CN108624650B - 判断实体瘤是否适合免疫治疗的方法和检测试剂盒 - Google Patents

判断实体瘤是否适合免疫治疗的方法和检测试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN108624650B
CN108624650B CN201810457196.5A CN201810457196A CN108624650B CN 108624650 B CN108624650 B CN 108624650B CN 201810457196 A CN201810457196 A CN 201810457196A CN 108624650 B CN108624650 B CN 108624650B
Authority
CN
China
Prior art keywords
hla
tumor
immunotherapy
peripheral blood
score
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201810457196.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN108624650A (zh
Inventor
韩玉卿
徐芹
李俊辉
张江生
王凯琳
蒲珏
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Lepu Medical Technology Beijing Co Ltd
Original Assignee
Lepu Medical Technology Beijing Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Lepu Medical Technology Beijing Co Ltd filed Critical Lepu Medical Technology Beijing Co Ltd
Priority to CN201810457196.5A priority Critical patent/CN108624650B/zh
Publication of CN108624650A publication Critical patent/CN108624650A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN108624650B publication Critical patent/CN108624650B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/106—Pharmacogenomics, i.e. genetic variability in individual responses to drugs and drug metabolism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明提供了一种用于判断患者中实体瘤是否适合进行免疫治疗的检测试剂盒，其包括分别用于检测如下指标的检测试剂：外周血循环肿瘤DNA的肿瘤突变负荷、HLA分型、HLA的杂合缺失状态、PD‑L1膜表达阳性的肿瘤细胞百分比、CD8+免疫细胞的浸润水平、FOXP3+免疫细胞的浸润水平、T细胞炎症相关基因的mRNA表达分值、外周血单个核细胞中CD14+CD16‑HLA‑DR+单核细胞的百分比、以及微卫星不稳定状态。相应地，本发明还提供了用于判断患者中实体瘤是否适合进行免疫治疗的方法。采用本发明的试剂盒和方法在对实体瘤患者进行筛选后，实现了客观反应率显著提升，在临床筛选适合进行免疫治疗的实体瘤患者方面具有广阔的应用前景。

Description

判断实体瘤是否适合免疫治疗的方法和检测试剂盒
技术领域
本发明涉及判断实体瘤是否适合免疫治疗的方法，尤其是采用多指标联合检测和逻辑斯谛回归模型来判断实体瘤是否适合免疫治疗的方法。本发明还涉及可用于该方法的检测试剂盒。
背景技术
肿瘤免疫治疗是近年来肿瘤治疗中最令人兴奋的发展，特别是PD-1/PD-L1免疫疗法已成为当今热门话题。虽然PD-1/PD-L1阻断剂已在临床上取得了较好的疗效和较高的耐受性，但是免疫检查点药物在临床应用时会出现显著的个体差异，不同患者对同一药物的药物敏感性不同。除在晚期霍奇金淋巴瘤中，PD-1阻断剂的客观反应率为60％外，在包括晚期非小细胞肺癌、晚期肾癌、晚期肝细胞肝癌、晚期胃癌在内的多种实体瘤中，客观反应率均不超过30％。
