CN106574296B - 用于测定dna的组织或细胞来源的方法和试剂盒 - Google Patents

用于测定dna的组织或细胞来源的方法和试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN106574296B
CN106574296B CN201580031764.XA CN201580031764A CN106574296B CN 106574296 B CN106574296 B CN 106574296B CN 201580031764 A CN201580031764 A CN 201580031764A CN 106574296 B CN106574296 B CN 106574296B
Authority
CN
China
Prior art keywords
dna
tissue
cell
methylation
cells
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201580031764.XA
Other languages
English (en)
Other versions
CN106574296A (zh
Inventor
Y.多尔
R.舍梅
B.格拉赛
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hadasit Medical Research Services and Development Co
Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Original Assignee
Hadasit Medical Research Services and Development Co
Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hadasit Medical Research Services and Development Co, Yissum Research Development Co of Hebrew University of Jerusalem filed Critical Hadasit Medical Research Services and Development Co
Publication of CN106574296A publication Critical patent/CN106574296A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN106574296B publication Critical patent/CN106574296B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6881—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for tissue or cell typing, e.g. human leukocyte antigen [HLA] probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/154—Methylation markers

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

公开了检测受试者的细胞类型或组织的死亡的方法。所述方法包括测定受试者的流体样品中包含的无细胞DNA是否来源于所述细胞类型或组织，其中所述测定通过确定无细胞DNA的连续序列上至少4个甲基化位点的甲基化状态来实现，所述序列包含不超过300个核苷酸，其中所述细胞类型或组织特有的DNA的连续序列上所述至少4个甲基化位点的每一个的甲基化状态指示所述细胞类型或组织的死亡。还公开了用于检测细胞死亡的试剂盒。

