究により新たに得られたジェノタイプデータを従来の結果に加えた関連解析(アレルデータによるχ2検定)を実施し、プールSNPの入れ替えを実施する。また、入れ替えを実施する場合は、「情報取得工程」の各測定のROC分析の再計算による閾値の再設定を行い、「情報提供工程」におけるベイズの事前分布を忘却し、一様分布(無情報事前分布)として再計算する。
・データの蓄積と更新により、ジェノタイプデータを用いてアレルデータによるχ2検定の結果が変化した場合、マーカー候補SNPの入れ替えを実施する。
実施例2又は実施例3又は実施例4の判定後の追跡研究により、広義POAGの発症および陰性の結果を得ることで、データの蓄積と更新(追加学習)を行う。追加学習は、追跡研究によって新たに得られた分類結果を用いてベイズの事前分布π(θ)を更新する。
・追跡研究により新たに得られたジェノタイプデータを従来の結果に加えた関連解析(アレルデータによるχ2検定)を実施し、プールSNPの入れ替えを実施する。また、入れ替えを実施する場合は、「情報取得工程」の各測定のROC分析の再計算による閾値の再設定を行い、「情報提供工程」におけるベイズの事前分布を忘却し、一様分布(無情報事前分布)として再計算する。
・データの蓄積と更新により、ジェノタイプデータを用いてアレルデータによるχ2検定の結果が変化した場合、マーカー候補SNPの入れ替えを実施する。
本発明の方法により、被験者由来のDNA上の本発明のSNPのアレルを分析することにより、被験者の広義原発開放隅角緑内障の発症リスクの高低を判定することができる。このリスクに基づき被験者は広義原発開放隅角緑内障の予防措置を講じ、又は先制医療を含む適切な治療を受けることができる。また、本発明のSNPを用いて、広義原発開放隅角緑内障の発症リスクが高い者を選択して緑内障治療薬の臨床試験を行うことにより、緑内障治療薬の臨床試験の期間を短縮できるため、有用である。
10 判定装置
20 測定装置
30 コンピュータシステム
40 記録媒体
300 コンピュータ本体
301 入力部
302 表示部
310 CPU
311 ROM
312 RAM
313 ハードディスク
314 入出力インターフェイス
315 読出装置(読取装置)
316 通信インターフェイス
317 画像出力インターフェイス
318 バス
20 測定装置
30 コンピュータシステム
40 記録媒体
300 コンピュータ本体
301 入力部
302 表示部
310 CPU
311 ROM
312 RAM
313 ハードディスク
314 入出力インターフェイス
315 読出装置(読取装置)
316 通信インターフェイス
317 画像出力インターフェイス
318 バス
Claims (11)
- 被検者から採取した生体試料における一塩基多型(SNP)のアレル情報に基づいて、表1に記載の12個のコアSNP群と、表2に記載のプールSNP群から選ばれるSNP(プール選抜SNP群)とを合わせて少なくとも30個のSNPについて、アレルを測定するアレル測定工程、
前記アレルの測定結果に基づいて、前記被検者における広義原発開放隅角緑内障の発症リスクに関する情報を取得する情報取得工程、及び
前記で得られた情報に基づいて、前記被検者の広義原発開放隅角緑内障の発症リスクを判定するための情報を提供する情報提供工程
を含む、被検者の広義原発開放隅角緑内障の発症リスクの診断を補助する方法。 - アレル測定工程が、
コアSNP群から選ばれる1個以上のSNP(第1コアSNP群)と、プールSNP群から選ばれる複数のSNP(第1プール選抜SNP群)とを合わせて少なくとも30個のSNPを含む第1SNP群について測定を行う第1測定ステップと、
第1コアSNP群とは異なる1個以上のSNP(第2コアSNP群)と、プールSNP群から選ばれる複数のSNP(第2プール選抜SNP群)とを合わせて少なくとも30個のSNPを含む第2SNP群について測定を行う第2測定ステップ
を含む工程であり、
ここで、前記第1プール選抜SNP群と第2プール選抜SNP群とは非同一である、請求項1記載の方法。 - アレル測定工程が、
コアSNP群から選ばれる1個以上のSNP(第1コアSNP群)と、プールSNP群から選ばれる複数のSNP(第1プール選抜SNP群)とを合わせて少なくとも30個のSNPを含む第1SNP群について測定を行う第1測定ステップと、
第1コアSNP群とは異なる1個以上のSNP(第2コアSNP群)と、プールSNP群から選ばれる複数のSNP(第2プール選抜SNP群)とを合わせて少なくとも30個のSNPを含む第2SNP群について測定を行う第2測定ステップと、
第1コアSNP群及び第2コアSNP群とは異なる1個以上のSNP(第3コアSNP群)と、プールSNP群から選ばれる複数のSNP(第3プール選抜SNP群)とを合わせて少なくとも30個のSNPを含む第3SNP群について測定を行う第3測定ステップ
を含む工程であり、
ここで、前記第1プール選抜SNP群と第2プール選抜SNP群と第3プール選抜SNP群とはいずれも非同一である、請求項1記載の方法。 - 情報取得工程が、測定されたアレルがリスクアレルであるか否かを判別し、リスクアレルの総数をカウントするステップを含む工程である、請求項1~3いずれか記載の方法。
- 生体試料が、全血、全血球、白血球、リンパ球、血漿、血清、リンパ液、涙液、唾液、鼻汁、脳脊髄液、骨髄液、精液、汗、粘膜組織、皮膚組織、又は毛根である、請求項1~4いずれか記載の方法。
- 情報提供工程が、前記情報取得工程により得られた被検者に関する結果が、アレル測定工程で用いられたSNPに基づいて予めROC分析により定められたカットオフ値を、上回る場合は前記被検者が広義原発開放隅角緑内障を発症するリスクが高く、下回る場合は前記被検者が広義原発開放隅角緑内障を発症するリスクが低いとの情報を提供するステップを含む工程である、請求項1~5いずれか記載の方法。
- 情報提供工程が、前記アレル測定工程が複数の測定ステップを含む場合、前記情報取得工程により得られた被検者に関する各測定ステップでの結果が、各測定ステップで用いられたSNP群に基づいて予めROC分析により定められたカットオフ値を上回るか否かを指標として、前記被検者が広義原発開放隅角緑内障を発症するリスクの高低についての情報を提供するステップを含む工程である、請求項2~5いずれか記載の方法。
- 情報提供工程が、前記情報取得工程で得られた結果にベイズ定理を当てはめて、前記被検者が広義原発開放隅角緑内障の発症リスクを有する確率を算出するステップを含む工程である、請求項1~5いずれか記載の方法。
- 情報提供工程が、前記情報取得工程で得られた結果にベイズ定理を当てはめて、前記被検者の広義原発開放隅角緑内障を予め設定されたパーセント(%)以上の確率で発症リスクを有する確率を算出するステップを含む工程である、請求項1~5いずれか記載の方法。
- プロセッサ及び前記プロセッサの制御下にあるメモリを含むコンピュータを備え、前記メモリには、
被検者から採取した生体試料における一塩基多型(SNP)のアレル情報に基づいて、表1に記載の12個のコアSNP群と、表2に記載のプールSNP群から選ばれるSNP(プール選抜SNP群)とを合わせて少なくとも30個のSNPについて、アレルを測定するアレル測定工程、
前記アレルの測定結果に基づいて、前記被検者における広義原発開放隅角緑内障の発症リスクに関する情報を取得する情報取得工程、及び
前記で得られた情報に基づいて、前記被検者の広義原発開放隅角緑内障の発症リスクを判定するための情報を提供する情報提供工程
を前記コンピュータに実行させるためのコンピュータプログラムが記録されている、広義原発開放隅角緑内障の発症リスクを有する被検者の検出装置。 - プロセッサ及び前記プロセッサの制御下にあるメモリを含むコンピュータであって、
被検者から採取した生体試料における一塩基多型(SNP)のアレル情報に基づいて、表1に記載の12個のコアSNP群と、表2に記載のプールSNP群から選ばれるSNP(プール選抜SNP群)とを合わせて少なくとも30個のSNPについて、アレルを測定するアレル測定工程、
前記アレルの測定結果に基づいて、前記被検者における広義原発開放隅角緑内障の発症リスクに関する情報を取得する情報取得工程、及び
前記で得られた情報に基づいて、前記被検者の広義原発開放隅角緑内障の発症リスクを判定するための情報を提供する情報提供工程
を実行させる、コンピュータプログラム。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2018525042A JP7072803B2 (ja) | 2016-06-30 | 2017-06-15 | 広義原発開放隅角緑内障の発症リスクの判定方法 |
Applications Claiming Priority (2)
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JP2016-129954 | 2016-06-30 | ||
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Citations (7)
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-
2017
- 2017-06-15 WO PCT/JP2017/022157 patent/WO2018003523A1/ja active Application Filing
- 2017-06-15 JP JP2018525042A patent/JP7072803B2/ja active Active
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