已有报道证实肿瘤细胞PD-L1的表达和肿瘤突变负荷可作为实体瘤中免疫治疗的患者筛选的生物标志物，但免疫系统对肿瘤的识别和杀伤是个复杂的过程：包括抗原递呈细胞对肿瘤新抗原的加工和呈递、免疫细胞转运至肿瘤病灶、免疫系统对肿瘤的识别和杀伤等。目前发现的生物标志物均是关注于局部事件，未从全局上对免疫系统识别和杀伤肿瘤能力进行评估。因此，亟需一种能够从全局上对免疫治疗的疗效进行更准确的预测的方法，以减少不必要的风险，并最大化患者收益。
发明内容
为了克服上述问题，本发明在一方面提供了一种用于判断患者中实体瘤是否适合进行免疫治疗的检测试剂盒，该检测试剂盒包括分别用于检测如下指标的检测试剂：外周血循环肿瘤DNA的肿瘤突变负荷、HLA分型、HLA的杂合缺失状态、PD-L1膜表达阳性的肿瘤细胞百分比、CD8+免疫细胞的浸润水平、FOXP3+免疫细胞的浸润水平、T细胞炎症相关基因的mRNA表达分值、外周血单个核细胞中CD14+CD16-HLA-DR+单核细胞的百分比、以及微卫星不稳定状态。
在一些实施方案中，所述T细胞炎症相关基因包括CXCR6、TIGIT、CD27、CD274、PDCD1LG2、LAG3、NKG7、PSMB10、CMKLR1、CD8A、IDO1、CCL5、CXCL9、HLA.DQA1、CD276、HLA.DRB1、STAT1、以及HLA.E。
在一些实施方案中，该检测试剂盒还包括利用所述指标的检测结果通过逻辑斯谛回归算法来判断所述患者中实体瘤是否适合进行免疫治疗的说明书。
另一方面，本发明还提供了一种判断患者中实体瘤是否适合免疫治疗的方法，包括：1)在所述患者中检测如下指标：外周血循环肿瘤DNA的肿瘤突变负荷、HLA分型、HLA的杂合缺失状态、PD-L1膜表达阳性的肿瘤细胞百分比、CD8+免疫细胞的浸润水平、FOXP3+免疫细胞的浸润水平、T细胞炎症相关基因的mRNA表达分值、外周血单个核细胞中CD14+CD16-HLA-DR+单核细胞的百分比、以及微卫星不稳定状态；以及2)根据步骤1)中所述指标的检测结果来判断所述实体瘤是否适合免疫治疗。
在一些实施方案中，该方法步骤2)包括利用步骤1)中所述指标的检测结果计算出用于判断所述实体瘤是否适合免疫治疗的评分，并将所述评分与预定值进行比较，当所述评分大于预定值时则认为所述实体瘤适合免疫治疗；当所述评分小于预定值时则认为所述实体瘤不适合免疫治疗。
在一些优选的实施方案中，所述评分的计算通过如下公式1逻辑斯谛回归算法进行：
Figure BDA0001659972270000021
其中，XOR＝β0+β1X1+β2X2+β2X3+β4X4+β5X5+β6X6+β7X7+β8X8+β9X9，X1至X9分别为所述指标的检测结果，β0为截距，β1至β9为回归系数；β0、β1至β9的具体值通过采用已知免疫治疗疗效的患者的所述指标的检测结果作为训练集并应用最大似然估计法获得。
在一些更优选的实施方案中，
XOR＝-2.183+0.129X1+1.035X2-0.866X3+5.217X4+1.009X5-0.35X6+0.944X7
+6.136X8+3.531X9；
其中：
X1为外周血循环肿瘤DNA的肿瘤突变负荷值；
X2为HLA分型：HLA分型为HLA-B44亚型时计为1；为HLA-B62亚型时，计为-1；为其它亚型时计为0；
X3为HLA的杂合缺失状态：为杂合缺失或纯合子时计为1；杂合时计为0；
X4为PD-L1膜表达阳性的肿瘤细胞百分比；
X5为肿瘤中CD8+免疫细胞的浸润值；
X6为肿瘤中FOXP3+免疫细胞的浸润值；
X7为18个T细胞炎症相关基因的mRNA表达分值，所述T细胞炎症相关基因包括CXCR6、TIGIT、CD27、CD274、PDCD1LG2、LAG3、NKG7、PSMB10、CMKLR1、CD8A、IDO1、CCL5、CXCL9、HLA.DQA1、CD276、HLA.DRB1、STAT1、以及HLA.E；
X8为外周血中CD14+CD16-HLA-DR+单核细胞的百分比；
X9为微卫星不稳定性状态：>20％的微卫星位点表现为不稳定，计为1；<20％的微卫星位点表现为不稳定，计为0。
在优选的实施方案中，所述免疫治疗疗效以客观反应率为主要指标。
在一些实施方案中，对HLA的杂合缺失状态的检测包括检测以下7个STR位点的纯合状态：D6S2852、D6S2872、D6S248、D6S1022、D6S265、D6S273、以及D6S1666。