Description

用于测定DNA的组织或细胞来源的方法和试剂盒
发明领域和背景
本发明，在其一些实施方案中，涉及测定无细胞DNA的来源的方法和其用于诊断与细胞死亡有关的病理过程、监测意图改变细胞死亡的治疗方案例如药物的用途，和其为临床和科研目的而研究影响细胞死亡水平的过程的用途。
数十年来已知血浆包含源自死亡细胞的无细胞循环DNA (cfDNA)的小片段(平均5000个基因组当量/ml)。尽管释放和清除cfDNA的基础机制仍不清楚，但该现象迅速用于与临床有关的各种应用。胎儿DNA的片段短暂在母体循环中移动的公认打开了基于下一代测序(NGS)的产前检验以鉴定胎儿三体性和其它遗传畸变的道路，有可能代替羊膜穿刺术。在癌症生物学中，已知肿瘤释放DNA (包括肿瘤-特异性体细胞突变)至循环，提供了用于液体活检以监测肿瘤动力学和基因组进化的手段。此外，根据区分供体与受体的DNA的单核苷酸多态性(SNPs)，cfDNA已用于检测在肾、肝或心脏移植后的移植物细胞死亡。在所有这些情况中，在目的组织(胎儿、肿瘤或移植物)和宿主的DNA序列之间存在遗传差异，这提供了高度特异性测定法的基础。
已知在多种另外的条件例如创伤性脑损伤、心血管疾病、脓毒症和强烈运动时，cfDNA的血液水平增加。然而在这些情况下，升高的cfDNA的来源是未知的，极大地损害了cfDNA作为诊断或预后工具的功用。例如，cfDNA可能来源于受损伤组织的实质细胞，但也可能来源于临死的炎性细胞。
尽管具有相同的核苷酸序列，但体内各细胞类型的DNA带有与其基因表达谱相关的独特的表观遗传标记。具体而言，用来抑制非转录的基因的DNA甲基化，是组织身份的基本方面。对各细胞类型而言，甲基化模式是独特的，在相同个体和个体之间的相同类型的细胞中保守，并且在生理或病理条件下高度稳定。因此，使用cfDNA的DNA甲基化模式来测定其来源组织并因此推断来源器官中的细胞死亡是可能的。
在理论上，考虑到cfDNA的总量、源自目的组织的分数和估计的cfDNA半寿期(15-120分钟)，这样的方法可鉴定目的组织中的细胞死亡比率。注意，因为该方法依赖于细胞身份的正常的稳定标记，其不能鉴定病理的性质(例如，区分源自死亡肿瘤细胞或由于在相同组织中创伤或炎症导致的死亡野生型细胞的cfDNA)。组织特异性细胞死亡的高度敏感性、最小侵入测定的潜在用途包括早期准确诊断以及在临床和药物开发背景中监测对疗法的反应。
组织-特异性DNA甲基化的经典实例由胰岛素基因启动子提供，其在产生胰岛素的胰腺β-细胞中未甲基化和在别处甲基化。最近的研究在新诊断的T1D患者的循环中以及在胰岛移植物受体中鉴定了未甲基化胰岛素启动子DNA，可能反映了β –细胞的自身免疫和同种免疫破坏两者(Akirav E.M.等 Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America, 108, 19018-19023 (2011); Lebastchi J 等,Diabetes 62, 1676-1680 (2013); Husseiny M. I. Plos one 9 e94591 (2014;和Herold K.C. 等, J Clin Invest. Doi:10.1172/jc178142 (2015))。
其它背景技术包括国际PCT公开号WO2013131083、WO 2014138133和WO201101728。
发明概述
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供检测受试者的细胞类型或组织的死亡的方法，包括测定受试者的流体样品中包含的无细胞DNA是否来源于所述细胞类型或组织，其中所述测定通过确定无细胞DNA的连续序列上至少4个甲基化位点的甲基化状态来实现，所述序列包含不超过300个核苷酸，其中所述细胞类型或组织特有的DNA的连续序列上至少4个甲基化位点的每一个的甲基化状态指示细胞类型或组织的死亡。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供鉴定目的细胞类型或组织的甲基化标记的方法，包括在目的细胞类型的DNA中鉴定包含至少4个甲基化位点的不超过300个核苷酸的连续序列，其中相对于第二种不同的细胞类型或组织，所述位点的每一个被差异甲基化，从而鉴定目的细胞类型或组织的甲基化标记。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供测定样品中的DNA是否来源于目的细胞类型或组织的方法，所述方法包括：
确定DNA的连续序列上至少4个甲基化位点的甲基化状态，所述序列包含不超过300个核苷酸，其中目的细胞特有的连续序列的至少4个甲基化位点的每一个的甲基化状态指示DNA来源于目的细胞。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供用于鉴定样品中的DNA来源的试剂盒，其包含能够检测核酸序列中至少4个甲基化位点的甲基化状态的寡核苷酸，所述核酸序列不超过300个碱基对和包含相对于与第一种目的细胞不同的第二种细胞，在第一种目的细胞中差异甲基化的至少4个甲基化位点。
根据本发明的一些实施方案的一个方面，提供用于鉴定样品中的DNA来源的试剂盒，其包含能够扩增具有不超过300个碱基对的核酸序列的DNA的至少两种寡核苷酸，其中所述核酸序列包含相对于与第一种目的细胞不同的第二种细胞，在第一种目的细胞中差异甲基化的至少4个甲基化位点。
根据本发明的一些实施方案，所述甲基化状态是非病变目的细胞类型或组织特有的。
根据本发明的一些实施方案，所述序列包含50-250个核苷酸。
根据本发明的一些实施方案，当所述细胞类型的死亡与病理过程有关时，所述方法还包括诊断所述病理过程。
根据本发明的一些实施方案，所述DNA是无细胞DNA。
根据本发明的一些实施方案，所述DNA是细胞DNA。
根据本发明的一些实施方案，所述方法还包括在测定之前裂解细胞DNA的细胞。
根据本发明的一些实施方案，至少4个甲基化位点包含至少5个甲基化位点。
根据本发明的一些实施方案，目的细胞类型包含在体液内。
根据本发明的一些实施方案，样品包含体液。
根据本发明的一些实施方案，所述体液选自血液、血浆、精液、乳、尿、唾液和脑脊液。
根据本发明的一些实施方案，所述确定使用至少一种甲基化-依赖性寡核苷酸实现。
根据本发明的一些实施方案，所述甲基化-依赖性寡核苷酸与4个甲基化位点的至少1个杂交，所述位点是甲基化的。
根据本发明的一些实施方案，所述甲基化-依赖性寡核苷酸与4个甲基化位点的至少1个杂交，所述位点是未甲基化的。
根据本发明的一些实施方案，所述确定使用甲基化-非依赖性寡核苷酸实现。
根据本发明的一些实施方案，所述确定使用至少两种甲基化-非依赖性寡核苷酸实现。
根据本发明的一些实施方案，所述确定通过以下实现：
(a) 使样品中的DNA与亚硫酸氢盐接触，以转化DNA的去甲基化胞嘧啶为尿嘧啶；
(b) 使用与邻近DNA的连续序列上的至少4个甲基化位点的第一个和最后一个的核酸序列杂交的寡核苷酸，扩增DNA的连续序列；和
(c) 对DNA的连续序列测序。
根据本发明的一些实施方案，样品包含来源于与所述细胞类型或组织不同的第二种细胞的无细胞DNA。
根据本发明的一些实施方案，所述方法还包括分析源自所述细胞类型或组织的无细胞DNA的量:源自第二种细胞的无细胞DNA的量。
根据本发明的一些实施方案，所述方法还包括分析源自所述细胞类型或组织的无细胞DNA的量:样品中无细胞DNA的总量。
根据本发明的一些实施方案，所述细胞类型选自胰腺β细胞、胰腺外分泌细胞、肝细胞、脑细胞、肺细胞、子宫细胞、肾细胞、乳腺细胞、脂肪细胞、结肠细胞、直肠细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、前列腺细胞和甲状腺细胞。
根据本发明的一些实施方案，所述组织选自胰腺组织、肝组织、肺组织、脑组织、子宫组织、肾组织、乳腺组织、脂肪、结肠组织、直肠组织、心脏组织、骨骼肌组织、前列腺组织和甲状腺组织。
根据本发明的一些实施方案，所述样品是血液样品。
根据本发明的一些实施方案，所述方法还包括定量测定来源于所述细胞类型或组织的无细胞DNA的量。
根据本发明的一些实施方案，所述序列包含50-250个核苷酸。
根据本发明的一些实施方案，所述DNA是无细胞DNA。
根据本发明的一些实施方案，所述DNA序列包含在SEQ ID NOs: 1-44的任一个所示的序列中。
根据本发明的一些实施方案，所述试剂盒还包含用于对DNA序列测序的至少一种试剂。
根据本发明的一些实施方案，所述试剂盒还包含具有所述核酸序列的DNA，其中DNA来源于已知的目的细胞。
根据本发明的一些实施方案，所述试剂盒用于诊断病理过程。
根据本发明的一些实施方案，所述试剂盒用于监测病理过程的治疗。
根据本发明的一些实施方案，所述试剂盒用于监测细胞类型或组织的死亡。
根据本发明的一些实施方案，所述试剂盒还包含亚硫酸氢盐。
根据本发明的一些实施方案，至少两种寡核苷酸的至少一种编码条码序列。
根据本发明的一些实施方案，至少两种寡核苷酸的至少一种用可鉴别部分标记。
根据本发明的一些实施方案，至少一种寡核苷酸用可检测部分标记。
根据本发明的一些实施方案，至少两种寡核苷酸的至少一种编码条码序列。
根据本发明的一些实施方案，两种寡核苷酸编码允许附着至流动池表面的序列。
除非另外定义，否则本文使用的所有技术和/或科学术语具有与本发明所属的本领域普通技术人员通常理解相同的含义。尽管类似或等同于本文所述的方法和材料的方法和材料可用于本发明的实施方案的实践或试验，但下文描述了示例性的方法和/或材料。在冲突的情况下，以本专利说明书，包括定义为准。此外，材料、方法和实施例仅为示例性的，和不意欲必然是限制性的。
附图简述
仅作为实例，参考附图，本文描述了本发明的一些实施方案。现在具体详细参考附图，应强调所示的细节为通过举例的方式，和为了示例性讨论本发明的实施方案的目的。在这一方面，说明书与附图一起使本领域技术人员明白本发明的实施方案可如何实施。
在附图中：
图1A-D：在T1D糖尿病患者的循环中的β细胞-来源的DNA。
A，用作标记的胰岛素基因启动子片段的结构。黑点代表CpG位点，箭头标记PCR引物的位置。
B，在多种组织中胰岛素基因启动子的单个CpG位点的甲基化状态。该图显示来自各组织的DNA中未甲基化分子的百分数。右边的一组条柱描述其中所有6个CpG位点未甲基化的分子的百分数。
C，健康对照(c)和最近诊断的T1D患者的血浆中β-细胞来源的DNA。完全未甲基化胰岛素启动子DNA分子的分数(反映了β-细胞来源的DNA的分数)乘以各个体中测量的cfDNA的绝对水平。Mann Whitney检验，对于对照vs患者，p<0.0001。
D，在肝内胰岛移植术后指定时间点采样的长期T1D患者的循环中β-细胞来源的DNA。
图2A-C：多发性硬化中少突胶质细胞来源的cfDNA的鉴定。
A，在多种组织中MBP3和WM1的甲基化状态。注意，在总脑中而非在富含神经元的小脑中缺少甲基化，表明未甲基化分子源自神经胶质(亦参见图8A-E和9A-E)。
B，健康个体的血浆中的少突胶质细胞-来源的DNA。
C，缓解型和复发型MS/NMO患者的血浆中的少突胶质细胞-来源的DNA。该图显示在各样品中未甲基化MBP3和WM1的累积值。对照 vs 稳定疾病，p=0.6；对照 vs 复发型疾病，p<0.0001；稳定 vs 复发型疾病，p<0.0001；对照 vs 所有患者，p=0.021。
图3A-D：在脑损伤后脑来源的cfDNA的鉴定。
A，在多种组织中CG09787504基因座(Brain1)的CpG位点的甲基化状态，如通过深度测序所测定的。条柱代表其中基因座的所有9个CpG未甲基化的分子的百分数。
B，在12名健康志愿者的血浆中脑来源的DNA，通过各个体中的cfDNA的量乘以完全未甲基化Brain1分子的分数计算。
C，在心跳停止后在10名患者血浆中的脑来源的DNA。各患者在苏醒后立即(“急性”)和在之后的时间点采样。标签标记存活(“活的”)或死亡的患者，和死亡原因(大脑、心脏或呼吸)。对照 vs 患者(所有时间点)，p<0.0001。
D，在创伤性脑损伤后在5名患者血浆中的脑来源的DNA，在神经创伤科住院之后在不同的天数采样。在一年后，两名患者仍然神经评分受损，两名患者恢复，和一名患者未存活，如所指示的。对照 vs 患者(所有时间点)，p=0.005。
图4A-C：在胰腺癌或胰腺炎患者中外分泌胰腺来源的cfDNA的鉴定。
A，在多种组织中CUX2和REG1A基因座中CpG簇的甲基化状态。尽管CUX2在导管中选择性发生未甲基化，但REG1A在导管和腺泡细胞两者中以及在~30%的结肠细胞中未甲基化。
B，在健康个体的血浆中未甲基化CUX2和REG1A DNA片段的水平。
C，在胰腺癌或慢性胰腺炎患者血浆中未甲基化外分泌胰腺标记的水平。该图显示对于各患者，在减去背景信号(在健康对照中见到的最高信号)后，来自各标记的信号强度。对照 vs 所有癌症患者，p<0.0001；对照 vs 局部癌症，p<0.0001；对照 vs 转移性疾病，p<0.0001；局部 vs 转移性癌症，p=0.047；对照 vs 胰腺炎，p<0.0001。
图5A-B：检测源自特定组织的循环DNA的方法的流程图。
A，鉴定组织-特异性甲基化标记的程序。
B，测定血浆中的组织-特异性DNA的水平的程序。
图6A-B：在健康志愿者和最近诊断的T1D患者的血浆中胰岛素基因启动子的甲基化。
A，胰岛素基因启动子的单个CpG位点的甲基化状态。
B，在与子图A相同的患者中4-6个CpG的扩展窗的甲基化状态，表示为%未甲基化DNA。
图7A-E：MBP3的3’ UTR的甲基化。
A，用作标记的MBP3 3’ UTR片段的结构。棒棒糖代表CpG。空心棒棒糖代表在Illumina 450k阵列中检测的CpG。箭头标记PCR引物的位置。
B，在Illumina 450k阵列上捕获的MBP3基因座的单个CpG位点的甲基化状态。数据来自公众可得的450k阵列。
C，在多种组织中来自MBP3基因座的单个CpG位点的甲基化状态和多个CpG的扩展窗，如通过深度测序所测定的。
D，在健康对照和复发型MS/NMO患者的血浆中来自MBP3基因座的单个CpG位点的甲基化。
E，在健康志愿者和MS/NMO患者(与子图D相同的患者)的血浆中完全未甲基化MBP3 基因座片段的分数。以ng/ml血浆表示的总的未甲基化MBP3基因座DNA示于图2C。
图8A-E：CG10809560和邻近的CpG位点的甲基化(WM1基因座)。
A，用作标记的WM1基因座片段的结构。棒棒糖代表CpG。空心棒棒糖代表在Illumina 450k阵列中检测的CpG。箭头标记PCR引物的位置。
B，在多种组织中WM1的甲基化状态，如公众可得的Illumina 450k阵列中所记录的。
C，在多种组织中来自WM1基因座的单个CpG位点的甲基化状态和多个CpG的扩展窗，如通过深度测序所测定的。
D，在健康对照和复发型MS/NMO患者的血浆中来自WM1基因座的单个CpG位点的甲基化。
E，在健康志愿者和MS/NMO患者(与子图D相同的患者)的血浆中完全未甲基化WM1 DNA片段的分数。
图9A-E：脑标记CG09787504 (Brain1)和邻近CpG位点的甲基化。
A，用作标记的Brain1基因座片段的结构。棒棒糖代表CpG。空心棒棒糖代表在Illumina 450k阵列中检测的CpG。箭头标记PCR引物的位置。
B，在多种组织中Brain1的甲基化状态，如在公众可得的Illumina 450k阵列中所记录的。
C，在多种组织中来自Brain1基因座的单个CpG位点的甲基化状态和多个CpG的扩展窗，如深度测序所测定的。
D，在健康对照和心跳停止后的患者的血浆中来自Brain1基因座的单个CpG位点的甲基化。
E，在健康志愿者和心跳停止后的患者(与子图D相同的患者)的血浆中完全未甲基化Brain1DNA片段的分数。
图10A-E：REG1A基因附近的CpG簇的甲基化。
A，用作标记的REG1A片段的结构。棒棒糖代表CpG。空心棒棒糖代表在Illumina450k阵列中检测的CpG。箭头标记PCR引物的位置。
B，在Illumina 450k阵列中捕获的在REG1A基因座中单个CpG位点的甲基化状态。数据来自公众可得的450k阵列。
C，在多种组织中来自REG1A基因座的单个CpG位点的甲基化状态和多个CpG的扩展窗，如通过深度测序所测定的。
D，在健康对照和胰腺癌患者的血浆中来自REG1A基因座的单个CpG位点的甲基化。
E，在健康志愿者和胰腺癌患者(与子图D相同的患者)的血浆中完全未甲基化REG1A片段的分数。
图11A-E：CUX2基因附近的CpG簇的甲基化。
A，用作标记的CUX2片段的结构。棒棒糖代表CpG。空心棒棒糖代表在Illumina450k阵列中检测的CpG。箭头标记PCR引物的位置。
B，在Illumina 450k阵列中捕获的CUX2基因座的单个CpG位点的甲基化状态。数据来自公众可得的450k阵列。
C，在多种组织中来自CUX2基因座的单个CpG位点的甲基化状态和多个CpG的扩展窗，如通过深度测序所测定的。
D，在健康对照和胰腺癌患者的血浆中来自CUX2基因座的单个CpG位点的甲基化。
E，在健康志愿者和胰腺癌患者(与子图D相同的患者)的血浆中完全未甲基化CUX2片段的分数。
图12是说明在一些ALS患者的血浆中存在脑DNA片段的图。
图13是说明在ALS患者的血浆中存在少突胶质细胞DNA (MBP; SEQ ID NO: 8)和白质DNA (WM1; SEQ ID NO: 7) (ng/mL血清)的图。
图14A-D是说明结肠上皮细胞的甲基化标记的图。图14A – SEQ ID NO: 18中包含的序列；图14B - SEQ ID NO: 19中包含的序列；图14C – 20中包含的序列；和图14D - SEQID NO: 17中包含的序列。
图15是说明在健康受试者的血液中不存在结肠DNA片段(正常周转至内腔)，而在结肠癌和克罗恩病患者的血液中存在结肠DNA的图。
图16是说明在各种组织中未甲基化SFTP/A1 (SEQ ID NO: 28中包含的序列) (一种肺标记)的组织分布的图。
图17是说明在各种组织中未甲基化SFTP/C (SEQ ID NO: 33中包含的序列) (一种肺标记)的组织分布的图。
图18是说明在各种组织中未甲基化CHST (SEQ ID NO: 32中包含的序列) (一种肺标记)的组织分布的图。
图19是说明在各种组织中未甲基化RAB4 (SEQ ID NO: 31中包含的序列) (一种肺标记)的组织分布的图。
图20A-C是说明三种骨骼肌标记(TNNI2，SEQ ID NO: 38中包含的序列；TPO，SEQID NO: 37中包含的序列；和MAD1L1，SEQ ID NO: 36中包含的序列) (在肌肉中未甲基化和在他处甲基化)的组织分布的图。
图21是说明在强烈运动后的健康个体和Duchenne或Becker肌肉萎缩的患者的血浆中骨骼肌来源的DNA水平的图。
图22是说明血管内皮细胞的甲基化标记(包含在DCUN1D2基因的SEQ ID NO: 21所示的序列中)的存在的图。
图23是说明肝细胞的甲基化标记(包含在ALB基因的SEQ ID NO: 27所示的序列中)的存在的图。
图24A-B是说明淋巴细胞的甲基化标记(包含在PTPRCAP基因的SEQ ID NO: 35所示的序列和AGAP2基因的SEQ ID NO: 34所示的序列中)的存在的图。
图25是说明肾的甲基化标记(包含在AQP2基因的SEQ ID NO: 26所示的序列中)的存在的图。
图26A-D是说明脂肪细胞的甲基化标记(包含在ACOT7基因的SEQ ID NO: 22所示的序列、COL4A1基因的SEQ ID NO: 23所示的序列、FRMD4A基因的SEQ ID NO: 24所示的序列、NNMT基因的SEQ ID NO: 25所示的序列)的存在的图。
图27A-D是说明在健康个体(C- 对照)的循环中脂肪细胞来源的DNA的图。
本发明具体实施方案的描述
本发明，在其一些实施方案中涉及测定无细胞DNA的来源的方法和其用于诊断与细胞死亡有关的病理过程、监测意欲改变细胞死亡的治疗方案例如药物的用途，和为临床和科研目的研究影响细胞死亡水平的过程的用途。
在详细说明本发明的至少一个实施方案之前，应理解本发明在其应用中不必然局限于以下描述中所示或通过实施例所例举的细节。本发明能够以各种方式实施或进行其它实施方案。
循环DNA的分析正开始改革产前诊断、肿瘤诊断和移植物排斥监测。然而，所有应用的主要限制在于对在目的组织和宿主之间可鉴别的遗传差异的存在的依赖性。本发明人已构思了一种用于检测无细胞循环DNA的组织来源的新方法，其克服了这一限制。
本发明人提出分析循环DNA片段中存在的组织-特异性甲基化模式(包含4或更多个甲基化位点)以提供稳健的工具，从而在基本上人体的每种组织中非侵入性地检测细胞死亡。本发明的方法显示与其它方法相比显著降低的噪音(健康个体的信号水平)至可设想临床功用的程度。
在将本发明转化为实践时，本发明人根据分析这样的甲基化模式，检测了在特定病理中源自特定人组织的循环血浆DNA。实例包括检测在1型糖尿病中的循环胰腺β细胞DNA(图1A-D)、在胰腺管腺癌和胰腺炎中的外分泌胰腺DNA (图4A-C)、创伤性脑损伤或缺血性创伤后的脑DNA (图3A-D)、复发型多发性硬化患者中的少突胶质细胞DNA (图2A-C)和ALS患者中的少突胶质细胞DNA和白质DNA (图12和13)。此外，本发明人检测了在结肠癌和克罗恩病患者的血液中的结肠DNA、在运动后健康个体的血液中的骨骼肌DNA、在健康个体的血液中的脂肪细胞DNA、在癌症患者的血液中的内皮细胞DNA和在多形性恶性胶质瘤患者的血液中的少突胶质细胞DNA。
该方法使得能够以最小入侵但高度灵敏和特异的方式检测在正常和病理性人组织中的急性细胞死亡。该方法的潜在功用是非常广泛的。在正常生理研究中，该方法可用于在发育期间和在生理扰动例如饮食改变、妊娠和衰老期间监测组织动力学。在各种各样的病理(包括但不限于癌症、创伤、感染和自身免疫疾病)中，该方法可用于早期诊断、监测疾病进展和评价对疗法的反应。在新药开发的情况下，该方法可适合于鉴定功效或毒性的信号，可能使冗长和昂贵的药物开发过程简化。
因此，根据本发明的一个方面，提供鉴定目的细胞类型或组织的甲基化标记的方法，包括鉴定目的细胞类型或组织的DNA中不超过300个核苷酸的连续序列，其包含至少4个甲基化位点，其中每个位点相对于第二种不同的细胞差异甲基化，从而鉴定目的细胞类型或组织的甲基化标记。
本发明考虑了鉴定在任何目的细胞中的甲基化标记，所述细胞包括但不限于胰腺细胞(例如胰腺β细胞、外分泌胰腺细胞(例如，腺泡细胞)、脑细胞、少突胶质细胞、心脏细胞(心肌细胞)、肝细胞(肝细胞)、肾细胞、血管内皮细胞、淋巴细胞、肺细胞、子宫细胞、乳腺细胞、脂肪细胞、结肠细胞、直肠细胞、前列腺细胞、甲状腺细胞和骨骼肌细胞。
如本文使用的术语“甲基化位点”是指与鸟嘌呤残基相邻的胞嘧啶残基(CpG位点)，其具有被甲基化的可能。
连续序列优选不超过300个核苷酸、295个核苷酸、290个核苷酸、285个核苷酸、280个核苷酸、275个核苷酸、270个核苷酸、265个核苷酸、260个核苷酸、255个核苷酸、250个核苷酸、245个核苷酸、240个核苷酸、235个核苷酸、230个核苷酸、225个核苷酸、220个核苷酸、215个核苷酸、210个核苷酸、205个核苷酸、200个核苷酸、195个核苷酸、190个核苷酸、185个核苷酸、180个核苷酸、175个核苷酸、170个核苷酸、165个核苷酸、160个核苷酸、155个核苷酸、150个核苷酸、145个核苷酸、140个核苷酸、135个核苷酸、130个核苷酸、125个核苷酸、120个核苷酸、115个核苷酸、110个核苷酸、105个核苷酸、100个核苷酸、95个核苷酸、90个核苷酸、85个核苷酸、80个核苷酸、75个核苷酸、70个核苷酸、65个核苷酸、60个核苷酸、55个核苷酸或50个核苷酸。
根据一个具体的实施方案，所述序列为50-300个核苷酸，例如50-250、50-200、100-300个核苷酸或100-250个核苷酸。
所述序列可具有编码区或非编码区。
根据一个具体的实施方案，所述序列并非来源于在目的细胞中差异表达的基因。因此，例如在鉴定胰腺β细胞的甲基化模式的情况下，DNA序列可以不是编码胰岛素或另一种胰腺β细胞蛋白的基因的一部分。
根据另一个具体的实施方案，甲基化模式表征正常目的细胞，并且不是表征病变细胞的甲基化模式(例如，不是表征特定类型的癌细胞的甲基化模式)。
连续核酸序列包含至少4个甲基化位点，但考虑至少5、至少6、至少7、至少8、至少9或甚至至少10或更多个甲基化位点。
为了考虑具体目的细胞的甲基化标记，相对于第二种不同的细胞，在所述目的细胞中至少4个甲基化位点的每一个必须被差异甲基化。
根据一个具体的实施方案，在目的细胞(对其测定甲基化模式的细胞)中至少4个甲基化位点的每一个未被甲基化，而在第二种不同的细胞中每个位点被甲基化。
根据另一个实施方案，在目的细胞中至少4个甲基化位点的每一个被甲基化，而在第二种不同的细胞中每个位点未被甲基化。
根据另一个实施方案，在目的细胞中4个甲基化位点中的至少一个未被甲基化，而在第二种不同的细胞中该位点被甲基化。
根据另一个实施方案，在目的细胞中4个甲基化位点中的至少两个未被甲基化，而在第二种不同的细胞中这些位点被甲基化。
根据另一个实施方案，在目的细胞中4个甲基化位点中的至少三个未被甲基化，而在第二种不同的细胞中这些位点被甲基化。
第二种不同的细胞可具有任何来源，包括例如血液细胞。
使用该方法，本发明人已鉴定了源自胰腺β细胞、腺泡细胞、脑细胞、神经元、少突胶质细胞、心肌细胞、肝细胞、肾细胞和骨骼肌细胞的DNA的甲基化标记，并且表明这些标记可成功区分源自这些细胞的DNA和源自血液细胞的DNA。
因此，根据本发明的另一个方面，提供测定样品中的DNA是否来源于目的细胞的方法，所述方法包括：
测定DNA的连续序列上的至少4个甲基化位点的甲基化状态，所述序列包含不超过300个核苷酸，其中目的细胞特有的连续序列上至少4个甲基化位点的每一个的甲基化状态指示DNA来源于目的细胞。
将理解，因为所分析的序列对于特定的细胞/组织类型是特异性的，所以该方法适合用于检查所研究的DNA是否来源于特定的细胞类型或组织类型。
因此，例如如果研究者希望测定样品中存在的DNA是否来源于胰腺β细胞，则他/她需要分析具有胰腺β细胞特有的甲基化模式的序列。
这样的序列包含在例如SEQ ID NOs: 1-4所示的序列中。
SEQ ID NOs: 1-4包含在不超过300个核苷酸的连续序列中包括至少4个甲基化位点的序列，所述位点在胰腺β细胞中未甲基化和在其它细胞(例如，血液细胞)中甲基化。根据一个具体的实施方案，连续序列包含在这些序列各自的位置250和251上的核苷酸CG。该CG在胰腺β细胞中未甲基化和在其它细胞(例如，血液细胞)中甲基化。
如果研究者希望测定样品中存在的DNA是否来源于胰腺管细胞，则他/她需要分析具有腺管细胞特有的甲基化模式的序列。
如果研究者希望测定样品中存在的DNA是否来源于肝细胞，则他/她需要分析具有肝细胞特有的甲基化模式的序列。
这样的序列包含在例如SEQ ID NO: 27所示的序列中。
SEQ ID NO: 27包含在不超过300个核苷酸的连续序列中包括至少4个甲基化位点的序列，所述位点在肝细胞中未甲基化和在其它细胞(例如，血液细胞)中甲基化。根据一个具体的实施方案，连续序列包含在这些序列各自的位置250和251上的核苷酸CG。该CG在肝细胞中未甲基化和在其它细胞(例如，血液细胞)中甲基化。
如果研究者希望测定样品中存在的DNA是否来源于肺组织，则他/她需要分析具有肺细胞特有的甲基化模式的序列。
这样的序列包含在例如序列28-33中。
SEQ ID NOs: 28-33包含在不超过300个核苷酸的连续序列中包括至少4个甲基化位点的序列，所述位点在肺细胞中未甲基化和在其它细胞(例如，血液细胞)中甲基化。根据一个具体的实施方案，连续序列包含在这些序列各自的位置250和251上的核苷酸CG。该CG在肺细胞中未甲基化和在其它细胞(例如，血液细胞)中甲基化。
如果研究者希望测定样品中存在的DNA是否来源于子宫组织，则他/她需要分析具有子宫细胞特有的甲基化模式的序列。
如果研究者希望测定样品中存在的DNA是否来源于肾细胞，则他/她需要分析具有肾细胞特有的甲基化模式的序列。
这样的序列包含在例如SEQ ID NO: 26中。
SEQ ID NO: 26包含在不超过300个核苷酸的连续序列中包括至少4个甲基化位点的序列，所述位点在肾细胞中未甲基化和在其它细胞(例如，血液细胞)中甲基化。根据一个具体的实施方案，连续序列包含在这些序列各自的位置250和251上的核苷酸CG。该CG在肾细胞中未甲基化和在其它细胞(例如，血液细胞)中甲基化。
如果研究者希望测定样品中存在的DNA是否来源于乳腺组织，则他/她需要分析具有乳腺细胞特有的甲基化模式的序列。
如果研究者希望测定样品中存在的DNA是否来源于脂肪细胞，则他/她需要分析具有脂肪细胞特有的甲基化模式的序列。
这样的序列包含在例如SEQ ID NOs: 22-25所示的序列中。
SEQ ID NOs: 22-25包含在不超过300个核苷酸的连续序列中包括至少4个甲基化位点的序列，所述位点在脂肪细胞中未甲基化和在其它细胞(例如，血液细胞)中甲基化。根据一个具体的实施方案，连续序列包含在这些序列各自的位置250和251上的核苷酸CG。该CG在脂肪细胞中未甲基化和在其它细胞(例如，血液细胞)中甲基化。
如果研究者希望测定样品中存在的DNA是否来源于结肠组织，则他/她需要分析具有源自结肠组织的细胞特有的甲基化模式的序列。
这样的序列包含在例如SEQ ID NOs: 17-20所示的序列中。
SEQ ID NOs: 17-20包含在不超过300个核苷酸的连续序列中包括至少4个甲基化位点的序列，所述位点在结肠组织的细胞中未甲基化和在其它非结肠组织的细胞(例如，血液细胞)中甲基化。根据一个具体的实施方案，连续序列包含在这些序列各自的位置250和251上的核苷酸CG。该CG在结肠细胞中未甲基化和在非结肠组织的细胞(例如，血液细胞)中甲基化。
如果研究者希望测定样品中存在的DNA是否来源于前列腺组织细胞，则他/她需要分析具有前列腺组织细胞特有的甲基化模式的序列。
如果研究者希望测定样品中存在的DNA是否来源于甲状腺组织细胞，则他/她需要分析具有甲状腺组织细胞特有的甲基化模式的序列。
如果研究者希望测定样品中存在的DNA是否来源于膀胱组织细胞，则他/她需要分析具有膀胱组织细胞特有的甲基化模式的序列。
如果研究者希望测定样品中存在的DNA是否来源于骨骼肌，则他/她需要分析具有骨骼肌特有的甲基化模式的序列。
这样的序列包含在例如序列36-39中。
SEQ ID NOs: 36-39包含在不超过300个核苷酸的连续序列中包括至少4个甲基化位点的序列，所述位点在骨骼肌中未甲基化和在非骨骼肌组织的细胞(例如，血液细胞)中甲基化。根据一个具体的实施方案，连续序列包含在这些序列各自的位置250和251上的核苷酸CG。该CG在骨骼肌中未甲基化和在非骨骼肌组织的细胞(例如，血液细胞)中甲基化。
如果研究者希望测定样品中存在的DNA是否来源于胰腺组织，则他/她需要分析具有胰腺组织特有的甲基化模式的序列。
这样的序列包含在例如序列40-44中。
SEQ ID NOs: 40-44包含在不超过300个核苷酸的连续序列中包括至少4个甲基化位点的序列，所述位点在胰腺组织中未甲基化和在非胰腺组织的细胞(例如，血液细胞)中甲基化。根据一个具体的实施方案，连续序列包含在这些序列各自的位置250和251上的核苷酸CG。该CG在胰腺组织中未甲基化和在非胰腺组织的细胞(例如，血液细胞)中甲基化。
如果研究者希望测定样品中存在的DNA是否来源于血液细胞，则他/她需要分析具有血液细胞特有的甲基化模式的序列。
这样的序列包含在例如SEQ ID NOs: 34和35所示的序列中。
SEQ ID NOs: 34和35包含在不超过300个核苷酸的连续序列中包括至少4个甲基化位点的序列，所述位点在血液细胞中未甲基化和在非血液细胞中甲基化。根据一个具体的实施方案，连续序列包含在这些序列各自的位置250和251上的核苷酸CG。该CG在血液细胞中未甲基化和在非血液细胞中甲基化。
如果研究者希望测定样品中存在的DNA是否来源于宫颈组织，则他/她需要分析具有宫颈细胞特有的甲基化模式的序列。
如果研究者希望测定样品中存在的DNA是否来源于脑组织，则他/她需要分析具有脑组织细胞特有的甲基化模式的序列。
这样的序列包含在例如序列5-16中。
SEQ ID NOs: 5-16包含在不超过300个核苷酸的连续序列中包括至少4个甲基化位点的序列，所述位点在脑组织细胞中未甲基化和在非脑组织细胞中甲基化。根据一个具体的实施方案，连续序列包含在这些序列各自的位置250和251上的核苷酸CG。该CG在脑细胞中未甲基化和在非脑组织细胞(例如，血液细胞)中甲基化。
如果研究者希望测定样品中存在的DNA是否来源于直肠组织，则他/她需要分析具有直肠组织细胞特有的甲基化模式的序列。
如果研究者希望测定样品中存在的DNA是否来源于心脏组织，则他/她需要分析具有心脏组织细胞特有的甲基化模式的序列。
如果研究者希望测定样品中存在的DNA是否来源于内皮组织，则他/她需要分析具有内皮细胞特有的甲基化模式的序列。
这样的序列包含在例如SEQ ID NO: 21中。
SEQ ID NO: 21包含在不超过300个核苷酸的连续序列中包括至少4个甲基化位点的序列，所述位点在肾细胞中未甲基化和在其它细胞(例如，血液细胞)中甲基化。根据一个具体的实施方案，连续序列包含在这些序列各自的位置250和251上的核苷酸CG。该CG在内皮细胞中未甲基化和在其它细胞(例如，血液细胞)中甲基化。
本发明人已鉴定的作为用于测定DNA的细胞来源的候选序列的序列可储存在数据库中。示例性的序列包括上文描述的那些 – 例如SEQ ID NOs: 1-44所示的那些。
数据库可分成对鉴定特定细胞类型或组织来源相关的序列。另外或备选地，数据库可分成非甲基化时指示特定细胞类型/组织来源的序列和甲基化时指示特定细胞类型/组织来源的序列。
数据库还可包含已测试的受试者的序列的甲基化状态。受试者可分类为健康的或有患病的。
数据库可以计算机可读形式储存在计算机可读介质上，任选和优选地通过数据处理器访问，例如通用计算机或专用电路。
可分析的样品通常是源自哺乳动物受试者的流体样品，包括例如血液、血浆、精液、乳、尿、唾液或脑脊液。
分析的样品通常包含来自至少两种细胞/组织来源的DNA，如下文进一步描述的。
根据一个实施方案，血液样品根据本领域众所周知的方法获自受试者。血浆或血清可根据本领域已知的方法分离。
DNA可立即或在1小时、2小时、3小时、4小时、5小时或6小时内自血液分离。任选地，在分离DNA之前，血液在温度例如4 ºC或-20 ºC下贮存。在一些实施方案中，将血液样品的一部分按照本发明在第一时间使用，而将血液样品(或其级分)的一个或多个剩余部分贮存一段时间供后续使用。
根据一个实施方案，DNA是细胞DNA (即包含在细胞中)。
根据又一个实施方案，DNA包含在脱落的细胞或不完整的细胞中。
DNA提取的方法是本领域众所周知的。经典的DNA分离方案基于使用有机溶剂的提取，例如苯酚和氯仿的混合物，接着用乙醇沉淀(J. Sambrook 等, "Molecular Cloning:A Laboratory Manual", 1989, 第2版, Cold Spring Harbour Laboratory Press: NewYork, N.Y.)。其它方法包括：盐析DNA提取(P. Sunnucks 等, Genetics, 1996, 144:747-756; S. M. Aljanabi和I. Martinez, Nucl. Acids Res. 1997, 25: 4692-4693)、三甲基溴化铵盐DNA提取(S. Gustincich 等, BioTechniques, 1991, 11: 298-302)和硫氰酸胍DNA提取(J. B. W. Hammond 等, Biochemistry, 1996, 240: 298-300)。
也存在许多通用试剂盒，其可用于从组织和体液提取DNA和可市售获自例如BDBiosciences Clontech (Palo Alto, Calif.)、Epicentre Technologies (Madison,Wis.)、Gentra Systems, Inc. (Minneapolis, Minn.)、MicroProbe Corp. (Bothell,Wash.)、Organon Teknika (Durham, N.C.)和Qiagen Inc. (Valencia, Calif.)。详细描述所遵循的方案的用户指南通常包括在所有这些试剂盒中。灵敏性、处理时间和成本可在试剂盒之间彼此不同。本领域普通技术人员可容易选择对于特定条件最合适的试剂盒。
根据另一个实施方案，DNA是无细胞DNA。对于该方法，不对样品进行细胞裂解。从体液分离无细胞DNA的方法也是本领域已知的。例如由Qiagen生产的Qiaquick试剂盒可用于从血浆或血清提取无细胞DNA。
在进行该方法之前可处理样品，例如在提取程序后可进行DNA纯化。样品中的DNA可经物理或化学裂解(例如，使用合适的酶)。样品的处理可包括以下一种或多种：过滤、蒸馏、离心、提取、浓缩、稀释、纯化、灭活干扰组分、加入试剂等。
应理解，本发明考虑分析超过1个靶序列(每一个在DNA的连续序列上包含至少4个甲基化位点)。因此，可分析例如2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个靶序列(作为组织或细胞-特异性标记)。这可平行使用相同的DNA制备物或在多个DNA制备物上完成。
测定甲基化位点的甲基化状态的方法是本领域已知的，并且包括使用亚硫酸氢盐。
在此方法中，DNA用亚硫酸氢盐处理，其转化胞嘧啶残基为尿嘧啶(其在PCR后被转化为胸腺嘧啶)，但保留5-甲基胞嘧啶残基不受影响。因此，亚硫酸氢盐处理在DNA序列中引入取决于单个胞嘧啶残基的甲基化状态的特定变化，得到关于DNA片段的甲基化状态的单-核苷酸解析信息。可对改变的序列进行各种分析，以检索该信息。因此，这种分析的目标被简化为区分从亚硫酸氢盐转化产生的单核苷酸多态性(胞嘧啶和胸腺嘧啶)。
在亚硫酸氢盐反应期间，应注意使DNA降解最小化，例如使孵育温度循环。
亚硫酸氢盐测序依赖于每一个单个未甲基化胞嘧啶残基至尿嘧啶的转化。如果转化不完全，则后续分析会错误地将未转化的未甲基化胞嘧啶解读为甲基化胞嘧啶，导致对甲基化的假阳性结果。仅单链DNA中的胞嘧啶对亚硫酸氢盐攻击易感，因此经受分析的DNA的变性是关键的。重要的是确保反应参数例如温度和盐浓度适合于保持DNA呈单链构象，并允许完全转化。
根据一个具体的实施方案，进行氧化型亚硫酸氢盐反应。5-甲基胞嘧啶和5-羟基甲基胞嘧啶两者在亚硫酸氢盐测序中均读为C。氧化型亚硫酸氢盐反应允许在单碱基解析时区分5-甲基胞嘧啶和5-羟基甲基胞嘧啶。该方法利用5-羟基甲基胞嘧啶特定化学氧化为5-甲酰基胞嘧啶，其随后在亚硫酸氢盐处理期间转化为尿嘧啶。然后读为C的唯一的碱基是5-甲基胞嘧啶，给出DNA样品的真实甲基化状态的图谱。5-羟基甲基胞嘧啶的水平也可通过测量亚硫酸氢盐和氧化型亚硫酸氢盐测序之间的差异来定量测定。
在分析之前(或与其同时)，亚硫酸氢盐-处理的包含至少4个甲基化位点的DNA序列可经过扩增反应。如果需要序列的扩增，则注意确保嘧啶残基的完全脱磺酸化。这可通过监测溶液pH实现，以确保脱磺酸化完成。
如本文使用的术语"扩增"是指通过产生多个(即至少2个)拷贝的所需序列，增加样品中一群特定核酸序列的表现的过程。用于核酸扩增的方法是本领域已知的，包括但不限于聚合酶链反应(PCR)和连接酶链反应(LCR)。在典型的PCR扩增反应中，目的核酸序列通常相对于其在起始样品中的量扩增至少5万倍的量。"拷贝"或"扩增子"不必然意指与模板序列完全序列互补或相同。例如，拷贝可包括核苷酸类似物，例如脱氧肌苷、故意的序列改变(例如通过包含可杂交但不与模板互补的序列的引物引入的序列改变)，和/或在扩增期间出现的序列错误。
典型的扩增反应通过使正向引物和反向引物(引物对)与样品DNA以及任何另外的扩增反应试剂在允许扩增靶序列的条件下接触进行。
术语"正向引物"和"正向扩增引物"在本文中可互换使用，是指杂交(或退火)至靶标(模板链)的引物。术语"反向引物"和"反向扩增引物"在本文中可互换使用，是指杂交(或退火)至互补靶标链的引物。相对于反向引物，正向引物与靶序列5'杂交。
如本文使用的术语"扩增条件"是指促进引物序列的退火和/或延伸的条件。这样的条件是本领域众所周知的，和取决于选择的扩增方法。因此，例如在PCR反应中，扩增条件通常包含热循环，即，反应混合物在两个或更多个温度之间循环。在等温扩增反应中，尽管可能需要初始温度增加而引发反应，但无热循环而发生扩增。扩增条件涵盖所有反应条件，包括但不限于温度和温度循环、缓冲液、盐、离子强度和pH等。
如本文使用的术语"扩增反应试剂"是指用于核酸扩增反应的试剂，可包括但不限于缓冲液、试剂、具有逆转录酶和/或聚合酶活性或外切核酸酶活性的酶、酶辅助因子例如镁或锰、盐、烟酰胺腺嘌呤二核酸酶(NAD)和脱氧核苷三磷酸(dNTPs)，例如脱氧腺苷三磷酸、脱氧鸟苷三磷酸、脱氧胞啶三磷酸和胸腺嘧啶三磷酸。本领域技术人员根据使用的扩增方法可容易选择扩增反应试剂。
根据本发明的这一方面，扩增可使用技术例如聚合酶链反应(PCR)完成，其包括但不限于等位基因特异性PCR、组装PCR或聚合酶循环组装(PCA)、不对称PCR、解旋酶依赖性扩增、热启动PCR、序列间特异性PCR (ISSR)、反转PCR、连接介导的PCR、甲基化-特异性PCR(MSP)、小引物PCR、多路连接依赖性探针扩增、多路PCR、巢式PCR、重叠延伸PCR、定量PCR(Q-PCR)、反转录PCR (RT-PCR)、固相PCR：包括多种含义，包括Polony扩增(例如，其中PCR菌落源自于凝胶基质中)、桥接PCR (引物共价连接至固体载体表面)、常规固相PCR (其中在带有具有匹配水性引物之一的序列的引物的固体载体存在时，应用不对称PCR)和增强型固相PCR (其中常规固相PCR可通过使用高Tm和巢式固体载体引物以及任选应用热“步骤”以利于固体载体引发而改进)；热不对称交错PCR (TAIL-PCR)、Touchdown PCR (步减PCR)、PAN-AC和通用快速步移。
PCR (或聚合酶链反应)技术是本领域众所周知的，并且已公开于例如，K. B.Mullis和F. A. Faloona, Methods Enzymol., 1987, 155: 350-355和美国专利号4,683,202; 4,683,195;和4,800,159 (其各自通过引用以其整体结合到本文中)。以其最简化的形式，PCR为使用与相对链杂交和侧连靶DNA的目的区域的两个寡核苷酸引物，用于酶促合成特定DNA序列的体外方法。多个反应循环，各循环包含：变性步骤、退火步骤和聚合步骤，导致特定DNA片段的指数积聚("PCR Protocols: A Guide to Methods andApplications", M. A. Innis (Ed.), 1990, Academic Press: New York; "PCRStrategies", M. A. Innis (Ed.), 1995, Academic Press: New York; "Polymerasechain reaction: basic principles and automation in PCR: A PracticalApproach", McPherson 等 (Eds.), 1991, IRL Press: Oxford; R. K. Saiki 等,Nature, 1986, 324: 163-166)。扩增的片段的末端由引物的5'端定义。在PCR反应中能够产生扩增产物的DNA聚合酶的实例包括但不限于：大肠杆菌DNA聚合酶I、DNA聚合酶I的Klenow片段、T4 DNA聚合酶；自水生栖热菌(Thermus aquaticus) (Taq) (可获自各种来源(例如Perkin Elmer))、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus) (United StatesBiochemicals)、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stereothermophilus) (Bio-Rad)或Thermococcus litoralis ("Vent"聚合酶，New England Biolabs)分离的热稳定DNA聚合酶。RNA靶序列可通过反转录mRNA为cDNA，然后如上文所述进行PCR而扩增(RT-PCR)。或者，单一酶可用于两个步骤，如美国专利号5,322,770中所述。
PCR循环的各步骤的持续时间和温度，以及循环数，通常根据结果的严格性要求进行调整。退火温度和时间通过预期引物退火至模板的效率和将耐受的错配程度两者来确定。优化反应循环条件的能力完全在本领域普通技术人员的知识范围内。尽管反应循环数可根据进行的检测分析而改变，但通常为至少15个、更通常至少20个，并可高达60个或更高。然而在许多情况下，反应循环数范围通常为约20至约45个。
PCR循环的变性步骤通常包括将反应混合物加热至升高的温度和将混合物保持在该升高的温度下，持续对于反应混合物中存在的任何双链或杂交的核酸足以解离的一段时间。对于变性，反应混合物的温度通常升高至范围约85 ℃-约100 ℃、通常约90 ℃-约98℃和更通常约93 ℃-约96 ℃的温度并在其中保持范围约3-约120秒、通常约5-约30秒的一段时间。
变性后，使反应混合物经历引物足以退火至混合物中存在的模板DNA的条件。通常选择为达到这些条件而将反应混合物降低至的温度以提供最佳效率和特异性，通常范围为约50 ℃-约℃、通常约55 ℃-约70 ℃和更通常约60 ℃-约68 ℃。退火条件通常保持范围约15秒-约30分钟、通常约30秒-约5分钟的一段时间。
在引物退火至模板DNA后或在引物退火至模板DNA期间，使反应混合物经历足以提供将核苷酸聚合至引物末端的条件，其方式使得使用其杂交的DNA作为模板，引物在5'至3'方向上延伸(即，足以酶促产生引物延伸产物的条件)。为实现引物延伸条件，反应混合物的温度通常升高至范围约65℃-约75 ℃、通常约67 ℃-约73 ℃的温度和在该温度下保持范围约15秒-约20分钟、通常约30秒-约5分钟的一段时间。
变性、退火和聚合的上述循环可使用通常称为热力循环仪或热循环仪的自动化装置进行。可使用的热循环仪描述于美国专利号5,612,473; 5,602,756; 5,538,871;和5,475,610 (其各自通过引用以其整体结合到本文中)。热循环仪可市售获自例如，PerkinElmer-Applied Biosystems (Norwalk, Conn.)、BioRad (Hercules, Calif.)、RocheApplied Science (Indianapolis, Ind.)和Stratagene (La Jolla, Calif.)。
根据一个实施方案，在扩增反应中使用的引物是甲基化非依赖性引物。这些引物侧连至少4个甲基化位点的第一个和最后一个(但不直接与所述位点杂交)，并且在PCR反应中能够产生包含所有4个或更多个甲基化位点的扩增子。
本发明的该方面的甲基化-非依赖性引物可包含接头序列，其包括条码序列。接头可进一步包含用于连接至流动池表面所必需的序列(P5和P7位点，用于后续测序)，编码RNA聚合酶的启动子和/或限制位点的序列。条码序列可用于鉴定特定的分子、样品或文库。条码序列可以为3-400个核苷酸，更优选地3-200个和甚至更优选地3-100个核苷酸。因此，条码序列可以是6个核苷酸、7个核苷酸、8个核苷酸、9个核苷酸或10个核苷酸。条码通常是4-15个核苷酸。
本发明的该方面的甲基化-非依赖性寡核苷酸不需要反映靶核酸序列的准确序列(即，不需要完全是互补的)，但必须足够互补以致在特定的试验条件下杂交至靶位点。因此，寡核苷酸的序列通常例如在至少13或更多个连续核苷酸的区域上与靶序列具有至少70%同源性、优选地至少80%、90%、95%、97%、99%或100%同源性。所述条件经选择使得寡核苷酸与靶位点的杂交是有利的，和与非靶位点的杂交最小化。
当选择杂交条件的严格性时，必须考虑各种因素。例如，寡核苷酸(例如，引物)越接近地反映靶核酸序列，测定条件严格性可越高，但严格性不应太高以致阻止寡核苷酸与靶序列杂交。此外，寡核苷酸与靶序列的同源性越低，测定条件的严格性应越低，但严格性不应太低以致允许与非特异性核酸序列杂交。
如所述的，本发明预期分析超过一个靶序列(每一个在DNA的连续序列上包含至少4个甲基化位点)。序列可单独或作为多路反应的一部分进行分析。
DNA可使用本领域已知的任何方法测序 – 例如，大量平行DNA测序、通过合成测序、通过连接测序、454焦磷酸测序、簇扩增、桥扩增和PCR扩增，但优选地，所述方法包括高通量测序方法。典型的方法包括Roche 454 Life SciencesTM, Branford, Conn.提供的测序技术和分析仪器，在本文中其有时称为"454技术"或"454测序"；Illumina, Inc, SanDiego, Calif提供的测序技术和分析仪器(其Solexa测序技术在本文中有时称为"Solexa方法"或"Solexa技术")；或ABI, Applied Biosystems, Indianapolis, Ind.提供的测序技术和分析仪器，在本文中其有时称为ABI-SOLiDTM平台或方法。
其它已知的测序方法包括例如，描述于以下的那些方法：Sanger, F.等, Proc.Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75, 5463-5467 (1977); Maxam, A. M. & Gilbert, W. ProcNatl Acad Sci USA 74, 560-564 (1977); Ronaghi, M. 等, Science 281, 363, 365(1998); Lysov, l. 等, Dokl Akad Nauk SSSR 303, 1508-1511 (1988); Bains W. &Smith G. C. J. Theor Biol 135, 303-307 (1988); Drnanac, R. 等, Genomics 4,114-128 (1989); Khrapko, K. R. 等, FEBS Lett 256.118-122 (1989); Pevzner P.A. J Biomol Struct Dyn 7, 63-73 (1989);和Southern, E. M. 等, Genomics 13,1008-1017 (1992)。也可使用基于焦磷酸的测序反应，如描述于例如美国专利号6,274,320、6,258,568和6,210,891。
Illumina或Solexa测序基于可逆染料-终止子。DNA分子通常连接至玻片上的引物并扩增，使得形成局部克隆集落。随后，可一次加入一个类型的核苷酸，并洗去非掺入的核苷酸。随后，可获取荧光标记的核苷酸的图像，并从DNA经化学除去染料，允许下一个循环。Applied Biosystems的SOLiD技术采用通过连接测序。该方法基于固定长度的所有可能的寡核苷酸的库的使用，其根据测序的位置进行标记。这样的寡核苷酸被退火和连接。随后，DNA连接酶优先连接匹配的序列通常在该位置上产生核苷酸的信号信息。因为DNA通常通过乳液PCR扩增，得到的珠，各自仅包含相同DNA分子的拷贝，可沉积在玻璃片上，产生数量和长度与Illumina测序相当的序列。考虑的测序方法的另一个实例是焦磷酸测序，特别是454焦磷酸测序，例如，基于Roche 454基因组测序仪。该方法在油溶液的水滴内扩增DNA，其中各液滴包含与单个引物包被的珠连接的单个DNA模板，其然后形成克隆集落。焦磷酸测序使用萤光素酶产生光以检测添加至新生DNA的单个核苷酸，并且合并的数据用于产生序列读出。进一步的方法基于Helicos的Heliscope技术，其中通过与阵列连接的polyT寡聚物捕获片段。在每个测序循环中，加入聚合酶和单一荧光标记的核苷酸和使阵列成像。随后除去荧光标签和重复循环。本发明的方法中包括的测序技术的其它实例为通过杂交测序、使用纳米孔测序、基于显微镜的测序技术、微流Sanger测序或基于微芯片的测序方法。本发明还进一步考虑这些技术的发展，例如，序列测定的准确度或测定生物体的基因组序列需要的时间等的进一步改进。
根据一个实施方案，测序方法包括深度测序。
如本文使用的术语“深度测序”和其变体是指在测序过程中读取核苷酸的次数。深度测序表明过程的覆盖度或深度是研究中的序列长度的许多倍。
将理解，本文所述的任何分析方法可以许多形式具体化。例如，其可在有形介质例如计算机上具体化以进行方法操作。其可在包含计算机可读指令的计算机可读介质上具体化，以进行方法操作。其还可在具有数字计算机能力的电子器件(其经排布以在有形介质上运行计算机程序或执行计算机可读介质上的指令)上具体化。
实施本实施方案的分析方法的计算机程序通常可在分配介质上分配至用户，例如但不限于CD-ROM或闪存介质。从分配介质，计算机程序可复制至硬盘或类似的中间存储介质。在本发明的一些实施方案中，实施本实施方案的方法的计算机程序可通过允许用户从远程位置通过互联网例如因特网下载程序而分配至用户。计算机程序可通过从其分配介质或其中间存储介质加载计算机指令至计算机的执行内存，配置计算机以按照本发明的方法执行而运行。所有这些操作是计算机系统技术领域的技术人员众所周知的。
可用于分析本文所述的甲基化模式的依赖于使用亚硫酸氢盐的其它方法在下文中描述：
甲基化-敏感性单-核苷酸引物延伸：
DNA经亚硫酸氢盐-转化，和亚硫酸氢盐-特异性引物退火至序列，直至紧接目的CpG之前的碱基对。使用DNA聚合酶终止二脱氧核苷酸，允许引物延伸1个碱基对至C (或T)，和定量测定C与T的比率。可使用许多方法来测定该C:T比率，例如使用放射性ddNTP作为引物延伸的报告物，基于荧光的方法或也可使用焦磷酸测序。基质辅助激光解吸电离/飞行时间(MALDI-TOF)质谱分析可用于区分两种多态性引物延伸产物，其本质上根据经设计用于SNP基因分型的GOOD测定。离子配对反相高效液相色谱(IP-RP-HPLC)也可用于区分引物延伸产物。
碱基特异性切割/MALDI-TOF：该方法利用通过加入碱基特异性切割步骤的亚硫酸氢盐-转化，以增强从核苷酸改变获得的信息。通过首先使用目的区域至RNA的体外转录(在初始扩增中通过加入RNA聚合酶启动子位点至PCR引物)，RNase A可用于在碱基特异性位点上切割RNA转录物。因为RNase A在胞嘧啶和尿嘧啶核糖核苷酸上特异性地切割RNA，当需要胞嘧啶-特异性(C-特异性)切割时碱基特异性通过加入掺入切割抵抗性dTTP而实现，和当需要尿嘧啶-特异性(U-特异性)切割时掺入dCTP。切割的片段然后可通过MALDI-TOF分析。亚硫酸氢盐处理导致通过C至U转化而引入/除去切割位点，或通过在扩增的反向链上G至A转化而片段质量改变。C-特异性切割将在所有甲基化CpG位点上特异性切割。通过分析得到片段的大小，有可能测定在该区域内CpG位点的DNA甲基化的特定模式。
本发明进一步考虑了分析至少4个位点的甲基化状态，包括使用甲基化-依赖性寡核苷酸。
甲基化依赖性寡核苷酸杂交至至少1个甲基化位点的甲基化形式或至少1个甲基化位点的未甲基化形式。
根据一个实施方案，甲基化依赖性寡核苷酸是探针。在一个实施方案中，在实验条件下探针杂交至甲基化位点以提供可检测信号和在相同的实验条件下不杂交至非甲基化位点以提供可检测信号。在另一实施方案中，在实验条件下探针杂交至非甲基化位点以提供可检测信号和在相同的实验条件下不杂交至甲基化位点以提供可检测信号。本发明的该方面的该实施方案的探针可以例如附着至固体支持物(例如阵列或珠)。
根据另一个实施方案，甲基化依赖性寡核苷酸是引物，当甲基化位点被甲基化时，当其用于扩增反应时能够扩增靶序列。根据另一个实施方案，甲基化依赖性寡核苷酸是引物，当甲基化位点未被甲基化时，当其用于扩增反应时能够扩增靶序列 – 见例如国际PCT公开号WO2013131083，其内容通过引用结合到本文中。
本发明的该方面的甲基化-依赖性寡核苷酸不需要反映靶核酸序列的准确序列(即，不需要完全互补)，但必须足够互补以致在特定实验条件下区分甲基化和非甲基化位点。因此，寡核苷酸的序列通常例如在至少13或更多个连续核苷酸的区域上与靶序列具有至少70%同源性、优选地至少80%、90%、95%、97%、99%或100%同源性。所述条件经选择使得寡核苷酸与甲基化位点的杂交是有利的，并且与非甲基化位点的杂交被最小化(并且反之亦然)。
通过实例的方式，根据需要的严格性，短核酸(长度低于200 bp，例如，长度13-50bp)的杂交可通过以下杂交方案实现：(i) 杂交溶液为6 x SSC和1 % SDS或3 M TMACl,0.01 M磷酸钠(pH 6.8), 1 mM EDTA (pH 7.6), 0.5 % SDS, 100 μg/ml变性的鲑鱼精DNA和0.1 %脱脂奶粉，杂交温度为低于Tm 1 - 1.5 ℃，最终的洗涤溶液为在低于Tm 1 - 1.5℃下3 M TMACl, 0.01 M磷酸钠(pH 6.8), 1 mM EDTA (pH 7.6), 0.5 % SDS (严格杂交条件)；(ii) 杂交溶液为6 x SSC和0.1 % SDS或3 M TMACI, 0.01 M磷酸钠(pH 6.8), 1mM EDTA (pH 7.6), 0.5 % SDS, 100 μg/ml变性鲑鱼精DNA和0.1 %脱脂奶粉，杂交温度为低于Tm 2 - 2.5 ℃，最终洗涤溶液为在低于Tm 1 - 1.5 ℃下3 M TMACl, 0.01 M磷酸钠(pH 6.8), 1 mM EDTA (pH 7.6), 0.5 % SDS，最终洗涤溶液为6 x SSC和最终在22 ℃下洗涤(严格至中等杂交条件)；和(iii) 杂交溶液为6 x SSC和1 % SDS或3 M TMACI, 0.01M磷酸钠(pH 6.8), 1 mM EDTA (pH 7.6), 0.5 % SDS, 100 μg/ml变性鲑鱼精DNA和0.1 %脱脂奶粉，杂交温度为低于Tm 2.5-3 ℃和最终洗涤溶液为在22 ℃下6 x SSC (中等杂交溶液)。
本发明的寡核苷酸可通过各种方法的任何一种制备(见例如, J. Sambrook 等,"Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 1989, 2.sup.nd Ed., Cold SpringHarbour Laboratory Press: New York, N.Y.; "PCR Protocols: A Guide to Methodsand Applications", 1990, M. A. Innis (Ed.), Academic Press: New York, N.Y.;P. Tijssen "Hybridization with Nucleic Acid Probes--Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology (Parts I和II)", 1993, Elsevier Science; "PCR Strategies", 1995, M. A. Innis (Ed.), Academic Press: New York, N.Y.;和"Short Protocols in Molecular Biology", 2002, F. M. Ausubel (Ed.), 5.sup.thEd., John Wiley & Sons: Secaucus, N.J.)。例如，寡核苷酸可使用本领域众所周知的多种化学技术中的任一种制备，包括例如，基于模板的化学合成和聚合，如描述于例如S. A.Narang 等, Meth. Enzymol. 1979, 68: 90-98; E. L. Brown 等, Meth. Enzymol.1979, 68: 109-151; E. S. Belousov 等, Nucleic Acids Res. 1997, 25: 3440-3444;D. Guschin 等, Anal. Biochem. 1997, 250: 203-211; M. J. Blommers 等,Biochemistry, 1994, 33: 7886-7896;和K. Frenkel 等, Free Radic. Biol. Med.1995, 19: 373-380;和美国专利号4,458,066。
例如,寡核苷酸可使用基于亚磷酰胺途径的自动化的固相程序制备。在这样的方法中，各核苷酸单独加入延伸的寡核苷酸链的5'-端，所述寡核苷酸链的3'-端与固体支持物连接。加入的核苷酸呈三价3'-亚磷酰胺的形式，其通过在5'-位置上的二甲氧基三苯甲基(或DMT)基团经保护免于聚合。在碱诱导亚磷酰胺偶联后，温和氧化得到五价磷酸三酯中间体和DMT除去得到用于寡核苷酸延伸的新位点。寡核苷酸然后从固体支持物上切下，和磷酸二酯和环外氨基用氢氧化铵脱保护。这些合成可在oligo合成仪上进行，例如市售得自Perkin Elmer/Applied Biosystems, Inc. (Foster City, Calif.)、DuPont(Wilmington, Del.)或Milligen (Bedford, Mass.)的那些。或者，寡核苷酸可从本领域众所周知的各种商业来源定制和订购,包括例如Midland Certified Reagent Company(Midland, Tex.)、ExpressGen, Inc. (Chicago, Ill.)、Operon Technologies, Inc.(Huntsville, Ala.)等等。
本发明的寡核苷酸的纯化，在必要或需要时，可通过本领域众所周知的多种方法的任何一种进行。寡核苷酸的纯化通常通过非变性丙烯酰胺凝胶电泳、通过描述于例如J.D. Pearson和F. E. Regnier (J. Chrom., 1983, 255: 137-149)的阴离子交换HPLC或通过反相HPLC (G. D. McFarland和P. N. Borer, Nucleic Acids Res., 1979, 7: 1067-1080)进行。
寡核苷酸的序列可使用任何合适的测序方法验证，包括但不限于化学降解(A. M.Maxam和W. Gilbert, Methods of Enzymology, 1980, 65: 499-560)、基质辅助激光解吸电离飞行时间(MALDI-TOF)质谱(U. Pieles 等, Nucleic Acids Res., 1993, 21: 3191-3196)、碱性磷酸酶和外切核酸酶组合消化后质谱(H. Wu和H. Aboleneen, Anal.Biochem., 2001, 290: 347-352)等。
在某些实施方案中，检测探针或扩增引物或探针和引物两者用可检测试剂或部分标记，然后用于扩增/检测测定法。在某些实施方案中，检测探针用可检测试剂标记。优选地，可检测试剂经选择使得其产生信号，该信号可测量并且其强度与所分析的样品中的扩增产物的量相关(例如成比例)。
寡核苷酸和可检测试剂之间的缔合可以是共价或非共价的。标记的检测探针可通过掺入或缀合至可检测部分而制备。标记可直接或间接(例如通过接头)连接至核酸序列。各种长度的接头或间隔臂是本领域已知的，和可市售获得，和可经选择以降低空间位阻或赋予得到的标记分子其它有用或需要的性质(见例如, E. S. Mansfield 等, Mol. Cell.Probes, 1995, 9: 145-156)。
用于标记核酸分子的方法是本领域众所周知的。对于标记方案的综述，本领域中标记检测技术和最近的进展，见例如, L. J. Kricka, Ann. Clin. Biochem. 2002, 39:114-129; R. P. van Gijlswijk 等, Expert Rev. Mol. Diagn. 2001, 1: 81-91;和S.Joos 等, J. Biotechnol. 1994, 35: 135-153。标准核酸标记方法包括：掺入放射性试剂，直接连接荧光染料(L. M. Smith 等, Nucl. Acids Res., 1985, 13: 2399-2412)或酶(B. A. Connoly和O. Rider, Nucl. Acids. Res., 1985, 13: 4485-4502)；核酸分子的化学修饰，使得它们可经免疫化学或通过其它亲和反应而检测(T. R. Broker 等,Nucl. Acids Res. 1978, 5: 363-384; E. A. Bayer 等, Methods of Biochem.Analysis, 1980, 26: 1-45; R. Langer 等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1981, 78:6633-6637; R. W. Richardson 等, Nucl. Acids Res. 1983, 11: 6167-6184; D. J.Brigati 等, Virol. 1983, 126: 32-50; P. Tchen 等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,1984, 81: 3466-3470; J. E. Landegent 等, Exp. Cell Res. 1984, 15: 61-72;和A.H. Hopman 等, Exp. Cell Res. 1987, 169: 357-368)；和酶介导的标记方法，例如随机启动、缺口翻译、PCR和用末端转移酶加尾(对于酶标记的综述，见例如J. Temsamani和S.Agrawal, Mol. Biotechnol. 1996, 5: 223-232)。更近开发的核酸标记系统包括但不限于：ULS (通用连接系统)，其基于单反应性顺铂衍生物与DNA的鸟嘌呤部分的N7位置的反应(R. J. Heetebrij 等, Cytogenet. Cell. Genet. 1999, 87: 47-52)；补骨脂素-生物素，其嵌入核酸和在UV辐射时变成共价键合至核苷酸碱基(C. Levenson 等, MethodsEnzymol. 1990, 184: 577-583;和C. Pfannschmidt 等, Nucleic Acids Res. 1996,24: 1702-1709)；光反应性叠氮基衍生物(C. Neves 等, Bioconjugate Chem. 2000, 11:51-55)；和DNA烷化剂(M. G. Sebestyen 等, Nat. Biotechnol. 1998, 16: 568-576)。
各种可检测试剂中的任一种可用于本发明的实践。合适的可检测试剂包括但不限于，各种配体、放射性核素(例如32P, 35S, 3H, 14C, 125I, 131I等)、荧光染料(对于具体的示例性荧光染料，见下文)、化学发光剂(例如，吖啶酯、稳定的二氧杂环丁烷等)；光谱可解析的无机荧光半导体纳米晶体(即，量子点)、金属纳米颗粒(例如金、银、铜和铂)或纳米簇；酶(例如，用于ELISA的那些酶，即，辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶)；比色标记(例如，染料、胶体金等)；磁性标记(例如DynabeadsTM)；和生物素、dioxigenin或抗血清或单克隆抗体可用的其它半抗原和蛋白。
在某些实施方案中，本发明的检测探针经荧光标记。具有各种化学结构和物理性质的大量已知的荧光标记部分可适用于实施本发明。合适的荧光染料包括但不限于，荧光素和荧光素染料(例如异硫氰酸荧光素或FITC、萘并荧光素、4',5'-二氯-2',7'-二甲氧基-荧光素、6羧基荧光素或FAM)、羰花青、部花青、苯乙烯基染料、氧鎓醇染料、藻红蛋白、赤藓红、伊红、若丹明染料(例如，羧基四甲基若丹明或TAMRA、羧基若丹明6G、羧基-X-若丹明(ROX)、丽丝胺若丹明B、若丹明6G、若丹明绿、若丹明红、四甲基若丹明或TMR)、香豆素和香豆素染料(例如甲氧基香豆素、二烷基氨基香豆素、羟基香豆素和氨基甲基香豆素或AMCA)、俄勒冈绿染料(例如俄勒冈绿488、俄勒冈绿500、俄勒冈绿514)、得克萨斯红、得克萨斯红-X、光谱红TM.、光谱绿TM.、花青染料(例如，Cy-3.TM.、Cy-5.TM.、Cy-3.5.TM.、Cy-5.5.TM.)、Alexa Fluor染料(例如Alexa Fluor 350、Alexa Fluor 488、Alexa Fluor 532、AlexaFluor 546、Alexa Fluor 568、Alexa Fluor 594、Alexa Fluor 633、Alexa Fluor 660和Alexa Fluor 680)、BODIPY染料(例如BODIPY FL、BODIPY R6G、BODIPY TMR、BODIPY TR、BODIPY 530/550、BODIPY 558/568、BODIPY 564/570、BODIPY 576/589、BODIPY 581/591、BODIPY 630/650、BODIPY 650/665)、IRDyes (例如IRD40、IRD 700、IRD 800)等。对于将荧光染料连接或掺入核酸分子的合适的荧光染料和方法的更多实例，参见例如"TheHandbook of Fluorescent Probes and Research Products", 9th Ed., MolecularProbes, Inc., Eugene, Oreg。荧光染料以及标记试剂盒可市售获自例如，AmershamBiosciences, Inc. (Piscataway, N.J.)、Molecular Probes Inc. (Eugene, Oreg.)和New England Biolabs Inc. (Beverly, Mass.)。分析序列的甲基化状态的另一种考虑的方法是通过在暴露于甲基化-敏感性限制性酶后分析DNA – 参见例如美国申请号20130084571和20120003634，其内容结合到本文中。
将理解，根据本文所述的方法分析甲基化状态允许准确测定DNA分子的细胞来源，甚至当样品的大部分DNA来源于不同的细胞来源时。本发明人已经证明，他们能够测定特定DNA的细胞来源，甚至当其对群体中DNA总量的贡献低于1:1000、低于1:5,000、1:10,000或甚至1:100,000时。
涉及细胞死亡的病理和疾病状况导致降解的DNA从濒死的细胞释放到体液(血液、血浆、尿、脑脊液)。因此，本文所述的方法可用于分析所述体液中特定细胞群体的细胞死亡的量。特定细胞群体的细胞死亡的量然后可用于诊断特定的病理状态(例如，疾病)或状况(例如，创伤)。
因此，根据本发明的另一方面，提供检测受试者的细胞类型或组织的死亡的方法，包括测定受试者的流体样品中包含的无细胞DNA是否来源于所述细胞类型或组织，其中所述测定通过确定无细胞DNA的连续序列上至少4个甲基化位点的甲基化状态来实现，所述序列包含不超过300个核苷酸，其中所述细胞类型或组织特有的DNA的连续序列上的至少4个甲基化位点的每一个的甲基化状态指示所述细胞类型或组织的死亡。
将理解，特定细胞类型的死亡可能与病理状态 - 例如，疾病或创伤有关。
特定细胞类型的死亡的监测还可用于监测预期导致特定细胞类型的细胞死亡的治疗方案的功效。
特定细胞类型的死亡的测定还可用于健康或生病受试者的各种机制的临床或科学研究。
因此，例如胰腺β细胞死亡的测量在糖尿病、高胰岛素血症和胰岛细胞肿瘤的情况下是重要的，和为了监测胰岛移植后β细胞存活，测定用于保护β细胞免于死亡的各种治疗方案的功效，和测定目的为在胰岛细胞肿瘤中引起胰岛细胞死亡的治疗的功效。类似地，所述方法允许鉴定和定量源自死亡肾细胞的DNA (肾衰竭的诊断)、死亡的神经元(有或没有治疗的创伤性脑损伤、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、中风、阿尔茨海默氏病、帕金森氏病或脑肿瘤的诊断)；死亡的胰腺腺泡细胞(胰腺癌或胰腺炎的诊断)；死亡的肺细胞(肺病理学包括肺癌的诊断)；死亡的脂肪细胞(脂肪更新改变的诊断)；死亡的肝细胞(指示肝衰竭、肝毒性或肝癌)；死亡的心肌细胞(指示心疾病、或在心脏移植的情况下的移植物障碍)；死亡的骨骼肌细胞(肌肉损伤和肌病的诊断)；死亡的少突胶质细胞(指示复发型多发性硬化、肌萎缩性侧索硬化中的白质损伤、或恶性胶质瘤)。
根据一个实施方案，分析的序列具有甲基化模式，其表示正常的目的细胞的特征，并且不是表示疾病细胞的特征的甲基化模式(例如不是表示特定类型的癌细胞的特征的甲基化模式)。可分析的示例性的序列包含在SEQ ID NOs: 1-44所示的序列中。这些序列进一步在上文中描述。
如本文使用的术语“诊断”是指测定疾病的存在，将疾病分类，测定疾病的严重性(级别或阶段)，监测疾病进展和对疗法的响应，预测疾病结果和/或恢复前景。
所述方法包括定量测定受试者的流体样品(例如血液样品)中包含的来源于细胞类型或组织的无细胞DNA的量。当源自细胞类型或组织的无细胞DNA的量高于预定水平，则其指示存在预定水平的细胞死亡。当细胞死亡的水平高于预定水平，则其指示受试者具有疾病或病理状态。测定预定水平可通过分析源自已知不具有所述疾病/病理状态的受试者的样品中存在的无细胞DNA的量进行。如果在试验样品中源自与疾病有关的细胞类型或组织的无细胞DNA的水平在统计学上显著高于获自健康(无疾病受试者)的样品中源自相同细胞类型或组织的无细胞DNA的水平，则其指示受试者具有所述疾病。或者，或另外地，测定预定水平可通过分析源自已知具有所述疾病的受试者的样品中存在的无细胞DNA的量进行。如果在试验样品中源自与所述疾病有关的细胞类型或组织的无细胞DNA的水平在统计学上显著类似于在获自患病受试者的样品中源自与所述疾病有关的细胞类型或组织的无细胞DNA的水平，则其指示受试者具有所述疾病。
疾病的严重性可通过定量测定具有与疾病有关的细胞群的特定甲基化模式的DNA分子的量来测定。定量测定具有靶组织的特定甲基化模式的DNA分子的量可使用校准曲线来实现，所述校准曲线通过使用来自靶组织的已知和各种数量的细胞产生。
根据一个实施方案，所述方法包括测定样品中源自目的细胞的无细胞DNA的量：无细胞DNA总量的比率。
根据又一个实施方案，所述方法包括测定样品中源自目的细胞的无细胞DNA的量:源自第二种目的细胞的无细胞DNA的量的比率。
本文所述的方法还可用于测定治疗剂或治疗的功效，其中当在给予治疗剂后与细胞群(其与疾病有关)有关的DNA的量降低时，其指示所述治疗剂或治疗是治疗性的。
试剂盒
本文所述的任何组分可包含在试剂盒中。在非限制性实例中，试剂盒包含能够扩增如上文所述的其甲基化状态指示疾病的DNA序列的至少一个引物对。根据一个实施方案，引物进一步包含条码序列和/或允许下游测序的序列，如上文进一步描述的。这样的引物序列包括例如SEQ ID NOs: 45-56所示的那些序列。根据一个实施方案，引物对中的各个引物包含在合适的容器中。根据另一个实施方案，试剂盒包含能够扩增如上文所述的其甲基化状态指示疾病的两个不同的DNA序列的两个引物对。根据另一个实施方案，试剂盒包含能够扩增如上文所述的其甲基化状态指示疾病的三个不同的DNA序列的三个引物对。根据另一个实施方案，试剂盒包含能够扩增如上文所述的其甲基化状态指示疾病的四个不同的DNA序列的四个引物对。根据另一个实施方案，试剂盒包含能够扩增如上文所述的其甲基化状态指示疾病的五个或更多个不同的DNA序列的五个或更多个引物对。
在另一个非限制性实例中，试剂盒包含能够检测核酸序列中至少4个甲基化位点的甲基化状态的寡核苷酸，所述核酸序列不超过300个碱基对和包含相对于与第一种目的细胞不同的第二种细胞，在第一种目的细胞中差异甲基化的至少4个甲基化位点。试剂盒可包含能够检测核酸序列中至少4个甲基化位点的甲基化状态的一种寡核苷酸。试剂盒可包含组合能够检测核酸序列中至少4个甲基化位点的甲基化状态的两种寡核苷酸。试剂盒可包含其组合能够检测核酸序列中至少4个甲基化位点的甲基化状态的三种寡核苷酸。试剂盒可包含其组合能够检测核酸序列中至少4个甲基化位点的甲基化状态的四种寡核苷酸。本发明的该方面的寡核苷酸可用可检测部分标记，如上文进一步描述的。
可包括在任何上述试剂盒中的另外组分包括至少一种以下组分：亚硫酸氢盐(和对于亚硫酸氢盐反应必需的其它试剂)、聚合酶、用于纯化DNA的试剂、MgCl2。试剂盒还可包含用于测序扩增的或非扩增的序列的反应组分。
试剂盒还可包含用作对照的DNA序列。因此，例如试剂盒可包含具有与扩增的源自健康受试者的序列相同的序列的DNA (用作阴性对照)和/或具有与扩增的源自已知具有所研究的疾病的受试者的序列相同的序列的DNA (用作阳性对照)。
此外，试剂盒可包含已知量的DNA使得可进行测试DNA的校准和定量。
试剂盒的容器通常包括至少一个管、试管、烧瓶、瓶、注射器或其它容器，组分可置于其中，和优选地在其中合适地等分。在试剂盒中存在超过一种组分的情况下，试剂盒还通常包含第二、第三或其它另外的容器，另外的组分可分开置于其中。然而，组分的各种组合可包含在容器中。
当试剂盒的组分在一种或多种液体溶液中提供时，液体溶液可以是水溶液。然而，试剂盒的组分可作为干粉提供。当试剂和/或组分作为干粉提供时，该粉末可通过加入合适的溶剂复溶。
试剂盒优选地包括用于使用试剂盒组分以及使用未包括在试剂盒中的任何其它试剂的说明书。说明书可包括可实现的变化。
预期在从本申请得到的专利的有效期期间，许多相关的测序技术将被开发(包括无需亚硫酸氢盐处理将能够测定甲基化状态的那些技术)，并且术语测序的范围意欲先验包括所有这样的新技术。
本文使用的术语“约”是指± 10 %。
术语"包含"、"包括"、“含有”、“具有”和它们的变化意指"包括但不限于"。
术语“由……组成”意指“包括和限于”。
术语"基本上由……组成"意指组合物、方法或结构可包括另外的成分、步骤和/或部件，但只有当另外的成分、步骤和/或部件实质上不改变所要求保护的组合物、方法或结构的基本和新特征时才如此。
本文使用的单数形式"一个"、"一种"和"所述"包括复数指代，除非上下文明确另外指示。例如，术语"一种化合物"或"至少一种化合物"可包括多种化合物，包括其混合物。
在本申请全文中，本发明的各种实施方案可以范围形式提供。应理解，范围形式的描述仅为了方便和简明，不应解释为对本发明的范围的固定限制。因此，范围的描述应认为已经明确公开了所有可能的子范围以及在该范围内的单个数值。例如，范围的描述例如1-6应认为已经明确公开了子范围例如1-3、1-4、1-5、2-4、2-6、3-6等，以及该范围内的单个值，例如1、2、3、4、5和6。不管范围的宽度如何这都适用。
本文使用的术语"方法"意指用于完成给定任务的方式、手段、技术和程序，包括但不限于化学、药理学、生物学、生物化学和医学领域的从业人员已知或从已知的方式、手段、技术和程序容易开发的那些方式、手段、技术和程序。
如本文使用的术语“治疗”包括废除、基本上抑制、减慢或逆转病况的进展，基本上改善病况的临床或美学症状或基本上防止病况的临床或美学症状的出现。
应理解，为清楚起见，在分开的实施方案的情况下描述的本发明的某些特征也可在单个实施方案中组合提供。相反地，为清楚起见，在单个实施方案的情况下描述的本发明的各种特征也可分开或以任何合适的亚组合或在本发明的任何其它所述的实施方案中合适地提供。在各个实施方案的情况下描述的某些特征不认为是那些实施方案的必需特征，除非实施方案在没有这些要素的情况下不起作用。
上文描述的和所附权利要求书部分要求保护的本发明的各个实施方案和方面在以下实施例中找到实验支持。
实施例
现在参考以下实施例，结合上文的描述，以非限制性方式说明本发明的一些实施方案。
通常，本文使用的命名法和用于本发明的实验室程序包括分子、生物化学、微生物学和重组DNA技术。这样的技术在文献中充分解释。参见例如，"Molecular Cloning: Alaboratory Manual" Sambrook 等, (1989); "Current Protocols in MolecularBiology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel 等, "CurrentProtocols in Molecular Biology", John Wiley和Sons, Baltimore, Maryland(1989); Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons,New York (1988); Watson 等, "Recombinant DNA", Scientific American Books, NewYork; Birren 等 (编辑) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols.1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998); 美国专利号4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659和5,272,057中所述的方法；"Cell Biology: ALaboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E.编辑(1994)；"Culture ofAnimal Cells - A Manual of Basic Technique" Freshney, Wiley-Liss, N. Y.(1994), 第三版；"Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E.编辑(1994); Stites 等(编辑), "Basic and Clinical Immunology" (第8版),Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994)；Mishell和Shiigi (编辑), "SelectedMethods in Cellular Immunology", W. H. Freeman和Co., New York (1980)；可用的免疫测定法广泛描述于专利和科学文献中，参见例如美国专利号3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 4,098,876; 4,879,219; 5,011,771和5,281,521；"Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J.编辑(1984)；“Nucleic Acid Hybridization"Hames, B. D.和Higgins S. J.编辑(1985)；"Transcription and Translation" Hames,B. D.和Higgins S. J.编辑(1984)；"Animal Cell Culture" Freshney, R. I.编辑(1986)；"Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986)；"A Practical Guideto Molecular Cloning" Perbal, B., (1984)和"Methods in Enzymology" Vol. 1-317,Academic Press; "PCR Protocols: A Guide To Methods and Applications",Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak 等, "Strategies for ProteinPurification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press(1996)；其全部通过引用结合到本文中，如同在本文中完全阐明。其它一般性参考资料在本文件的全文中提供。其中的程序认为是本领域众所周知的，和为读者方便起见而提供。其中包含的所有信息通过引用结合到本文中。
材料和方法
患者：所有临床研究由相关当地伦理委员会批准，和在血液采样之前从所有受试者或他们的合法监护人获得告知同意。
1. 最近诊断的T1D患者：血浆从1-4个月之前诊断有T1D的11名患者(年龄4-20，平均9.5岁)制备。
2. 胰岛移植物接受者：患者为44-57岁，其T1D持续时间为10-36年和血糖水平控制差(HbA1C 6.4-10)。抗排斥疗法包括阿伦单抗、依那西普和阿那白滞素。维持疗法包括他克莫司和MMF。
3. MS/NMO患者：MS和NMO患者分别根据2010 McDonald标准(1)和NMO诊断标准(2)诊断。患者特征如下：复发–缓解型MS患者，n=49，74%女性，平均年龄= 36±12.5，范围18-68岁，疾病持续时间4±4.5年，范围0-14年。失能状态扩展量表(Expanded DisabilityStatus Scale, EDSS) = 2.8 ± 1.8，范围1-7.5。在测试之前2个月，无一患者已接受类固醇治疗。在复发性患者中，在IV类固醇疗法之前抽取血液。在采样时，一名患者用Copaxone处理和4名患者用依木兰(Imuran)处理。
4. 心跳停止患者：在瑞典Uppsala大学医院的重症监护病房(ICU)中收集样品。心跳停止的无意识患者用自发循环恢复(ROSC)恢复意识。在苏醒后按所述(Mörtberg E等,Resuscitation 2011;82:26–31)立刻给予体温32–34ºC的低体温处理24 h，通气和药理学支持。如果患者为(i) 未醒，(ii) 不遵从任何命令和(iii) 对任何刺激无响应，则其定义为昏迷。所有患者在桡动脉或股动脉中接受动脉导管用于血液采样。在紧急期尽可能快地开始和在心跳停止后24、48、72、96和108小时继续，收集连续的血液样品。等份血清于-70 ºC冷冻直至分析。
5. 创伤性脑损伤：具有隔离的严重创伤性脑损伤(TBI)的5名患者(3名男性和2名女性，全部高加索人，平均年龄39)从瑞典哥德堡Sahlgrenska大学医院的神经重症监护病房(NICU)的临床研究中募集。所有患者具有局部挫伤和全身浮肿的混合。根据以下标准，所有具有严重TBI：1) 反应水平量表(RLS) 4，对应于格拉斯哥昏迷量表(Glasgow ComaScale)上的评分8 (3=无响应，15=清醒) (3)；2) 需要通气机处理；3) 监测颅内压(ICP)。创伤后连续数天获取静脉血液样品。在临床和放射学评价后，患者在入院后数小时内经过神经外科干预，以接受内室导管用于颅内压(ICP)监测/治疗性CSF引流。合适时，占位性病变例如出血和挫伤经手术除去。患者然后根据标准方案“Lund概念”处理，目的为保持脑灌注压高于60 mm Hg和颅内压低于20 mm Hg (4)。收集的数据包括人口统计学和临床变量，例如年龄、性别和损伤时间。在整个研究期间连续记录生理学和实验室变量，和同时调整以保持在以下限度内：血红蛋白>120 g/L，血清钠>135至<150 mmol/L，血清钾>4.0至<5.0mmol/L，血清白蛋白>35至<50 g/L，体核温度37 +- 0.5℃，平均动脉血压(MABP)在70和100mm Hg之间，ICP <20 mm Hg，脑灌注压CPP (MABP - ICP) >60 mm Hg，PO2 >12至<18 kPa，PCO2大约4.5 kPa和标准pH。根据NICU惯例，血糖保持在4和6 mmol/L之间。没有患者接受过类固醇。
6. 胰腺癌和慢性胰腺炎：血浆从42名患有经病理证实的胰腺癌患者(28名男性和14名女性，平均年龄68，范围41-87)和10名慢性胰腺炎患者制备。使用美国关节委员会关于胰腺癌的癌症TNM分类(2010)。在血浆收集时，29名患者患有局部疾病(4名在I期和25名在II期，全部在手术前)和13名患者患有转移性疾病，IV期。
7. 健康对照：总共40名健康个体(50%女性；年龄22-60)志愿参与研究，作为无偿健康对照。所有人都否认具有与所研究的疾病状态有关的症状的任何迹象。
DNA处理：无细胞DNA使用试剂盒(Qiaquick, Qiagen)自血浆或血清分离，和用亚硫酸氢盐(Zymo research)处理。使用对亚硫酸氢盐-处理的DNA特异性但不依赖于监测的CpG位点上的甲基化状态的引物，亚硫酸氢盐处理的DNA经PCR扩增。引物被条码化，当使用MiSeq (Illumina)测序产物时允许混合来自不同个体的样品。
胰腺腺泡和导管细胞的甲基化组(Methylome)：按之前所述，将导管和腺泡细胞自离解的人尸体胰腺分离。活细胞用细胞表面标记染色，和分类。基因组DNA使用苯酚/氯仿分离和按制造商说明书处理用于Illumina 450k阵列。
胰岛素
引物序列：SEQ ID NOs: 45和46
MBP3
引物序列: SEQ ID NOs: 55和56
CG10809560 (WM1)
引物序列: SEQ ID NOs: 51和52
CG09787504
引物序列: SEQ ID NOs: 53和54
胰腺 (CUX2)
引物序列: SEQ ID NOs: 47和48
胰腺 (REG1A)
引物序列: SEQ ID NOs: 49和50
统计学分析：为了评价各组之间差异的显著性，根据各患者中未甲基化组织特异性DNA的值，使用双尾MannWhitney检验。
实施例1
组织特异性甲基化标记的鉴定
本发明人鉴定了区分单个组织或细胞类型与其它组织的组织特异性DNA甲基化标记。特别注意的是在目的组织和造血细胞之间不同的标记，其被认为是cfDNA的主要贡献者和因此是系统噪音的主要潜在来源。他们分析了公众可得的甲基化组(主要是来自癌症基因组图谱[The Cancer Genome Atlas, TCGA]和基因表达合集[Gene ExpressionOmnibus, GEO]的Illumina 450k阵列数据)以鉴定具有区别的甲基化模式的单个CpG二核苷酸，在一种组织中明确地未甲基化和在其它组织中甲基化(见流程图，图5A-B)。
Illumina阵列提供关于单个CpG二核苷酸的甲基化状态的信息。各位点的辨别力是有限的，因为其可在来自其中其通常未甲基化或甲基化的组织的小部分分子中分别被随机甲基化或未甲基化。为增加测定的信号:噪音比，本发明人利用了DNA甲基化的区域性质。他们定义了邻近原始CpG标记位点的4-9个CpG位点的“扩展窗”，理由是相同分子中多个邻近胞嘧啶的偶然甲基化或去甲基化的可能性小。为了测定这些扩展窗的甲基化的状态，他们从不同的人组织获得DNA，和用亚硫酸氢盐处理以转化未甲基化胞嘧啶为尿嘧啶。包含标记CpG位点和多个邻近CpG的短片段然后经PCR扩增，和使用Illumina MiSeq测序来自PCR产物的多个分子。
作为Illumina甲基化组阵列之间的比较的备选方法，在一些情况下本发明人根据已知组织特异性基因的启动子选择和验证组织特异性标记(其可能不足以表现在Illumina阵列中) (图5A-B)。如下文实施例中所示，与单个CpG位点的信息内容相比，其中多个邻近CpG位点共有相同的组织特异性甲基化模式的DNA分子的评分在目的组织和其它组织之间提供显著更高的辨别力。因此，本发明人已经定义了包含4-9个CpG位点的DNA的短序列，其组合的甲基化状态构成了相对于血液细胞和其它组织，对目的组织独特的表观遗传标记。
实施例2
在T1D患者的循环中存在未甲基化胰岛素基因启动子
为了检测源自β-细胞的cfDNA，胰岛素基因启动子用作β-细胞特异性甲基化标记。试图在外周血液样品中鉴定源自β-细胞的DNA的之前的研究根据在胰岛素启动子中2-3个CpG二核苷酸的甲基化状态，利用甲基化特异性PCR (J等, Diabetes 62, 1676-1680(2013))。然而，胰岛素启动子在附近包含另外的CpG位点，其可用于改进在β-细胞和其它组织的DNA之间的区别(图1A)。为了测试这一构思，胰岛素基因启动子的160bp片段从获自多种组织的亚硫酸氢盐处理的DNA扩增，并对产物测序以测定在各组织中各CpG的甲基化状态。如图1B所示，在90-95%的来自人β-细胞的DNA分子中，和在5-15%的来自其他组织的DNA分子中各CpG未甲基化。然而当将该信息组合并计算其中所有6个CpG位点未甲基化的DNA分子的分数时，β细胞和所有其它组织之间的差异变得显著更大：尽管约80%的来自β-细胞的DNA分子完全未甲基化，但<0.01%的来自任何其它组织的分子完全未甲基化。因此胰岛素基因启动子(包含在SEQ ID NO: 1中)中6个邻近未甲基化CpG位点的长度稳健地区分β-细胞与其它组织，且信噪比接近10,000:1。
该信息然后用于在T1D患者的循环中寻找β-细胞来源的cfDNA。来自患者的血浆DNA用亚硫酸氢盐处理，经PCR扩增和测序以测定包含完全未甲基化胰岛素启动子DNA的分子的分数。将获得的分数乘以各样品中测量的cfDNA的浓度，以得到在各患者的血液中循环的β-细胞来源的DNA的值(ng/ml) (图5A-B)。健康志愿者(n=25)的cfDNA具有极低频率的完全未甲基化胰岛素基因启动子分子(至多0.12%的循环胰岛素启动子片段)。当乘以各个体的cfDNA总量时，发现<0.06 ng/ml的循环DNA源自β-细胞(等同于10个基因组)，与健康成人中极低的β-细胞更新率一致(图1C)。诊断后2-16周采样的来自T1D患者(n=11)的血浆显示在cfDNA中未甲基化胰岛素启动子DNA的清楚信号(每1 ml的血浆，1.06-8.6 ng β-细胞DNA)，指示β-细胞的正进行的自身免疫破坏(图1C)。
还研究了获自用尸体同种异体胰岛移植和用免疫抑制剂治疗的长期T1D患者的血浆样品。如图1D所示，所有患者的血浆在移植后1-2小时具有高的信号(未甲基化胰岛素DNA)，其在之后的数小时和数天内显著下降。可能由急性局部缺血引起的在移植后移植的β-细胞立即广泛丢失，与之前的移植患者成像研究一致。在大多数患者中，在移植后7天和甚至1个月时检出明显高于背景的信号，表明尽管免疫抑制但β-细胞仍持续低水平丢失。
为了证实胰岛素基因启动子的多个CpG位点的组合甲基化模式是检测在循环中β-细胞来源的DNA所必需的，检查了在健康个体和最近诊断的T1D患者的血浆中各单个的CpG的甲基化状态。各单个CpG在健康对照和T1D患者的血浆中不具有不同的模式(在224 ~15%的cfDNA分子中未甲基化)。然而共同地，6个CpG位点在T1D患者的血浆中产生在健康对照中不存在的清楚信号(图6A-B)。
这些结果支持了该基于下一代测序(NGS)的方法用于检测源自特定组织的cfDNA的非常高的灵敏度和特异性。关于T1D，在健康对照和最近诊断的患者的信号之间完全分开有利地与之前报告相比较，之前报告证实了在健康对照和糖尿病患者之间显著的信号重叠。这表明有可能在临床诊断之前以及在另外的目的场景(例如监测用于防止移植的β-细胞的破坏的免疫抑制的功效)下，使用该测定法以鉴定β细胞死亡。
实施例3
在多发性硬化中少突胶质细胞来源的cfDNA的鉴定
脑细胞死亡的非侵入检测特别具有挑战。在理论上，脑特异性甲基化模式可用于鉴定脑来源的cfDNA。本发明人寻找在多发性硬化(MS)和视神经脊髓炎(NMO)的患者的血液中循环的少突胶质细胞/神经胶质DNA的证据，所述疾病为其中在白质中产生髓磷脂的少突胶质细胞和星形细胞受到破坏的自身免疫疾病。分析了正常人白质的公开的甲基化组，和在髓磷脂碱蛋白(此处称为MBP3)的3’ UTR中和未定义的基因座附近(Illumina阵列中的CG10809560，其称为白质1 (WM1))鉴定了邻近的CpG位点的簇，这些位置在少突胶质细胞中选择性地未甲基化(图2A)。如同胰岛素基因启动子，这些簇中的单个CpG显示中等的信噪比：它们在60-85%的源自富含少突胶质细胞的来源(神经胶质制备物、白质和整脑)的DNA分子中，和在2-35%的来自其它组织的DNA中未甲基化(图7A-E和8A-E)。组合MBP3和WM1基因座中所有CpG极大地增加了富含少突胶质细胞的DNA和来自其它来源(包括血液)的DNA之间的区别(图7A-E和8A-E)。因此，在所有邻近CpG位点上未甲基化的来自MBP3 (包含在SEQ IDNO: 8中)或WM1 (包含在SEQ ID NO: 7中)基因座的DNA可用作少突胶质细胞的专用标记。
健康个体(n=19)在他们的血浆中具有可忽略水平的未甲基化MBP3或WM1，表明少突胶质细胞的最低基础更新(图2B)。大多数稳定的MS患者(n=30)没有或具有极低的信号。然而在疾病恶化期间大多数患者(接近采样时，临床上和使用脑MRI均记录复发，n=19)在他们的血浆中显示MBP3、WM1或两者的未甲基化DNA(图2B)。这一观察结果与短暂的循环未甲基化MBP3或WM1DNA反映急性少突胶质细胞细胞死亡的观念一致。初期的分析未揭示与一些复发型患者中的信号缺乏的临床关系。在血液中的信号和年龄、性别、EDSS (失能状态扩展量表)或疾病持续时间之间未观察到相关性。这些结果表明，少突胶质细胞的急性自身免疫破坏可表现为来自MBP3或WM1基因座的完全未甲基化DNA片段的循环水平增加，开辟了开发用于诊断和监测脱髓鞘疾病的敏感性测试的途径。可开发少突胶质细胞的另外的甲基化标记以进一步增加测定的特异性和敏感性。
实施例4
在急性脑损伤后脑来源的cfDNA的鉴定
为了获得更一般性的脑损伤标记，对于其甲基化状态区分脑DNA与其它组织的基因座，扫描Illumina阵列。基因座CG09787504 (此处称为Brain1；包含在SEQ ID NO: 11中)附近的9个CpG位点的簇在70%的来自脑组织的各种来源(富含神经元或神经胶质)的DNA中，和在<5%的来自其它组织的DNA分子中(可能反映了在这些组织中存在的周围神经元的DNA)完全未甲基化。重要的是，血液中<0.03%的分子未甲基化，提供了该基因座的甲基化在脑和血液之间>2000倍的差异(图3A和图9A-E)。
健康个体在血浆中具有极低水平的完全未甲基化Brain1 (图3B)。这一低的基线可反映低于测定法灵敏度极限的神经元更新或一种用于从濒死的脑细胞中清除DNA的备选机制。检查两种脑损伤情况下的患者中的血浆样品，两种条件均已知涉及神经元损伤以及血-脑屏障的破坏。令人惊讶的是，在心跳停止以及证明的缺血性脑损伤后多个时间点采样的患者(n=10)显示在血浆中高水平的未甲基化Brain1 (图3C)。类似地，因严重创伤性脑损伤(TBI)后神经外伤而入住重症监护病房的患者(n=5)在血浆中具有升高的未甲基化Brain1 (图3D)。两组结果均与在这些患者中源自死亡脑细胞(神经元和/或神经胶质)的循环DNA片段一致。脑来源的cfDNA的量和时间模式在患者之间不同。在心跳停止组中，在大部分患者中在苏醒后不久的第一时间点观察到最强的信号，在后续几天内降低。在TBI患者组中，观察到脑来源的cfDNA的更加延迟的模式。这些发现结果表明，根据独特的甲基化标记，可在神经炎性、创伤性和缺血性脑病理的患者的循环中鉴定出脑特异性DNA以及少突胶质细胞特异性DNA。
实施例5
在胰腺癌和胰腺炎中外分泌胰腺来源的cfDNA的鉴定
本发明人测试了该方法是否可在癌症的情况下用于检测cfDNA。尽管与正常组织相比，肿瘤在甲基化组上呈现出广泛变化，但大部分组织特异性甲基化位点被认为在肿瘤中保持完整。因此，肿瘤中的细胞死亡应产生带有肿瘤的来源组织的正常甲基化模式的cfDNA。胰腺导管腺癌被认为起源于外分泌胰腺的腺泡或导管细胞。使用抗体自人尸体材料FACS-纯化导管和腺泡细胞，和他们的甲基化组使用Illumina 450k阵列获得(结果未公开)。这些数据的分析揭示，多个CpG在外分泌胰腺中未甲基化和在大部分其它组织中甲基化。两个位点经选择用于进一步分析，和鉴定了可用作外分泌胰腺的标记的邻近CpG的簇，其可区分腺泡和导管细胞与其它细胞类型(图4A、图10A-E和11A-E)。健康受试者(n=25)在他们的cfDNA中具有极低水平的未甲基化外分泌胰腺标记，与该组织的低更新一致(图4B)。几乎一半的胰腺癌患者(20/42)显示外分泌胰腺来源的cfDNA高于背景水平(图4C)。在晚期疾病患者中存在更强信号的趋势，和这些患者更可能显示高于背景的信号。但是，1期和2期(局部疾病)的一些患者具有清楚的信号(11/29)，表明该方法可在原则上鉴定可切除期的胰腺癌的细胞死亡。
为了进一步测试细胞死亡的所有病因导致组织特异性cfDNA增加的假设，检查了慢性胰腺炎患者的血浆。的确，7/10的具有该非恶性疾病的患者具有升高的胰腺来源的cfDNA水平(图4C)。注意到胰腺炎患者具有在腺泡和导管细胞两者中均未甲基化的更清楚的标记信号(REG1A)，而胰腺癌患者具有在导管细胞中优先未甲基化的更强的标记信号(CUX2)，可能反映了在各病理中濒死细胞的表观遗传身份。简言之，带有外分泌胰腺的甲基化模式的cfDNA存在于胰腺癌和胰腺炎的患者的血液中，反映了在这些病况中外分泌细胞的死亡。
实施例6
在ALS患者的血浆中脑来源的DNA的鉴定
在神经变性疾病肌萎缩性侧索硬化(ALS)中，运动神经元死亡，接着肌肉细胞死亡。本发明人测试了在ALS患者的循环中是否能鉴定出脑来源的DNA片段。如图12中所示，与健康个体(n=12)的接近零信号相比，40%的ALS患者(n=29)显示在他们的血浆中可测量的水平的脑来源的DNA (根据未甲基化CG0978 [Brain1]的分数乘以在他们的血浆中的无细胞DNA的总量)。此外，本发明人在ALS患者的血浆中寻找神经胶质DNA的存在。图13表明与健康个体的无信号相比，测试的ALS患者(n=10)的70%在他们的血浆中具有至少两种神经胶质标记(WM1和MBP3)。这些发现结果与关于ALS患者中对白质的损伤的临床报告一致。在初步分析中本发明人还在ALS患者的血液中鉴定了肌肉DNA (数据未显示)。因此，为诊断、监测疾病进展和评价药物活性的目的，该测定法可用于在ALS患者中检测和监测神经元、神经胶质和肌肉细胞死亡。
实施例7
在恶性胶质瘤患者血浆的神经胶质DNA的鉴定
恶性胶质瘤起源于神经胶质细胞。对于神经胶质DNA (WM1或MBP3的未甲基化片段)的存在，本发明人检查了恶性胶质瘤患者的血浆。发现测试的恶性胶质瘤患者(n=10)的30%具有高于健康个体的最低水平的清楚信号。因此，该方法可用于鉴定和监测恶性胶质瘤的细胞死亡。
实施例8
在结肠癌或克罗恩病患者的血浆中结肠上皮DNA的鉴定
本发明人鉴定了结肠DNA的数种标记，全部在结肠中具有未甲基化的CpG簇，其在其它组织中未甲基化。未甲基化分子的组织分布显示于图14A-D。
本发明人然后确定了这些标记是否存在于结肠的疾病的患者的血浆中。如图15中所示，健康个体(n=8)具有极低水平的来自四种标记的任一种的未甲基化DNA。这与在结肠的正常更新期间死亡的细胞脱落至内腔和它们的DNA不到达循环的观念一致。相比之下，大部分结肠癌患者在他们的血浆中具有高水平的1-4个结肠标记。这一发现结果与结肠癌细胞的广泛死亡和它们的DNA释放至循环一致，如之前使用在血液中肿瘤特异性突变的鉴定所示的。测试的单个克罗恩病患者也是结肠标记阳性的，表明广泛的病理结肠细胞死亡和DNA释放至血液。
因此，该方法可在结肠癌或克罗恩病患者的血液中鉴定结肠DNA。注意尽管使用血液检测结肠癌的现有方法依赖于患者特异性的体细胞突变，但本发明的方法是通用的，因为其依赖于在个体中保守和甚至在癌症中明显保持稳定的结肠标记。
实施例9
在肺癌患者的血浆中肺DNA的鉴定
本发明人鉴定和验证了肺细胞的几种标记，其在肺上皮组织的DNA中未甲基化和在其它组织中甲基化，和在健康个体的血浆中和在肺癌患者的血浆中测试了它们的水平。
图16显示未甲基化SFTP/A1 (一个在肺细胞中特异性表达和在肺中还特异性未甲基化的基因)的组织分布。发现未甲基化SFTP/A1不存在于大部分健康个体的血浆中，但存在于大部分肺癌患者的血浆中。
图17显示未甲基化SFTP/C (另一个在肺细胞中特异性表达和在肺中还特异性未甲基化的基因)的组织分布。发现未甲基化SFTP/C不存在于大部分健康个体的血浆中，但存在于许多肺癌患者的血浆中。
图18显示未甲基化CHST (一个在肺中特异性未甲基化的基因)的组织分布。发现未甲基化CHST不存在于大部分健康个体的血浆中，但存在于许多肺癌患者的血浆中。
图19显示未甲基化RAB4 (一个在肺中特异性未甲基化的基因)的组织分布。发现未甲基化RAB4不存在于健康个体的血浆中，但存在于一些肺癌患者的血浆中。
发现肺癌患者的血浆倾向于包含超过一种肺标记。这一特征区分肺癌患者和健康个体的血浆。
实施例10
在运动后和肌肉萎缩的血浆中骨骼肌DNA的鉴定
本发明人鉴定和验证了骨骼肌的三种甲基化标记，其在骨骼肌中未甲基化和在其它组织(包括心)中甲基化。图20A-C显示这些标记(TNN、TPO和MAD1)的组织分布。
图21显示在健康对照的血浆中这些标记中的两种(未甲基化TPO和TNN)的水平非常低，反映了肌肉在基线的极低更新(其中一个健康对照因为不清楚的原因而显示信号)。三个健康个体在强烈身体运动后不久都显示两种标记的清楚信号，表明这些标记可捕获运动诱导的肌肉细胞死亡。在Duchenne或Becker肌肉萎缩(BMD或DMD)的15名患者中，5名显示清楚的信号，反映了肌肉细胞死亡。因此，该测定法可用于检测和监测运动后和病理变性病况中的骨骼肌细胞死亡。
实施例11
在循环中血管内皮来源的DNA的鉴定
为了鉴定内皮细胞的甲基化标记，本发明人测定了自脐带分选的人内皮细胞的甲基化组。图22显示内皮细胞的一种标记，其在内皮细胞(来自脐带)中未甲基化，但在测试的所有特定细胞类型(淋巴细胞和胰腺腺泡细胞、α细胞和导管细胞)中完全甲基化。来自组织活检的DNA显示该标记的甲基化的约10%缺乏，反映了在所有组织中存在内皮细胞。大部分健康个体在他们的血清中没有信号，表明内皮细胞的低基线更新。在月经周期期间女性的血液显示由于广泛的血管破坏而预期的高信号。妊娠女性具有信号，其强于患有先兆子痫的女性。测试的所有癌症患者显示清楚的信号。
这些发现结果表明，该方法允许在各种情况下鉴定内皮细胞死亡，例如以评价在癌症或其它病理中和在病理例如先兆子痫中抗血管发生药物的活性。
实施例12
在循环中肝来源的DNA的鉴定
本发明人鉴定和验证了肝细胞标记。图23显示白蛋白(ALB)的启动子在肝细胞中未甲基化(和在肾和胰腺中至一定程度)，但在别处甲基化。健康个体的血液不包含信号或包含相对高水平的未甲基化白蛋白启动子DNA，表明波动的基线更新或肝细胞清除。测试的所有肝炎患者(n=7)是阳性的，表明该方法可检测病理性肝细胞死亡。
实施例13
源自非-淋巴细胞的无细胞循环DNA的鉴定
图24A-B显示作为在淋巴细胞中未甲基化和在他处甲基化而鉴定的标记。在大部分健康个体的血液中，大部分分子未甲基化，反映了大部分无细胞循环DNA在基线条件下来源于濒死血液细胞的事实。然而在强烈运动后不久的健康个体或癌症患者的血清中，存在高水平的甲基化的这些标记，指示无细胞循环DNA源自非-淋巴细胞(明显地，运动后的肌肉DNA和癌症患者的肿瘤DNA)。这些标记可用于广泛地评价在个体中与正常的偏移：证明了在组织而非血液中的细胞死亡。
实施例14
在循环中肾来源的DNA的鉴定
图25表明AQP (来自一种水通道蛋白基因的序列)在肾细胞中未甲基化和在血液中甲基化。健康个体在血液中不具有未甲基化AQP (可能反映了在正常肾中濒死细胞脱落至尿而非血液)。患有先兆子痫的妊娠女性(已知具有肾损伤)显示强的信号。这些发现结果指示该方法可用于检测在各种病理条件下的肾细胞死亡(例如，在一些脓毒症患者中的急性肾小管坏死)。
实施例15
在循环中脂肪细胞DNA的鉴定
已经表明脂肪细胞的总数在成年生命期间保持稳定，以及证明了新脂肪细胞的大量形成。因此，预测脂肪细胞死亡的速率一定等于脂肪细胞形成的速率。
图26A-D显示在脂肪细胞中未甲基化和在他处(此处仅显示血液)甲基化的四个不同的基因座。
图27A-D显示大部分健康个体的血浆包含脂肪细胞DNA的多个甲基化标记，指示正进行的脂肪细胞更新，与这些细胞的连续形成和破坏一致。因此该方法可用于监测脂肪细胞死亡，例如以研究生理和病理病况以及影响该过程的药物。
尽管本发明已经结合其特定的实施方案进行了描述，但明显的是，许多改变、修改和变化对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，意欲包括所有这样的改变、修改和变化，其落入随附权利要求的精神和宽泛范围内。
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请通过引用以其整体结合到本说明书中，至如同各单独的出版物、专利或专利申请明确和单独地表明通过引用结合到本文中的相同程度。此外，在本申请中任何参考文献的引用或鉴定不应解释为承认这样的参考文献可用作本发明的现有技术。在使用章节标题的情况下，它们不应解释为必定是限制性的。
Figure IDA0001179115920000011
Figure IDA0001179115920000021
Figure IDA0001179115920000031
Figure IDA0001179115920000041
Figure IDA0001179115920000051
Figure IDA0001179115920000061
Figure IDA0001179115920000071
Figure IDA0001179115920000081
Figure IDA0001179115920000091
Figure IDA0001179115920000101
Figure IDA0001179115920000111
Figure IDA0001179115920000121
Figure IDA0001179115920000131
Figure IDA0001179115920000141
Figure IDA0001179115920000151
Figure IDA0001179115920000161
Figure IDA0001179115920000171

Claims (40)

1.检测受试者的细胞类型或组织的死亡的方法，包括测定受试者的血液样品中包含的无细胞DNA是否来源于所述细胞类型或组织，其中所述测定通过确定相同的无细胞DNA分子上的连续序列上至少4个邻近甲基化位点的甲基化状态来实现，所述序列包含不超过300个核苷酸，其中所述细胞类型或组织特有的所述相同DNA分子的所述连续序列上的所述至少4个邻近甲基化位点的每一个的甲基化状态指示细胞类型或组织的死亡。
2.测定样品中的DNA是否来源于目的细胞类型或组织的方法，所述样品包含来自至少两种细胞类型或组织来源的DNA，所述方法包括：
确定相同DNA分子上的连续序列上至少4个邻近甲基化位点的甲基化状态，所述序列包含不超过300个核苷酸，其中相同DNA分子的所述连续序列上所述至少4个邻近甲基化位点的每一个的甲基化状态指示所述DNA来源于所述目的细胞类型或组织。
3.权利要求1或2的方法，其中所述甲基化状态是非病变目的细胞类型或组织特有的。
4.权利要求1或2的方法，其中所述序列包含50-250个核苷酸。
5.权利要求1或2的方法，其中所述细胞类型或组织是人细胞类型或组织。
6.权利要求3的方法，其中所述DNA是无细胞DNA。
7.权利要求3的方法，其中所述DNA是细胞DNA。
8.权利要求7的方法，其中所述方法还包括在所述测定之前裂解所述细胞DNA的细胞。
9.权利要求1-2和6-8中任一项的方法，其中所述至少4个邻近甲基化位点包含至少5个邻近甲基化位点。
10.权利要求1-2和6-8中任一项的方法，其中所述至少4个邻近甲基化位点中的每一个的甲基化状态是相同的甲基化标记，并且其中所述至少4个邻近甲基化位点在所述至少4个邻近甲基化位点的所有位点被甲基化或在所述至少4个邻近甲基化位点的所有位点未甲基化。
11.权利要求2的方法，其中所述样品包含体液。
12.权利要求1或11的方法，其中所述体液选择血液、血浆、精液、乳、尿、唾液和脑脊液。
13.权利要求1-2、6-8和11中任一项的方法，其中所述确定或鉴定使用至少一种甲基化-依赖性寡核苷酸实现。
14.权利要求13的方法，其中所述甲基化-依赖性寡核苷酸与所述4个邻近甲基化位点的至少1个杂交，所述位点是甲基化的。
15.权利要求13的方法，其中所述甲基化-依赖性寡核苷酸与所述4个邻近甲基化位点的至少1个杂交，所述位点是未甲基化的。
16.权利要求1-2、6-8和11中任一项的方法，其中所述确定或鉴定使用甲基化-非依赖性寡核苷酸实现。
17.权利要求1-2、6-8和11中任一项的方法，其中所述确定或鉴定使用至少两种甲基化-非依赖性寡核苷酸实现。
18.权利要求1-2、6-8和11中任一项的方法，其中所述确定或鉴定通过以下实现：
(a) 使样品中的DNA与亚硫酸氢盐接触，以将DNA的去甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶；
(b) 使用与在DNA的所述连续序列上邻近所述至少4个邻近甲基化位点的第一个和最后一个的核酸序列杂交的寡核苷酸，经克隆扩增DNA的所述连续序列；和
(c) 对DNA的所述经克隆扩增的连续序列测序。
19.权利要求18的方法，其中所述测序是深度测序。
20.权利要求1或6的方法，其中所述样品包含来源于与所述细胞类型或组织不同的第二种细胞的无细胞DNA。
21.权利要求20的方法，进一步包括分析源自所述细胞类型或组织的无细胞DNA的量：源自所述第二种细胞的无细胞DNA的量，或者分析源自所述细胞类型或组织的无细胞DNA的量：样品中的无细胞DNA的总量。
22.权利要求20的方法，进一步包括分析源自所述细胞类型或组织的无细胞DNA的量：样品中的无细胞DNA的总量。
23.权利要求1或2的方法，其中所述细胞类型选自胰腺β细胞、胰腺外分泌细胞、肝细胞、脑细胞、肺细胞、子宫细胞、肾细胞、乳腺细胞、脂肪细胞、结肠细胞、直肠细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、前列腺细胞和甲状腺细胞。
24.权利要求1或2的方法，其中所述组织选自胰腺组织、肝组织、肺组织、脑组织、子宫组织、肾组织、乳腺组织、脂肪、结肠组织、直肠组织、心脏组织、骨骼肌组织、前列腺组织和甲状腺组织。
25.权利要求2的方法，其中所述样品是血液样品。
26.权利要求1或6的方法，进一步包括定量测定来源于所述细胞类型或组织的无细胞DNA的量。
27.用于鉴定样品中的DNA的来源的试剂盒，所述样品包含来自至少两种细胞类型或组织来源的DNA，所述试剂盒包含能够检测相同DNA分子的连续核酸序列中至少4个邻近甲基化位点的甲基化状态的至少两种寡核苷酸，所述核酸序列不超过300个碱基对和包含相对于与第一种目的细胞不同的第二种细胞在所述第一种目的细胞中差异甲基化的至少4个邻近甲基化位点。
28.权利要求27的试剂盒，其中所述序列包含50-250个核苷酸。
29.权利要求27或28的试剂盒，其中所述DNA是无细胞DNA，任选其中所述样品是血液样品。
30.权利要求27或28的试剂盒，其中所述DNA序列包含在SEQ ID NOs: 1-44中任一个所示的序列中。
31.权利要求27或28的试剂盒，其还包含用于对所述DNA序列测序的至少一种试剂。
32.权利要求27或28的试剂盒，其还包含具有所述核酸序列的DNA，其中所述DNA来源于已知的目的细胞。
33.权利要求27或28的试剂盒，其用于诊断病理过程。
34.权利要求27或28的试剂盒，其用于监测病理过程的治疗。
35.权利要求27或28的试剂盒，其用于监测细胞类型或组织的死亡。
36.权利要求27或28的试剂盒，其还包含亚硫酸氢盐。
37.权利要求27的试剂盒，其中所述至少两种寡核苷酸的至少一种用可鉴别部分标记。
38.权利要求27的试剂盒，其中所述至少两种寡核苷酸的至少一种编码条码序列。
39.权利要求27的试剂盒，其中所述至少两种寡核苷酸编码允许附着至流动池表面的序列。
40.权利要求1-2、6-8和11中任一项的方法，其中所述确定或鉴定使用多路反应实现。
CN201580031764.XA 2014-04-14 2015-04-14 用于测定dna的组织或细胞来源的方法和试剂盒 Active CN106574296B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201461979233P 2014-04-14 2014-04-14
US61/979233 2014-04-14
PCT/IL2015/050404 WO2015159293A2 (en) 2014-04-14 2015-04-14 A method and kit for determining the tissue or cell origin of dna

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN106574296A CN106574296A (zh) 2017-04-19
CN106574296B true CN106574296B (zh) 2021-03-02

Family

ID=53051869

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201580031764.XA Active CN106574296B (zh) 2014-04-14 2015-04-14 用于测定dna的组织或细胞来源的方法和试剂盒

Country Status (13)

Country Link
US (3) US11203784B2 (zh)
EP (4) EP3132055A2 (zh)
JP (1) JP6750879B2 (zh)
CN (1) CN106574296B (zh)
DK (2) DK3643795T3 (zh)
FI (1) FI4026917T3 (zh)
HR (1) HRP20240189T1 (zh)
IL (1) IL248299B (zh)
LT (1) LT4026917T (zh)
PL (1) PL4026917T3 (zh)
PT (1) PT4026917T (zh)
SI (1) SI4026917T1 (zh)
WO (2) WO2015159293A2 (zh)

Families Citing this family (46)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11913065B2 (en) 2012-09-04 2024-02-27 Guardent Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US10876152B2 (en) 2012-09-04 2020-12-29 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
CA2883901C (en) 2012-09-04 2023-04-11 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US20160040229A1 (en) 2013-08-16 2016-02-11 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
EP3524694B1 (en) 2013-12-28 2020-07-15 Guardant Health, Inc. Methods and systems for detecting genetic variants
WO2015159293A2 (en) 2014-04-14 2015-10-22 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. A method and kit for determining the tissue or cell origin of dna
ES2741400T3 (es) 2014-07-18 2020-02-10 Univ Hong Kong Chinese Análisis de patrones de metilación de tejidos en mezcla de ADN
CN115287348A (zh) 2015-07-20 2022-11-04 香港中文大学 Dna混合物中组织的单倍型的甲基化模式分析
WO2017106768A1 (en) 2015-12-17 2017-06-22 Guardant Health, Inc. Methods to determine tumor gene copy number by analysis of cell-free dna
US11384382B2 (en) 2016-04-14 2022-07-12 Guardant Health, Inc. Methods of attaching adapters to sample nucleic acids
EP3443066A4 (en) 2016-04-14 2019-12-11 Guardant Health, Inc. EARLY DETECTION METHODS FOR CANCER
EP3452620A4 (en) * 2016-05-04 2020-01-01 Queen's University At Kingston CELL-FREE DETECTION OF METHYLATED TUMOR DNA
EP3885447B1 (en) 2016-05-30 2024-01-10 The Chinese University Of Hong Kong Detecting hematological disorders using cell-free dna in blood
JP2019521673A (ja) * 2016-06-07 2019-08-08 ザ リージェンツ オブ ザ ユニヴァーシティー オブ カリフォルニア 疾患および状態の分析のためのセルフリーｄｎａメチル化パターン
CA3033650A1 (en) * 2016-08-17 2018-02-22 The Regents Of The University Of California A novel immunoprobe-based method to assess organ injury status through a biofluid-based cell-free dna (cfdna) assay
US11959125B2 (en) * 2016-09-15 2024-04-16 Sun Genomics, Inc. Universal method for extracting nucleic acid molecules from a diverse population of one or more types of microbes in a sample
TWI797095B (zh) 2016-10-24 2023-04-01 美商格瑞爾有限責任公司 腫瘤檢測之方法及系統
AU2017369018B2 (en) 2016-11-30 2021-02-25 The Chinese University Of Hong Kong Analysis of cell-free DNA in urine and other samples
JP7300989B2 (ja) 2016-12-22 2023-06-30 ガーダント ヘルス， インコーポレイテッド 核酸分子を解析するための方法およびシステム
US10633713B2 (en) 2017-01-25 2020-04-28 The Chinese University Of Hong Kong Diagnostic applications using nucleic acid fragments
US11781188B2 (en) 2017-04-06 2023-10-10 Cornell University Methods of detecting cell-free DNA in biological samples
CN111032868A (zh) * 2017-06-30 2020-04-17 加利福尼亚大学董事会 用于评估无细胞dna中的dna甲基化的方法和系统
WO2019012542A1 (en) 2017-07-13 2019-01-17 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. DETECTION OF SPECIFIC DNA FROM A FABRIC
WO2019012544A1 (en) 2017-07-13 2019-01-17 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. STRATEGY FOR DOUBLE PROBE DROPLETS FOR SPECIFIC DETECTION OF CIRCULATING DNA MOLECULES SPECIFIC TO A TISSUE
EP3652344A1 (en) 2017-07-13 2020-05-20 Yissum Research and Development Company of the Hebrew University of Jerusalem Ltd. Dna targets as tissue-specific methylation markers
DE102017126248B4 (de) * 2017-11-09 2019-10-17 Epiontis Gmbh ERGIC1 als epigenetischer Marker zur Identifizierung von Immunzellen, insbesonderemonozytischem myeloid-abgeleiteten Suppressor-Zellen (mMDSCs)
WO2019159184A1 (en) * 2018-02-18 2019-08-22 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Cell free dna deconvolution and use thereof
EP3766076A4 (en) * 2018-03-15 2021-12-29 Grail, Inc. Tissue-specific methylation marker
JP2021112127A (ja) * 2018-04-26 2021-08-05 暁生 黒田 膵β細胞の傷害検査方法
TW202410055A (zh) 2018-06-01 2024-03-01 美商格瑞爾有限責任公司 用於資料分類之卷積神經網路系統及方法
EP3856903A4 (en) 2018-09-27 2022-07-27 Grail, LLC METHYLATION MARKER AND TARGETED METHYLATION PROBE PANEL
US11581062B2 (en) 2018-12-10 2023-02-14 Grail, Llc Systems and methods for classifying patients with respect to multiple cancer classes
CA3121926A1 (en) * 2018-12-18 2020-06-25 Grail, Inc. Systems and methods for estimating cell source fractions using methylation information
WO2020155149A1 (en) * 2019-02-02 2020-08-06 Lenovo (Beijing) Limited Enhanced scheduling of time sensitive networking
IL265451B (en) 2019-03-18 2020-01-30 Frumkin Dan Methods and systems for the detection of methylation changes in DNA samples
US11773450B2 (en) 2019-04-03 2023-10-03 Grail, Llc Methylation-based false positive duplicate marking reduction
EP3947728A1 (en) * 2019-04-03 2022-02-09 Yissum Research Development Company of the Hebrew University of Jerusalem Ltd. Primers for multiplex pcr
US11396679B2 (en) 2019-05-31 2022-07-26 Universal Diagnostics, S.L. Detection of colorectal cancer
US11001898B2 (en) 2019-05-31 2021-05-11 Universal Diagnostics, S.L. Detection of colorectal cancer
CA3151538A1 (en) 2019-09-30 2021-04-08 Stefanie Ann Ward Mortimer Compositions and methods for analyzing cell-free dna in methylation partitioning assays
US11898199B2 (en) 2019-11-11 2024-02-13 Universal Diagnostics, S.A. Detection of colorectal cancer and/or advanced adenomas
EP4150121A1 (en) 2020-06-30 2023-03-22 Universal Diagnostics, S.A. Systems and methods for detection of multiple cancer types
CN118215845A (zh) 2021-09-13 2024-06-18 普罗科技有限公司 增强的对生物分子的检测和定量
US20230212674A1 (en) * 2021-12-30 2023-07-06 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. Compositions and methods for identifying cell types
WO2023178109A2 (en) * 2022-03-15 2023-09-21 Resonant Llc Neuronal methylation signatures from cell free dna as a pre-symptomatic neurodegenerative condition surveillance diagnostic
WO2024038457A1 (en) 2022-08-18 2024-02-22 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. A method for determining the tissue or cell of origin of dna

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999018124A1 (en) * 1997-10-07 1999-04-15 Merck & Co., Inc. Assays for nuclear receptor ligands using fret
EP1342794A1 (en) * 2002-03-05 2003-09-10 Epigenomics AG Method and device for determination of tissue specificity of free floating DNA in bodily fluids
WO2005118852A2 (en) * 2004-06-04 2005-12-15 The Chinese University Of Hong Kong A marker for prenatal diagnosis and monitoring
WO2012047091A1 (en) * 2010-10-08 2012-04-12 Universiti Putra Malaysia Glp-1 promoter mediated insulin expression for the treatment of diabetes
WO2012178007A1 (en) * 2011-06-22 2012-12-27 Yale University COMPOSITIONS AND METHODS OF DIAGNOSING DISEASES AND DISORDERS ASSOCIATED WITH β CELL DEATH

Family Cites Families (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL154600B (nl) 1971-02-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen.
NL154598B (nl) 1970-11-10 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking.
NL154599B (nl) 1970-12-28 1977-09-15 Organon Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen, alsmede testverpakking.
US3901654A (en) 1971-06-21 1975-08-26 Biological Developments Receptor assays of biologically active compounds employing biologically specific receptors
US3853987A (en) 1971-09-01 1974-12-10 W Dreyer Immunological reagent and radioimmuno assay
US3867517A (en) 1971-12-21 1975-02-18 Abbott Lab Direct radioimmunoassay for antigens and their antibodies
NL171930C (nl) 1972-05-11 1983-06-01 Akzo Nv Werkwijze voor het aantonen en bepalen van haptenen, alsmede testverpakkingen.
US3850578A (en) 1973-03-12 1974-11-26 H Mcconnell Process for assaying for biologically active molecules
US3935074A (en) 1973-12-17 1976-01-27 Syva Company Antibody steric hindrance immunoassay with two antibodies
US3996345A (en) 1974-08-12 1976-12-07 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US4034074A (en) 1974-09-19 1977-07-05 The Board Of Trustees Of Leland Stanford Junior University Universal reagent 2-site immunoradiometric assay using labelled anti (IgG)
US3984533A (en) 1975-11-13 1976-10-05 General Electric Company Electrophoretic method of detecting antigen-antibody reaction
US4098876A (en) 1976-10-26 1978-07-04 Corning Glass Works Reverse sandwich immunoassay
US4458066A (en) 1980-02-29 1984-07-03 University Patents, Inc. Process for preparing polynucleotides
US4879219A (en) 1980-09-19 1989-11-07 General Hospital Corporation Immunoassay utilizing monoclonal high affinity IgM antibodies
US5011771A (en) 1984-04-12 1991-04-30 The General Hospital Corporation Multiepitopic immunometric assay
US4666828A (en) 1984-08-15 1987-05-19 The General Hospital Corporation Test for Huntington's disease
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4801531A (en) 1985-04-17 1989-01-31 Biotechnology Research Partners, Ltd. Apo AI/CIII genomic polymorphisms predictive of atherosclerosis
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
US5322770A (en) 1989-12-22 1994-06-21 Hoffman-Laroche Inc. Reverse transcription with thermostable DNA polymerases - high temperature reverse transcription
US5272057A (en) 1988-10-14 1993-12-21 Georgetown University Method of detecting a predisposition to cancer by the use of restriction fragment length polymorphism of the gene for human poly (ADP-ribose) polymerase
US5192659A (en) 1989-08-25 1993-03-09 Genetype Ag Intron sequence analysis method for detection of adjacent and remote locus alleles as haplotypes
KR100236506B1 (ko) 1990-11-29 2000-01-15 퍼킨-엘머시터스인스트루먼츠 폴리머라제 연쇄 반응 수행 장치
CA2218875C (en) 1991-07-23 2000-11-07 The Research Foundation Of State University Of New York Improvements in the in situ pcr
US5281521A (en) 1992-07-20 1994-01-25 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Modified avidin-biotin technique
US5612473A (en) 1996-01-16 1997-03-18 Gull Laboratories Methods, kits and solutions for preparing sample material for nucleic acid amplification
GB9620209D0 (en) 1996-09-27 1996-11-13 Cemu Bioteknik Ab Method of sequencing DNA
GB9626815D0 (en) 1996-12-23 1997-02-12 Cemu Bioteknik Ab Method of sequencing DNA
US6274320B1 (en) 1999-09-16 2001-08-14 Curagen Corporation Method of sequencing a nucleic acid
EP1451354A2 (en) * 2001-11-23 2004-09-01 Epigenomics AG Method and nucleic acids for the analysis of a lymphoid cell proliferative disorder
HUE028727T2 (en) 2007-06-08 2017-01-30 Epigenomics Ag Method for methylation analysis
RU2503088C2 (ru) 2009-07-01 2013-12-27 Шарп Кабусики Кайся Подложка с активной матрицей и органическое электролюминесцентное устройство отображения
US9783850B2 (en) 2010-02-19 2017-10-10 Nucleix Identification of source of DNA samples
US9366632B2 (en) 2010-02-12 2016-06-14 Raindance Technologies, Inc. Digital analyte analysis
AU2011244084A1 (en) 2010-04-20 2012-11-15 Nucleix Methylation profiling of DNA samples
WO2013131083A1 (en) 2012-03-02 2013-09-06 Winthrop-University Hospital METHOD FOR USING PROBE BASED PCR DETECTION TO MEASURE THE LEVELS OF CIRCULATING DEMETHYLATED β CELL DERIVED DNA AS A MEASURE OF β CELL LOSS IN DIABETES
JP5962761B2 (ja) 2012-07-20 2016-08-03 株式会社村田製作所 生体センサ
WO2014138133A1 (en) 2013-03-04 2014-09-12 Islet Sciences, Inc. Compositions and methods for detecting hypo-methylated dna in body fluids
CA2901293A1 (en) 2013-03-15 2014-09-25 Abbott Molecular Inc. Detection of bisulfite converted nucleotide sequences
WO2015159293A2 (en) 2014-04-14 2015-10-22 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. A method and kit for determining the tissue or cell origin of dna
JP6681841B2 (ja) 2014-05-09 2020-04-15 ライフコーデックス アーゲー 特別な細胞タイプに由来するｄｎａの検出とそれに関連する方法
US10858706B2 (en) 2015-07-10 2020-12-08 Nyu Winthrop Hospital System, method and kit for analysis of circulating differentially methylated DNA as a biomarker of beta-cell loss
EP3652344A1 (en) 2017-07-13 2020-05-20 Yissum Research and Development Company of the Hebrew University of Jerusalem Ltd. Dna targets as tissue-specific methylation markers
WO2019012542A1 (en) 2017-07-13 2019-01-17 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. DETECTION OF SPECIFIC DNA FROM A FABRIC
WO2019012544A1 (en) 2017-07-13 2019-01-17 Yissum Research Development Company Of The Hebrew University Of Jerusalem Ltd. STRATEGY FOR DOUBLE PROBE DROPLETS FOR SPECIFIC DETECTION OF CIRCULATING DNA MOLECULES SPECIFIC TO A TISSUE

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999018124A1 (en) * 1997-10-07 1999-04-15 Merck & Co., Inc. Assays for nuclear receptor ligands using fret
EP1342794A1 (en) * 2002-03-05 2003-09-10 Epigenomics AG Method and device for determination of tissue specificity of free floating DNA in bodily fluids
WO2005118852A2 (en) * 2004-06-04 2005-12-15 The Chinese University Of Hong Kong A marker for prenatal diagnosis and monitoring
WO2012047091A1 (en) * 2010-10-08 2012-04-12 Universiti Putra Malaysia Glp-1 promoter mediated insulin expression for the treatment of diabetes
WO2012178007A1 (en) * 2011-06-22 2012-12-27 Yale University COMPOSITIONS AND METHODS OF DIAGNOSING DISEASES AND DISORDERS ASSOCIATED WITH β CELL DEATH

Non-Patent Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Development of a Quantitative Methylation-Specific Polymerase Chain Reaction Method for Monitoring Beta Cell Death in Type 1 Diabetes;MOHAMED I. HUSSEINY等;《PLOS ONE》;20121029;第7卷(第10期);e47942 *
Encoding PCR Products with Batch-stamps and Barcodes;Megan L. McCloskey等;《BIOCHEMICAL GENETICS, KLUWER ACADEMIC PUBLISHERS-PLENUM PUBLISHERS, NE》;20071023;第45卷(第11-12期);761-767 *
Epigenome-wide association studies for common human diseases;Vardhman K. Rakyan等;《Nat Rev Genet》;20110712;第12卷(第8期);529–541 *
Homo sapiens chromosome 16, cosmid clone 400H11 (LANL), complete sequence;DATABASE EMBL;《DATABASE EMBL》;19980406;全文 *
Immune Therapy andβ-Cell Death in Type 1 Diabetes;J. LEBASTCHI等;《DIABETES》;20130219;第 62卷(第5期);1676-1680 *
MOHAMED I. HUSSEINY等.Development of a Quantitative Methylation-Specific Polymerase Chain Reaction Method for Monitoring Beta Cell Death in Type 1 Diabetes.《PLOS ONE》.2012,第7卷(第10期),e47942. *
MOHAMED I. HUSSEINY等.Tissue-Specific Methylation of Human Insulin Gene and PCR Assay for Monitoring Beta Cell Death.《PLOS ONE》.2014,第9卷(第4期),e94591. *
TANIA MADI等.The determination of tissue-specific DNA methylation patterns in forensic biofluids using bisulfite modification and pyrosequencing.《ELECTROPHORESIS》.2012,第33卷(第12期),1736-1745. *
The determination of tissue-specific DNA methylation patterns in forensic biofluids using bisulfite modification and pyrosequencing;TANIA MADI等;《ELECTROPHORESIS》;20120628;第33卷(第12期);1736-1745 *
Tissue Specific NA Methylation in Normal Human Breast Epithelium and in Breast Cancer;Ayelet Avraham等;《PLoS ONE》;20140320;第20卷(第3期);e91805 *
Tissue-Specific Methylation of Human Insulin Gene and PCR Assay for Monitoring Beta Cell Death;MOHAMED I. HUSSEINY等;《PLOS ONE》;20140410;第9卷(第4期);e94591 *

Also Published As

Publication number Publication date
EP4306659A2 (en) 2024-01-17
PL4026917T3 (pl) 2024-04-08
IL248299A0 (en) 2016-11-30
US20170121767A1 (en) 2017-05-04
US20220064730A1 (en) 2022-03-03
WO2015159293A2 (en) 2015-10-22
PT4026917T (pt) 2024-02-12
JP2017511142A (ja) 2017-04-20
EP3643795A1 (en) 2020-04-29
WO2015159292A3 (en) 2015-12-10
EP4026917A1 (en) 2022-07-13
HRP20240189T1 (hr) 2024-04-26
EP4306659A3 (en) 2024-03-27
WO2015159293A3 (en) 2015-12-10
FI4026917T3 (fi) 2024-02-14
US11203784B2 (en) 2021-12-21
IL248299B (en) 2021-04-29
US20230242985A1 (en) 2023-08-03
EP3132055A2 (en) 2017-02-22
DK4026917T3 (da) 2024-02-12
EP3643795B1 (en) 2022-03-30
DK3643795T3 (da) 2022-05-09
WO2015159292A2 (en) 2015-10-22
JP6750879B2 (ja) 2020-09-02
CN106574296A (zh) 2017-04-19
SI4026917T1 (sl) 2024-05-31
EP4026917B1 (en) 2023-11-15
LT4026917T (lt) 2024-03-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20230242985A1 (en) Method and kit for determining the tissue or cell origin of dna
US20200340057A1 (en) Dna targets as tissue-specific methylation markers
JP7485427B2 (ja) 肺癌を診断するためのキットおよび方法
US20130178389A1 (en) Composite assay for developmental disorders
US20230120076A1 (en) Dual-probe digital droplet pcr strategy for specific detection of tissue-specific circulating dna molecules
US20200165671A1 (en) Detecting tissue-specific dna
WO2024038457A1 (en) A method for determining the tissue or cell of origin of dna
TWI753455B (zh) 用以評估個體罹患胃癌或癌前病變之風險的方法、其套組、其分析器及其生物標誌
IL280297B (en) Non-invasive cancer detection is based on DNA methylation changes
WO2023135600A1 (en) Personalized cancer management and monitoring based on dna methylation changes in cell-free dna
CN117821585A (zh) 结直肠癌早期诊断标志物及应用
TW202328459A (zh) 一種腫瘤檢測方法及應用
CN116064820A (zh) 用于检测早期肝癌的生物标记物、试剂盒及其使用方法
CN117778568A (zh) 鉴别胃癌的标志物及应用
CN117512115A (zh) 一种通过基因甲基化信号预放大提高检测肿瘤灵敏率的方法
CN116463417A (zh) 检测目标区域甲基化水平的试剂在制备肝癌诊断产品中的应用
BRPI1006640A2 (pt) métodos e reagentes para a detecção precoce de melanoma

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant