[相關申請案之交叉參考]
本申請案主張2015年7月20日申請之名稱為「Methylation Pattern Analysis Of Haplotypes In Tissues In A DNA Mixture」之美國臨時申請案第62/194,702號之優先權,其全部內容出於所有目的以引用的方式併入本文中。
術語
「甲基化組」提供基因組中複數個位點或基因座之DNA甲基化量的量度。甲基化組可對應於所有基因組、基因組之大部分或基因組之相對較小部分。所關注的甲基化組之實例為可將DNA貢獻至體液(例如血漿、血清、汗液、唾液、尿液、生殖器分泌物、精液、糞便流體、腹瀉流體、腦脊髓液、胃腸道分泌物、腹水流體、胸膜液、眼內流體、來自水囊腫(例如睾丸)之流體、來自包囊之流體、胰臟分泌物、腸道分泌物、痰、眼淚、來自乳房及甲狀腺之抽吸流體等)中之器官之甲基化組(例如腦細胞、骨骼、肺、心臟、肌肉及腎等之甲基化組)。器官可為移植器官。胎兒之甲基化組為另一實例。
「血漿甲基化組」為自動物(例如人類)之血漿或血清測定之甲基化組。血漿甲基化組為游離甲基化組之一個實例,因為血漿及血清包括游離DNA。血漿甲基化組亦為混合甲基化組之實例,因為其為胚胎/母體甲基化組或腫瘤/患者甲基化組或衍生自背景或器官移植中之不同組織或器官或供體/受體甲基化組之DNA的混合物。
「位點」(亦稱作「基因組位點」)對應於單一位點,其可為單一鹼基位置或相關鹼基位置群,例如CpG位點或相關鹼基位置之較大群。「基因座」可對應於包括多個位點之區域。基因座可僅包括一個位點,此將使得基因座在該背景下等效於一個位點。
各基因組位點(例如CpG位點)之「甲基化指數」可指在該位點顯示甲基化之DNA片段(例如如測定自序列讀數或探針)相對於覆蓋該位點之讀數總數之比例。「讀數」可對應於獲自DNA片段之資訊(例如位點之甲基化狀態)。讀數可使用優先雜交至特定甲基化狀態之DNA片段之試劑(例如引物或探針)獲得。通常,此類試劑在藉由取決於DNA分子之甲基化狀態不同地修飾或不同地識別DNA分子之方法,例如亞硫酸氫鹽轉化,或甲基化敏感限制酶,或甲基化結合蛋白,或抗甲基胞嘧啶抗體,或識別甲基胞嘧啶及羥甲基胞嘧啶之單分子定序技術處理後施用。
區域之「甲基化密度」可指顯示甲基化之區域內之位點之讀數數目除以覆蓋區域中之位點之讀數總數。位點可具有特定特徵,例如為CpG位點。因此,區域之「CpG甲基化密度」可指顯示CpG甲基化之讀數數目除以覆蓋區域中之CpG位點(例如特定CpG位點、CpG島或較大區域內之CpG位點)之讀數總數。舉例而言,人類基因組中每100 kb分區(bin)之甲基化密度可自亞硫酸氫鹽處理之後於CpG位點未轉化之胞嘧啶(其對應於甲基化胞嘧啶)的總數測定為映射至100 kb區域之序列讀數所覆蓋之所有CpG位點的比例。此分析亦可對於其他分區大小,例如500 bp、5 kb、10 kb、50 kb或1 Mb等進行。區域可為整個基因組或染色體或染色體之一部分(例如染色體臂)。當區域僅僅包括CpG位點時,CpG位點之甲基化指數與區域之甲基化密度相同。「甲基化胞嘧啶之比例」可指相比於分析之胞嘧啶殘基總數展示為甲基化(例如在亞硫酸氫鹽轉化之後未經轉化)之胞嘧啶位點「C」之數目,即包括區域中除CpG背景之外的胞嘧啶。甲基化指數、甲基化密度及甲基化胞嘧啶之比例為「甲基化程度」之實例。除亞硫酸氫鹽轉化之外,熟習此項技術者已知之其他方法可用於查詢DNA分子之甲基化狀態,包括(但不限於)對甲基化狀態敏感之酶(例如甲基化敏感限制酶)、甲基化結合蛋白、使用對甲基化狀態敏感之平台之單分子定序(例如奈米孔定序(Schreiber等人 Proc Natl Acad Sci 2013; 110: 18910-18915)及藉由Pacific Biosciences單分子實時分析(Flusberg等人 Nat Methods 2010; 7: 461-465))。
「甲基化圖譜」(亦稱為甲基化狀態)包括與區域之DNA甲基化有關之資訊。與DNA甲基化有關之資訊可包括(但不限於)CpG位點之甲基化指數、區域中CpG位點之甲基化密度、相鄰區域上CpG位點的分佈、含有超過一個CpG位點之區域內各個別CpG位點之甲基化模式或程度以及非CpG甲基化。基因組之大部分甲基化圖譜可視為等效於甲基化組。哺乳動物基因組中之「DNA甲基化」通常係指添加甲基至CpG二核苷酸中之胞嘧啶殘基的5'碳(即5-甲基胞嘧啶)。DNA甲基化可在例如CHG和CHH之其他情況下發生於胞嘧啶中,其中H為腺嘌呤、胞嘧啶或胸腺嘧啶。胞嘧啶甲基化亦可呈5-羥甲基胞嘧啶形式。亦報導非胞嘧啶甲基化,如N
6
-甲基腺嘌呤。
「甲基化感測定序」係指允許吾人在定序方法期間確定DNA分子之甲基化狀態的任何定序方法,包括(但不限於)亞硫酸氫鹽定序、或定序前甲基化敏感限制酶消化、使用抗-甲基胞嘧啶抗體或甲基化結合蛋白之免疫沈澱或可說明甲基化狀態之單分子定序。
「組織」對應於一群細胞,其共同歸類為一個功能單元。單一組織中可發現超過一種類型的細胞。不同類型之組織可由不同類型之細胞(例如肝細胞、肺泡細胞或血細胞)組成,但亦可對應於來自不同生物體(母親與胎兒)的組織或對應於健康細胞與腫瘤細胞。「參考組織」對應於用於測定組織特異性甲基化程度之組織。來自不同個體之相同組織類型之多個樣品可用於測定該組織類型之組織特異性甲基化程度。
「生物樣品」係指獲自個體(例如人類,如懷孕女性、患有癌症之個體或疑似患有癌症之個體、器官移植受體或疑似具有涉及器官(例如心肌梗塞中之心臟、或中風中之大腦、或貧血中之造血系統)之疾病過程之個體)且含有一或多個所關注的核酸分子之任何樣品。生物樣品可為體液,如血液、血漿、血清、尿液、陰道流體、來自水囊腫(例如睾丸)之流體、或陰道沖洗流體、胸膜液、腹水流體、腦脊髓液、唾液、汗液、淚液、痰、支氣管肺泡灌洗術流體等。亦可使用糞便樣品。在各種實施例中,游離DNA已增濃之生物樣品(例如經由離心方案獲得的血漿樣品)中之大部分DNA可游離(與細胞相對),例如大於50%、60%、70%、80%、90%、95%或99%。離心方案可包括3,000 g×10分鐘、獲得流體部分及再在30,000 g下再離心10分鐘以移除殘餘細胞。
術語「癌症程度」可指是否存在癌症(亦即存在或不存在)、癌症階段、腫瘤尺寸、是否存在轉移、身體總腫瘤負荷,及/或癌症嚴重度之其他量度(例如癌症復發)。癌症程度可為數字或其他標誌,諸如符號、字母表字母及顏色。程度可為零。癌症程度亦包括與突變或多種突變相關的癌變前或癌前期病狀(狀態)。可以各種方式使用癌症程度。舉例而言,篩選可檢查已知先前未患癌症之某人是否存在癌症。評估可調查已診斷患有癌症之某人以監測癌症隨時間之進展,研究治療有效性或確定預後。在一個實施例中,預後可用患者死於癌症之機率或特定期限或時間之後癌症進展之機率或癌症轉移之機率表示。偵測可意謂『篩選』或可意謂檢查暗示有癌症特徵(例如症狀或其他陽性測試)的某人是否患有癌症。
術語染色體區域之「序列不平衡」可在生物體健康之情況下指呈相對於期望值之來自染色體區域之游離之DNA分子之量的任何顯著偏差。舉例而言,染色體區域可展現某一組織中之擴增或缺失,進而導致DNA混合物(含有與來自其他組織之DNA混合之來自組織之DNA)中之染色體區域之序列不平衡。舉例而言,期望值可獲自另一樣品或獲自假設正常之另一染色體區域(例如代表二倍體生物體之兩個複本之量)。染色體區域可由多個不相交子區組成。
基因組基因座(標記物)之「類型」對應於基因座跨越組織類型之特定屬性。說明書主要係指I型基因座及II型基因座,其特性詳細提供於下文。給定類型之基因座可具有跨越組織類型之甲基化程度之特定統計變化。基因組基因座(標記物)之「類別」對應於跨越相同組織類型之不同個體之基因座之甲基化程度之特定變化。一組基因座(標記物)可由任何數目的各種類型及/或類別之基因座組成。因此,一組基因座對應於針對特定量測值選擇之基因座且不暗示組中之基因座之任何特定特性。
「分離值」對應於涉及兩個值,例如兩個百分比貢獻或兩個甲基化程度之差值或比率。分離值可為簡單差值或比率。分離值可包括其他係數,例如相乘係數。作為其他實例,可使用該等值之函數的差值或比率,例如兩個值之自然對數(ln)的差值或比率。分離值可包括差值及比率。
如本文所用,術語「
分類
」係指與樣品之特定特性相關之任何數字或其他字符。舉例而言,符號「+」(或字語「正性」)可表示樣品歸類為具有缺失或擴增。分類可為二元(例如正性或負性)或具有更多分類層級(例如1至10或0至1之標度)。術語「
閾值
」及「
臨限值
」係指使用於操作之預定數字。臨限值可為高於或低於特定分類適用之值。可在此等上下文中之任一者中使用此等術語中之任一者。
DNA混合物(例如血漿)中之組織類型(例如胚胎組織、肝臟等)之間的甲基化差異可用於區分特定組織類型組織單倍型之特性。舉例而言,懷孕女性之血漿中之兩個母體單倍型之甲基化程度可用於確定何種單倍型自母親遺傳至胎兒。作為另一實例,胚胎組織中之兩個單倍型之甲基化程度可用於偵測胎兒中之序列不平衡(例如非整倍性)。亦可分析其他組織類型,例如用以偵測特定組織類型中之疾病病況。亦可測定拷貝數變異所發源之組織類型。
一些實施例可使用特定組織類型之某些基因組位點之已知甲基化程度自各種組織類型測定血漿(或其他DNA混合物)中之游離DNA之百分比。舉例而言,可對於肝臟樣品量測基因組位點之甲基化程度,且此等組織特異性甲基化程度可用於測定混合物中之多少游離DNA來自肝臟。可量測對DNA混合物提供重大貢獻之組織類型之甲基化程度,以使得可計算游離DNA混合物之優勢(例如大於90%、95%或99%)。此類其他樣品可包括(但不限於)以下中的一些或全部:肺、結腸、小腸、胰臟、腎上腺、食道、脂肪組織、心臟及大腦。
解卷積方法可用於測定已知組織特異性甲基化程度之組織類型中之每一者之百分比貢獻(例如百分比)。在一些實施例中,線性方程組可自已知組織特異性甲基化程度及指定基因組位點之混合物甲基化程度產生,且可測定(例如使用最小平方)最佳近似量測之混合物甲基化程度之百分比貢獻。
一旦測定百分比貢獻,百分比貢獻可用於各種目的。舉例而言,胚胎組織之百分比貢獻差異可用於測定自親體遺傳何種單倍型。可對於兩個親體單倍型中之每一者測定一或多個雜合基因座處之等位基因。一或多個雜合基因座處之游離DNA可用於測定兩個百分比貢獻:各單倍型各一個。舉例而言,具有第一單倍型之等位基因之游離之DNA分子可用於測定第一百分比貢獻,且具有第二單倍型之等位基因之游離之DNA分子可用於測定第二百分比貢獻。遺傳之單倍型將對應於胚胎組織之較高百分比貢獻。
另外,遺傳之單倍型將由於胚胎游離DNA之一般低甲基化而具有較低甲基化程度。可比較兩個單倍型之甲基化程度,且具有較低甲基化程度之單倍型可鑑別為遺傳之單倍型。
作為另一實例,可在胎兒之目標染色體區域中偵測到序列不平衡。可測定目標染色體區域中之第一單倍型之混合物中之胚胎組織類型之目標百分比貢獻。類似地,可測定參考染色體區域之胚胎組織類型之參考百分比貢獻。兩個貢獻之間的分離值可相比於臨限值以確定胎兒是否具有序列不平衡(例如非整倍性)。
作為另一實例,第一單倍型可具有特異於健康細胞或異常細胞之簽名。針對第一單倍型測定之百分比貢獻於參考百分比貢獻之間的分離值可相比於臨限值以確定第一組織類型是否具有疾病病況之分類。作為實例,第一單倍型可為移植器官或腫瘤,或僅在健康細胞中且不再移植器官或腫瘤中。疾病病況可為移植器官是否經排斥,或腫瘤是否尺寸增加或轉移(例如在不移除所有腫瘤之手術之後)。
作為另一實例,拷貝數變異之組織來源可使用甲基化解卷積測定。第一染色體區域可鑑別為展現拷貝數變異。對於M個組織類型中之每一者,可測定第一染色體區域中之兩個單倍型之百分比貢獻之間的對應分離值。具有最高分離值之組織類型可鑑別為源組織。
首先描述甲基化解卷積,且接著描述甲基化標記之選擇及甲基化解卷積之精確性。接著描述百分比貢獻用於測定胚胎基因組部分之用途。
I.根據甲基化解卷積之DNA混合物之組成
不同組織類型可對於基因組位點具有不同甲基化程度。此等差異可用於測定混合物中來自各種組織類型之DNA之百分比貢獻。因此,可藉由組織特異性甲基化模式分析測定DNA混合物之組成。以下實例論述甲基化密度,但可使用其他甲基化程度。
A . 單一基因組位點
甲基化解卷積之原理可使用單一甲基化基因組位點(甲基化標記物)測定來自生物體之DNA混合物之組成而說明。假定組織A對於基因組位點完全甲基化,即100%之甲基化密度(MD)且組織B完全未甲基化,即0%之MD。在此實例中,甲基化密度係指CpG二核苷酸在所關注的區域中經甲基化之背景下之胞嘧啶殘基之百分比。
若DNA混合物C由組織A及組織B組成且DNA混合物C之總甲基化密度為60%,則吾人可根據下式推論組織A及B對DNA混合物C之比例貢獻:
MD
C
= MD
A
× α + MD
B
× b,
其中
MDA
、
MDB
、
MDC
分別表示組織A、組織B及DNA混合物C之MD;且a及b為組織A及B對DNA混合物C之比例貢獻。在此特定實例中,假定組織A及B為DNA混合物僅有的兩種成分。因此,a+b=100%。因此據計算,組織A及B分別對DNA混合物貢獻60%及40%。
組織A及組織B中之甲基化密度可獲自生物體樣品或獲自相同類型之其他生物體(例如其他人類,潛在地為相同亞群)之樣品。若使用來自其他生物體之樣品,則組織A之樣品之甲基化密度之統計分析(例如平均值、中值、幾何平均值)可用於獲得甲基化密度
MDA
,且對於
MDB
情況類似。
可選擇基因組位點以具有最小個體間變化,例如小於變化之特定絕對量或在測試之基因組位點之最低部分內。舉例而言,對於最低部分,實施例可僅選擇測試之一群基因組位點中具有變化之最低10%之基因組位點。其他生物體可獲自健康個人,以及患有特定生理病況之個人(例如懷孕女性、或不同年齡的人或特定性別的人),其可對應於包括測試的當前生物體之特定亞群。
亞群之其他生物體亦可具有其他病理學病況(例如患有肝炎或糖尿病等的患者)。此類亞群可對於各種組織具有改變的組織特異性甲基化模式。除使用正常組織之甲基化模式以外,此類疾病病況下之組織之甲基化模式可用於解卷積分析。此解卷積分析可在測試來自患有彼等病況之此類亞群之生物體時較精確。舉例而言,硬化肝或纖維化腎可具有分別相比於正常肝臟及正常腎臟之不同甲基化模式。因此,若對於肝硬化患者篩選其他疾病,則可較精確的是包括硬化肝作為向血漿DNA貢獻DNA之候選物中的一者,連同其他組織類型之健康組織。
B . 多個基因組位點
當存在更多潛在候選組織時,更多基因組位點(例如10個或大於10個)可用於測定DNA混合物之構成。DNA混合物之比例組成之評估精確性取決於多種因素,包括基因組位點數目、基因組位點(亦稱作「位點」)對特定組織之特異性及跨越不同候選組織及跨越用於測定參考組織特異性程度之不同個體之位點變化性。位點對組織之特異性係指特定組織於其他組織類型之間的基因組位點之甲基化密度差異。
其甲基化密度之間的差異愈大,位點將對特定組織愈具特異性。舉例而言,若位點在肝臟中完全甲基化(甲基化密度=100%)且在所有其他組織中完全未甲基化(甲基化密度=0%),則此位點將對肝臟具有高度特異性。然而,跨越不同組織之位點變化性可由例如(但不限於)不同類型的組織中之位點之甲基化密度之範圍或標準差反映。較大範圍或較高標準差將允許在數學上更確切及精確地測定不同器官對DNA混合物之相對貢獻。此等因素對估計候選組織對DNA混合物之比例貢獻之精確性的影響說明於本申請案之隨後部分中。
此處,吾人使用數學方程式以說明不同器官對DNA混合物之比例貢獻的推演。DNA混合物中之不同位點之甲基化密度與不同組織中之對應位點之甲基化密度之間的數學關係可表示為:
,
其中
表示DNA混合物中之位點i之甲基化密度;
pk
表示組織k對DNA混合物之比例貢獻;
MDik
表示組織k中之位點i之甲基化密度。當位點數目與器官數目相同或大於該數目時,可測定個別
pk
之值。組織特異性甲基化密度可獲自其他個體,且可選擇位點以具有最小個體間變化,如上所述。
額外標準可包括於算法中以改良精確性。舉例而言,所有組織之聚集貢獻可受限於100%,即
。
此外,所有器官之貢獻可需要為非負的:
由於生物學變異,觀測之總體甲基化模式可能與推論自組織之甲基化之甲基化模式不完全相同。在此類情況下,將需要數學分析以測定個別組織之最可能的比例貢獻。就此而言,DNA中觀測之甲基化模式於自組織推論之甲基化模式之間的差值藉由W指示。
其中O為對於DNA混合物觀測之甲基化模式且
Mk
為個別組織k之甲基化模式。
pk
為組織k對DNA混合物之比例貢獻。各
pk
之最可能的值可藉由使W最小化測定,其為觀測與推論之甲基化模式之間的差值。此方程式可使用數學算法求解,例如藉由(但不限於)使用二次規劃、線性/非線性回歸、期望最大化(EM)算法、最大似然性算法、最大後驗評估及最小平方方法。
C . 甲基化解卷積方法
如上文所述,可分析包括來自生物體之游離之DNA分子之混合物的生物樣品以測定混合物之組成,特定言之來自不同組織類型之貢獻。舉例而言,可測定來自肝臟之游離之DNA分子之百分比貢獻。生物樣品中之百分比貢獻之此等量測值可用於進行生物樣品之其他量測,例如鑑別腫瘤所位於之位置,如在稍後部分中描述。
圖1為說明分析游離之DNA分子之DNA混合物以自根據本發明之實施例之甲基化程度測定來自各種組織類型之百分比貢獻之方法100的流程圖。生物樣品包括來自M種組織類型之游離之DNA分子之混合物。生物樣品可為各種實例中的任一者,例如如本文中所提及。組織類型之數目M大於2。在各種實施例中,M可為3、7、10、20或大於20,或中間的任何數目。方法100可至少部分由使用電腦系統進行,本文所描述之其他方法亦可如此。
在步驟110處,對於分析鑑別N個基因組位點。N個基因組位點可具有各種屬性,例如如第II部分中更詳細地描述,該部分描述I型及II型基因組位點。作為實例,N個基因組位點可僅包括I型或II型位點,或兩者之組合。可基於一或多種其他樣品之分析,例如基於獲自關於各種個體中量測之甲基化程度之資料庫之資料鑑別基因組位點。
可選擇特定基因組位點以提供所需精確性程度。舉例而言,可使用具有至少一個臨限值變化性之基因座,與僅使用對一種組織類型具有特異性之基因座相反。可選擇第一組(例如10個)基因組位點以使得各自具有跨越M種組織類型至少0.15之甲基化程度之變異係數且使得各自具有就一或多種其他樣品而言超過0.1的M種組織類型之最大與最小甲基化程度之間的差異。此第一組基因組位點可不對於特定組織類型具有特定甲基化簽名,例如僅僅或主要在特定組織類型中經甲基化。此類第一組稱為II型位點。此等基因組位點可與稱為I型位點的具有特定簽名之基因組位點組合使用。
使用II型位點可確保跨越組織類型之甲基化程度之全空間由基因組位點橫跨,進而提供相比於I型位點增加之精確性。僅使用更多I型位點對甲基化空間提供冗餘基矢(亦即更多與其他位點具有相同模式之基因組位點),而添加甲基化程度具有跨越不同組織之各種值之其他基因組位點添加新穎基矢以經由線性方程組區分百分比貢獻。
在一些實施例中,N個基因組位點中之至少10個各自具有至少0.15的跨越M種組織類型之甲基化程度之變異係數。至少10個基因組位點亦可各自具有超過0.1的M種組織類型之最大與最小甲基化程度之間的差異。可對於一個樣品或樣品組量測基因座之此等甲基化特性。樣品組可針對包括測試之本發明生物體之生物體亞群,例如具有與本發明生物體共用之特定特點之亞群。此等其他樣品可稱作參考組織,且可使用來自不同樣品之不同參考組織。
在步驟120處,在M中組織類型中之每一者之N個基因組位點獲得N個組織特異性甲基化程度。N大於或等於M,以使得組織特異性甲基化程度可用於解卷積以測定分率百分比。組織特異性甲基化程度可形成維度N×M之矩陣A。矩陣A之各行可對應於特定組織類型之甲基化模式,其中模式具有N個基因組位點之甲基化程度。
在各種實施例中,組織特異性甲基化模式可自公共資料庫或前述研究檢索。在本文中之實例中,嗜中性白血球及B細胞之甲基化資料自基因表現彙編(Gene Expression Omnibus)(Hodges等人 Mol Cell 2011;44:17-28)下載。其他組織(海馬區、肝、肺、胰臟、心房、結腸(包括其各種部分,例如乙狀結腸、橫結腸、升結腸、降結腸)、腎上腺、食道、小腸及CD4 T細胞)之甲基化模式自RoadMap Epigenomics項目(Ziller等人 Nature 2013; 500:477-81)下載。白血球層、胎盤、腫瘤及血漿資料之甲基化模式自報導公佈(Lun等人 Clin Chem. 2013;59:1583-94;Chan等人 Proc Natl Acad Sci USA. 2013;110:18761-8)。此等組織特異性甲基化模式可用於鑑別用於解卷積分析中之N個基因組位點。
在步驟130處,接收包括來自M種組織類型之游離之DNA分子之混合物的生物樣品。生物樣品可以多種方法獲自患者生物體。獲得此類樣品之方式可為非侵入性或侵入性的。非侵入性獲得之樣品之實例包括某些類型之流體(例如血漿或血清或尿液)或糞便。舉例而言,血漿包括來自許多器官組織之游離之DNA分子,且因此適用於經由一種樣品分析許多器官。
在步驟140處,來自生物樣品之游離之DNA分子經分析以鑑別其對應於生物體之參考基因組中之位置。舉例而言,游離之DNA分子可經測序以獲得序列讀段,且可將該等序列讀段與參考基因組映射(比對)。若生物體為人類,則參考基因體將為潛在地來自特定子群體之參考人類基因體。作為另一實例,可藉由不同探針分析游離之DNA分子(例如在PCR或其他擴增之後),其中各探針對應於基因組位置,其可覆蓋雜合子及一或多個CpG位點,如下文所述。
可分析統計顯著數目之游離之DNA分子以提供精確解卷積以測定來自M種組織類型之百分比貢獻。在一些實施例中,分析至少1,000個游離之DNA分子。在其他實施例中,可分析至少10,000或50,000或100,000或500,000或1,000,000或5,000,000個或超過5,000,000個游離之DNA分子。分析之分子總數可取決於M及N,及所需精確度(精確性)。在各種實例中,分析之游離DNA之總數可小於500,000、1百萬、2百萬、5百萬、1千萬、2千萬或5千萬。
在步驟150處,使用各位於參考基因組之N個基因組位點中的任一者處之游離之DNA分子量測N個基因組位點之N混合物甲基化程度。DNA分子可藉由對應於基因組位點或基因座之一或多個鹼基位置之DNA分子之一或多個鹼基鑑別為位於基因組位點或基因座處。因此,DNA分子之序列將覆蓋基因組位點或基因座之一或多個鹼基位置。此資訊可基於步驟140中測定之位置測定。位於基因座位點之DNA分子之此類鑑別可用於本文所述之方法之任何類似步驟。
N混合物甲基化程度係指生物樣品之混合物中之甲基化程度。舉例而言,若來自混合物之游離之DNA分子位於N個基因組位點中的一者處,則該位點之分子之甲基化指數可包括於該位點之總甲基化密度中。N混合物甲基化程度可形成長度為N之甲基化向量b,其中b對應於可測定各對應組織類型之百分比貢獻之觀測值。
在一個實施例中,可使用全基因組亞硫酸氫鹽定序測定DNA混合物中之基因組位點之甲基化程度。在其他實施例中,可使用甲基化微陣列分析,如Illumina HumanMethylation450系統,或藉由使用甲基化免疫沈澱(例如使用抗甲基胞嘧啶抗體)或用甲基化結合蛋白處理,繼之以微陣列分析或DNA定序,或藉由使用甲基化敏感限制酶處理,繼之以微陣列或DNA定序,或藉由使用甲基化感測定序,例如使用單分子定序方法(例如藉由奈米孔定序(Schreiber等人 Proc Natl Acad Sci 2013; 110: 18910-18915)或藉由Pacific Biosciences單分子實時分析(Flusberg等人 Nat Methods 2010; 7: 461-465))測定CpG位點之甲基化程度。組織特異性甲基化程度可以相同方式量測。在其他實施例中,其他方法,例如(但不限於)靶向亞硫酸氫鹽定序、甲基化特異性PCR、基於非亞硫酸氫鹽之甲基化感測定序(例如藉由單分子定序平台(Powers等人 Efficient and accurate whole genome assembly and methylome profiling of E. coli. BMC Genomics. 2013; 14:675))可用於分析血漿DNA甲基化解卷積分析之血漿DNA之甲基化程度。
在步驟160處,測定組合向量之M值。各M值對應於M中組織類型之特定組織類型對DNA混合物之百分比貢獻。鑒於矩陣A由N×M組織特異性甲基化程度組成(亦即M種組織類型中之每一者之N個組織特異性甲基化程度),可求解組合向量之M值以提供N混合物甲基化程度(例如甲基化向量b)。M百分比貢獻可對應於藉由求解Ax=b確定之向量x。當N大於M時,求解可涉及誤差之最小化,例如使用最小平方。
在步驟170處,使用組合向量測定混合物中之M種組織類型中之每一者之量。組合向量之M值可直接當作M種組織類型之百分比貢獻。在一些實施方案中,M值可轉化為百分比。誤差術語可用於將M值轉換至較高或較低值。
D . 應用
如上所述,百分比貢獻可用於生物樣品之其他量測及其他測定,例如特定染色體區域是否具有序列不平衡、特定組織類型是否患病及測定由獲得樣品之懷孕女性之胎兒遺傳兩種親體單倍型中之何種單倍型。
圖2顯示顯示根據本發明之實施例之DNA甲基化解卷積(例如使用血漿)之若干潛在應用之示意圖。圖2中,生物樣品205在210處進行全基因組亞硫酸氫鹽定序。在230處,血漿DNA組織映射使用組織特異性甲基化圖譜220測定組織貢獻百分比。實例組織特異性甲基化圖譜顯示為肝臟、血細胞、脂肪組織、肺、小腸及結腸。貢獻百分比可如上文及他處所述測定,例如求解Ax=b。應用之實例包括產前測試241、癌症偵測及監測242、器官移植監測及器官損傷評估244。
適用於測定不同器官對血漿DNA之貢獻的甲基化標記(基因組位點)之清單可藉由比較不同組織,包括肝臟、肺、食道、心臟、胰臟、乙狀結腸、小腸、脂肪組織、腎上腺、結腸、T細胞、B細胞、嗜中性白血球、大腦及胎盤之甲基化特徵(圖2)鑑別。在各種實例中,肝臟、肺、食道、心臟、胰臟、結腸、小腸、脂肪組織、腎上腺、大腦及T細胞之全基因組亞硫酸氫鹽定序資料自來自拜勒醫藥學會(Baylor College of Medicine)之人類表觀基因組圖譜(Human Epigenome Atlas)檢索(www.genboree.org/epigenomeatlas/index.rhtml)。B細胞及嗜中性白血球之亞硫酸氫鹽定序資料來自Hodges等人之出版物(Hodges等人; Directional DNA methylation changes and complex intermediate states accompany lineage specificity in the adult hematopoietic compartment. Mol Cell 2011; 44: 17-28)。胎盤之亞硫酸氫鹽定序資料來自Lun等人(Lun等人 Clin Chem 2013; 59:1583-94)。在其他實施例中,標記物可鑑別自使用微陣列分析,例如使用Illumina Infinium HumanMethylation450 BeadChip陣列產生之資料集。
II.甲基化標記物之選擇
在上文中,吾人已描述使用甲基化分析測定DNA混合物之組成的原理。特定言之,不同器官(或組織)對血漿DNA之百分比貢獻可使用甲基化分析測定。在此部分中,吾人另外描述選擇甲基化標記物之方法及此技術之臨床應用。
藉由甲基化分析測定DNA混合物之組成的結果受用於DNA混合物之組成之解卷積的甲基化標記物影響。因此,選擇適當基因組甲基化標記物可就精確測定DNA混合物之構成而言重要。
A . 用於解卷積之甲基化標記物之標準
對於標記物選擇,可考慮以下三中屬性:(i)甲基化標記物需要具有在跨越不同個體之相同組織類型中量測之甲基化程度之低變化性。由於DNA混合物之組成的測定取決於組織特異性甲基化模式之識別,跨越不同個體之相同組織類型中之甲基化程度之低變化性將適用於精確鑑別DNA混合物中之組織特異性模式。在組織特異性甲基化程度獲自其他生物體之樣品(例如獲自資料庫)之實施例中,低變化性意謂來自其他樣品之甲基化程度與當前測試之生物體之組織特異性甲基化程度類似。
(ii)甲基化標記物需要具有跨越不同組織之甲基化程度之高變化性。對於特定標記物,跨越不同組織之甲基化程度之較高差異可提供不同組織對DNA混合物之貢獻的更精確測定。特定言之,可藉由使用具有屬性(ii)之一族標記物及具有屬性(iii)之另一組標記物獲得精確性之改進。
(iii)甲基化標記物需要具有相比於大部分或所有其他組織時特定不同的特定組織中之甲基化程度。相比於上文第(ii)點,標記物可具有大部分組織之甲基化程度之低變化性,但其在一種特定組織中之甲基化程度不同於大部分其他組織。此標記物將特別適用於測定與其他組織具有不同甲基化程度之組織的貢獻。
B . 實例
標記物選擇之原理說明於表1中之以下假設實例中。
| 標記物1 | 標記物2 | 標記物3 | 標記物4 | 標記物5 | 標記物6 |
肝臟1 | 20% | 69% | 9% | 9% | 10% | 90% |
肝臟2 | 50% | 70% | 10% | 10% | 10% | 90% |
肝臟3 | 90% | 71% | 11% | 11% | 10% | 90% |
心臟 | 20% | 20% | 30% | 13% | 12% | 12% |
肺 | 30% | 30% | 60% | 17% | 14% | 84% |
結腸 | 40% | 40% | 90% | 20% | 80% | 80% |
表 1 .
6種假設甲基化標記物之不同組織中之甲基化密度。
在此假設實例中,當相比於標記物1時,標記物2在來自三個個體之肝臟中之甲基化密度中具有較低變化性。因此,作為測定肝臟在DNA混合物中之貢獻的簽名,標記物2優於標記物1。
相比於標記物4,標記物3具有跨越不同組織類型之甲基化密度之較高變化性。根據上文所述之數學關係,來自不同組織之估計貢獻之相同變化程度將對於標記物3提供相比於標記物4更大的DNA混合物之推論甲基化密度之變化。因此,各組織之貢獻之評估可在標記物3之情況下更精確。
標記物5具有跨越肝臟、心臟及肺之甲基化密度之低變化性。其甲基化密度在10%至14%之範圍內變化。然而,結腸之甲基化密度為80%。此標記物將特別適用於測定結腸在DNA混合物中之貢獻。類似地,相比於針對標記物6之其他組織,心臟為低甲基化的。因此,心臟之貢獻可藉由標記物6精確測定。因此,標記物5及6之組合將能夠精確測定結腸及心臟之貢獻。添加標記物2及3將接著足以推論包括肝臟、心臟、肺及結腸之四種器官中之每一者之貢獻。
C . 不同類型的標記物
甲基化標記物可不必需具有所有以上三種屬性。I型甲基化標記物將通常具有以上屬性(iii)。多種此類標記物亦可具有屬性(i)。另一方面,II型甲基化標記物將通常具有以上屬性(ii)。多種此類標記物亦可具有屬性(i)。亦有可能的是特定標記物可具有全部三種屬性。
在一些實施例中,標記物廣泛地分成兩種類型(I型及II型)。I型標記物具有組織特異性。此等標記物對特定群組之一或多種組織之甲基化程度不同於大部分其他組織。舉例而言,特定組織可具有相比於所有其他組織之甲基化程度的顯著甲基化程度。在另一實例中,兩種組織(例如組織A及組織B)具有類似甲基化程度,但組織A及B之甲基化程度顯著不同於其餘組織之甲基化程度。
II型標記物具有高組織間甲基化變化性。此等標記物之甲基化程度跨越不同組織高度可變。此類別中之單一標記物可能不足以測定特定組織對DNA混合物之貢獻。然而,II型標記物之組合,或與一或多種I型標記物之組合可共同地使用以推論個別組織之貢獻。在以上定義下,特定標記物可僅為I型標記物、僅為II型標記物或同時為I型及II型標記物兩者。
1. I 型 標記物
在一個實施例中,可藉由對於所有候選組織比較標記物之甲基化密度與此特定標記物之甲基化密度之平均值及標準差(SD)鑑別I型標記物。在一個實施方案中,若標記物在一個組織中之甲基化密度不同於所有組織之平均值3個標準差(SD),則標記物經鑑別。
研究獲自上文所提及之來源之14種組織之甲基化圖譜以選擇標記物。在一個分析中,使用以上標準鑑別總共1,013種I型標記物(美國臨時申請案第62/158,466號之附錄A之表S1中標記為I型之標記物)。在其他實施例中,可使用特定組織與平均甲基化密度之間的其他閾值,例如(但不限於)1.5 SD、2 SD、2.5 SD、3.5 SD及4 SD。在另一實施例中,I型標記物可經由特定組織之甲基化密度與所有組織之中值甲基化密度之比較鑑別。
在其他實施例中,當超過一個組織(例如(但不限於)兩個、三個、四個或五個組織)顯示與所有候選組織之平均甲基化密度顯著不同的甲基化密度時,可獲得I型標記物。在一個實施方案中,截止甲基化密度可計算自所有候選組織之甲基化密度的平均值及SD。出於說明目的,閾值可定義為比平均甲基化密度高或低3 SD。當超過一個(例如(但不限於)兩個、三個、四個、五個或大於五個)組織之甲基化密度高於組織之平均甲基化密度超過3 SD或低於平均甲基化密度超過3 SD時,選擇標記物。
2. II型標記物
為了鑑別II型標記物,計算跨越所有14種候選組織之甲基化密度之平均值及SD且SD與平均值的比率表示為變異係數(CV)。在此說明性實例中,吾人對於CV使用>0.25之閾值以鑑別合格II型標記物,以及超出0.2之組織群之最大與最小甲基化密度之間的差值。使用此等標準,鑑別5820種II型標記物(附錄A之表S1中標記為II型之標記物)。在其他實施例中,可對於CV使用其他閾值,例如(但不限於)0.15、0.2、0.3及0.4。在其他實施例中,可使用最大與最小甲基化密度之間的差值之其他閾值,例如(但不限於)0.1、0.15、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45及0.5。
在其他實施例中跨越相同組織類型之多個樣品之平均值可用於量測跨越不同組織之甲基化程度之變化。舉例而言,可對來自10個樣品之相同基因組位點之10個甲基化程度取平均值以獲得基因組位點之單一甲基化程度。可進行類似方法以對於基因組位點之其他組織類型測定平均甲基化程度。跨越組織類型之平均值可隨後用於測定基因組位點是否具有跨越組織類型之顯著變化。可使用除平均值以外的其他統計值,例如中值或幾何平均值。此類統計值可用於鑑別I型及/或II型標記物。
相同組織類型之不同樣品(例如來自不同個體)可用於測定跨越不同樣品之甲基化程度之變化。因此,若存在多個相同組織類型之樣品,則實施例可另外量測相同組織類型之此類樣品之間的特定標記物之變化。具有跨越樣品之低變化之標記物將為比具有高變化之標記物更可靠的標記物。標記物及解卷積之其他細節可見於Chiu等人之名稱為「Methylation Pattern Analysis Of Tissues In A DNA Mixture」之共同擁有的美國專利公開案2016/0017419及名稱為「Non-Invasive Determination Of Methylome Of Fetus Or Tumor From Plasma」之PCT公開案WO2014/043763中。
D . 不同類別之標記物
基因組基因座(甲基化標記物)之「類別」對應於跨越相同組織類型之不同個體之基因座之甲基化程度之特定變化。不同類別可在跨越個體之特定組織類型之間具有不同變化範圍。第一類別之甲基化標記物可在測試之個體之間具有10%或更低的甲基化程度之差異。第二類別之甲基化標記物可在測試之個體之間具有大於10%之甲基化程度之差異。使用具有低個體間變化之甲基化標記物(第一類別標記物)將潛在地改良測定特定器官在DNA混合物中之貢獻之精確性。
E . 鑑別潛在甲基化標記物
在一些實施例中,以如下方式鑑別潛在甲基化標記物。此類潛在甲基化標記物可隨後經受以上標準以鑑別I型及II型標記物。在其他實施例中,不需要鑑別I型或II型。且其他實施例可使用其他技術鑑別潛在甲基化標記物。
在一些實施例中,對於潛在甲基化標記物考慮常染色體上之CpG島(CGI)及CpG岸。不使用性染色體上之CGI及CpG岸以使與源資料中之性別相關染色體劑量差異有關的甲基化程度之變化最小化。CGI自加州大學聖塔克魯斯(UCSC)資料庫(genome.ucsc.edu/, 27,048個關於人類基因組之CpG島)下載(Kent等人, UCSC之人類基因組瀏覽器, Genome Res. 2002;12(6):996-1006)且CpG岸定義為CpG島之2 kb邊窗(Irizarry等人 The human colon cancer methylome shows similar hypo- and hypermethylation at conserved tissue- specific CpG island shores. Nat Genet 2009; 41(2): 178 - 186)。接著,CpG島及岸細分為非重疊500 bp單元且各單元視為潛在甲基化標記物。
在14種組織類型之間比較所有潛在基因座之甲基化密度(亦即在500 bp單元內甲基化CpGs之百分比)。如先前報導(Lun等人Clin Chem. 2013; 59: 1583-94),發現胎盤與其餘組織比較時整體低甲基化。因此,胎盤之甲基化圖譜不包括於標記物鑑別階段。使用其餘13種組織類型之甲基化圖譜,鑑別兩種類型之甲基化標記物。舉例而言,當與13種組織類型之平均值比較時,I型標記物可指在一種組織中具有低於或高於3 SD之甲基化密度的任何基因組位點。當(A)最高甲基化組織之甲基化密度高於最低甲基化組織之甲基化密度至少20%;及(B)跨越13種組織類型之甲基化密度除以該群之平均甲基化密度之SD (亦即變異係數)為至少0.25時,II型標記物可視為高度可變。最後,為了減少潛在冗餘標記物之數目,在兩個CpG岸側接一個CpG島之一個連續區段中僅可選擇一個標記物。
F . 基於應用之選擇
對於特定應用選擇之甲基化標記物集合可依所需應用之參數變化。舉例而言,對於聚焦於單倍型或等位基因分析之應用,適用標記物將為該等位於相同游離之DNA分子上為雜合等位基因中之一者。由於游離之DNA分子(例如血漿DNA)通常小於200 bp,適用標記物可為200 bp之雜合基因座(例如SNP)內之CpG位點。作為另一實例,對於DNA自特定組織釋入血漿具有特殊重要性之應用,吾人可選擇優先較大數目之甲基化標記物,當與標記物集合中之其他標記物比較時,在此組織類型中差別地甲基化(例如I型標記物)。
解卷積分析中之甲基化標記物之數目及選擇可根據預期用途變化。若對肝臟之百分比貢獻特別感興趣,例如在已接受肝臟移植之患者中,則更多I型肝臟特異性標記物可用於解卷積分析以增加移植肝臟對血漿DNA之貢獻之定量的精確性。
III. 組成精確性
如上文所述,實施例可鑑別血漿DNA之組織貢獻者。在各種實例中,進行血漿DNA之全基因組亞硫酸氫鹽定序且參看不同組織之甲基化圖譜進行分析。使用二次規劃作為實例,血漿DNA定序資料去卷積為來自不同組織之比例貢獻。對於懷孕女性;患有肝細胞癌、肺癌及結腸直腸癌之患者;以及骨髓及肝臟移植後的個體測試實施例。
在大部分個體中,白血球為循環DNA池之主要貢獻者。懷孕女性中之胎盤貢獻與如藉由胎兒特異性遺傳標記物顯示之比例貢獻相關。移植衍生的對移植受體中之血漿之貢獻與使用供體特異性遺傳標記物測定之彼等相關。患有肝細胞癌、肺癌或結腸直腸癌之患者顯示來自具有腫瘤之器官之較高血漿DNA貢獻。肝細胞癌患者中之肝臟貢獻亦與使用腫瘤相關拷貝數變異進行之量測相關。
在癌症患者及展現血漿中之拷貝數變異之懷孕女性中,甲基化解卷積識別造成偏差之組織類型。在懷孕期間診斷為患有濾泡性淋巴瘤之懷孕女性中,甲基化解卷積指示大體上較高的自B細胞向血漿DNA池之貢獻且將局部B細胞(而非胎盤)指示為血漿中觀測之拷貝數變異之來源。因此,實施例可充當基於不同組織對血漿之擾動比例貢獻之鑑別評估大範圍的生理學及病理學病況之強力工具。
A . 不同類型的血球之貢獻
作為甲基化解卷積之實例,吾人測定不同組織及細胞類型對循環DNA之貢獻。自兩個罹患全身性紅斑性狼瘡症(SLE)之患者收集兩個血液樣品。在收集之後,靜脈血液樣品在1,500 g下離心10分鐘。在離心之後,分離血細胞及血漿。接著自血細胞提取DNA。DNA經亞硫酸氫鹽轉化且使用HiSeq2000定序器中之流動池之一條通道定序。使用細胞類型特異性甲基化模式分析來分析兩個血細胞樣品。嗜中性白血球、淋巴球、食道、結腸、胰臟、肝臟、肺、心臟、腎上腺及海馬區之甲基化模式包括為血細胞DNA之潛在候選物。609 選擇甲基化標記物用於分析。亦將兩個個體之全血樣品送至細胞計數以測定血細胞之嗜中性白血球及淋巴球之分率組成。
| 血液樣品1 | 血液樣品2 |
| 細胞類型特異性甲基化模式分析 | 血球計數 | 細胞類型特異性甲基化模式分析 | 血球計數 |
嗜中性白血球 | 90.5% | 93.6% | 89.4% | 89.9% |
淋巴球 | 9.5% | 6.4% | 10.6% | 10.1% |
食道 | 0% | - | 0% | - |
結腸 | 0% | - | 2% | - |
胰臟 | 0% | - | 0% | - |
肝臟 | 0% | - | 1% | - |
肺 | 1% | - | 1% | - |
心臟 | 0% | - | 3% | - |
腎上腺 | 0% | - | 0% | - |
海馬區 | 0% | - | 0% | - |
表 2 .
藉由解卷積模式分析及細胞計數之血液組織貢獻
對於甲基化模式分析,嗜中性白血球及淋巴球測定為構成血細胞DNA之主要組分。嗜中性白血球及淋巴球之貢獻之相對比例與其根據細胞計數分析之血液樣品中之相對豐度類似。
B . 懷孕女性
使用懷孕女性之血漿DNA之甲基化分析來分析不同組織,包括肝臟、肺、胰臟、結腸、海馬區、小腸、血細胞、心臟、腎上腺、食道及胎盤之貢獻。由於胎盤基因型一般與胎兒的基因型相同但不同於懷孕女性的基因型,胎盤對母體血漿之精確貢獻可藉由計數樣品照組胎兒特異性等位基因數目精確測定。
1. 組成及與胎兒 DNA 百分比之相關性
對於15個懷孕女性(來自第一、第二及第三個三月期中之每一者之五個)進行血漿DNA之全基因組亞硫酸氫鹽定序。進行甲基化解卷積且推論來自不同組織之百分比貢獻。基於使用二次規劃分析之表S1中之所有I型及II型標記物之甲基化程度(如甲基化密度)測定不同器官之貢獻。
圖3A顯示根據本發明之實施例之就15個懷孕女性而言之不同器官對血漿DNA之百分比貢獻的圖300。各條形對應於一種樣品之結果。不同顏色表示不同器官對血漿之貢獻。此等結果顯示白血球(亦即嗜中性白血球及淋巴球)為血漿DNA池之最重要貢獻者。此觀測結果與先前在骨髓移植後獲得之觀測結果一致((Lui YY等人 Clin Chem 2002; 48:421-7)。
圖4顯示根據本發明之實施例測定自懷孕女性中之血漿DNA組織映射分析之百分比貢獻的表400。此等結果亦顯示胎盤為懷孕女性中之血漿DNA之另一關鍵貢獻者,分率濃度為9.9%至38.4%。
吾人亦使用如先前所述之懷孕女性不具有之父本遺傳胎兒單核苷酸多態性(SNP)等位基因量測胎盤貢獻(31)。為了分析胎兒特異性SNP等位基因,藉由分析絨毛膜絨毛樣品或胎盤測定胎兒之基因型。藉由分析血細胞測定懷孕女性之基因型。基於SNP之結果顯示甲基化解卷積結果之獨立驗證。
圖3B顯示推論自血漿DNA甲基化解卷積之胎盤貢獻之血漿DNA分率與使用根據本發明之實施例的胎兒特異性SNP等位基因推論之胎兒DNA百分比濃度之間的相關性之圖350。圖350顯示藉由甲基化解卷積測定之胎盤貢獻與使用SNP量測之胎兒DNA百分比濃度具有強相關性(r =0.99,p<0.001,皮爾森相關性(Pearson correlation))。因此,在兩個參數之值之間觀測到良好正相關,表明血漿DNA甲基化解卷積精確測定胎盤對母體血漿樣品之貢獻。
圖5顯示根據血漿DNA組織映射的除胎盤以外之器官之百分比貢獻及基於根據本發明之實施例的胎兒特異性SNP等位基因之胎兒DNA百分比濃度之圖。X軸表示藉由基於SNP之分析估計之胎兒DNA百分比濃度且Y軸表示藉由血漿組織DNA映射分析推論之百分比貢獻。嗜中性白血球之血漿DNA貢獻顯示逆相關。此可能由於嗜中性白血球為血漿DNA池之主要貢獻者且因此胎盤貢獻增加,來自嗜中性白血球之相對貢獻將必然地減少。其餘組織之甲基化解卷積結果不顯示與胎兒DNA百分比濃度之相關性。
圖6顯示來自根據本發明之實施例之非懷孕健康對照個體組之血漿DNA組織映射分析之百分比貢獻的表600。當方法應用於非懷孕健康對照之血漿時,在大部分樣品中不存在胎盤貢獻(中值:0%;四分位數範圍:0%至0.3%)。
2. 所選標記物與隨機標記物之比較
藉由所選標記物相對於隨機標記物測試百分比貢獻之精確性。對於不同標記物組進行不同組成計算。基於上文提及之標準選擇一組,且另一組為隨機組。結果顯示重要的是公正地選擇甲基化標記物(基因座)用途,以便獲得精確結果。
對於此分析募集十一個懷孕女性及四個健康非懷孕個體。其血漿DNA經亞硫酸氫鹽轉化且使用Illumina HiSeq2000定序器定序。各血漿樣品藉由定序流動池之一個通道定序。接著使用生物信息學程式Methy-Pipe分析序列讀數(Jiang P. PLoS One 2014; 9: el00360)。此程式可將亞硫酸氫鹽轉化序列讀數與參考基因組比對且測定各定序片段上之各CpG位點之甲基化狀態。
第一組標記物對於鑑別血漿DNA中之不同組織具有高特異性。對於各組織類型,選擇相比於其他組織具有甲基化密度之最大差異的標記物。標記物測定自含有至少一個CpG二核苷酸之基因組區域。在此實例中,CpG島(CGI)用作潛在標記物,其在DNA之特定伸長部中具有高頻之CpG位點。此特定實例中之CGI下載自加州大學聖塔克魯斯(UCSC)資料庫:(genome.ucsc.edu)。總計,吾人自人類基因組獲得27,048個CpG島。CpG島之中值尺寸為565 bp(範圍:200 bp至45 kb)。90%之島小於1.5 kb。
對於各甲基化標記物,測定所關注的組織與其他組織之間的甲基化密度之差值。差值接著表示為跨越其他組織之標準差(SD)數目。對於所關注的組織,所有標記物根據甲基化密度之此差值分級。選擇具有高於(10個標記物)及低於(10個標記物)其他組織之平均甲基化密度之最大差異的20個標記物。標記物之數目可變化,例如(但不限於)5、15、20、30、40、50、100及200。
另外,亦選擇具有跨越所有不同組織之高變化性的標記物。在此實例中,選擇在具有最高與最低甲基化密度之組織之間具有>50%差值之標記物。在其他應用中,可使用其他值,例如(但不限於)20%、30%、40%、60%、70%及80%。此外,亦基於平均值及SD計算跨越不同組織之甲基化密度之變化性。在此實例中,若SD之值超過平均值兩倍,則亦選擇標記物。在其他應用中,亦可使用其他閾值,例如(但不限於)1、1.5、2.5及3。基於此等選擇標準,對於第一組選擇344個甲基化標記物。
對於第二組,341個標記物隨機選自上文所述之27,048個CGI。所有CGI首先編號為1至27,048。接著,由電腦產生隨機數(在1與27,048之間)用於標記物選擇。接著重複此方法直至選擇總共341個標記物。若產生之隨機數已使用,則將產生另一隨機數。預期此組標記物在鑑別組織特異性甲基化模式中具有低得多的特異性。因此,預期測定血漿DNA之組成的精確性降低。
圖7顯示關於根據本發明之實施例使用第一組標記物(具有高器官特異性)之11個懷孕女性及4個非懷孕健康個體的不同器官對血漿DNA之估計貢獻之表700。藉由計數胎兒特異性等位基因測定胎兒DNA百分比濃度且顯示於底列中。在四個非懷孕對照個體中之每一者中,胎盤對血漿之貢獻測定為接近0%。此指示此方法之特異性。
圖8顯示關於根據本發明之實施例使用第二組標記物(具有低器官特異性)之11個懷孕女性及4個非懷孕健康個體的不同器官對血漿DNA之估計貢獻之表800。藉由計數胎兒特異性等位基因測定之胎兒DNA百分比濃度顯示於底列中。使用此等較低特異性標記物,觀測到自胎盤之相對非一致貢獻百分比,且在四個非懷孕對照個體中觀測到自胎盤之相當大的貢獻。此指示標記物之組織特異性在此方法中重要。
圖9A為顯示估計胎兒DNA百分比濃度(貢獻自胎盤)與藉由計數母體血漿樣品中之胎兒特異性等位基因測定之胎兒DNA百分比濃度之間的相關性之圖900。使用第一組甲基化標記物,來自兩種技術之結果具有良好相關性。然而使用第二組甲基化標記物,藉由使用甲基化分析之評估顯示與使用胎兒特異性等位基因計數測定之真實值之顯著偏差。
圖9B為顯示來自甲基化標記物之評估與藉由胎兒特異性等位基因計數測定之胎兒DNA百分比濃度之間的絕對差之圖950。使用甲基化分析之評估之中值誤差分別為使用第一組標記物及第二組標記物之4%及8%。
C . 不同標準之影響
如上文所述,各種標準可用於鑑別不同類型之標記物。舉例而言,I型標記物可藉由不同於所有組織之平均甲基化程度(例如至少特定臨限值,如3 SD)之特定組織中之甲基化程度鑑別。且對於II型標記物,使用某一變化及最大差值之標準。以下部分顯示不同標準鑑別標記物之精確性。
1. 在較不嚴格標準下之標記物效能
吾人使用具有跨越不同組織之不同變化性的標記物比較甲基化解卷積分析之效能。基於具有不同選擇標準之兩組標記物對於15個懷孕女性測定胎盤對血漿DNA之貢獻。兩組標記物均包括如前述部分中所述之所有I型標記物。然而,兩組標記物之II型標記物之選擇標準不同。
第I組標記物包括所有5,820種滿足具有>0.25之甲基化密度CV且組織群之最大與最小甲基化密度之間的差值超過0.2之標準的II型標記物。對於第II組標記物,CV要求為>0.15且組織群之最大與最小甲基化密度之間的差值超過0.1。此組標記物中存在8,511種II型標記物。
圖10A為顯示根據本發明之實施例使用具有不同選擇標準之標記物推論的胎盤對血漿DNA之貢獻之圖1000。垂直軸對應於使用第II組標記物推論之胎盤貢獻。水平軸對應於使用第I組標記物推論之胎盤貢獻。在基於具有不同選擇標準之兩組標記物的胎盤貢獻結果之間存在良好相關性(r=0.99,皮爾森相關性)。因此,可使用CV>0.15及組織群之最大與最小甲基化密度之間的差值超過0.1之要求獲得良好精確性。
2. 相同組織類型內之甲基化程度變化之影響
為了調查相同組織類型之間的標記物(例如來自不同個體)之甲基化程度變化是否將影響解卷積分析之效能,吾人分析來自兩個懷孕個案之胎盤組織。鑑別兩種類別之甲基化標記物。特定言之,兩種類別基於其在兩個胎盤組織中之甲基化程度之相似性而鑑別。類別i之標記物具有10%或低於10%之甲基化密度。類別ii之標記物在兩個胎盤組織之間具有高變化性(甲基化密度之差值大於10%)。
圖10B為顯示使用在相同組織類型中具有低變化性(類別i)及高變化性(類別ii)之標記物之血漿DNA解卷積之精確性的圖1050。進行血漿DNA解卷積以對於15個懷孕女性測定胎盤對血漿DNA之貢獻。對於各標記物,兩個胎盤組織之甲基化密度之平均值用於表示分析中之胎盤之甲基化程度。對於使用類別i及類別ii標記物之解卷積分析中之每一者,使用總共1,024種標記物。
另外基於胎兒特異性SNP等位基因之比例測定血漿中胎盤衍生之DNA的量。藉由基於類別i及類別ii標記物之甲基化解卷積分析推論之百分比貢獻接著相比於基於胎兒特異性SNP等位基因之結果。來自基於胎兒特異性等位基因估計之值的衍生胎盤貢獻之中值偏差分別為2.7%(使用類別i標記物)及7.1%(使用類別ii標記物)。因此,使用具有組織甲基化程度之較低個體間變化之類別i標記物給出甲基化解卷積分析中之較好精確性。
當使用在相同組織類型內具有高變化性之標記物(類別ii)時,觀測到來自甲基化解卷積與胎兒特異性等位基因分析之結果之間的顯著較高差異(P<0.0001,威爾科克森符號秩檢驗(Wilcoxon sign-rank test))。換言之,使用在相同組織類型內具有低變化性之標記物將增加甲基化解卷積分析之精確性。因此,可基於相同組織類型內之變化性,例如(但不限於)CV值及相同組織類型之最大與最小甲基化密度之間的差值選擇標記物。
IV. 胎兒簽名之解卷積
若已知基因組簽名(例如特定SNP等位基因),則實施例可測定何種組織為此類簽名之來源。因此,若特定簽名代表胎兒(例如特定基因座之父系等位基因),則簽名對胎盤組織之百分比貢獻將相當大。
為了說明單一核苷酸改變亦可用於測定衍生出改變之源組織,吾人分析懷孕女性之血漿DNA。胎盤及母體白血球層經基因分型以鑑別母親經純合且胎兒經雜合之SNP。吾人將胎兒及母親共用之等位基因指示為A且將胎兒特異性等位基因指示為B。因此,母親具有AA之基因型且胎兒在此等SNP中之每一者處具有AB之基因型。
在母體血漿DNA之亞硫酸氫鹽定序之後,選擇攜有胎兒特異性等位基因(B等位基因)及至少一個CpG位點之所有DNA片段且用於下游分析。總共13.1億片段經定序且677,140個攜有胎兒特異性等位基因(B等位基因)之片段用於解卷積分析。所有藉由至少10個DNA片段覆蓋之CpG位點用於解卷積分析。可使用覆蓋位點之其他數目的DNA片段,如5、15、20、25或30。由於B等位基因為胎兒特異性的,預期此等DNA片段衍生自胎盤。
組織 | 貢獻 ( % ) |
肝臟 | 0.9 |
肺 | 0.0 |
結腸 | 0.0 |
小腸 | 0.0 |
胰臟 | 0.5 |
腎上腺 | 0.0 |
食道 | 3.1 |
脂肪組織 | 0.0 |
心臟 | 0.0 |
大腦 | 0.3 |
T細胞 | 0.0 | |
B細胞 | 0.0 | |
中性粒細胞 | 0.0 | |
胎盤 | 95.2 | |
| | | |
表 3 .
使用胎兒特異性等位基因之甲基化解卷積分析。
在表3中,自甲基化解卷積分析顯示胎盤推論為攜有胎兒特異性SNP等位基因之此等DNA片段之主要貢獻者。此等結果表明甲基化解卷積分析精確鑑別攜有胎兒特異性等位基因之此等DNA片段之組織來源。
此顯示特定等位基因可歸於胎兒。此類技術更詳細地描述於下文中,用於使用甲基化解卷積分析測定胎兒之基因型及單倍型。
V . 測定胎兒基因組 ( 突變分析 )
對於非侵襲性產前測試,使用母體血漿DNA分析母體突變之遺傳為具挑戰性之任務。舉例而言,若懷孕女性對於突變為雜合的,則使用母體血漿DNA分析之胎兒突變狀態之分析將在技術上困難,因為不管其胎兒之突變狀態,突變及正常等位基因均將存在於其血漿中。先前,已開發多種不同方法以解決此問題(Lun等人 Proc Natl Acad Sci USA. 2008;105:19920-5;Lo 等人 Sci Transl Med. 2010;2:61ra91;Lam等人 Clin Chem. 2012;58:1467-75)。此等先前方法之原理涉及母體血漿中之突變與正常等位基因之相對量之間的比較。為了增強比較之統計功效,此等方法中的一些另外涉及連接至突變等位基因之SNP等位基因及連接至正常等位基因之彼等等位基因之相對量的比較。作為替代方案或另外,本發明之一些實施例可藉由甲基化解卷積分析推論胎兒之突變狀態。
A . 使用甲基化解卷積之等位基因之貢獻
在此實例中,測定胎兒之基因型。假定父親及母親在特定基因座處之基因型分別為NN及MN。M及N分別指示突變及正常等位基因。在此情境下,胎兒可自母親遺傳M等位基因或N等位基因。因此,胎兒存在兩種可能的基因型,即MN及NN。在母體血漿中,攜有胎兒基因型之DNA實際上衍生自胎盤。因此,此等DNA片段將展現胎盤甲基化圖譜。
圖11A顯示胎兒遺傳來自母親之M等位基因且在根據本發明之實施例之特定基因座處具有MN之基因型的第一情形。在圖11A之頂部部分(經標記基因型)中,父親顯示為具有基因型NN,母親顯示為具有基因型MN,且胎兒顯示為具有基因型MN。展現胎盤甲基化圖譜之DNA片段用P標記,其顯示於胎兒基因型上。舉例而言,胎盤甲基化圖譜可對應於接近特定基因座之基因組位點之某些甲基化程度。對準至特定基因座之DNA片段亦可包括接近基因座之基因組位點(例如在基因座之200 bp內),且因此可用於對於甲基化解卷積分析量測甲基化程度。考慮親體之基因型,M等位基因對母親具有特異性且N等位基因在父親與母親之間共用。
在圖11A之底部部分(經標記母體血漿)中,顯示兩個等位基因M及N之實例,其中各實例表示所關注的基因座處之血漿中之不同DNA分子。出於說明的目的,僅顯示少數DNA分子。在此實例中,胎兒DNA百分比假設為25%,如藉由25%之DNA分子用P標記所示。
在母體血漿樣品中,吾人選擇性地分析攜有M等位基因之DNA片段且進行甲基化解卷積分析。由於胎兒具有MN之基因型,胎盤將M及N等位基因兩者貢獻於母體血漿DNA。因此,攜有M等位基因之DNA片段中的一些亦將在接近基因座之基因組位點攜有胎盤特異性甲基化圖譜。甲基化解卷積分析將指示攜有M等位基因之DNA片段中的一些將衍生自胎盤,且因此胎兒基因型包括M等位基因。
圖11B顯示胎兒遺傳來自母親之N等位基因且在根據本發明之實施例之特定基因座處具有NN之基因型的第二情形。在此情況下,僅攜有N等位基因之DNA片段將在母體血漿中展現胎盤甲基化圖譜。因此,藉由甲基化解卷積之攜有M等位基因之DNA片段之選擇性分析將指示此等DNA片段不具有來自胎盤之顯著貢獻。因此,可確定胎兒不具有M,且因此具有NN之基因型。
在一些實施例中,可比較M及N等位基因之胎盤貢獻。此處,吾人假定胎兒DNA占總母體血漿DNA之大致10%。M及N等位基因之選擇性解卷積將適用於指示胎兒自母親遺傳何種等位基因。預期結果展示於下表4中:
| 胎兒基因型 |
| MN | NN |
攜有M等位基因之血漿DNA之胎盤貢獻 | 大致10% | 不顯著(接近零) |
攜有N等位基因之血漿DNA之胎盤貢獻 | 大致10% | 大致20% |
M及N等位基因之胎盤貢獻的比率(M:N) | 1:1 | 0:2 |
表 4 .
針對NN父體基因型的M及N等位基因之胎盤貢獻。
在表4中,可比較M及N等位基因之百分比胎盤貢獻。兩種等位基因之大致相同胎盤貢獻(例如在彼此之臨限值內)表明胎兒基因型為MN。另一方面,N等位基因相比於M等位基因顯著較高的胎盤貢獻將指示NN之胎兒基因型。
在另一實施例中,不需要顧及父體基因型。在此情況下,胎兒之可能的基因型包括MM、MN及NN。
| 胎兒基因型 |
| MN | NN | MM |
攜有M等位基因之血漿DNA之胎盤貢獻 | 大致10% | 不顯著(接近零) | 大致20% |
攜有N等位基因之血漿DNA之胎盤貢獻 | 大致10% | 大致20% | 不顯著(接近零) |
M及N等位基因之胎盤貢獻的比率(M:N) | 1:1 | 0:2 | 2:0 |
表 5 .
針對未知父體基因型的M及N等位基因之胎盤貢獻。
在表5中,顯示針對不同胎兒基因型的攜有M及N等位基因之DNA片段之胎盤貢獻。當胎兒具有MM之基因型時,M等位基因之胎盤貢獻將顯著高於N等位基因之胎盤貢獻。當胎兒具有NN之基因型時,N等位基因之胎盤貢獻將顯著高於N等位基因之胎盤貢獻。當胎兒具有NM之基因型時,M等位基因之胎盤貢獻將大致等於N等位基因之胎盤貢獻。
因此,當未知父體基因型時,可測定兩種等位基因之百分比貢獻。亦即,第一百分比貢獻可使用對準至基因座且包括N之第一組游離之DNA分子測定。第一組游離之DNA分子之甲基化程度可在接近基因座之K基因組位點量測。且第二百分比貢獻可使用對準至基因座且包括M之第二組游離之DNA分子測定。第二組游離之DNA分子之甲基化程度可在接近基因座之K基因組位點量測。對於胎兒基因型為MN之第一情形,針對任一等位基因測定之百分比貢獻將大致相同,如可藉由測定百分比貢獻是否在彼此之臨限值內檢驗。
為了說明此方法之可行性,吾人分析懷孕女性之血漿DNA。血漿DNA經亞硫酸氫鹽轉化且使用大規模平行定序進行分析。另外,分析胎盤及血細胞以測定胎兒及母親之基因型。出於說明的目的,分析位於
KLF2
基因內之SNP。對於此SNP,母親及胎兒之基因型分別為CG及CC。在此基因型組合下,胎盤將C等位基因貢獻於母體血漿,但母體血漿中之所有G等位基因將衍生自母體組織。
在定序資料中,存在24個攜有G等位基因之片段及55個攜有C等位基因之片段。此等DNA片段內之CpG位點用於甲基化解卷積。在此分析中,一個目標為測定兩種等位基因之胎盤貢獻。為了說明原理,僅將胎盤及血細胞視為甲基化解卷積分析之候選組織。在另一實施例中,三種或大於三種類型之組織可用作候選物。在另一實施例中,組織預期具有顯著貢獻,例如血細胞、肝臟、肺、腸及胎盤可用作候選物。
| C等位基因 | G等位基因 | C/G比 |
胎盤 | 62.6% | 1.8% | 34 |
血球 | 37.4% | 98.2% | |
表 6 .
針對未知父體基因型的C及G等位基因之胎盤貢獻。
在表6中,來自胎盤之貢獻對於C等位基因及G等位基因分別推論為62.6%及1.8%。C/G之胎盤貢獻比為34。此等結果表明胎兒之基因型將為CC。此與胎盤組織之基因分型結果一致。
此實施例不同於基於具有特定甲基化模式之DNA之等位基因比率分析的非侵入性產前測試之前述方法且潛在地更具效用(Tong等人 Clin Chem 2006; 52: 2194-202)。在此前述方法中,組織特異性DNA首先基於甲基化模式鑑別自DNA混合物(例如血漿DNA)。舉例而言,特定基因在血細胞中完全未甲基化且在胎盤中經甲基化。鑑別使用使甲基化胎盤DNA保持完整之酶進行。
因此,血漿中剩餘的所有甲基化DNA分子將衍生自胎盤而非衍生自血細胞。接著,位於胎盤衍生之DNA分子上之SNP之等位基因比率可藉由使用完整胎盤DNA量測基因座處之不同等位基因之量測定。當胎兒對於SNP為雜合時,胎盤特異性DNA中之兩種等位基因的比率將為大致1。然而,若胎兒受非整倍體染色體影響且具有三個攜有此特定SNP之染色體複本,則兩種等位基因的比率將為1:2或2:1。
在此前述方法中,組織特異性DNA分子需要首先基於所關注的組織特有的甲基化狀態進行鑑別。甲基化DNA分子對於胎盤獨特,因為就目標區域而言,血細胞完全未甲基化。然而,在本發明實施例中,不需要某一甲基化狀態之獨特性。候選組織僅需要在其甲基化圖譜中不同,因此可使用更多基因座,進而實現單倍型解卷積。因此,可基於不同等位基因之甲基化圖譜測定其組織貢獻。另外,前述方法可更易受統計變化,因為各等位基因之情況下之胎兒讀數數目直接彼此相比。然而,當胎盤貢獻彼此相比時,胎兒讀數數目不直接彼此相比。取而代之,胎盤貢獻測定自所有讀數(甲基化或非甲基化),且因此胎盤貢獻可相同,即使在胎兒讀數數目不同時亦如此。因此,可導致對一種單倍型之覆蓋度偏差。
B . 使用解卷積測定遺傳單倍型
先前已展示經由懷有胎兒之懷孕女性之血漿DNA(或其他游離DNA)之分析,可使用相對單倍型劑量分析(RHDO)方法推論由胎兒遺傳之母體單倍型(Lo等人 Sci Transl Med 2010; 2: 61ra91及美國專利8,467,976)。在此方法中,吾人對於懷孕女性使用單倍型資訊。可使用家族分析或直接分析單倍型之方法(例如Fan等人 Nat Biotechnol 2011; 29: 51-57;Snyder等人 Nat Rev Genet 2015; 16: 344-358)獲得此後一資訊。在母親中雜合但在父親中純合之SNP可用於RHDO分析。此類使用特定SNP可限制可使用的基因座,且因此限制資料及精確性的量。實施例可不如此受限於此類特定SNP。另外,實施例可與以上參考組合使用以提供增加的精確性。
實施例可使用甲基化解卷積以使用游離之DNA分子對於兩種單倍型測定胎盤貢獻。胎盤貢獻可經比較以測定由胎兒遺傳何種單倍型。實施例可以推論之母體或父體單倍型起始,且接著量測彼等推論之單倍型中之每一者中含有SNP等位基因之血漿DNA分子之甲基化程度。吾人可隨後進行甲基化解卷積。胎兒單倍型可鑑別為具有來自甲基化解卷積分析之最高胎盤貢獻之單倍型。在所有以上實施例中,父體或母體單倍型亦可藉由家族分析(亦即藉由分析其他家族成員之DNA)或藉由直接方法(例如由Fan等人 Nat Biotechnol 2012描述之方法)測定,而非推論之單倍型。
1.
母體單倍型
在此實例中,吾人展示可用於推論由未出生的胎兒遺傳之母體單倍型之血漿DNA甲基化解卷積分析。來自懷孕女性之基因組DNA源,例如白血球層DNA可經受基因分型,例如使用微陣列。接著,將母體基因分型結果輸入單倍型推論程式(例如IMPUTE2,Howie等人 PLoS Genet. 2009;7:e 1000529)中以推論可能的第一母體單倍型及第二母體單倍型。群體特異性基因型及單倍型資訊可考慮在內以改良推論之精確性。在其他實施例中,親體單倍型可藉由單一分子分析,例如(但不限於)由Fan等人(Nat Biotechnol. 2011 ;29:51-7)、Kaper等人(Proc Natl Acad Sci USA. 2013; 110:5552-7)、Lan等人(Nat Commun. 2016;7:11784)及Selvaraj等人(Nat Biotech 2013;31:1111-1118)描述之方法產生。接著,母體血漿DNA可經受全基因組亞硫酸氫鹽定序及與參考基因組序列之比對。可隨後對於預測之單倍型中之每一者進行甲基化解卷積。由於母體血漿中之胎兒DNA主要源自胎盤,由胎兒遺傳之母體單倍型為顯示最高胎盤貢獻之單倍型。
母體單倍型資訊可用於將SNP等位基因及相同同源染色體上之CpG位點連接在一起。接著,可使用SNP等位基因鑑別來自相同染色體複本(單倍型)之DNA片段。此特定染色體複本(單倍型)上之CpG位點(或其他位點)可用於甲基化解卷積。由於可用於解卷積之CpG位點數目將與同源染色體上之SNP數目成比例且比基於單倍型之解卷積分析中連接至單一SNP之CpG位點數目大得多,此方法將比使用連接至單一SNP之CpG位點之解卷積分析更精確。原理說明於圖12A中。
圖12A顯示根據本發明之實施例使用甲基化解卷積由胎兒遺傳之母體單倍型之測定。在圖12A之頂部部分中,母親及胎兒之兩種單倍型顯示於三個基因座處且母親為雜合的。兩種母體單倍型標記為Hap I及Hap II。在此實例中,胎兒自母親遺傳Hap I。出於說明目的,僅顯示母親為雜合之SNP基因座。出於說明目的,在此實例中,父親對於此等基因座中之每一者為純合的。然而,相同原理擴展至父親在無任何變化的情況下為雜合之情形。
在圖12A之底部部分(經標記母體血漿)中,顯示各基因座處之兩個等位基因之實例,其中各實例表示所關注的基因座處之血漿中之不同DNA分子。出於說明的目的,僅顯示少數DNA分子。在此實例中,胎兒DNA百分比假設為20%,如藉由20%之DNA分子用P標記所示。
在母體血漿中,攜有胎兒基因型之DNA分子衍生自胎盤且因此攜有胎盤特異性甲基化模式。用「P」標記之圓形表示接近雜合基因座之展現胎盤甲基化模式之CpG位點。包括雜合基因座及相鄰位點之讀數可用於量測甲基化程度以偵測胎盤甲基化模式。在此實例中,一個目標為測定胎兒是否自母親遺傳Hap I或Hap II。為達成此目標,選擇在Hap I上攜有等位基因且覆蓋至少一個CpG位點之血漿DNA片段用於甲基化解卷積。由於胎兒自母親遺傳Hap I,胎盤將向此池貢獻顯著比例之血漿DNA分子。另一方面,當藉由甲基化解卷積分析在Hap II上攜有等位基因之片段時,將觀測到自胎盤之極低貢獻。
為了說明此情形,吾人分析關於表6在上文陳述之母體血漿樣品。吾人聚焦於染色體1上之5 Mb區域。選擇母親為雜合且胎兒為純合之SNP用於分析。對於此等SNP基因座中之每一者,在母親與胎兒之間共用之等位基因形成一個單倍型(表示為Hap I)且僅存在於母體基因組上之等位基因形成另一單倍型(表示為Hap II)。因此,在此實例中,存在兩種母體單倍型(Hap I及Hap II)且胎兒自母親遺傳Hap I。在母體血漿中,在Hap I上攜有等位基因之DNA片段及在Hap II上攜有等位基因之彼等分別使用甲基化解卷積分析。雜合SNP之相同血漿DNA分子上之所有CpG位點用於解卷積分析。在此實例中,此等CpG位點中無一者與I型或II型標記物重疊。
| Hap I | Hap II |
肝臟 | 0% | 0% |
肺 | 0% | 6.7% |
結腸 | 3.4% | 6.2% |
小腸 | 0% | 10.6% |
胰臟 | 4.1% | 0% |
腎上腺 | 0% | 4.6% |
食道 | 0% | 0% |
脂肪組織 | 3.7% | 3.6% |
心臟 | 0% | 0% |
大腦 | 6.8% | 10.6% |
T細胞 | 6.8% | 21% |
B細胞 | 8.9% | 11.7% |
中性粒細胞 | 12.7% | 25% |
胎盤 | 53.5% | 0% |
表 7 .
Hap I及Hap II之甲基化解卷積。
表7顯示在兩種母體單倍型,即Hap I及Hap II上攜有等位基因之血漿DNA片段之解卷積。胎兒遺傳母體Hap I。自此解卷積分析,胎盤推論為貢獻53.5%在Hap I上攜有等位基因之血漿DNA片段。另一方面,不存在胎盤對在Hap II上攜有等位基因之血漿DNA片段之貢獻。因此,甲基化解卷積分析已精確預測胎兒自母親遺傳Hap I。可使用與I型及/或II型標記物重疊之CpG位點達成較大精確性。
作為另一實例,為了展示此方法之實際效用,募集另一懷孕女性。獲取母體外周血。血液樣品分離為血漿及細胞組分。使用Illumina HumanOmni2.5-8 BeadChip陣列分析母體白血球層。吾人使用IMPUTE2 (Howie等人 PLoS Genet. 2009;7:e1000529)推論染色體1p之端粒末端上之5 Mb區域上之851個雜合SNP之相。單倍型定相係基於1000個基因組之參考單倍型(mathgen.stats.ox.ac.uk/impute/1000GP_Phase3.tgz)。
在獲得定相單倍型之後,連接至兩種單倍型之CpG位點用於進行甲基化解卷積。雜合SNP之相同血漿DNA分子上之所有CpG位點用於解卷積分析。在此實例中,此等CpG位點中無一者與I型或II型標記物重疊。在851個用於解卷積之SNP中,820個(96.2%)在內含子及基因間區域上。其中無一者與CpG島或岸重疊。
| Hap I | Hap II |
肝臟 | 0 | 0 |
肺 | 0 | 5.4 |
結腸 | 0 | 6.2 |
小腸 | 0 | 0 |
胰臟 | 0 | 25 |
腎上腺 | 0 | 0 |
食道 | 0 | 0 |
脂肪組織 | 0 | 17.8 |
心臟 | 0 | 0 |
大腦 | 0 | 0 |
T細胞 | 11 | 7.9 |
B細胞 | 0 | 0 |
嗜中性白血球 | 20.2 | 28.4 |
胎盤 | 68.9 | 9.3 |
表 8 .
Hap I及Hap II之甲基化解卷積。
表8顯示自一組參考單倍型推論之兩種母體單倍型上攜有等位基因之血漿DNA片段之解卷積。兩種單倍型命名為Hap I及Hap II。推論之Hap I具有顯著高於Hap II之量的胎盤貢獻,即68.9%相對於9.3%。因此,推論母體Hap I已由胎兒遺傳。依賴於單倍型推論之母體遺傳與來自母體及胎兒基因型之結果一致。
此方法之優勢為不限於胎兒之父親為純合且胎兒之母親為雜合之SNP。實際上,在以上實例中,吾人已在不知曉或推論父體基因型或單倍型的情況下進行分析。此為優於上述方法之優勢((Lo等人 Sci Transl Med 2010; 2: 61ra91;美國專利8,467,976;Fan等人 Nature 2012; 487: 320- 324;Kitzman等人 Sci Transl Med 2012; 4: 137ra76)。
在一些實施例中,第一單倍型之第一百分比貢獻可相比於基於胎兒DNA百分比濃度衍生之參考值以測定單倍型是否由胎兒遺傳。閾值可計算為例如(但不限於)胎兒DNA百分比濃度之1倍、1.2倍、1.4倍、1.6倍、1.8倍、2倍、2.2倍、2.4倍、2.6倍或2.8倍。以此方式,若第一百分比貢獻足夠大,則不需要測定第二單倍型之第二百分比貢獻。
在一些實施例中,遺傳性單倍型可具有胎兒分率雙倍之解卷積分率濃度且非遺傳性單倍型具有不顯著貢獻。非遺傳性單倍型之貢獻可不具有零貢獻,因為父體單倍型可由於一些父體等位基因可與母體等位基因相同而對此分析給出噪聲。若噪聲程度高,則可測定第二單倍型之百分比貢獻,且具有較高解卷積分率之單倍型可推論為由胎兒遺傳。
一些實施方案可使用參考值測試兩種單倍型以證實僅遺傳一種。若似乎遺傳兩者,則兩個百分比貢獻可彼此相比。另外,若似乎遺傳兩者,則可檢驗父體基因組,因為胎兒可能遺傳匹配非遺傳之母體單倍型之父體單倍型。
在其他實施例中,第二百分比貢獻可用於測定參考值,例如第二百分比貢獻加上臨限值。因此,參考值可為第二百分比貢獻與臨限值之總和。
2. 父體單倍型
在另一實施例中,甲基化解卷積分析可應用於父體單倍型遺傳之分析。
圖12B顯示根據本發明之實施例之父體單倍型甲基化分析之說明。甲基化解卷積可對在父體Hap III及Hap IV上攜有等位基因之母體血漿DNA片段進行。由於胎兒已遺傳Hap III,相比於Hap IV,Hap III之胎盤貢獻將較高。因此,可推論胎兒之父體遺傳。
此實施例具有優於前述基於父體特異性等位基因之分析之方法的優點。舉例而言,對於SNP位置1,A等位基因存在於父親中,但不存在於母親中。因此,母體血漿中之父體特異性A等位基因之偵測指示由胎兒遺傳Hap III。然而,對於位置2處之SNP,C及T等位基因均不為胎兒特異性的。在此情況下,無法使用父體特異性等位基因分析。然而,甲基化解卷積分析不需要存在父體特異性等位基因。因此,在父親及母親兩者中雜合之SNP可用於兩種父體單倍型之甲基化解卷積分析。
因此,如用於母體單倍型之類似方法可用於測定遺傳何種父體單倍型。在圖12B中,Hap III之胎盤貢獻將高於Hap IV之胎盤貢獻。父體單倍型可以可測定母體單倍型之相同或類似方式測定。
3. 使用解卷積之方法
圖13為說明使用根據本發明之實施例之甲基化解卷積測定來自母體樣品之胎兒基因組之一部分之方法1300的流程圖。生物樣品包括來自複數種組織類型,包括母體組織類型及胎兒組織類型之游離之DNA分子的混合物。胎兒具有父親及為懷孕女性之母親。胎兒基因組部分可為整個染色體複本或染色體複本之僅一部分。胎兒基因組之測定部分可經組合以提供關於胎兒基因組之不同部分,至多整個胎兒基因組之資訊。
在步驟1310處,分析來自生物樣品之複數個游離之DNA分子。步驟1310可使用圖1之方法100之步驟140中所述之技術進行。舉例而言,可分析至少1,000個游離之DNA分子以測定游離之DNA分子所位於之位置,且甲基化程度可如下所述地量測。另外,分析游離之DNA分子以測定游離之DNA分子之各別等位基因。舉例而言,DNA分子之等位基因可測定自獲自定序或獲自雜交至DNA分子之特定探針之序列讀數,其中兩種技術均可提供序列讀數(例如探針可在存在雜交時視為序列讀數)。
在步驟1320處,測定胎兒之第一親體之第一親體基因組之第一染色體區域之第一單倍型及第二單倍型。熟習此項技術者將瞭解測定親體之單倍型的各種技術。單倍型可測定自與用於測定下文甲基化程度相同的樣品或測定自不同樣品。在一些實施方案中,單倍型可測定自細胞樣品,例如血液樣品之白血球層或另一器官之組織。測定單倍型之實例提供於美國專利第8,467,976號中,其以全文引用的方式併入本文中。第一親體可為母親或父親。偵測親體單倍型之方法的其他實例包括(但不限於)由Fan等人(Nat Biotechnol 2011; 29: 51-57)、Snyder等人(Nat Rev Genet 2015; 16: 344-358)描述之方法、來自10X Genomics之GemCode技術(www.10xgenomics.com/)及來自Cergentis之靶向基因座擴增(TLA)技術(www.cergentis.com/)。
在步驟1330處,一或多個雜合基因座鑑別自第一及第二單倍型。各雜合基因座具有第一單倍型中之對應第一等位基因及第二單倍型中之對應第二等位基因。一或多個雜合基因座可為第一複數個雜合基因座,其中第二複數個雜合基因座可對應於不同染色體區域。
在步驟1340處,鑑別第一組複數個游離之DNA分子。複數個游離之DNA分子中之每一者位於來自步驟1330之雜合基因座中的任一者處且包括對應第一等位基因,以使得游離之DNA分子可鑑別為對應於第一單倍型。可能的是游離之DNA分子位於大於一個雜合基因座處,但通常,一個讀數將僅包括一個雜合基因座。第一組游離之DNA分子中之每一者亦包括N個基因組位點中之至少一者,其中基因組位點用於量測甲基化程度。N為整數,例如大於或等於2、3、4、5、10、20、50、100、200、500、1,000、2,000、或5,000。因此,游離之DNA分子之讀數可指示1位點、2位點等的覆蓋度。
在步驟1350處,使用第一組複數個游離之DNA分子量測N個基因組位點(例如CpG位點)處之N個第一混合物甲基化程度。可對於N個基因組位點中之每一者量測一個第一混合物甲基化程度。步驟1350可以與圖1之方法100之步驟150類似之方式進行。在一些實施例中,DNA分子之甲基化程度之量測可使用甲基化感測定序結果,其亦可用於測定DNA分子之位置及各別等位基因。熟習此項技術者將瞭解可用於測定DNA分子上之位點之甲基化狀態的各種技術。
在步驟1360處,使用N個第一甲基化程度測定混合物中之胎兒組織類型之第一百分比貢獻。在一些實施例中,步驟1360可經由圖1之方法100之步驟160及170進行。因此,可對於一組M種組織類型同時測定百分比貢獻。步驟1360可使用對於M種組織類型中之每一者測定之N個基因組位點之N個組織特異性甲基化程度,例如圖1之方法100之步驟120。
在步驟1370處,鑑別第二組複數個游離之DNA分子。複數個游離之DNA分子中之每一者位於來自步驟1330之雜合基因座中的任一者處且包括對應第二等位基因,以使得游離之DNA分子可鑑別為對應於第二單倍型。第二組游離之DNA分子中之每一者亦包括N個基因組位點中之至少一者,其中基因組位點用於量測甲基化程度。
在步驟1380處,使用第二組複數個游離之DNA分子量測N個基因組位點之N個第二混合物甲基化程度。步驟1380可以類似於步驟1350的方式進行。
在步驟1385處,使用N個第二甲基化程度測定混合物中之胎兒組織類型之第二百分比貢獻。步驟1385可以類似於步驟1360的方式進行。
在步驟1390處,計算第一百分比貢獻與第二百分比貢獻之間的第一分離值。分離值之實例描述於本文中,例如包括差值或比率。
在步驟1395處,基於第一分離值在一或多個雜合基因座處測定胎兒基因組之部分。因此,可測定第一親體之遺傳單倍型。舉例而言,第一分離值可為第一百分比貢獻與第二百分比貢獻的比率。當比率大於臨限值時,胎兒基因組之部分可測定為具有第一單倍型之一或多個複本且無第二單倍型之複本。臨限值之實例包括(但不限於)1.3、1.4、1.5、1.6、1.8、2.0、2.2、2.4、2.6、2.8及3.0。當比率小於臨限值時,胎兒基因組之部分可測定為具有第二單倍型之一或多個複本且無第一單倍型之複本。臨限值之實例包括(但不限於)0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7及0.8。當比率等於閾值內之一者時,胎兒基因組之部分可測定為具有第一單倍型及第二單倍型。閾值之實例包括(但不限於)0.85、0.9、0.95、1.0、1.05、1.1及1.15。當兩個親體在分析之區域中具有相同單倍型時,可遺傳兩種單倍型。
作為另一實例,第一分離值為第一百分比貢獻與第二百分比貢獻之差值。當差值大於臨限值時,胎兒基因組之部分可測定為具有第一單倍型之一或多個複本且無第二單倍型之複本。臨限值之實例包括(但不限於)1%、1.5%、2%、2.5%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、10%、12%、14%、16%、18%及20%。當差值小於臨限值,例如當臨限值為負數時,胎兒基因組之部分可測定為具有第二單倍型之一或多個複本且無第一單倍型之複本。
亦可測定另一親體之遺傳單倍型。舉例而言,可在另一親體之基因組中鑑別第一染色體區域之第二複數個雜合基因座。可對於另一親體之單倍型中之每一者測定百分比貢獻,且分離值可用於測定另一親體之遺傳單倍型。
舉例而言,第一複數個雜合基因座及第二複數個雜合基因座可為相同基因座或不同。第二複數個雜合基因座中之每一者可包括另一親體之第一單倍型(例如第一父體單倍型)組之對應第三等位基因及另一親體之第二單倍型(例如第二父體單倍型)中之對應第四等位基因。第三及第四等位基因可與第一及第二等位基因相同。除第一親體之第一及第二組游離之DNA分子以外,第三組複數個游離之DNA分子可各位於第二複數個雜合基因座中的任一者處,包括雜合基因座之對應第三等位基因,且包括K個基因組位點中之至少一者。K個基因組位點可與用於第一親體之N個基因組位點相同或不同。以與第一親體類似之方式,可使用第三組的第二複數個游離之DNA分子在K個基因組位點量測K第三混合物甲基化程度,且可使用K第三甲基化程度測定混合物中之胎兒組織類型之第三百分比貢獻。第三百分比貢獻對應於另一親體之第一單倍型(例如第一父體單倍型)。
第四組複數個游離之DNA分子可各位於第二複數個雜合基因座中的任一者處,包括雜合基因座之對應第四等位基因,且包括K個基因組位點中之至少一者。因此,第四組DNA可用於測試另一親體之第二單倍型。可使用第四組的第二複數個游離之DNA分子量測K個基因組位點之K第四混合物甲基化程度,且可使用K第四甲基化程度測定混合物中之胎兒組織類型之第四百分比貢獻。可計算第三百分比貢獻與第四百分比貢獻之間的第二分離值,且可基於第二分離值測定第二複數個雜合基因座處之胎兒基因組之部分。來自另一親體之遺傳單倍型可以與用於第一親體類似之方式測定。第四百分比貢獻對應於另一親體之第二單倍型(例如第二父體單倍型)。
在一些實施例中,不需要測定第二百分比貢獻。取而代之,若對應百分比貢獻足夠高,則單倍型可測定為遺傳的。舉例而言,第一百分比貢獻可相比於參考值以測定胎兒是否在第一染色體區域遺傳第一單倍型。當第一百分比貢獻超過參考值時,胎兒可測定為在第一染色體區域遺傳第一單倍型。
在其他實施例中,參考值可測定自第二百分比貢獻。舉例而言,參考值可為第二百分比貢獻與臨限值之總和。與臨限值之總和可確保第一百分比貢獻充分地大於第二百分比貢獻。
可藉由比較第二百分比貢獻與參考值對第二單倍型進行遺傳之分開測定以測定胎兒是否在第一染色體區域遺傳第二單倍型。當第二百分比貢獻超過參考值時,胎兒可測定為在第一染色體區域遺傳第二單倍型。若兩個百分比貢獻均測定為超過參考值,則兩個百分比貢獻可彼此相比以測定一者是否顯著大於另一者(例如使用臨限值)。可測定另一親體之單倍型以鑑別此等單倍型中的一者是否與第一親體之單倍型相同,進而解釋可遺傳第一親體之兩種單倍型。
C . 使用甲基化程度測定遺傳單倍型
其他實施例可使用游離胎兒DNA之一般低甲基化將遺傳單倍型鑑別為具有較低總甲基化程度之一者。實施例可以推論之母體或父體單倍型起始,且接著量測彼等推論之單倍型中之每一者中含有SNP等位基因之血漿DNA分子之甲基化程度。在分析母體單倍型之一個實施方案中,可比較兩個推論母體單倍型之甲基化程度,且具有較低甲基化程度之一者將預測為由胎兒遺傳之單倍型。在分析父體單倍型之另一實施方案中,可比較兩個推論父體單倍型之甲基化程度,且具有較低甲基化程度之一者將預測為由胎兒遺傳之單倍型。
1. 實例
舉例而言,可測定兩種母體單倍型中之每一者之甲基化程度。由於胎盤組織相比於其他組織相對低甲基化,吾人預期由胎兒遺傳之母體單倍型將比不由胎兒遺傳之單倍型更低甲基化。使用母親之實際單倍型在母體血漿中測試甲基化密度,該等單倍型使用母體、父體及胎兒基因型推論。
| Hap I | Hap II |
總甲基化密度 | 65% | 87% |
表 9 .
實際Hap I及Hap II之甲基化密度。
表9顯示母體血漿中之兩種母體單倍型之甲基化密度。由於Hap I為根據基因分型由胎兒遺傳之實際單倍型,單倍型之甲基化分析結果恰當地鑑別遺傳。
在其他實施例中,可基於單獨的母親基因型推論母體單倍型,或來自單倍型資料庫之群體之參考單倍型亦可用於此分析。用於此實例之母體單倍型使用IMPUTE2程式定相。因此,推論之母體單倍型亦可用於此分析。
| Hap I | Hap II |
總甲基化密度 | 68% | 76% |
表 10 .
推論之Hap I及Hap II之甲基化密度。
表10顯示母體血漿中之兩種推論之母體單倍型之甲基化密度。由胎兒遺傳之推論之母體單倍型具有較低甲基化密度。可用於測定一種單倍型是否具有足夠較低的甲基化密度之統計程序之實例包括卡方檢驗(chi-square test)。可能需要兩個甲基化程度之間的分離足夠大(例如大於臨限值)以進行測定。若分離不足,則可進行不確定分類。在一些實施例中,兩種單倍型之遺傳之測定可測定分離是否不足夠大且兩個甲基化程度是否均低於臨限值水準,其可藉由包括胎兒DNA表徵。舉例而言,表9及10指示低於70%之甲基化密度可指示胎兒遺傳該單倍型。當親體對於分析之區域共用單倍型時,可遺傳兩種單倍型。
在另一實施例中,可比較攜有父體Hap III及Hap IV之母體血漿DNA之總甲基化密度。與母體單倍型分析類似,胎兒將推論為遺傳具有較低總甲基化密度之父體單倍型。
2. 使用甲基化程度之方法
圖14為說明使用根據本發明之實施例之甲基化程度測定來自母體樣品之胎兒基因組之一部分之方法1400的流程圖。生物樣品包括來自複數種組織類型,包括母體組織類型及胎兒組織類型之游離之DNA分子的混合物。胎兒具有父親及為懷孕女性之母親。胎兒基因組部分可為整個染色體複本或染色體複本之僅一部分。胎兒基因組之測定部分可經組合以提供整個胎兒基因組,如同本文所述之其他方法。
在步驟1410處,分析來自生物樣品之複數個游離之DNA分子。步驟1410可以與圖13之方法1300之步驟1310類似之方式進行。
在步驟1420處,測定胎兒之第一親體之第一親體基因組之第一染色體區域之第一單倍型及第二單倍型。步驟1420可以與圖13之步驟1320類似之方式進行。在一些實施例中,可使用來自第一親體之樣品,例如血液樣品或可包含或可不包含胎兒DNA之其他組織在複數個雜合基因座處測定第一親體之基因組之基因型。可獲得複數個參考單倍型,例如自參考基因組之資料庫。可使用基因型及複數個參考單倍型推論第一單倍型及第二單倍型。舉例而言,可相對於參考單倍型比較各基因型之等位基因,且可丟棄在對應基因座處不包括等位基因之任何單倍型。一旦保留兩個參考單倍型,彼等單倍型可鑑別為第一單倍型及第二單倍型。
在步驟1430處,自第一及第二單倍型鑑別複數個雜合基因座。各雜合基因座具有第一單倍型中之第一等位基因及第二單倍型中之第二等位基因。
在步驟1440處,鑑別第一組複數個游離之DNA分子。步驟1440可以與圖13之步驟1340類似之方式進行。
在步驟1450處,使用第一組複數個游離之DNA分子量測第一混合物甲基化程度。舉例而言,第一混合物甲基化程度可為第一組游離之DNA分子之甲基化密度。甲基化密度可計算為第一組之所有游離之DNA分子之總甲基化密度。在另一實例中,可對於各基因座計算分離甲基化密度,且分離甲基化密度可經組合以獲得第一混合物甲基化程度,例如分離甲基化密度之平均值。
在步驟1460處,鑑別第二組複數個游離之DNA分子。1460可以與圖13之步驟1370類似之方式進行。
在步驟1470處,使用第二組複數個游離之DNA分子量測第二混合物甲基化程度。舉例而言,第二混合物甲基化程度可為第二組游離之DNA分子之甲基化密度。
在步驟1480處,基於第一混合物甲基化程度及第二混合物甲基化程度中之何者較低測定由胎兒遺傳第一單倍型及第二單倍型中之何者。作為步驟1480之部分,可在第一混合物甲基化程度與第二混合物甲基化程度之間測定分離值,且相比於臨限值。臨限值可確保較低水準足夠低。臨限值可使用卡方檢驗測定。舉例而言,可對已知遺傳單倍型之樣品進行量測,且可測定分離值之分佈,且可選擇精確測定獲自樣品之訓練資料中之遺傳單倍型之臨限值。方法1300及1400亦可組合,其中各方法以檢查形式進行,且遺傳單倍型測定兩種方法是否彼此一致。
D . 基因座之選擇
各種實施例可用於比較母體血漿中兩種推論母體單倍型之甲基化程度或百分比貢獻。在一個實施例中,可在分析之前測定欲分析之SNP基因座數目。舉例而言,可根據多種因素,例如(但不限於)所需統計檢定力、所關注區域中胎盤及血球之甲基化程度平均差異及對於各SNP分析之分子數目,測定用於單倍型解卷積分析之SNP基因座數目。
所關注區域之尺寸可為固定的,且所關注區域內之所有SNP可用於分析。可考慮多種因素,例如(但不限於)所需統計檢定力、所關注區域中胎盤及血球之甲基化程度平均差異、對於各SNP分析之分子數目及與所關注區域減數分裂重組之機率,來測定所關注區域之尺寸。
在其他實施例中,在分析之前不測定SNP數目及欲分析區域的尺寸。舉例而言,SNP數目可依序增加直至資料足以獲得關於何種母體單倍型比另一者在統計學上顯著地較少甲基化之統計學上顯著結論。舉例而言,所關注區域上之SNPs可以其基因組座標之升序排列。接著,可用具有基因組座標之最低數目的SNP之資料進行統計測試。若此足以作出關於何種單倍型在統計學上較少甲基化之結論,則作出結論。類似地,SNPs可以足夠使用的基因組座標之最高數目降序排列。
若統計精確性不足,則可以具有基因組座標之較高數目的下一SNP為起始物進行另一統計比較。另一方面,若第一SNP之資料不足以得出一種單倍型比另一種較少甲基化(或百分比貢獻之間的分離值不足夠大)之結論,則可添加另一SNP之資料且進行另一輪統計測試。可繼續此程序直至累積資料足以作出統計顯著結論。可進行多個統計測試以比較兩種單倍型之甲基化程度,例如(但不限於)斯圖登氏t檢驗(Student's t-test)、曼-惠氏秩和檢驗(Mann-Whitney rank-sum test)及卡方檢驗。可基於結論之所需置信度測定統計顯著性程度,例如(但不限於)採用0.05、0.01、0.001、0.0001或0.00001之P-值。
E . 與 RHDO 之 組合
在一些實施例中,由美國專利8,467,976之RHDO分析產生的結果可與本發明甲基化實施例組合以達成較精確診斷程序或減少所需的定序量。舉例而言,可使用本發明實施例及使用美國專利8,467,976之RHDO分析之結果測定胎兒單倍型,且可比較測定自兩種技術之胎兒單倍型。舉例而言,兩個分析之結果將僅在其一致時為可接受的。若兩個分析顯示不同結論,則可進行其他分析,例如可以較高深度之覆蓋度對基因組重複量測。
為使此類組合方法最具成本效益,較佳具有可對於兩種方法產生資料之一種類型的定序。在一個實施例中,此可藉由將產生定序以及甲基化資訊之單分子方法進行,例如使用來自Pacific Biosciences之單分子實時定序技術,或奈米孔定序(例如來自Oxford Nanopore Technologies)。此等為甲基化感測定序之兩個實例。在另一實施例中,可對亞硫酸氫鹽定序結果進行RHDO分析。對於此類實施例,亦可使用亞硫酸氫鹽定序測定任何母體及父體基因資訊。亞硫酸氫鹽定序因此為甲基化感測定序之另一實例。此外,可使用其他甲基化感測定序技術,如氧化亞硫酸氫鹽定序(Booth等人 Science 2012; 336: 934-937)或Tet輔助亞硫酸氫鹽定序(Yu等人 Cell 2012; 149: 1368-1380)。後者實例將允許吾人分析所分析DNA分子之5-甲基胞嘧啶分佈。
F . 使用胎兒基因組之知識
胎兒基因組之非侵入性產前分析可用於測定胎兒是否自親體遺傳疾病。此特別適用於偵測單基因性疾病,例如先天性腎上腺增生(New等人 J Clin Endocrinol Metab 2014;99:E1022-30)、β-地中海型貧血(Lam等人 Clin Chem. 2012;58:1467-75)及遺傳性肌營養不良(Genet Med 2015;17:889-96)。若偵測到單基因性疾病,則可進行各種處理,例如可終止懷孕、在懷孕之前或出生之後提供之處理。舉例而言,類固醇處理可在產前向確認具有受先天性腎上腺增生影響之胎兒的懷孕女性給予以避免異常性發育。
VI . 非整倍性偵測之單倍型解卷積分析
單倍型解卷積亦可用於偵測胎兒之染色體區域之序列不平衡,如非整倍體、微缺失或微擴增(例如微重複)。舉例而言,一個區域中之單倍型之百分比貢獻可相比於另一區域中之另一單倍型之百分比貢獻。
A . 母親
圖15顯示對於根據本發明之實施例之母體單倍型基於單倍型解卷積之染色體非整倍性偵測。在此圖示中,母親具有兩個母體單倍型,即Hap I及Hap II。出於說明目的,吾人假定其血漿DNA之80%衍生自其自身細胞且20%衍生自胎盤,此為通常量測之範圍內的例示百分比。此方法可一般應用於具有不同胎兒DNA百分比之孕婦。不需要胎兒DNA百分比之知識,但僅提供用於說明,儘管胎兒DNA百分比之量測可以各種方法進行,例如使用胎兒特異性等位基因或胎兒特異性甲基化標記物。
胎兒遺傳Hap I且另一單倍型來自父親,即Hap III。胎盤衍生之DNA將展現胎兒基因型,且可藉由分析產生於胎盤衍生之DNA之百分比貢獻偵測序列不平衡。
如上文所說明,可經由兩種母體單倍型之解卷積測定母體單倍型之胎兒遺傳。可對於兩種母體單倍型中之每一者進行胎盤對母體DNA之貢獻的分析。相比於不由胎兒遺傳之母體單倍型(Hap II),由胎兒遺傳之母體單倍型(在此實例中為Hap I)將具有高得多的胎盤貢獻。Hap I之胎盤貢獻將與母體血漿中之胎兒DNA百分比濃度正相關。
在測定由胎兒遺傳何種母體單倍型之後,可經由母體單倍型解卷積進一步測定胎兒自母親遺傳之染色體之劑量。在此圖示中,使用母體單倍型解卷積分析兩個染色體區域。在一個實施例中,參考染色體(RefChr)為不太可能受染色體非整倍性影響之染色體或染色體區域。參考染色體區域顯示於圖15之左側。目標染色體(TargetChr)為潛在地受染色體非整倍性影響之染色體或染色體區域。目標染色體區域顯示於圖15之右側。兩個區域可為相同染色體之不同區域或兩種不同染色體之區域。
在所示之實例中,已經由各區域之Hap I及Hap II之甲基化解卷積推論胎兒對於參考染色體及目標染色體兩者自母親遺傳Hap I。接著,可在參考染色體與目標染色體之間比較關於Hap I之母體血漿DNA之胎盤貢獻。若目標染色體區域之Hap I之胎盤貢獻顯著不同於參考染色體區域之Hap I之胎盤貢獻(例如由於擴增較高或由於缺失較低),則可鑑別序列不平衡。
出於說明目的,吾人使用三染色體性之偵測作為實例。然而,亦可使用此方法偵測其他類型之染色體非整倍體(包括單染色體)、次染色體區域之擴增或次染色體區域之缺失。對於三染色體性,可自父親(表示為三染色體性(F))或母親(表示為三染色體性(M))遺傳受影響染色體之額外複本。在超過90%的第21對染色體三體症病例下,染色體21之額外複本衍生自母親(Driscoll等人 N Engl J Med 2009;360: 2556- 2562)。在三染色體(M)之情形下,目標染色體之Hap I之胎盤貢獻將高於參考染色體。在圖15中,三染色體(M)藉由Hap I之兩個實例顯示,其將對於目標區域提供比Hap I之一個實例對於參考區域高的胎盤貢獻。
可藉由比較兩個胎盤貢獻之間的分離值及臨限值(其可基於胎兒DNA百分比之分開量測)測定Hap I對於目標染色體之胎盤貢獻是否高於對於參考染色體之貢獻。較高胎兒DNA百分比將導致兩個胎盤貢獻之間的較高預期分離值且因此臨限值可設定為較高。舉例而言,在胎兒DNA百分比為20%之情況下,Hap I對於參考區域之胎盤貢獻將為約20%且Hap I對於目標區域之胎盤貢獻將為約36.4%。
舉例而言,假定10個DNA分子存在於參考染色體處,則其中之兩個為胎兒且其中之八個為母體。對於兩個胎兒DNA分子,一個衍生自Hap I且一個衍生自Hap III。對於八個母體DNA分子,四個為Hap I且四個為Hap II。對於目標區域,將存在來自胎兒之Hap I之額外DNA分子。因此,將總共存在兩個胎兒Hap I DNA分子及4個母體Hap I DNA分子,提供2/6=33.3%。差值(例如13.3%)之臨限值可置於0與13.3%之間以提供最優特異性及敏感性。分離值之分佈可測定自參考樣品組。在整倍體之情境下,胎盤貢獻將大致相同,例如分離值將小於臨限值。基於本文及美國專利8,467,976及本文中所引用之其他參考文獻中之描述,熟習此項技術者將知曉如何選擇適合臨限值。
在一個實施例中,各已知懷有整倍體胎兒之一群懷孕女性之目標與參考染色體之間的Hap I之胎盤貢獻之比率(或其他分離值)可用作參考間隔。測試案例中之比率可相比於此參考組以測定是否關於目標區域相對於參考區域存在Hap I之胎盤貢獻的顯著升高。在20%胎兒DNA的實例中,比率將為33.3/20=1.67。比率可一般為2/(1+f),其中f表示胎兒DNA百分比濃度。在另一實施例中,可測定目標與參考染色體之間的Hap I之胎盤貢獻之差值。此差值接著相比於參考組。
B . 父親
在另一實施例中,可在母體血漿中進行父體單倍型(Hap III及Hap IV)之單倍型解卷積。可以如關於母體單倍型類似之方式進行父體單倍型之分析。
圖16顯示對於根據本發明之實施例之父體單倍型基於單倍型解卷積之染色體非整倍性偵測。在此圖示中,父親具有兩個父體單倍型,即Hap III及Hap IV。如同圖15,胎兒自母親遺傳Hap I且自父親遺傳Hap III。
在染色體之額外複本衍生自父親(三染色體(F))之情形下,Hap III對於目標染色體之胎盤貢獻將高於對於參考染色體。此對於三染色體(F)實例顯示,其中顯示Hap III之兩個複本。如關於母體單倍型在上文所述,Hap III對於目標及參考區域之胎盤貢獻之間的分離值可相比於臨限值以測定目標區域是否存在Hap III之額外複本。在各種實施例中,測試案例之兩個胎盤貢獻之比率或差值可相比於各已知懷有整倍體胎兒之懷孕女性之參考組以測定胎兒是否具有目標染色體之染色體三染色體,或目標染色體區域之擴增或缺失。臨限值可基於整倍體胎兒之參考組、非整倍性胎兒之參考組或兩者之分離值。亦可使用胎兒DNA百分比之分開量測,如本文所述。
C . 偵測序列不平衡之方法
圖17為根據本發明之實施例使用來自懷孕女性之生物樣品偵測懷孕女性之未出生胎兒之胎兒基因組之一部分中之序列不平衡之方法1700的流程圖。
在步驟1710處,分析來自生物樣品之複數個游離之DNA分子。步驟1710可以與圖13之方法1300之步驟1310類似之方式進行。
在步驟1720處,測定胎兒之第一親體之第一親體基因組之目標染色體區域的第一目標單倍型,且測定第一親體基因組之參考染色體區域之第一參考單倍型。步驟1720可以與圖13之步驟1320類似之方式進行。目標染色體區域及參考染色體區域可為整個染色體或染色體之僅一部分。因此,目標染色體區域可為第一染色體且參考染色體區域可為不同於第一染色體之第二染色體。第一親體可為胎兒之母親或父親。
目標染色體區域可基於各種標準選擇。舉例而言,可選擇複數個目標區域,因為可能想到測試多個指定尺寸之非重疊區域,如1 Mb、5 Mb、10 Mb、20 Mb、50 Mb等。作為另一實例,可基於將區域鑑別為具有比預期更多的DNA分子之複本數分析選擇目標染色體區域,例如如美國專利公開案2009/0029377及2011/0276277中所述。
在一些實施例中,可測定胎兒自第一親體遺傳第一目標單倍型及胎兒自第一親體遺傳第一參考單倍型。測定可包括圖13或圖14之實施例。舉例而言,測定胎兒自第一親體遺傳第一目標單倍型可包括測定對應於第二目標單倍型之混合物中之胎兒組織類型之第二目標百分比貢獻、計算第一目標百分比貢獻與第二目標百分比貢獻之間的第二分離值及基於第二分離值測定胎兒自第一親體遺傳第一目標單倍型。
在步驟1730處,鑑別第一親體基因組之目標染色體區域之複數個目標雜合基因座。各目標雜合基因座包括第一親體基因組之第一染色體區域之第一目標單倍型種之對應第一目標等位基因及第二目標單倍型中之對應第二目標等位基因。返回參看圖15之實例,目標雜合基因座具有Hap I上之{G,T,A}之對應第一目標等位基因且具有Hap II上之{A,G,C}之對應第二目標等位基因。
在步驟1740處,鑑別目標組之複數個游離之DNA分子。目標組之各游離之DNA分子位於目標雜合基因座中的任一者處,包括對應第一目標等位基因,且包括目標染色體區域中之N個基因組位點中之至少一者。步驟1740可以與本文所述類似之方式進行。舉例而言,序列讀數可映射至參考基因組,其中目標組之複數個游離之DNA分子與目標雜合基因座中的任一者對準。
在步驟1750處,使用目標組之複數個游離之DNA分子量測N個基因組位點之N個第一混合物甲基化程度。步驟1750可以與圖13之步驟1350類似之方式進行。
在步驟1760處,使用N個第一甲基化程度測定混合物中之胎兒組織類型之第一百分比貢獻。步驟1760可以與圖13之步驟1360類似之方式進行。
在步驟1770處,對於第一親體基因組之參考染色體區域鑑別複數個參考雜合基因座。各參考雜合基因座包括第一親體基因組之參考染色體區域中之第一參考單倍型中之對應第一參考等位基因及第二參考單倍型中之對應第二參考等位基因。返回參看圖15之實例,參考雜合基因座具有Hap I上之{A,T,C}之對應第一目標等位基因且具有Hap II上之{T,C,A}之對應第二目標等位基因。
在步驟1775處,鑑別參考組之複數個游離之DNA分子。參考組之各游離之DNA分子位於參考雜合基因座中的任一者處,包括對應第一參考等位基因,且包括參考染色體區域中之K個基因組位點中之至少一者。
在步驟1780處,K參考混合物甲基化程度使用複數個游離之DNA分子之參考組量測於K個基因組位點。
在步驟1785處,使用K參考甲基化程度在混合物中測定胎兒組織類型之第一參考百分比貢獻。
在步驟1790處,計算第一目標百分比貢獻與第一參考百分比貢獻之間的第一分離值。
在步驟1795處,第一分離值相比於臨限值以確定胎兒是否對於目標染色體區域具有序列不平衡之分類。若第一分離值超過臨限值,則可鑑別序列不平衡。可如上文所述測定臨限值,例如基於不具有序列不平衡之樣品之參考組及/或具有序列不平衡之樣品之參考組中可見之分離值。作為實例,分類可對於測試之序列不平衡為正性、負性或不確定的。
取決於序列不平衡的類型,可使用不同臨限值。舉例而言,若序列不平衡為缺失,則第一分離值將預期為負值。在此情況下,臨限值可為負數,且該比較可根據為較大負數測定第一臨限值超過臨限值。若序列不平衡測試為擴增,則其可測試分離值是否大於臨限值。因此,使用之臨限值可取決於測試之序列不平衡的類型。
VII . 鑑別患病組織之簽名之解卷積
若已知基因組簽名(例如特定SNP等位基因),則實施例可測定何種組織為此類簽名之來源。由於展現簽名之游離之DNA分子來自源組織,源組織可鑑別自使用展現簽名之游離之DNA分子測定之百分比貢獻。因此,具有移植器官之簽名(例如移植器官之單倍型之簽名)之游離之DNA分子可用於在高敏感度下監測來自移植器官之游離之DNA分子之量的變化,例如鑒於混合物中之DNA之高百分比貢獻將來自移植器官。對於移植提供實例以顯示技術為精確的。在另一實例中,腫瘤之簽名可用於鑑別腫瘤所駐留之組織。
A . 器官移植
作為器官移植之實例,吾人分析接受肝臟移植之患者及接受骨髓移植之患者的血漿。對於各情況,經由來自患者及供體之組織的基因分型鑑別供體特異性SNP等位基因。對於肝臟移植受體,供體肝臟之生檢及受體之血細胞經定序。對於骨髓移植案例,頰黏膜拭子(受體基因型)及血細胞(供體基因型)經定序。血漿DNA樣品在亞硫酸氫鹽轉化之後定序。攜有供體特異性SNP等位基因及至少一個CpG位點之經定序DNA片段用於下游甲基化解卷積分析。對於接受肝臟及骨髓移植之患者分別定序總共7千2百萬及1.21億個讀數。對於兩種情況,38及5355個片段分別用於解卷積分析。
組織類型 | 肝臟移植受體 | 骨髓移植受體 |
肝臟 | 45.4 | 4.4 |
肺 | 0.0 | 1.5 |
結腸 | 29.3 | 6.3 |
小腸 | 0.0 | 1.8 |
胰臟 | 0.0 | 0.0 |
腎上腺 | 0.0 | 0.0 |
食道 | 0.0 | 0.0 |
脂肪組織 | 0.0 | 14.8 |
心臟 | 0.0 | 0.0 |
大腦 | 14.5 | 9.6 |
T細胞 | 0.0 | 12.3 |
B細胞 | 5.9 | 16.6 |
嗜中性白血球 | 4.9 | 32.8 |
表 6 .
兩個移植受體中不同器官對攜有供體特異性等位基因之血漿DNA片段之百分比貢獻。
表6顯示對肝臟移植受體及骨髓移植受體中攜有供體特異性等位基因之血漿DNA片段的甲基化解卷積分析。數目表示不同組織對供體特異性血漿DNA片段之百分比貢獻。對於肝臟移植案例,肝臟展示為此等DNA片段之最重要貢獻者。對於骨髓移植案例,造血系統(包括T細胞、B細胞及嗜中性白血球)為供體特異性DNA片段之主要貢獻。此等結果指示甲基化解卷積可精確指示具有單一核苷酸改變之DNA片段之組織來源。少量定序片段很可能由於量測不精確性歸因於其他組織,因為相對較小數目的供體特異性片段用於解卷積分析。
可以上述方式測定及監測與移植器官相關之組織的百分比貢獻。在基線百分比貢獻(參考百分比貢獻之實例)由於僅使用展現供體簽名之游離之DNA分子而相對較高之情況下,可偵測到血漿中之供體DNA之總量的較小變化。因此,甲基化解卷積分析可應用於監測器官移植。
如關於肝臟移植在上文可見,甲基化解卷積並非絕對特異性的。在此分析中,攜有供體特異性等位基因之血漿DNA片段用於甲基化解卷積分析。此等片段特異於供體且應僅衍生自此肝臟移植受體之肝臟。因此,肝臟之理論貢獻應為100%。另一可能性為某些細胞類型存在於不同類型的組織中,使得肝臟甲基化圖譜與其他組織重疊。舉例而言,肝臟中之結締組織細胞亦可存在於其他器官中。但可鑑別來自其他患者或本發明患者之其他樣品(例如在其他時間)之相對百分比是否釋放更多游離之DNA分子。
在各種實施例中,供體簽名可對應於供體基因組之特定單倍型或染色體區域中之兩種單倍型。甲基化解卷積可使用位於特定供體單倍型上之游離之DNA分子進行,且可監測特定單倍型之百分比貢獻之增加。若出現顯著增加(例如如藉由百分比或絕對臨限值所量測),則可鑑別移植器官之排斥反應。
圖18顯示根據本發明之實施例用於器官移植監測之單倍型解卷積之圖示。供體具有標記為Hap I及Hap II之單倍型,且受體具有標記為Hap III及Hap IV之單倍型。供體具有基因座1及基因座3處之簽名,因為等位基因未發現於受體單倍型上。基因座2及基因座4不具有供體簽名。因此,實施例可使用位於基因座1及基因座3處之DNA分子作為解卷積方法之部分。
血漿DNA解卷積可用於測定來自移植器官之經測定百分比貢獻在基線處或相對於基線增加。在一些實施例中,若存在不同簽名,則可對於Hap I及Hap II中之每一者分別測定百分比貢獻;此類不同簽名可存在於不同基因座處。在其他實施例中,可對於兩種單倍型測定單一百分比貢獻,例如當其共用簽名時。在圖18中所示之實例中,Hap I及Hap II在基因座1及基因座3處共用簽名。
因此,可使用單倍型解卷積測定移植器官之貢獻。單倍型對移植器官之貢獻的增加將適用於指示器官對血漿DNA增加的貢獻。在各種實施例中,基線水準可測定自不具有排斥反應之移植受體群體或具有排斥反應之移植受體群體。當使用具有排斥反應之受體時,基線水準可測定為低於來自具有排斥反應之移植受體群體之彼等。
如上所述,供體可具有兩個一致單倍型或受體亦可具有兩個一致單倍型。此外,供體及受體可共用單倍型。只要供體或受體具有獨特單倍型,可測定來自供體組織之游離之DNA分子之百分比的變化。在前者中,將在看見血漿(或其他樣品)中之供體獨特性單倍型之貢獻增加時偵測到排斥反應。在後者中,將在看見血漿中之受體獨特性單倍型之貢獻減少時偵測到排斥反應。
因此,一些實施例可使用存在於生物體之正常細胞中且不存在於可在混合物中之異常細胞中的第一單倍型。此將對應於上文後一實例,當受體具有獨特單倍型時。另一實例為當患者具有相比於腫瘤之健康細胞中之獨特單倍型時(例如先前發現於生物體中)。在此實施例中,當第一分離值小於臨限值時,第一組織類型可測定為具有疾病病況。
在一些實施例中,若移植器官偵測為遭排斥,則可提供處理。舉例而言,可提供為抗排斥反應藥物之劑量的變化。作為另一實例,可獲得新器官,且可進行手術以移除舊移植的器官且放入新移植的器官。
B . 肝細胞癌 ( HCC )
作為測定癌症簽名或偏差之源組織(或監測已知存在或已存在之腫瘤)之實例,吾人分析HCC患者之血漿。患者之腫瘤及血細胞經定序以鑑別癌症特異性單核苷酸突變。攜有癌症特異性突變及至少一個CpG位點之經定序DNA片段用於下游甲基化解卷積分析。總共11,968個片段用於解卷積分析。除來自正常組織器官之甲基化圖譜以外,吾人亦包括HCC組織之甲基化圖譜作為候選源組織。
在另一實施例中,更多類型之腫瘤組織可視為用於突變之候選組織。在一個實施例中,常見癌症,例如(但不限於)結腸直腸癌、肺癌、乳癌、胰臟癌、前列腺癌、膀胱癌、子宮頸癌及卵巢癌之甲基化圖譜可包括為候選組織。在另一實施例中,僅最可能的特異於患者之癌症可包括於分析中。舉例而言,在女性患者中,考慮乳癌、卵巢癌、結腸直腸癌及子宮頸癌。在另一實施例中,在候選組織之選擇中考慮種族本源及年齡。
表7顯示攜有癌症相關突變之血漿DNA片段之甲基化解卷積。解卷積分析精確測定攜有癌症相關突變之DNA片段主要衍生自肝癌組織。
組織 | 貢獻 ( % ) | |
肝臟 | 0.0 |
肺 | 0.0 |
結腸 | 0.0 |
小腸 | 0.0 |
胰臟 | 0.0 |
腎上腺 | 0.0 |
食道 | 0.0 |
脂肪組織 | 0.0 |
心臟 | 0.0 |
大腦 | 0.0 |
T細胞 | 0.0 |
B細胞 | 0.0 |
中性粒細胞 | 4.6 |
肝癌 | 95.4 |
胎盤 | 0.0 |
表 7 .
使用癌症突變之HCC患者之百分比貢獻。
在一些實施例中,腫瘤可起初藉由偵測拷貝數變異鑑別,例如如美國專利第8,741,811號及第9,121,069號中所述。可基於各種腫瘤中先前鑑別之拷貝數變異之模式測定特定源組織,例如如美國專利申請案14/994,053中所述。一旦已鑑別腫瘤,可進行治療,例如藉由手術、放射線療法或化學療法。無論如何,可在測定源組織之後獲得生檢。癌症特異性點突變可測定自生檢或測定自血漿中之DNA片段(例如如美國專利公開案2014/0100121中所述,或與拷貝數變異相關之其他混合物。
在治療後,關鍵變化將為基因組偏差,包括拷貝數變異及點突變之消失。當此等偏差消失時,受影響區域中之點突變之基因組簽名之分析將經由甲基化解卷積分析得到組織貢獻之變化。若腫瘤在將來恢復,則將再次可見組織組成中之癌症相關變化(如使用甲基化解卷積分析測定)。舉例而言,百分比貢獻可相比於參考百分比貢獻,且若偵測到變化,則可提供新治療時程。
在各種實施例中,癌症特異性突變可僅在一種單倍型上或在兩種單倍型上,例如以與上文供體實例類似之方式。因此,若存在不同簽名,則如同供體,可分別對於Hap I及Hap II中之每一者測定百分比貢獻;此類不同簽名可存在於不同基因座處。在其他實施例中,可對於兩種單倍型測定單一百分比貢獻,例如當其共用簽名時。
C . 印跡
在另一實施例中,單倍型解卷積分析可應用於顯示組織特異性印跡之基因組區域之分析。已顯示不同組織器官中之父體及母體遺傳等位基因之差異性甲基化為正常現象(Baran等人 Genome Res 2015;25:927-36)。單倍型解卷積將適用於監測展現組織特異性印跡之器官的貢獻。舉例而言,當父體及母體遺傳單倍型在肝臟中但不在其他組織中具有不同甲基化狀態時,可對父體及母體遺傳單倍型兩者進行甲基化解卷積。在一個實施例中,父體及母體甲基化模式均可包括為分析中之候選組織。
D . 使用基因組簽名之方法
圖19為說明分析生物體之生物樣品以偵測第一組織類型是否具有與根據本發明之實施例之第一單倍型相關之疾病病況之方法1900的流程圖。生物樣品包括來自複數種組織類型(包括第一組織類型)之游離之DNA分子之混合物。至少部分使用電腦系統進行方法1900。
在步驟1910處,分析來自生物樣品之複數個游離之DNA分子。步驟1910可使用圖1之方法100之步驟140中所述之技術進行。舉例而言,可分析至少1,000個游離之DNA分子以測定游離之DNA分子所位於之位置,且甲基化程度可如下所述地量測。另外,分析游離之DNA分子以測定游離之DNA分子之各別等位基因。舉例而言,DNA分子之等位基因可測定序列讀數或雜交至DNA分子之特定探針。
在步驟1920處,鑑別一或多個基因座。各基因座在第一染色體區域之第一單倍型上具有第一等位基因。第一單倍型具有以下特性中之任一者:(1)不存在於生物體之健康細胞中,但可替代地來自腫瘤或移植組織(作為實例);或(2)存在於生物體之正常細胞中且不存在於可在混合物中之異常細胞中。因此,第一單倍型具有基因組簽名。以此方式,健康(正常)細胞與異常細胞之間存在差異,進而允許實施例追蹤一者或另一者或兩者之百分比貢獻,以追蹤異常細胞之程度(例如百分比貢獻)。在特性(1)之情況下,第一單倍型與疾病病況,例如癌症或移植組織之排斥反應相關聯。因此,特定癌症可在該特定癌症之癌症基因組中具有第一單倍型。
可藉由獲得組織樣品(例如腫瘤或移植組織)及分析組織樣品之DNA分子以測定第一單倍型來鑑別第一單倍型上之一或多個基因座處之一或多種第一等位基因。此類組織樣品可獲自生檢,且方法1900可用於測試癌症是否已轉移至其他組織,或是否在術後復發。基因座中的每一者可為異常細胞中之雜合基因座或純合基因座。舉例而言,在圖18中,基因座1及基因座3在供體器官中純合。但最後,將對於所有基因座在血漿中觀測到超過一個等位基因,因為各基因座將對於健康細胞或對於異常細胞具有簽名。因此,將跨越組織類型存在兩種單倍型,但單一組織類型可在分析區域中僅具有一種單倍型。
在步驟1930處,鑑別第一組複數個游離之DNA分子。複數個游離之DNA分子中之每一者位於來自步驟1920之基因座中的任一者處且包括一個基因座處之對應第一等位基因,以使得游離之DNA分子可鑑別為對應於第一單倍型。第一組游離之DNA分子中之每一者亦包括N個基因組位點中之至少一者,其中基因組位點用於量測甲基化程度。N為整數,例如大於或等於2、3、4、5、10、20、50、100、200、500、1,000、2,000或5,000。
在步驟1940處,使用第一組複數個游離之DNA分子量測N個基因組位點之N個第一混合物甲基化程度。可對於N個基因組位點中之每一者量測一個第一混合物甲基化程度。步驟1940可以與圖1之方法100之步驟150類似之方式進行。在一些實施例中,DNA分子之甲基化程度之量測可使用甲基化感測定序結果,其亦可用於測定DNA分子之位置及各別等位基因。
在步驟1950處,使用N個第一甲基化程度測定混合物中之第一組織類型之第一百分比貢獻。在一些實施例中,步驟1950可經由圖1之方法100之步驟160及170進行。因此,可對於一組M種組織類型同時測定百分比貢獻。步驟1950可使用對於M種組織類型中之每一者測定之N個基因組位點之N個組織特異性甲基化程度,例如如同圖1之方法100之步驟120。
在步驟1960處,計算第一百分比貢獻與參考百分比貢獻之間的分離值。分離值之實例描述於本文中。參考百分比貢獻可使用來自就第一組織類型而言健康之生物體的樣品測定。對於移植實例,參考百分比貢獻可測定自移植之第一組織不遭排斥之生物體之生物樣品的一或多次量測。
在步驟1970處,分離值可相比於臨限值以確定第一組織類型是否具有疾病病況之分類。舉例而言,若第一單倍型與癌症相關聯,則可觀的第一百分比貢獻指示第一組織類型具有癌症,如可藉由超出臨限值之分離值量測(例如當參考百分比貢獻為零時)。第一百分比貢獻超過臨限值之量可指示癌症之某一程度。作為另一實例,第一單倍型可特異於移植組織,且相對於參考之高貢獻可指示生物體排斥移植組織。
在第一單倍型存在於生物體之正常細胞中且不存在於可在混合物中之異常細胞中的一個實施例中,當第一分離值小於臨限值時,第一組織類型可測定為具有疾病病況。疾病病況之實例為先兆子癇,其可與如胎盤之胎兒組織之病理學變化譜相關聯。舉例而言,在此類情況下,若第一單倍型特異於胎兒,例如父體遺傳單倍型,則其可在併發先兆子癇之孕婦之母體血漿中增加。
在一些實施例中,亦可使用用於患病組織,例如移植組織或腫瘤之第二單倍型。因此,可計算第二百分比貢獻且相比於參考百分比貢獻。因此,第二組複數個游離之DNA分子可各位於一或多個基因座中的任一者處,包括第一染色體區域之第二單倍型上之對應第二等位基因,且包括N個基因組位點中之至少一者。第二單倍型將具有僅來自健康細胞或異常細胞之相同特性。
可測試複數種組織類型(例如使用圖1之方法100),以測定第一單倍型之源組織,例如當其與癌症相關聯時。因此,可使用N個第一甲基化程度測定混合物中之其他組織類型之百分比貢獻,且對應百分比貢獻與各別參考百分比貢獻之間的對應分離值可相比於臨限值以確定其他組織類型中之每一者是否具有特定癌症之分類。不同組織可具有不同參考百分比貢獻。
VIII. 鑑別癌症之 CNA 之源組織
在一些實施例中,腫瘤之來源可並非已知。因此,可能難以鑑別腫瘤中之點突變,如可用於圖19之方法1900或本文所述之其他方法。另外,腫瘤可不具有大量點突變,但可具有展現擴增及缺失(拷貝數變異之實例)之染色體區域。
為了解決此問題,實施例可使用複本數分析鑑別展現拷貝數變異(CNA)之區域。通常,CNA僅出現於區域之一種單倍型上。由於僅一種單倍型具有擴增或缺失,將在腫瘤駐留之組織類型之百分比貢獻之間存在相對較大差異。
CNA分析可以多種方式進行,例如如美國專利第8,741,811號及第9,121,069號中所述。舉例而言,人類基因組(或其他類型的生物體之基因組)可分割成大致3,000個非重疊1 Mb分區。可測定映射至各1 Mb分區之讀數數目。在對GC偏差進行校正(Chen EZ等人 (2011)
PLoS One
6(7):e21791)之後,可計算各分區之序列讀數密度。對於各分區,測試案例之序列讀數密度可相比於參考對照個體之值。複本數增減可分別定義為高於及低於對照之平均值3個標準差。因此,可基於位於第一染色體區域中之游離之DNA分子之第一量將第一染色體區域鑑別為展現拷貝數變異。
為了測定血漿中之拷貝數變異之組織來源,可使用位於展現血漿中之此類偏差之基因組區域內之甲基化標記物進行血漿DNA組織映射。在關於癌症患者之以下實例中,僅在偏差影響至少30 Mb之連續染色體區域之情況下進行血漿DNA拷貝數變異之映射以使得足夠數目之甲基化標記物可用於映射。
A . 鑑別具有拷貝數變異 ( CNA ) 之區域
在知情同意之情況下自香港威爾士王子醫院手術部(Department of Surgery, Prince of Wales Hospital, Hong Kong)募集患有HCC之62歲男性患者。在診斷時及切除腫瘤之後3個月在EDTA管中收集十毫升靜脈血液。血液樣品在3000 g下離心10分鐘以自血漿分離血細胞。血漿在30000 g下再離心10分鐘以移除其餘的細胞。
自血細胞提取之DNA用於遵循製造商說明書使用10x基因組學平台定相SNP以構築患者之單倍型。使用MagAttract HMW DNA套組(QIagen, Germany)自血液或組織樣品提取高分子量DNA。藉由基因組DNA分析ScreenTape在4200 TapeStation系統(Agilent, Germany)上驗證DNA之品質。DNA藉由dsDNA HS分析套組在Qubit 3.0螢光計(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)上定量。使用GemCode系統及其相關試劑(10X Genomics, Pleasanton, CA)進行樣品索引及文庫製備(Zheng等人 Nat Biotechnol. 2016年3月;34:303-11)。簡言之,對於GEM反應輸入DNA之lng,其中個別DNA分子經分割以引入特定條碼且延長DNA。在GEM反應之後,根據製造商的建議製備定序文庫。文庫藉由使用KAPA文庫定量套組(KAPA Biosystems, Wilmington, MA)之qPCR定量。藉由98 bp、14 bp I5及8 bp I7索引讀數之雙末端定序在HiSeq 2500定序器(Illumina, San Diego, CA)上對標準化文庫定序。使用Long Ranger軟體程序組(10X Genomics)分析定序結果以使得所有雜合SNP經定相且測定患者之兩種單倍型。
血漿樣品使用Illumina定序17×之深度。拷貝數變異根據如先前所述之方法偵測於HCC患者之血漿中(Chan等人 Clin Chem. 2013;59:211-24)。
圖20顯示根據本發明之實施例在HCC患者之血漿中偵測之拷貝數變異之圖。內圓表示診斷時收集之血漿樣品之結果(預操作)且外圓表示在切除腫瘤之後3個月收集之血漿樣品之結果(後操作)。各點表示1 Mb區域。綠點、紅點及灰點分別表示複本數增加、複本數損失及無複本數變化的區域。拷貝數變異在診斷時偵測於血漿樣品中且此等變化在移除腫瘤之後消失。
在圖20中,兩個區域由於具有CNA而突出顯示。區域2010具有複本數增加,且區域2020具有複本數損失。可使用個體之任何組織樣品,且不僅僅腫瘤樣品來測定此等區域之單倍型。複本數之差異為驅動百分比貢獻之差異的因素,且差異應在具有腫瘤之組織類型中最大。
B . 測定拷貝數變異之組織來源
吾人對於兩種單倍型獨立地進行甲基化解卷積分析。出於說明目的,兩種單倍型命名為Hap I及Hap II。覆蓋雜合SNP及至少一個CpG位點之血漿DNA分子用於此分析。在Hap I上攜有SNP等位基因之血漿DNA分子與在Hap II上攜有等位基因之彼等獨立地分析。CpG位點之甲基化狀態用於甲基化解卷積以將分子獨立地映射至Hap I及Hap II。因此,可測定對血漿DNA中之Hap I及Hap II之組織貢獻。
首先,吾人聚焦於具有擴增之區域。出於說明目的,吾人分析染色體lq(作為實例)上之擴增區域。
| 診斷時 | 腫瘤切除後 |
Hap I | 34,119 | 11,131 |
Hap II | 26,582 | 11,176 |
表11顯示來自兩種單倍型之序列讀數數目。在診斷時,映射至Hap I之讀數數目相比於映射至Hap II之讀數數目增加。此指示Hap I相對於Hap II擴增。此觀測結果與特定染色體在癌症而非擴增至相同程度之兩者同源染色體中複製之事實相容,其與拷貝數變異優先出現於一種單倍型之事實一致(Adey A.等人, Nature. 2013;500:207- 11;LaFramboise T.等人, PLoS Comput Biol. 2005;1(6):e65)。兩種單倍型之劑量差值在切除腫瘤之後消失。在診斷時與腫瘤切除之後獲取之血漿樣品之間的絕對序列讀數數目之差值係由於對於兩種血漿樣品產生之序列讀數之總數的差值。
| 診斷時 | 腫瘤切除後 |
| Hap I | Hap II | 差值 | Hap I | Hap II | 差值 |
肝臟 | 19.7 | 8.0 | 11.7 | 21.3 | 21.9 | -0.6 |
肺 | 5.4 | 0 | 5.4 | 0 | 0 | 0 |
結腸 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
大腦 | 0 | 0 | 0 | 9.0 | 9.0 | 0 |
心臟 | 0 | 17.0 | -17 | 3.0 | 2.5 | -0.5 |
血細胞 | 74.9 | 75.0 | 0 | 66.7 | 66.6 | 0.1 |
總計 | 100 | 100 | 0 | 100 | 100 | 0 |
表12顯示針對在診斷時及腫瘤切除後之兩種單倍型的不同組織對血漿DNA之百分比貢獻。在診斷時,針對Hap I及Hap II的肝臟對血漿DNA之貢獻分別為19.7%及8.0%。不同類型的組織之間的最高差值為11.7%。此指示血漿中之Hap I與Hap II之間的劑量差值最可能貢獻自肝臟之貢獻。此另外指示染色體畸變之可能來源係來自肝臟,因為複本數變化最可能歸因於序列讀數計數分析中之Hap I之複製。在另一實施例中,Hap I及Hap II之貢獻之差值可經排位以指示不同組織為拷貝數變異之起源的相對似然性。
針對心臟之值為-17,其與藉由表11鑑別之拷貝數變異在相反方向上。因此,儘管針對心臟之絕對值大於針對肝臟之絕對值,相反符號將心臟折扣為腫瘤之源組織類型可行的候選物。由於所有器官之總貢獻為100%,肝臟貢獻之正差值導致其他組織具有負值。
類似地,此單倍型特異性甲基化解卷積亦可在具有複本數損失之區域上進行。出於說明目的,吾人在展現複本數損失之染色體1p上之區域上進行此分析。
| 診斷時 | 腫瘤切除後 |
Hap I | 19,973 | 8,323 |
Hap II | 12,383 | 7,724 |
表13顯示來自兩種單倍型之序列讀數數目。在診斷時,映射至Hap II之讀數數目相比於映射至Hap I之讀數數目減少。在腫瘤組織中,大部分具有染色體複本數損失之區域將僅涉及兩種染色體中的一者之缺失。因此,Hap II之劑量之相對減小與Hap II之缺失相容。在切除腫瘤之後消失的兩種單倍型之劑量差值指示腫瘤衍生之DNA的量已減少或自血漿消失。
| 診斷時 | 腫瘤切除後 |
| Hap I | Hap II | 差值
(Hap I-Hap II) | Hap I | Hap II | 差值
(Hap I-Hap II) |
肝臟 | 13.3 | 5.5 | 7.8 | 10.2 | 13.2 | -3 |
肺 | 0 | 0 | 0 | 4.1 | 0.5 | 3.6 |
結腸 | 3.8 | 0 | 3.8 | 8.6 | 17.5 | -8.9 |
大腦 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
心臟 | 3.7 | 0 | 3.7 | 25.5 | 19.4 | 6.1 |
血細胞 | 79.2 | 94.5 | -15.3 | 51.6 | 49.4 | 2.2 |
總計 | 100 | 100 | 0 | 100 | 100 | 0 |
表14顯示針對在診斷時及腫瘤切除後之兩種單倍型的不同組織對血漿DNA之百分比貢獻。在診斷時,針對Hap I及Hap II的肝臟對血漿DNA之貢獻分別為13.3%及5.5%。不同類型的組織之間的最高差值為7.8%。此指示血漿中之Hap I與Hap II之間的劑量差值最可能貢獻自肝臟之貢獻。此另外指示染色體畸變之可能來源係來自肝臟,因為複本數變化最可能歸因於序列讀數計數分析中之Hap II之缺失。在另一實施例中,Hap I及Hap II之貢獻之差值可經排位以指示不同組織為拷貝數變異之起源的相對似然性。
C . 測定腫瘤之組織來源之方法
圖21為說明分析生物體之生物樣品以鑑別根據本發明之實施例之染色體畸變之起源之方法的流程圖。生物樣品包括來自包括第一組織類型之複數種組織類型之游離之DNA分子之混合物。
在步驟2110處,分析來自生物樣品之複數個游離之DNA分子。步驟2110可使用圖1之步驟1910及圖1之方法100之步驟140,以及描述類似特徵之其他步驟中所述之技術進行。
在步驟2115處,第一染色體區域基於位於第一染色體區域中之游離之DNA分子之第一量鑑別為展現生物體中之拷貝數變異。舉例而言,進行血漿DNA分析以鑑別展現拷貝數變異之區域。該畸變可對應於過表現或表現不足。在一些實施例中,基因組可分成分區(例如1 Mb分區),且可測定來自特定分區之游離之DNA分子的量(例如藉由將序列讀數映射至參考基因組之該部分)。特定分區之量可經標準化(例如就分區之平均量而言),且可鑑別過表現或表現不足。
可使用除計數向特定區域之DNA分子映射以外的其他技術。舉例而言,與第一染色體區域對準之DNA分子之尺寸分佈可用於偵測CNA。舉例而言,游離腫瘤DNA小於來自正常細胞之游離DNA。此尺寸差異可用於偵測該區域之兩種單倍型之間,或該區域與另一區域之間的尺寸分佈(例如平均尺寸或不同尺寸之DNA分子數目比)差異。
在步驟2120處,測定第一染色體區域中之生物體之第一單倍型及第二單倍型。兩種單倍型可測定為步驟2115之部分。兩種單倍型可使用相同游離混合物或自不同樣品,例如細胞樣品測定。
在步驟2130處,鑑別第一染色體區域之一或多個雜合基因座。各雜合基因座包括第一單倍型中之對應第一等位基因及第二單倍型中之對應第二等位基因。步驟2130可以與本文所述之方法之其他類似步驟類似之方式進行。
在步驟2140處,鑑別第一組複數個游離之DNA分子。第一組之各DNA分子位於一或多個雜合基因座中的任一者處,包括雜合基因座之對應第一等位基因,且包括N個基因組位點中之至少一者。N為大於或等於2之整數。步驟2140可以與本文所述之方法之其他類似步驟類似之方式進行。
在步驟2150處,使用第一組複數個游離之DNA分子量測N個基因組位點之N個第一混合物甲基化程度。步驟2150可以與本文所述之方法之其他類似步驟類似之方式進行。
在步驟2160處,鑑別第二組複數個游離之DNA分子。第二組之各DNA分子位於一或多個雜合基因座中的任一者處,包括雜合基因座之對應第二等位基因,且包括N個基因組位點中之至少一者。步驟2160可以與本文所述之方法之其他類似步驟類似之方式進行。
在一些實施例中,可測定第一組複數個游離之DNA分子中之游離之DNA分子之第一數目,且可測定第二組複數個游離之DNA分子中之游離之DNA分子之第二數目,例如如表11中所示。可測定何數目較高,進而向源組織提供關於預期分離值之資訊,例如何種單倍型應具有較高百分比貢獻。
第一組複數個游離之DNA分子可具有第一尺寸分佈,且第二組複數個游離之DNA分子可具有第二尺寸分佈。可對於各單倍型測定DNA分子之尺寸分佈之統計值,進而提供第一統計值及第二統計值。具有較小尺寸分佈之單倍型將預期具有比其他單倍型高的複本數,因為已知腫瘤游離DNA較小,如美國專利第8,741,811號中所述。尺寸分佈之統計值之實例為不同尺寸之DNA分子之數目比、平均尺寸或特定尺寸(例如低於尺寸閾值)之DNA分子之百分比。
在步驟2170處,使用第二組複數個游離之DNA分子量測N個基因組位點之N個第二混合物甲基化程度。步驟2170可以與本文所述之方法之其他類似步驟類似之方式進行。
步驟2180及2190可對於複數種M組織類型中之每一者進行。M種組織類型可包括經篩選且可已知參考甲基化程度之組織類型的預設清單。預設列表可包括最顯著可見癌症之組織。M為大於1之整數。
在步驟2180處,電腦系統使用N個第一甲基化程度測定混合物中之組織類型之對應第一百分比貢獻。電腦系統使用N個第二甲基化程度測定混合物中之組織類型之對應第二百分比貢獻。步驟2180可以與本文所述之方法之其他類似步驟類似之方式進行。
在步驟2190處,計算對應第一百分比貢獻與對應第二百分比貢獻之間的對應分離值。可使用各種分離值,例如如本文所述。
在步驟2195處,第一組織類型基於在對應分離值中具有最大值之第一組織類型之第一分離值鑑別為拷貝數變異之起源。測定可能需要最高分離值充分高於第二最高分離值。舉例而言,可能需要差值至少為臨限值,例如1%、2%、3%、4%、5%、6%或7%。在一個實施方案中,第一分離值與次最高分離值之間的差值可相比於臨限值以確定第一組織類型為拷貝數變異之起源之可能性程度的分類。因此,即使該差值不高於臨限值,可提供概率或其他分類。舉例而言,可使用0至臨限值之線性關係,其中一旦該差值等於臨限值,概率為100%。
取決於如何測定分離值,最大值可為最大負數或最大正數。舉例而言,表14中之差值可使用Hap II-Hap I測定。可使用各單倍型上之DNA分子之分析測定最大值應為正值或負值,例如如表13中之計數或如上文所述之尺寸分析。在一些實施方案中,可始終測定分離值以使得預期最大正值,例如藉由自具有較高複本數之單倍型之百分比貢獻減去具有較低複本數之單倍型之百分比貢獻。
在鑑別來源之後,可進行使用成像模式,例如個體(整個個體或特定言之,候選器官)之電腦層析成像(CT)掃描或磁共振成像(MRI)之研究以證實或排除腫瘤於器官中之存在。若證實腫瘤存在,則可進行治療,例如手術(藉由手術刀或藉由輻射)或化學療法。
IX . 電腦系統
本文中提及之任何電腦系統均可利用任何適合數目之子系統。此類子系統之實例顯示於圖22之電腦設備10中。在一些實施例中,電腦系統包括單一電腦設備,其中子系統可為電腦設備之組件。在其他實施例中,電腦系統可包括具有內部組件之多個電腦設備,其各自為一個子系統。電腦系統可包括桌上型及膝上型電腦、平板電腦、行動電話及其他行動裝置。
圖22中所示之子系統經由系統匯流排75互連。展示額外子系統,諸如印表機74、鍵盤78、儲存裝置79、耦接至顯示配接器82之監測器76等。耦合至輸入/輸出(I/O)控制器71之周邊裝置及I/O裝置可藉由任何數目之此項技術中已知之構件(諸如輸入/輸出(I/O)埠77 (例如,USB、FireWire
®
))連接至電腦系統。舉例而言,I/O埠77或外部介面81 (例如,乙太網路、Wi-Fi等)可用於將電腦系統10連接至廣域網路(諸如,網際網路、鼠標輸入裝置或掃描儀)。經由系統匯流排75實現之互連允許中央處理器73與各子系統通信及控制來自系統記憶體72或儲存裝置79 (例如固接磁碟,諸如硬碟機,或光碟)之複數個指令之執行,以及子系統之間的資訊交換。系統記憶體72及/或儲存裝置79可體現電腦可讀媒體。另一子系統為資料採集裝置85,諸如,攝影機、麥克風、加速計及其類似物。本文所提及之任何資料可自一個組件輸出至另一個組件且可輸出至使用者。
電腦系統可包括例如藉由外部接口81或藉由內部接口連接在一起的複數個相同組件或子系統。在一些實施例中,電腦系統、子系統或設備可經網路連通。在該等情況下,可將一個電腦視為用戶端且另一個電腦視為伺服器,其中每一者可為同一電腦系統之一部分。用戶端及伺服器各自可包括多個系統、子系統或組件。
實施例之態樣可使用硬體(例如特殊應用積體電路或場可程式化閘陣列)、以邏輯控制形式實施及/或使用電腦軟體、使用普通可程式化處理器、以模組化或整合方式實施。如本文中所使用,處理器包括位於同一積體晶片上之單核心處理器、多核心處理器,或位於單一電路板上或網路化之多個處理單元。基於本文所提供之揭示內容及教示,一般熟習此項技術者將知道及瞭解使用硬體及硬體與軟體之組合來實施本發明之實施例的其他方式及/或方法。
描述於本申請案中之任何軟體組件或功能可作為待由處理器執行的使用任何適合之電腦語言(諸如Java、C、C++、C#、Objective-C、Swift)或腳本語言(諸如Perl或Python)的軟體程式碼,使用例如習知或目標定向技術來執行。軟體程式碼可以一系列指令或命令形式儲存於電腦可讀媒體上以用於儲存及/或傳輸。適合的非暫時性電腦可讀媒體可包括隨機存取記憶體(RAM)、唯讀記憶體(ROM)、磁性媒體(諸如硬碟機或軟碟機),或光學媒體,諸如光盤(CD)或DVD (數位化通用光碟)、快閃記憶體,及其類似物。電腦可讀媒體可為該等儲存或傳輸裝置之任何組合。
該等程序亦可使用適用於經由有線、光學及/或符合多種協定之無線網路(包括網際網路)傳輸的載波信號來編碼及傳輸。因而,電腦可讀媒體可使用經由此類程式編碼的資料信號建立。以程式碼編碼之電腦可讀媒體可與相容裝置一起封裝或與其他裝置分開單獨提供(例如藉助於網際網路下載)。任何此等電腦可讀媒體可存在於單一電腦產品(例如,硬碟機、CD或整個電腦系統)上或其內部,且可存在於系統或網路內之不同電腦產品上或其內部。電腦系統可包括用於向使用者提供本文所提及之任何結果的監測器、印表機、或其他適合之顯示器。
本文所描述之任何方法可完全或部分地使用電腦系統來進行,該電腦系統包括一或多個處理器,該等處理器可經組態以進行該等步驟。因此,實施例可針對經組態以執行本文所描述之任何方法之步驟的電腦系統,潛在地使用不同組件執行各別步驟或各別步驟組。儘管本文中方法之步驟以經編號之步驟呈現,但其可同時或以不同次序執行。另外,此等步驟之部分可與其他方法之其他步驟之部分一起使用。另外,步驟之全部或部分可視情況選用。另外,任何方法中之任何步驟可使用用於執行此等步驟的模組、單元、電路或其他構件來執行。
可在不脫離本發明之實施例的精神及範疇的情況下以任何適合之方式組合特定實施例之特定細節。然而,本發明之其他實施例可針對於與各個別態樣或此等個別態樣之特定組合相關的特定實施例。
已出於說明及描述之目的呈現本發明之實例實施例的上述描述。其並不意欲為窮盡性的或將本發明限制於所描述之精確形式,且鑒於以上教示,許多修改及變化為可能的。
除非特別指示相反,否則「一(a/an)」或「該(the)」之敍述意欲意謂「一或多個(種)」。除非明確指示相反,否則「或」之使用欲意謂「包括或」而並非「互斥或」。提及「第一」組件不一定需要提供第二組件。此外,除非有明確陳述,否則提及「第一」或「第二」組件不會將所提及組件限於特定位置。
本文所提及之所有專利、專利申請案、公開案及描述均出於所有目的以全文引用之方式併入。不容許任一者為先前技術。