在一些优选的实施方案中，所述免疫治疗为涉及PD-1和/或PD-L1的免疫治疗。
本发明采用多指标联合检测和逻辑斯谛回归模型来预测免疫疗法治疗疗效，从而判断实体瘤患者是否适合免疫治疗，在对实体瘤患者进行筛选后，实现了客观反应率显著提升。本发明的检测试剂盒和方法在临床筛选适合进行免疫治疗的实体瘤患者方面具有广阔的应用前景。
附图说明
图1显示了对外周血CtDNA的肿瘤突变负荷进行检测的示意流程图。
图2显示本发明逻辑斯谛回归模型的ROC曲线。
具体实施方式
除非另有说明，本文使用的所有技术和科学术语具有本领域普通技术人员所通常理解的含义。
本发明通过对实体瘤患者中多个指标的联合检测来判断该患者是否适合进行免疫治疗，这些检测指标包括：外周血循环肿瘤DNA的肿瘤突变负荷、HLA分型、HLA的杂合缺失状态、PD-L1膜表达阳性的肿瘤细胞百分比、CD8+免疫细胞的浸润水平、FOXP3+免疫细胞的浸润水平、T细胞炎症相关基因的mRNA表达分值、外周血单个核细胞中CD14+CD16-HLA-DR+单核细胞的百分比、以及微卫星不稳定状态。
外周血循环肿瘤DNA(即CtDNA)的肿瘤突变负荷指CtDNA每百万碱基中被检测出的基因非同义突变的个数，其范围可以从零至数百个，这些基因突变包括基因编码错误、碱基替换、基因插入或缺失错误。常用的检测方法包括从外周血提取DNA，并采用新一代测序(二代测序)直接鉴别DNA突变信息。
HLA(human leukocyte antigen)分型指鉴定个体HLA基因的基因型。HLA基因位于人6号染色体上短臂上，长约4000Kb。HLA是复杂的遗传多态性系统，有几十个基因座，每个基因座位又有几十个等位基因，且呈共显性表达。由于HLA基因位于同一条染色体上，其多基因座位上的基因型组合相对稳定，很少发生同源染色体间交换，这就构成了以单元型(haplotype)为特征的遗传。本发明中HLA分型尤其关注HLA-B44亚型和HLA-B62亚型。关于这两亚型的更详细说明，例如可参见C.Naugler，Origins and relatedness of humanleukocyte antigen class I allele supertypes.Human Immunology；2010,71:837–842。经典的HLA分型技术包括限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)、序列特异性寡核苷酸探针(PCR-SSO)、序列特异性引物(PCR-SSP)、以及直接测序分型(PCR-SBT)等。随着二代测序系统和相关数据处理软件的发展，其在HLA分型方面的应用也逐渐广泛。
HLA基因的杂合缺失状态是对肿瘤中相关HLA等位基因的SNP位点或区域的杂合性(heterozygosity)的鉴定。杂合缺失(loss of heterozygosity)指两等位基因中的一个或部分区域丢失而导致的杂合性改变。在肿瘤细胞中，杂合缺失常常导致抑癌基因的功能丧失。可以通过对特定位点短串联重复序列(short tandem repeat，STR)来检测杂合缺失状态。
程序性死亡分子1(PD-1)及其配体(PD-L1)是一对负性免疫共刺激分子。正常情况下，组织细胞表面的PD-L1与淋巴细胞表面的PD-1结合后，可抑制淋巴细胞功能，诱导活化的淋巴细胞凋亡，从而在自身免疫耐受及防止自身免疫性疾病中发挥重要作用。多种肿瘤细胞表面也表达PD-L1，可与肿瘤浸润淋巴细胞表面的PD-1分子结合，抑制淋巴细胞的功能及细胞因子的释放，并诱导淋巴细胞凋亡，从而抵抗淋巴细胞的杀伤作用，最终导致肿瘤发生免疫逃逸。对肿瘤中PD-L1膜表达阳性的肿瘤细胞百分比的检测通常采用免疫组化方法进行。例如，在手术或穿刺取得肿瘤组织切片后，通过抗PD-L1抗体偶联的显色剂显色来评价PD-L1的表达情况。
肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte,TIL)指从肿瘤组织中分离到的淋巴细胞。当肿瘤中存在大量浸润淋巴细胞时，可能表明机体启动了对抗肿瘤的免疫反应。TIL细胞的表型比较复杂，在大多数肿瘤中，TIL的细胞表型重点是CD3+。但随着肿瘤来源组织的不同，其它细胞表型的TIL可能也以相当的比例存在，这其中就包括本发明关注的CD8+和FOXP3+免疫细胞。对它们的检测，与上文PD-L1类似，也可以采用免疫组化方法进行。
T细胞炎症相关基因的mRNA表达分值用于考察T细胞炎症相关基因的表达情况。本发明选取的18个T细胞炎症相关基因以及如何计算其表达分值在下文实施例3中有详细说明。
对外周血单个核细胞中CD14+CD16-HLA-DR+单核细胞的百分比可以采用流式细胞术进行。
微卫星不稳定状态(microsatellite instability，MSI)指与正常组织相比，在肿瘤中某一微卫星由于重复单位的插入或缺失而造成的微卫星长度的任何改变，出现新的微卫星等位基因，其常由DNA复制时错配修复功能缺陷造成。对MSI的检测可以采用PCR法进行，例如，从肿瘤切片提取DNA，以一些微卫星点为标记指导合成引物进行PCR，再通过凝胶电泳分析得出MSI谱，进行比较分析。或者，也可以采用二代测序直接分析核苷酸序列的变化。
在一些实施方案中，上述9个指标的检测方法如下：利用靶区域捕获-二代测序对外周血循环肿瘤DNA的肿瘤突变负荷、微卫星不稳定性、HLA分型进行检测[1]；利用荧光PCR-毛细管电泳对HLA的杂合缺失状态检测[2]；利用免疫组织化学对肿瘤细胞表面PD-L1的表达、肿瘤组织中CD8+、FOXP3+免疫细胞的浸润进行检测[3]；利用基于外标品的Q-RT-PCR对T细胞炎症相关的基因的mRNA的表达绝对值进行检测[4]；利用流式细胞术对外周血中CD14+CD16-HLA-DR+单核细胞的百分比进行检测[5]。
以患者中上述多个指标的检测结果为基础，本发明提供了用于判断该患者实体瘤是否适合进行免疫治疗的方法。在一些实施方案中，该方法涉及以下式的逻辑斯谛回归数学模型对检测数据进行处理：
Figure BDA0001659972270000051
其中XOR＝β0+β1X1+β2X2+β2X3+β4X4+β5X5+β6X6+β7X7+β8X8+β9X9，X1至X9分别为所述多个指标的检测结果，β0为截距，β1至β9为回归系数。
通过整理公式1可得
Figure BDA0001659972270000052
其中POR/(1-POR)的值称为发生比，取值范围为0到∞，其值接近于0表示客观反应概率非常低，接近于∞则表示客观反应概率非常高。
对公式2两边同时取对数，可得
Figure BDA0001659972270000053
等式的左边称为对数发生比或分对数，于是，逻辑斯谛回归模型公式1可以视为对数变换下关于自变量XOR的一个多元线性模型。
可以通过采用已知免疫治疗疗效的患者的上述多个指标的检测结果作为训练集，并应用最大似然估计法获得β0至β9的具体值。
在一个优选的实施方案中，XOR＝-2.183+0.129X1+1.035X2-0.866X3+5.217X4+1.009X5-0.35X6+0.944X7+6.136X8+3.531X9，其中
X1为外周血循环肿瘤DNA的肿瘤突变负荷值，具体为样本DNA中每百万碱基出现的非同义突变个数，取值范围为零至数百，为连续型的自变量；
X2为HLA分型，HLA分型为HLA-B44亚型，计为1，HLA分型为HLA-B62亚型，计为-1，其它计为0，该自变量为3分类变量；
X3为HLA的杂合缺失状态：杂合缺失或纯合子计为1，杂合计为0，该自变量为二分类变量；
X4为PD-L1膜表达阳性的肿瘤细胞百分比，为连续的自变量，取值范围为0-100％；
X5为肿瘤组织中CD8+免疫细胞的浸润，取值范围通常为0-3，单位为千个细胞/mm2，为连续的自变量；
X6为肿瘤组织中FOXP3+免疫细胞的浸润，取值范围通常为0-2，单位为千个细胞/mm2，为连续的自变量；
X7为18个T细胞炎症相关的基因的mRNA表达分值，取值范围通常为1-3，为连续的自变量；
X8为外周血中CD14+CD16-HLA-DR+单核细胞的百分比，取值范围为0-50％，为连续的自变量；
X9为微卫星不稳定性状态，二代测序中，>20％的微卫星位点表现为不稳定，即为微卫星不稳定(MSI)，计为1；<20％的微卫星位点表现为不稳定，即微卫星稳定(MSS)，计为0。
本发明采用的逻辑斯谛回归数学模型可用于预测免疫疗法治疗疗效，对实体瘤患者进行筛选后，客观反应率提升显著，从而可以更好的用于治疗方式的选择。
对特定实体瘤患者，先测定这9个指标，对这些指标(即自变量)进行预处理变换，然后将变换后的值带入公式1，求得其POR，将POR与模型临界值(预定值)做比较，如果大于该临界值，则建议进行免疫疗法治疗。其中，模型临界值可通过绘制logit模型的受试者工作特征(ROC)曲线得到，而ROC曲线可针对训练集进行绘制。
本发明通过综合运用靶区域捕获测序、生物信息学分析、实验手段(免疫组织化学、Q-RT-PCR、荧光PCR-毛细管电泳)、疗效分析、数学模型多种方法，最终筛选出多个免疫治疗的疗效预测指标，并据此构建了用于预测免疫治疗疗效的数学模型。
本发明的方法选择外周血进行肿瘤突变负荷的检测，不仅可以做到无创检测，相比于组织肿瘤突变负荷检测，能更真实的反映免疫治疗前肿瘤突变负荷的真实状态；且可对无法进行手术或活检获得组织的患者进行肿瘤突变负荷检测。
本发明采用的数学模型采用多变量模型，整合并综合评估了与患者免疫状态相关的多个指标，有利于更好更精细的筛选有效人群。
本发明选择客观反应率作为疗效的主要指标，能够更快和更准确地评估免疫治疗的疗效。常用的疗效评价指标包括客观反应率、无疾病进展生存时间，以及总生存时间。总生存时间涵盖了从诊断明确到患者死亡的整个病程，是多种治疗综合作用的表现，影响因素众多，用于反映免疫疗法的疗效欠妥。无疾病进展生存时间表示从诊断明确到第一次肿瘤进展的时间，主要受到一线治疗方案的影响，而目前免疫疗法多用于非一线治疗，因此亦不考虑选用无疾病进展生存时间。而客观反应率是指按照RECIST标准肿瘤评估达到完全缓解或者部分缓解的比例，多数在治疗的前8周之内就能准确评估，较能反应免疫疗法治疗的效果，故而选为主要的疗效评估指标。
利用本发明提供的数学模型对免疫治疗人群进行筛选后，在多种实体瘤中，客观反应率从30％提高至80％，提升显著，从而可以更好的用于治疗方式的预测。
相应地，本发明还提供了判断患者中实体瘤是否适合进行免疫治疗的检测试剂盒。该试剂盒包括适用于检测上述9个指标的试剂，例如用于外周血CfDNA检测的DNA提取试剂，测序相关试剂，用于PD-L1、CD8、FOXP3分子检测的相关免疫组化试剂等。对于每个具体指标的检测，往往可以采用多种方式进行，因而，本发明的检测试剂盒也可以包括与这些检测方式相应的检测试剂，只要它们用于检测上述9个指标即可。本发明的检测试剂盒还可包括指导使用者检测这9个指标并且利用上述数学模型来判断患者是否适合进行免疫治疗的说明书。
以下通过具体实施例来进一步说明本发明。
实施例1突变负荷的检测
于2016年4月-2017年11月收集80例实体瘤患者的肿瘤组织的FFPE(甲醛固定石蜡包埋)样本和外周血。提取这80例实体瘤患者外周血CfDNA(循环游离DNA)和外周血基因组DNA，针对DNA进行测序文库的构建、杂交捕获、上机测序，对得到的测序数据进行生物信息学分析，流程可参见图1。根据以下公式4计算外周血CtDNA的肿瘤突变负荷。
突变负荷＝样本测定区域变异总数/靶区域大小 (公式4)
实施例2 HLA杂合缺失的检测
提取实施例1中所述80例实体瘤患者的肿瘤组织和配对的外周血基因组DNA，选取7个位于HLA基因所在基因组区域的多态性STR位点，利用荧光PCR-毛细管电泳检测7个STR位点的纯合状态(7个位点为D6S2852、D6S2872、D6S248、D6S1022、D6S265、D6S273、D6S1666)，每个位点的杂合缺失比率根据以下公式5计算。公式5中等位1为峰高变低的等位，杂合缺失比率高于0.4，则认为该位点发生杂合缺失，与外周血基因组DNA相比，有一个位点发生杂合缺失，则该样本HLA的状态为杂合缺失。
杂合缺失比率＝1-Ht值＝1-[外周血基因组DNA等位2的峰高/外周血基因
组DNA等位1的峰高]/[肿瘤组织基因组DNA等位2的峰高/肿瘤组织基因
组DNA等位1的峰高] (公式5)
实施例3计算18个T细胞炎症相关的基因的mRNA表达分值
提取实施例1中80例实体瘤患者的肿瘤组织的RNA，选取18个与T细胞炎症有关的基因(见表1)，反转录成cDNA，在cDNA样品中加入固定量的外标品。
利用Q-RT-PCR方法(基于taqman探针)检测18个与T细胞炎症相关的基因、1个内参基因β-actin、1个外标品的Ct值，计算每个基因的表达分值，然后求取平均数，该值即为18个T细胞炎症相关的基因的mRNA表达分值。以下以CXCR6基因为例阐述计算方法：CXCR6的绝对表达量＝外标品的绝对拷贝数*2-ΔΔCt，而ΔΔCt＝[Ct(CXCR6)-Ct(内参基因)]-[Ct(外标品)-Ct(参比基因)]，CXCR6的基因分值＝log10(CXCR6的绝对表达量/内参基因的绝对表达量)。
表1 T细胞炎症相关基因
基因名称 生物学功能
CXCR6 细胞因子/趋化因子
TIGIT 免疫调节分子
CD27 T细胞免疫维持
CD274 免疫调节分子
PDCD1LG2 T细胞免疫调节
LAG3 免疫调节分子
NHG7 NK细胞活性
PSMB10 细胞裂解
CMKLR1 细胞因子/趋化因子
CD8A T细胞的标志物
IDO1 免疫调节分子
CCL5 细胞因子/趋化因子
CXCL9 细胞因子/趋化因子
HLA.DQA1 抗原递呈
CD276 免疫调节分子
HLA.DRB1 抗原递呈
STAT1 T细胞免疫维持
HLA.E NK细胞活性
实施例4建立逻辑斯谛回归模型
测定实施例1中80例实体瘤患者的外周血循环肿瘤DNA的肿瘤突变负荷值、HLA分型、HLA杂合缺失状态、肿瘤组织中PD-L1膜表达阳性的肿瘤细胞百分比、肿瘤组织中CD8+免疫细胞的浸润、肿瘤组织中FOXP3+免疫细胞的浸润、18个T细胞炎症相关基因的mRNA表达分值、外周血中CD14+CD16-HLA-DR+单核细胞的百分比、微卫星不稳定性状态，以此作为训练集，应用R语言的逻辑斯谛回归模型得到客观反应率与每个自变量的关系的数学模型，利用极大似然法估计回归系数(见表2)，并绘制该模型的ROC曲线(见图2)，取约登指数(敏感度+特异度-1)最大时的界值为模型的界值。临界值为0.712。
表2逻辑斯谛回归模型的系数估计
自变量 系数 标准差 Z重统计量 P值
截距 -2.183 0.07 -22.05 ＜0.0001
X1 0.129 0.211 24.74 ＜0.0001
X2 1.035 0.85 -2.74 0.0128
X3 -0.866 0.236 3.68 0.0011
X4 5.217 0.365 -4.32 ＜0.0001
X5 1.009 0.001 18.56 ＜0.0001
X6 -0.35 0.05 12.35 ＜0.0001
X7 0.944 0.081 -9.88 0.0032
X8 6.136 0.401 3.51 ＜0.0001
X9 3.531 0.003 8.27 ＜0.0001
实施例5逻辑斯谛回归模型的验证
在30例实体瘤患者中对本发明的逻辑斯谛回归模型进行验证。检测30例实体瘤患者的上述9种指标。表3-6显示了这些指标检测结果的统计值。将每个样本的9个指标的值进行预处理，利用实施例4确定的逻辑斯谛回归模型计算POR，并将POR与临界值比较，大于临界值0.712，则预测该样本对抗PD-1单抗药物有客观反应。预测30例实体瘤患者有10例对抗PD-1单抗药物有客观反应，而实际临床用药观察发现预测出的10例实体瘤患者有8例具有较好的用药效果，准确率为80％；预测20例患者对抗PD-1单抗药物无反应，实际情况为：19例患者无反应，1例患者有反应。模型的真阳性率(true positive rate，TPR)的准确率为88.9％，模型预测结果的伪阴性率为95％。
表330例实体瘤患者6个指标的检测结果统计
Figure BDA0001659972270000101
表430例实体瘤患者HLA分型的检测结果统计
HLA类型 样本数 占比
B44亚型 8 26.7％
B62亚型 3 10％
其它 19 63.3％
表530例实体瘤患者HLA杂合缺失状态检测结果统计
HLA杂合缺失状态 样本数 占比
杂合缺失 10 33.3％
杂合保留 20 66.7％
表630例实体瘤患者MSI状态检测结果统计
MSI状态 样本数 占比
MSI-H 2 6.7％
MSI-L或MSS 28 93.3％
本发明所属领域技术员应理解，以上具体实施例描述的方法和材料，仅是示例性的，而不应视为限定本发明的范围。
参考文献：
[1]A hybridization capture-based next-generation sequencing clinicalassay fbr solid tumortumor molecular oncology.J Mol Diagn；2015，17(3)，251-264.
[2]Loss of heterozygosity at the human leukocyte antigen locus inthymic epithelial tumors.Thorac Cancer；2015，6(6)：749-753
[3]PD-1 blockade induces responses by inhibiting adaptive immuneresistance Nature；2014，515(7528)：568-571
[4]IFN-γ-related mRNA profile predicts clinical response to PD-1blockade.J Clin Invest；2017，127(8)：2930-2940.
[5]High-dimensional single-cell analysis predicts responsetoanti-PD-1immunotherapy.2017，Nat Med；24(2)：144-153.

Claims (1)

1.用于检测如下指标的检测试剂在制备用于判断患者中实体瘤是否适合进行免疫治疗的检测试剂盒中的应用：外周血循环肿瘤DNA的肿瘤突变负荷、HLA分型、HLA的杂合缺失状态、PD-L1膜表达阳性的肿瘤细胞百分比、CD8+免疫细胞的浸润水平、FOXP3+免疫细胞的浸润水平、T细胞炎症相关基因的mRNA表达分值、外周血单个核细胞中CD14+CD16-HLA-DR+单核细胞的百分比、以及微卫星不稳定状态，
其中所述T细胞炎症相关基因为CXCR6、TIGIT、CD27、CD274、PDCD1LG2、LAG3、NKG7、PSMB10、CMKLR1、CD8A、IDO1、CCL5、CXCL9、HLA.DQA1、CD276、HLA.DRB1、STAT1、以及HLA.E；所述HLA的杂合缺失状态为以下7个STR位点的纯合状态：D6S2852、D6S2872、D6S248、D6S1022、D6S265、D6S273、以及D6S1666；
其中利用所述指标的检测结果计算出用于判断所述实体瘤是否适合免疫治疗的评分，并将所述评分与预定值进行比较，当所述评分大于预定值时则认为所述实体瘤适合免疫治疗；当所述评分小于预定值时则认为所述实体瘤不适合免疫治疗；
其中所述评分的计算通过如下公式1逻辑斯谛回归算法进行：
Figure FDA0003548489250000011
其中XOR＝-2.183+0.129X1+1.035X2-0.866X3+5.217X4+1.009X5-0.35X6+0.944X7+6.136X8+3.531X9，其中：
X1为外周血循环肿瘤DNA的肿瘤突变负荷值；
X2为HLA分型：HLA分型为HLA-B44亚型时计为1；为HLA-B62亚型时，计为-1；为其它亚型时计为0；
X3为HLA的杂合缺失状态：为杂合缺失或纯合子时计为1；杂合时计为0；
X4为PD-L1膜表达阳性的肿瘤细胞百分比；
X5为肿瘤中CD8+免疫细胞的浸润值；
X6为肿瘤中FOXP3+免疫细胞的浸润值；
X7为18个所述T细胞炎症相关基因的mRNA表达分值；
X8为外周血中CD14+CD16-HLA-DR+单核细胞的百分比；以及
X9为微卫星不稳定性状态：>20％的微卫星位点表现为不稳定，计为1；<20％的微卫星位点表现为不稳定，计为0；
其中所述免疫治疗为涉及PD-1和/或PD-L1的免疫治疗。
CN201810457196.5A 2018-05-14 2018-05-14 判断实体瘤是否适合免疫治疗的方法和检测试剂盒 Active CN108624650B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810457196.5A CN108624650B (zh) 2018-05-14 2018-05-14 判断实体瘤是否适合免疫治疗的方法和检测试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810457196.5A CN108624650B (zh) 2018-05-14 2018-05-14 判断实体瘤是否适合免疫治疗的方法和检测试剂盒

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN108624650A CN108624650A (zh) 2018-10-09
CN108624650B true CN108624650B (zh) 2022-04-29

Family

ID=63693083

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810457196.5A Active CN108624650B (zh) 2018-05-14 2018-05-14 判断实体瘤是否适合免疫治疗的方法和检测试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN108624650B (zh)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109949862A (zh) * 2019-03-13 2019-06-28 拓普基因科技（广州）有限责任公司 一种血液ctDNA的微卫星不稳定性检测方法
CN109988838A (zh) * 2019-03-28 2019-07-09 厦门艾德生物医药科技股份有限公司 一种可对肿瘤靶向治疗相关靶点和免疫治疗相关tmb及msi同时进行检测的体系
CN110172510A (zh) * 2019-04-30 2019-08-27 北京组学生物科技有限公司 用于乳腺癌的试剂体系和试剂盒及其应用
WO2021202917A1 (en) * 2020-04-01 2021-10-07 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University A noninvasive multiparameter approach for early identification of therapeutic benefit from immune checkpoint inhibition for lung cancer
CN112885406B (zh) * 2020-04-16 2023-01-31 深圳裕策生物科技有限公司 检测hla杂合性缺失的方法及系统
CN111863126B (zh) * 2020-05-28 2024-03-26 上海市生物医药技术研究院 构建结直肠肿瘤状态评估模型的方法及应用
CN113125751B (zh) * 2021-04-12 2022-11-08 首都医科大学附属北京世纪坛医院 外周血pd-1/pd-l1预测乳腺癌肿瘤组织中pd-l1水平的方法
CN114231628A (zh) * 2021-12-03 2022-03-25 无锡臻和生物科技有限公司 预测胃肠肿瘤免疫检查点抑制剂疗效的标志物组合及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101068936A (zh) * 2004-11-22 2007-11-07 惠氏公司 用于实体瘤预后及治疗的方法和系统
CN103384827A (zh) * 2010-11-24 2013-11-06 伊玛提克斯生物技术有限公司 用于预测癌症免疫治疗效果的生物标记

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101068936A (zh) * 2004-11-22 2007-11-07 惠氏公司 用于实体瘤预后及治疗的方法和系统
CN103384827A (zh) * 2010-11-24 2013-11-06 伊玛提克斯生物技术有限公司 用于预测癌症免疫治疗效果的生物标记

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Allele-Specific HLA Loss and Immune Escape in Lung Cancer Evolution;Nicholas McGranahan et al.;《cell》;20171026;第171卷;摘要，方法 *
High-dimensional single-cell analysis predicts response to anti-PD-1 immunotherapy;Carsten Krieg et al.;《nature medicine》;20180108;第24卷(第2期);摘要 *
IFN-γ–related mRNA profile predicts clinical response to PD-1 blockade;Mark Ayers et al.;《The Journal of Clinical Investigation》;20170831;第127卷(第8期);摘要，图4 *
Loss of heterozygosity at the human leukocyte antigen locus in thymic epithelial tumors;Yuan Chen et al.;《Thorac Cancer》;20151231;第6卷;摘要 *
深度解读肿瘤免疫治疗的三驾马车及Biomarker研究（网址：www.seqchina.cn/5560.html）;陈初夏;《测序中国》;20180319;说明书第4-5页 *
肿瘤免疫治疗标志物的研究进展;邹建玲等;《中国医学前沿杂志（电子版）》;20171231;第9卷(第10期);第23页第2段 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN108624650A (zh) 2018-10-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN108624650B (zh) 判断实体瘤是否适合免疫治疗的方法和检测试剂盒
JP7368483B2 (ja) 相同組換え欠損を推定するための統合された機械学習フレームワーク
EP2925885B1 (en) Molecular diagnostic test for cancer
EP2715348B1 (en) Molecular diagnostic test for cancer
TWI798718B (zh) Dna混合物中組織之單倍型甲基化模式分析
CA3180334A1 (en) Methods for detection of donor-derived cell-free dna
JP7241352B2 (ja) 肺扁平上皮癌のサブタイピングのための方法
JP2015536639A5 (zh)
KR101672531B1 (ko) 조기 유방암 예후 예측 진단용 유전자 마커 및 이의 용도
WO2017156290A1 (en) A novel algorithm for smn1 and smn2 copy number analysis using coverage depth data from next generation sequencing
JP2012507798A (ja) 遺伝子コピー数の変化のパターンに基づいた結腸直腸癌のゲノム分類
Dey-Rao et al. Genome-wide transcriptional profiling of chronic cutaneous lupus erythematosus (CCLE) peripheral blood identifies systemic alterations relevant to the skin manifestation
Liu et al. A forward look at noninvasive prenatal testing
EP3825417A2 (en) Tissue molecular signatures of kidney transplant rejections
EP3574113A1 (en) Improved methods for assessing risk of developing breast cancer
JP5608169B2 (ja) 遺伝子コピー数の変化のパターンに基づいた悪性メラノーマのゲノム分類
CN114891876A (zh) 一种诊断高度近视的功能基因组区生物标志物组合
US9845504B2 (en) Method for treating rheumatoid arthritis with agents that recognize the B-lymphocyte CD20 membrane receptor
CN111254196A (zh) Inpp4b基因变异在预测非小细胞肺癌患者对免疫检查点抑制剂疗法敏感性中的应用
KR20180007291A (ko) 암 리스크를 검출하는 방법
CN113168885A (zh) 用于体细胞突变的方法和系统及其用途
US20080140320A1 (en) Biometric analysis populations defined by homozygous marker track length
US20110301055A1 (en) Methods for determining a prognosis in multiple myeloma
JP2023546240A (ja) 疾患を発症するリスクを評価する方法
US20190002981A1 (en) Method of Testing for Preeclampsia and Treatment Therefor

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant