JP2021112127A

JP2021112127A - 膵β細胞の傷害検査方法

Info

Publication number: JP2021112127A
Application number: JP2018085689A
Authority: JP
Inventors: 暁生黒田; Akio Kuroda; 美鈴山田; Misuzu Yamada; 宗英松久; Munehide MATSUHISA
Original assignee: Matsuhisa Munehide; Yamada Misuzu
Current assignee: Matsuhisa Munehide; Yamada Misuzu
Priority date: 2018-04-26
Filing date: 2018-04-26
Publication date: 2021-08-05
Also published as: JP7060274B2; WO2019207921A1; JPWO2019207921A1

Abstract

【課題】本発明の課題は、１型糖尿病患者の早期発見のために膵β細胞の傷害の程度を簡便に検査できる方法を開発することである。【解決手段】被験者の血清から膵β細胞に由来するｃｆＤＮＡを単離し、バイサルファイト処理を行った後、ＡＲＭＳ−ＰＣＲ法により、膵β細胞由来のインスリン遺伝子の非メチル化ＣｐＧ部分を検出・確認できることを見出した。本発明の方法により、より簡便に１型糖尿病患者の早期症状を検出できるようになった。これにより、１型糖尿病患者の早期発見と早期治療だけでなく、１型糖尿病の膵島移植等の治療の有効性を確認する手段としても使用できることが明らかとなった。【選択図】なし

Description

本発明は、血中の膵β細胞由来のＤＮＡを検出して、膵β細胞の傷害程度や進行状況を評価する検査方法に関するものである。

糖尿病患者の数は近年、非常に増加しており、２０１６年に国内では１，０００万人を超えたと報告されている。糖尿病は、膵臓のβ細胞から分泌されるインスリン作用が相対的に減少する病気である。血中のインスリン量の減少や、インスリン作用の減弱のため、血糖値が上昇し、その結果血管障害を来し、動脈硬化症や腎臓障害など多様な糖尿病合併症が進行する。
糖尿病は、１型糖尿病と２型糖尿病に大別され、１型糖尿病は膵β細胞が死滅するため、インスリンが産生されなくなる疾患である。２型糖尿病は、インスリンの効果が減弱したり、分泌のタイミングが遅れ、患者に膵β細胞傷害が進行する疾患であって、肥満・運動不足・ストレスなど環境因子の増悪を契機に発症し、疾患感受性遺伝子変異の集積した人に起こりやすい。
特に、１型糖尿病は、主に自己免疫応答によって、膵β細胞特異的に細胞死が誘導され、80%以上の膵β細胞が傷害をうけた結果、高血糖に至り診断される。そこで、１型糖尿病の早期診断、早期治療を行い、β細胞機能を少しでも保護することが求められている。その早期発見のために、膵島関連自己抗体であるＧＡＤ抗体やＩＡ−２抗体等の検出が行われている。しかし、これらの抗体はその抗体価による重症度分類はできず、膵β細胞傷害の程度を反映するものでないことが課題であった。このため、膵β細胞の死滅の状況を的確に検出する方法が不可欠となっている。
また、1型糖尿病の根治医療として膵臓移植あるいは膵島移植が行われているが、移植された膵臓や膵島は拒絶反応を起こしやすく、また自己免疫応答の再燃が生じる危険もある。現在は血清アミラーゼの上昇や血糖値の上昇など間接的指標によりグラフト傷害を診断しているため、適切な免疫抑制治療の強化が行えずグラフト喪失に至る場合が多い。このことからも、直接的な膵β細胞傷害の臨床的指標が望まれている。

１型糖尿病の早期からの免疫寛容療法の導入とその効果検証および、重症患者への膵臓・膵島移植後の拒絶反応など臓器障害の検出から的確な治療介入のためには、より直接的に膵β細胞の死滅の状況を検出する必要がある。
そこで、血液中を循環するゲノムＤＮＡの中に含まれる膵β細胞由来の遊離ＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ：ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅＤＮＡ）の検出を検討した。β細胞が死滅すれば、β細胞由来のＤＮＡが体内に放出され、血液に流入して、血液中を循環することになるからである。
現在、膵β細胞由来のｃｆＤＮＡを効率的に検出するために、ＤＮＡのメチル化の有無に着目した研究が進められている（非特許文献１、２）。膵β細胞がインスリンを選択的に分泌していることから、インスリンの産生に係るＤＮＡ領域は、他の体細胞と比べてＣｐＧのメチル化が少ないことが報告されている。特に、図１に示されるように、インスリンのプロモーター領域のメチル化の割合は、膵β細胞特異的にきわめて低いと報告されている（非特許文献３）。

上記インスリンのプロモーター領域のメチル化の有無を指標にして、膵β細胞のｃｆＤＮＡの確認が種々検討されている。ＤＮＡのメチル化の識別には、色々な解析手法が使用されるが、例えばＤＮＡのバイスルファイト処理を行い、第１のＮｅｓｔｅｄＰＣＲを行い、次にＤＮＡ塩基配列特異的なＰＣＲを行って、増幅したＤＮＡを電気泳動し検出することなどが行われている（特許文献１）。使用されるＰＣＲの方法にも工夫がなされ、特定のプローブを用いるＤｒｏｐｌｅｔＤｉｇｉｔａｌ法（非特許文献４，５）が報告されている。更に、次世代シークエンサーによるＭｉSｅｑ法（非特許文献６）なども行われている。
しかし、非特許文献１−５の方法はＣｐＧ配列のメチル化状態を検討する部位が少ないため特異性が低く、非特許文献６の方法の検査費用は高額であり、臨床検査で汎用することは困難である。それ故、臨床検査に使用するために、より簡便で安価かつ特異性の高い方法が強く求められている。

再表２０１１−１３２７９８号公報

ＨｅｒｏｌｄＫＣ．ｅｔａｌ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，２０１５，１２５（３）：１１６３−１１７３ＪｏｈｎＡ．Ｏｌｓｅｎｅｔａｌ，ＰＬＯＳＯＮＥ，２０１６，Ａｐｒ２５：１１（４）ｅ０１５２６６２ＨｕｓｓｅｉｎｙＭＩ，ｅｔＰＬＯＳＯＮＥ，２０１４，Ａｐｒ１０：９（４）ｅ９４５９１ＳａｈａｒＵ−Ｂ．ｅｔａｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ２０１４，１５５（９）：３６９４−３６９８ＭａｒｉｓａＭ．Ｆ．ｅｔａｌ．２０１５ＤｉａｂａｔｅｓＪｕｌ；ｄｂ１５０４３０Ｌｅｈｍａｎｎ−ｗｈｅｒｍａｎｅｔａｌ．Ｅ１８２６−Ｅ１８３４，ＰＮＡＳ，Ｍａｒｃｈ１４，２０１６

本発明の課題は、膵β細胞由来のｃｆＤＮＡに関する簡便で安価かつ特異性の高い臨床検査方法（血中ｃｆＤＮＡの検出方法）を提供することである。

従来の分析方法では、メチル化されたＤＮＡの存在確認を行うことが中心であった（特開２０１０−１５８２４０、特開２０１０−６８７７５、特開２００６−４２６４１）。そして、ＤＮＡのメチル化された部位やメチル化のパターンを解析することにより、癌の診断や治療マーカーとして使用できると報告されている（特開２００５−５３６２２９、特開２００９−２３２７６１）。
しかし、これらの方法では、所望の位置のメチル化と非メチル化のデータの識別が困難であり、その識別操作に時間が掛かり、高額の機器を使用する等のことがあり、汎用と言えないものである。また、既知の膵β細胞由来のｃｆＤＮＡ検出方法（非特許文献１〜５）でも方向性は示されているが、実際にその方法を追試しても偽陽性を排除することが困難であり、臨床検査方法として、簡易で安価に使用できるものではなかった。

そこで、本発明者らは、ＰＣＲの手法を用い、膵β細胞由来のｃｆＤＮＡを高精度で検出する方法を検討した。その結果、インスリン遺伝子のエクソン２領域の非メチル化ＤＮＡをＰＣＲ法で増幅して確認することがより適切であることを見出した。
従来、健常人と患者（１型糖尿病患者や膵島移植患者など）の識別が困難であり、ＰＣＲ法の更なる改良が必要であった。本発明者らは、種々検討の結果、色々なＰＣＲ法の中でも膵β細胞由来の非メチル化ＤＮＡの定量性を向上させるためには、ＡＲＭＳ（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｒｅｆｒａｃｔｏｒｙｍｕｔａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ）−ＰＣＲ法を適用し、２段階で遺伝子増幅することが好ましいことを見出した。
ＡＲＭＳ法のプライマーとして、更に種々検討の結果、多くのプライマーの組合せの中から、第一段階のプライマーとしては、次の表１のプライマーセットが最も適切であることを見出した。

また、第二段階のプライマーとしては、次の表２のプライマーセットが最も適切であることを見出した。

本発明者らは、表１と表２のプライマーセットを用いた２段階ＡＲＭＳ−ＰＣＲ法を使用して、１型糖尿病患者と健常人の血中のｃｆＤＮＡの検査を実施したところ、図１０に示されるように、１型糖尿病患者では特別に高い陽性反応を示すが大多数では陰性であり、健常人では弱陽性を示す場合も認めた。本発明者らは、上記の知見に基づいて、本発明を完成した。

本発明の要旨は以下の通りである。
（１）被験者の血中ｃｆＤＮＡの中の膵β細胞由来のインスリン遺伝子の検出方法であって、
ａ）２段階のＡＲＭＳ−ＰＣＲ法でインスリン遺伝子エクソン２領域の遺伝子増幅を行い、
ｂ）第一段階で次のプライマーセットを使用し、
Ｆｏｒｗａｒｄ側：５‘−ＴＡＧＴＴＴＴＴＧＴＧＡＡＴＴＡＡＴＡＴＴＴＧＴＴＴＧ−３’（配列番号１）、
Ｒｅｖｅｒｓｅ側：５‘−ＣＣＴＡＣＡＡＡＴＣＣＴＣＴＡＣＣＴＣＣＧＡＡ−３’（配列番号２）、
ｃ）第二段階で次のプライマーセットを使用する
Ｆｏｒｗａｒｄ側：５‘−ＴＴＴＧＧＴＧＧＡＡＧＴＴＴＴＴＴＡＴＴＴＡＧＴＧＴＣＴＧ−３’（配列番号３）、
Ｒｅｖｅｒｓｅ側：５‘−ＡＡＴＣＴＴＡＡＡＴＡＴＡＴＡＡＡＡＡＡＡＡＣＣＴＧＡＴ−３’（配列番号４）、
ことを特徴とする、膵β細胞由来インスリン遺伝子の血中ｃｆＤＮＡの検出方法。
（２）上記２段階のＡＲＭＳ−ＰＣＲ法に先立ち、インスリン遺伝子ｃｆＤＮＡのエクソン２領域（＋３０１〜＋４２９部分）の遺伝子増幅を次のプライマーセットで行う
Ｆｏｒｗａｒｄ側：５‘−ＡＧＴＴＧＴＡＧＴＴＴＴＴＧＴＧＡＡＴＴＡＡＴＡＴＴＴＧ−３’（配列番号５）、
Ｒｅｖｅｒｓｅ側：５‘−ＴＣＡＣＣＣＴＡＣＡＡＡＴＣＣＴＣＴＡＣＣ−３’（配列番号６）、
ことを特徴とする、上記（１）に記載の膵β細胞由来インスリン遺伝子の血中ｃｆＤＮＡの検出方法。
（３）第一段階のプライマーセットが、
Ｆｏｒｗａｒｄ側が少なくとも、５‘−ＡＡＴＴＡＡＴＡＴＴＴＧＴＴＴＧ−３’（配列番号７）の塩基配列であり、
Ｒｅｖｅｒｓｅ側が少なくとも、５‘−ＡＴＣＣＴＣＴＡＣＣＴＣＣＧＡＡ−３’（配列番号８）の塩基配列である、
第二段階のプライマーセットが、
Ｆｏｒｗａｒｄ側が少なくとも、５‘−ＴＴＴＴＡＴＴＴＡＧＴＧＴＣＴＧ−３’（配列番号９）の塩基配列であり、
Ｒｅｖｅｒｓｅ側が少なくとも、５‘−ＡＴＡＡＡＡＡＡＡＡＣＣＴＧＡＴ−３’（配列番号１０）の塩基配列である
ことを特徴とする、上記（１）又は（２）に記載の膵β細胞由来インスリン遺伝子の血中ｃｆＤＮＡの検出方法。
（４）２段階のＡＲＭＳ−ＰＣＲ法において、第一段階のＰＣＲを１５サイクルで行い、第二段階のＰＣＲを４０回で行うことを特徴とする、上記（１）〜（３）のいずれかに記載の膵β細胞由来インスリン遺伝子の血中ｃｆＤＮＡの検出方法。
（５）血中の膵β細胞由来のｃｆＤＮＡを検出するための２段階ＡＲＭＳ−ＰＣＲ法のプライマーセットであって、
ａ）第一段階のプライマーセットとして、
Ｆｏｒｗａｒｄ側が、５‘−ＴＡＧＴＴＴＴＴＧＴＧＡＡＴＴＡＡＴＡＴＴＴＧＴＴＴＧ−３’（配列番号１）の塩基配列であり、
Ｒｅｖｅｒｓｅ側が、５‘−ＣＣＴＡＣＡＡＡＴＣＣＴＣＴＡＣＣＴＣＣＧＡＡ−３’（配列番号２）の塩基配列である、
ｂ）第二段階のプライマーセットとして、
Ｆｏｒｗａｒｄ側が、５‘−ＴＴＴＧＧＴＧＧＡＡＧＴＴＴＴＴＴＡＴＴＴＡＧＴＧＴＣＴＧ−３’（配列番号３）の塩基配列であり、
Ｒｅｖｅｒｓｅ側が、５‘−ＡＡＴＣＴＴＡＡＡＴＡＴＡＴＡＡＡＡＡＡＡＡＣＣＴＧＡＴ−３’（配列番号４）の塩基配列である
ことを特徴とする、プライマーセット。
（６）血中の膵β細胞由来のｃｆＤＮＡを検出するための２段階ＡＲＭＳ−ＰＣＲ法のプライマーセットであって、
ａ）第一段階のプライマーセットが、
Ｆｏｒｗａｒｄ側が少なくとも、５‘−ＡＡＴＴＡＡＴＡＴＴＴＧＴＴＴＧ−３’（配列番号７）の塩基配列であり、
Ｒｅｖｅｒｓｅ側が少なくとも、５‘−ＡＴＣＣＴＣＴＡＣＣＴＣＣＧＡＡ−３’（配列番号８）の塩基配列である、
ｂ）第二段階のプライマーセットが、
Ｆｏｒｗａｒｄ側が少なくとも、５‘−ＴＴＴＴＡＴＴＴＡＧＴＧＴＣＴＧ−３’（配列番号９）の塩基配列であり、
Ｒｅｖｅｒｓｅ側が少なくとも、５‘−ＡＴＡＡＡＡＡＡＡＡＣＣＴＧＡＴ−３’（配列番号１０）の塩基配列である
ことを特徴とする、上記（５）に記載のプライマーセット。
（７）血中の膵β細胞由来のｃｆＤＮＡを検出するために、ヒトインスリン遺伝子のエクソン２領域の遺伝子配列（＋３０１〜＋４２９）を増幅するためのプローブであって、
Ｆｏｒｗａｒｄ側：５‘−ＡＧＴＴＧＴＡＧＴＴＴＴＴＧＴＧＡＡＴＴＡＡＴＡＴＴＴＧ−３’（配列番号５）、
Ｒｅｖｅｒｓｅ側：５‘−ＴＣＡＣＣＣＴＡＣＡＡＡＴＣＣＴＣＴＡＣＣ−３’（配列番号６）、
であることを特徴とする、プライマーセット。
（８）以下のａ）、ｂ）から、少なくともａ）を含む、血中の膵β細胞インスリン遺伝子由来のｃｆＤＮＡを検出方法するための試薬又はキット。
１）上記（５）又は（６）に記載のプライマーセット
２）上記（７）に記載のプライマーセット

本発明の検出方法の特徴は、膵β細胞インスリン遺伝子に由来するｃｆＤＮＡの中で、インスリン遺伝子エクソン２領域の非メチル化ＤＮＡに着目して、ＡＲＭＳ−ＰＣＲ法で遺伝子増幅し、非メチル化ＤＮＡ増幅産物を検出する方法である。この遺伝子増幅には、偽陽性も多く起き、プライマーセットの良否がその結果の成否を決めるものとなっている。本発明のＡＲＭＳ−ＰＣＲ法のプライマーセットは、非メチル化ＤＮＡ増幅産物の陽性者と陰性者を的確に区別できるものであることが示されている。
本発明のプライマーセットを用いた検出方法で、膵β細胞インスリン遺伝子に由来するｃｆＤＮＡが検出できることは、膵β細胞が損傷を受け、膵β細胞に由来する遺伝子がｃｆＤＮＡとして血液中に流出していることを表している。従って、本発明の検出方法を用いることにより、膵β細胞の損傷の様子をモニターすることができる。また、本発明の検出方法は、これまでの公知の次世代シークエンサー法と比較し、技術的に汎用されているＰＣＲ法を使用するものであり、そのため安価な検出方法となっている。

インスリン遺伝子のエクソン２領域のＣｐＧ配列では、他の体細胞（血液、乳腺、結腸、腎臓、肝臓、肺、脾臓、胃）と比べて、膵β細胞のＣｐＧのメチル化の割合が低いことを表した図である。ＰＬｏＳＯＮＥ９（４）ｅ９４５９１（２０１４）の図３を改変して使用した。インスリン遺伝子のエクソン２領域を遺伝子増幅するためのＰＣＲ用プライマーの位置を表した図である。ＡＲＭＳ法で使用するプライマーにおいて、ミスマッチ部分の適切な種類を選択するために作製された各３種のプライマーを表した図である。上記図３で作製されたプライマーの効率を検証した図である。最初のＰＣＲでは、Ｆ２とＲ２の組合せ、Ｆ３とＲ１の組合せ、Ｒ３とＲ２の組合せが良好であることが示された。図４と同様に、図３で作製されたプライマーの効率を検証した図である。第二のＰＣＲでは、Ｆ１とＲ１の組合せが良好であることが示された。１型糖尿病患者（Ｔ１Ｄ）と健常人（Ｎｏｒｍａｌ）の各ｃｆＤＮＡ、ＥＣプラスミド（ＥＣ）、ＥＴプラスミド（ＥＴ）を用いて、プライマーとして、Ｆ３とＲ１、Ｆ３とＲ２、Ｆ２とＲ２の組合せで遺伝子増幅した場合の増幅効率を検証した図である。Ｆ３Ｒ１の組み合わせがＴ１Ｄの検出能が最も高いことが示された。図６のＥＣプラスミド、ＥＴプラスミドに代えて、血液ｇｅｎｏｍｅＤＮＡを用いて、プライマーの増幅効率を検証した図である。ネガティブコントロールである血液ｇｅｎｏｍｅＤＮＡよりもＦ３Ｒ１を用いたＰＣＲではＣｑ値が低くより陽性であるデータを示した。最初のＰＣＲのプライマーとして、Ｆ２Ｒ２、Ｆ３Ｒ２、Ｆ３Ｒ１の３種の組合せの中で、Ｆ３Ｒ１の組合せが、血中膵β細胞のｃｆＤＮＡを的確に遺伝子増幅できることを検証した図である。最初のＰＣＲのプライマーとして、Ｆ２Ｒ１とＦ３Ｒ１の組合せを用いた場合の遺伝子増幅効率を比較した図である。Ｆ３Ｒ１の組み合わせの方がＦ２Ｒ１の組み合わせよりも陽性サンプルであるＴ１ＤとＮｏｒｍａｌのＰＣＲのＣｑ値の差がより大きく検出できていることが示された。本発明のプライマーのセットとして、最初にＦ３Ｒ１、次にＦ１Ｒ１を使用することにより、１型糖尿病患者のｃｆＤＮＡと健常人のｃｆＤＮＡから膵β細胞に由来するインスリン遺伝子を検出でき、患者と健常人の区別ができることを検証した図である。健常人のサンプルでは２１検体中１検体で強陽性であったが、小児１型糖尿病患者のサンプルでは１０検体中９検体で強陽性であった。また、成人１型糖尿病患者のサンプルでは５４検体中４検体で強陽性であった。

本発明の「ｃｆＤＮＡ」とは、血清中に存在するセルフリーＤＮＡのことである。
本発明では常法により、血清中のｃｆＤＮＡを採取し、バイスルファイト処理を行って非メチル化シトシンをウラシルに変換する。そのことにより、膵β細胞インスリン遺伝子由来のＤＮＡの非メチル化シトシンはチミン（Ｔ）に変換され増幅されているので、ＣとＴの相違の識別が容易になる。その後、検体に含まれるＤＮＡコピー数が大変少量であるためバイスルファイト処理を行ったＤＮＡのＰＣＲによる遺伝子増幅をＡＲＭＳ−ＰＣＲの前に行っている。
本発明の「ＡＲＭＳ−ＰＣＲ法」とは、常法のＡＲＭＳ（ＡｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎＲｅｆｒａｃｔｏｒｙＭｕｔａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ）法のことをいう。ＡＲＭＳ−ＰＣＲ法では、３’末端をミスマッチのない塩基として設定し、３’末端から２塩基目にメチル化が入っているシトシン（Ｃ）と非メチル化シトシン由来のチミン（Ｔ）が来るように設定する。また、プライマーがミスマッチを起こして、ＰＣＲが起こらなくなるように、更に５’側にもう1塩基のミスマッチを作る。このことにより、塩基１個のミスマッチである場合には、ＰＣＲの増幅が起こるが、塩基２個のミスマッチがあれば、ＰＣＲが増幅しない。このような遺伝子増幅システムがＡＲＭＳ−ＰＣＲ法というものである。

本発明のＡＲＭＳ−ＰＣＲ法における「プライマーセット」とは、バイスルファイト処理を行ったＤＮＡのＰＣＲによる遺伝子増幅後に２段階に分けてエクソン２領域の非メチル化シトシン部位含むＤＮＡを効率的に遺伝子増幅させるためのプライマーの組合せを言う。なお、上記表１と表２に記載されたプライマーは、３’末端から３番目の塩基の設定が重要であり、プライマーの長さは大きな影響を与えない。従って、プライマーの長さは、アニーリングを起こすために必要な長さがあればよく、塩基数として１６以上あればよい。それ故、本発明のプライマーは、表１と表２のプライマーに限定されるものではなく、５’端末までの長さは目的に応じて適宜調節できるものである。例えば、第一段階のプライマーセットでは、Ｆｏｒｗａｒｄ側が少なくとも、５‘−ＡＡＴＴＡＡＴＡＴＴＴＧＴＴＴＧ−３’（配列番号７）の塩基配列、Ｒｅｖｅｒｓｅ側が少なくとも、５‘−ＡＴＣＣＴＣＴＡＣＣＴＣＣＧＡＡ−３’（配列番号８）の塩基配列があればよい。また、第二段階のプライマーセットでは、Ｆｏｒｗａｒｄ側が少なくとも、５‘−ＴＴＴＴＡＴＴＴＡＧＴＧＴＣＴＧ−３’（配列番号９）の塩基配列、Ｒｅｖｅｒｓｅ側が少なくとも、５‘−ＡＴＡＡＡＡＡＡＡＡＣＣＴＧＡＴ−３’（配列番号１０）の塩基配列があればよい。
本発明のエクソン２領域を遺伝子増幅する「プライマーセット」とは、本発明の場合、＋３０１〜＋４２９部分のＤＮＡ領域を増幅するものであるが、これを含む領域を増幅するためのプライマーであれば使用可能である。それ故、本発明で記載したプライマーセットに限定されるものではない。

次に実施例を挙げて本発明を更に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

（実施例１）cｅｌｌｆｒｅｅＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）の分離精製
血中にエクソソーム等の形で微小量循環する膵β細胞のインスリン遺伝子を検出するため、まず、被験者の血液から、膵β細胞のインスリン遺伝子のエクソン２部分の遺伝子を増幅して採取することを行った。
（１）方法
ａ）ｃｆＤＮＡの採取とバイスルファイト処理：
被験者から採血し、血清分離のために３０分以上室温で保存する。血清を４℃ １３５０Ｇで１２分遠心し、上清を新たな１５ｍＬチューブに移す。さらに血清を４℃ ３０００Ｇで１２分遠心して上清（約３ｍＬ）を１ｍＬずつ分注した。血清１ｍＬより、ＢＩＯＯＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣＣＯＲＲＰＯＲＡＴＩＯＮ社のＮｅｘｔＰｒｅｐ―ＭａｇｃｆＤＮＡＩｓｏｌａｔｉｏｎＫｉｔを用いてｃｆＤＮＡを精製、１２μＬで溶出した。溶出液１０μＬを用いてｉｎｎｕＣＯＮＶＥＲＴＢｉｓｕｌｆｉｔｅＢａｓｉｃＫｉｔ（ＡｎａｌｙｔｉｋＪｅｎａ社）を用いてバイスルファイト処理を行い、５０μＬにて溶出した。
ｂ）膵β細胞のインスリン遺伝子のエクソン２部分の増幅：
上記溶出液を用いて、ｃｆＤＮＡのインスリン遺伝子のエクソン２部分をＣｐＧのメチル化の有無にかかわらず、遺伝子増幅した。ＰＣＲの機材はＢＩＯ−ＲＡＤ社のＴ１００ＴＭＴｈｅｒｍａｌＣｙｃｌｅｒを使用した。
ＱＩＡＧＥＮ推奨プロトコール (ｃａｔ．Ｎｏｓ．２０３６４３)に基づき、表３のプライマーを用いて、上記バイスルファイト処理液（１本差ＤＮＡ）５μＬ、ＰＣＲマスターミックス（Ｑｉａｇｅｎ社ＨｏｔＳｔａｒＴａｑｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）１０μＬ、表１のプライマーミックス（５μＭｅａ．）１μＬ、ＣａｒａＩＬｏａｄ２μＬ、無菌蒸留水２μＬを使用し、９５℃で５分間した後、９４℃で３０秒、５０℃で３０秒、７２℃で３０秒の反応処理を１５サイクル行った。その後、７２℃で１０分間の反応を行った。

（２）結果
増幅されたエクソン２部分のＤＮＡの中には、膵β細胞のインスリン遺伝子由来のＤＮＡが含まれると、図２に示されるように、＋３３１位、＋３６７位、＋３７４位、＋４０１位、＋４０４位の５カ所がチミン（Ｔ）に変化した二本鎖ＤＮＡが存在する。

（実施例２）ＡＲＭＳ法による選択的な膵β細胞のインスリン遺伝子（エクソン２部分）の増幅のためのプライマー検討
（１）プライマーの作成
実施例１で得られたエクソン２部分の増幅二本鎖ＤＮＡを用いて、＋３３１、＋４０４ｂｐのＣｐＧの脱メチル化の有無を確認することを行った。脱メチル化されていれば、遺伝子増幅が可能であり、膵β細胞のインスリン遺伝子由来のＤＮＡが選択的に遺伝子増幅されることになる。
ＰＣＲ処理を行うために、図３に示すようなプライマーを作製した。まず、Ｆｏｗａｒｄ側及びＲｅｖｅｒｓｅ側のプライマーとして、３‘末端から３つ目の塩基をミスマッチさせた各3種類のプライマーを作製した。そして、各プライマーの特異度（ミスマッチに関するプライマーの特異性）と組合せを検討した。なお、逆側のプライマーは膵β細胞でも非膵β細胞でも増幅するプライマーを用いて、それぞれのプライマーの検出精度の高いものを選択した。

（２）方法
ＰＣＲのプライマーの最適化を目指して、以下のモデル反応を行った。使用するインスリン遺伝子のＤＮＡは次のものである。
ａ）膵β細胞をバイスルファイト処理したときのインスリン遺伝子のＣｐＧ配列が同じ（ＴＧ）であるＥＴプラスミド
ｂ）非膵β細胞をバイスルファイト処理したときのインスリン遺伝子のＣｐＧ配列が同じ（ＣＧ）であるＥＣプラスミド
これらプラスミドのＰＣＲを行うことで、プライマーのミスマッチの特異度が、どれだけETで増幅されやすく、ECで増幅されにくいかで評価できると考えた。
ＰＣＲの方法としては、ＲｏｃｈｅＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ９６推奨プロトコールに基づき行った。第１段階のＡＲＭＳ法としては、ＥＴプラスミドとＥＣプラスミドの０．０１８ｎｇ/ｍＬを１μＬ、ＰＣＲマスターミックス（ＦａｓｔＳｔａｒｔＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）１０μＬ、図３のプライマーミックス（５μＭｅａ．）１μＬ、無菌蒸留水８μＬを使用し、９５℃で１０分間処理した後、９５℃で１０秒、５６℃で１０秒、７２℃で１０秒の反応処理を１５サイクル行った。第２段階のＡＲＭＳ法としては、上記の第１段階の方法と同様に３５サイクル行った。
（３）結果
図４で示されるように、第１段階のＡＲＭＳ法で使用するプライマーでは、Ｆｏｒｗａｒｄ側でＦ２，Ｆ３、Ｒｅｖｅｒｓｅ側でＲ１，Ｒ２で良好な分離が得られた。一方、図５で示されるように、第２段階のＡＲＭＳ法で使用するプライマーでは、Ｆｏｒｗａｒｄ側ではＦ１が最もＣｑの分離が良好であり、Ｒｅｖｅｒｓｅ側ではＲ１のみがＰＣＲで増幅することが示された。従って、第２段階のＡＲＭＳ法で使用するプライマーはＦ１とＲ１の組み合わせとなった。

（実施例３）第１段階のＡＲＭＳ法で用いるプライマーの検討
実施例２の第１段階のＡＲＭＳ法で使用されるプライマーの中で、どの組み合わせが実際の患者および健常者の血清から取り出した陽性および陰性のｃｆＤＮＡで差が出るかについて検討した。
（１）方法
次の試料を用いて、プライマーの組合せ（Ｆ３Ｒ１、Ｆ３Ｒ２、Ｆ２Ｒ２、Ｆ２Ｒ１、Ｆ１Ｒ２）の効果を確認した。
ａ）１型糖尿病患者血清から実施例１に準じて得られたｃｆＤＮＡ溶液
ｂ）健常人血清から実施例１に準じて得られたｃｆＤＮＡ溶液
ｃ）実施例２で用いたＥＴプラスミドとＥＣプラスミドの溶液
ｄ）血液のゲノムＤＮＡ（ＢｌｏｏｄＧｅｎｏｍｅＤＮＡ）の溶液
なお、ＰａｎｃｒｅａｓゲノムＤＮＡは、ＢｉｏＣｈａｉｎ社のヒト成人の正常組織（膵臓）由来のゲノムＤＮＡを用い、ＢｌｏｏｄゲノムＤＮＡはＰｒｏｍｅｇａ社のヒトゲノムＤＮＡを用いた。各５μｇを上記の方法でバイスルファイト処理を行い、５０μＬで溶出した。Ｐｒｏｍｅｇａ社のＱｕａｎｔｕｓＴＭＦｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒで一本鎖ＤＮＡ量の濃度測定を行い、1ｎｇを用いた。
第１段階のＡＲＭＳ法を行った後、第２段階のＡＲＭＳ法をＦ１Ｒ１のプライマーの組み合わせで行った。

（２）結果
図６〜７に示されるように、膵β細胞由来のインスリン遺伝子の増幅が高いプライマーの組合せは、Ｆ３Ｒ１であり、次にＦ３Ｒ２、Ｆ２Ｒ２であった。
また、Ｆ１Ｒ２、Ｆ２Ｒ１のプライマーの組合せについても、遺伝子増幅が高いものであったが、Ｆ１Ｒ２の場合、陰性となるべきＥＣプラスミドで陽性の電気泳動が示されたことから不適と判断した。図８に示されるように、Ｆ２Ｒ２、Ｆ３Ｒ２のプライマーの組み合わせでは陽性検体であるＴ１Ｄの検体で陽性を示さなかった。また、図９に示されるように、Ｆ２Ｒ１、Ｆ３Ｒ１の場合には、1型糖尿病患者サンプル（３９番）で陽性であったが、健常人（７番）でも陽性となった。更に検討の結果、電気泳動では陽性であったが、融解温度曲線の結果から、いずれも異なるものが増幅されていることが確認された。
なお、陽性サンプルと陰性サンプルのＣｑ値の差は、Ｆ３Ｒ１がＦ２Ｒ１よりも小さいことから、ＰＣＲの特異度はＦ３Ｒ１の方が優れていると考えられた。

（実施例４）第１段階でＦ３Ｒ１を使用し、第２段階でＦ１Ｒ１のプライマーの組合せを使用する、患者および健常者のｃｆＤＮＡのインスリン遺伝子評価
（１）患者および健常者のｃｆＤＮＡサンプル
ａ）健常人のｃｆＤＮＡ溶液
健常人２１名の血清から実施例１に準じてｃｆＤＮＡ溶液を作製した。
ｂ）成人１型糖尿病患者血清のｃｆＤＮＡ溶液
成人１型糖尿病患者５４名の血清から実施例１に準じてｃｆＤＮＡ溶液を作製した。
患者背景は男性/女性：１４／４０例、平均年齢：４６．９±１５．２才、罹病期間：１１．９±９．９年、ＨｂＡ１ｃ: ８．１±１．８％、血清Ｃペプチド０．５２±１．３３ｎｇ／ｍＬ、ＧＡＤ抗体：２６４３±１３９１０Ｕ／ｍＬ
ｃ）小児１型糖尿病患者のｃｆＤＮＡ溶液
徳島大学病院に通院中の小児１型糖尿病患者１０名の血清から実施例１に準じてｃｆＤＮＡ溶液を作製した。患者背景は男児/女児：７／３例、平均年齢：１２．５±６．０才、罹病期間：５．０±３．６年、HbA1c: ７．８±１．０％、血清Ｃペプチド１．４５±０．３２ｎｇ／ｍＬ、ＧＡＤ抗体：２２６±４２６Ｕ／ｍＬ
（２）方法
上記の各ｃｆＤＮＡを使用し、実施例２に準じて、ＡＲＭＳ法のＰＣＲ処理を行った。
まず、上記ｃｆＤＮＡ溶液（精製処理済み）１μＬと、ＰＣＲマスターミックス（ＦａｓｔＳｔａｒｔＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）１０μＬ、表１のプライマーミックス（５μＭｅａ．）１μＬ、無菌蒸留水８μＬを使用し、９５℃で１０分間処理した後、９５℃で１０秒、５６℃で１０秒、７２℃で１０秒の反応処理を１５回サイクル行った。

第１段階のＡＲＭＳ・ＰＣＲ増幅処理液（精製処理済み）１μＬ、ＰＣＲマスターミックス（ＦａｓｔＳｔａｒｔＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ）１０μＬ、表２のプライマーミックス（５μＭｅａ．）１μＬ、無菌蒸留水８μＬを使用し、９５℃で１０分間処理した後、９５℃で１０秒、５６℃で１０秒、７２℃で１０秒の反応処理を４０回サイクル行った。

（３）結果
図１０に示されるように、１型糖尿病患者の血清では、健常人の血清と比較すると、膵β細胞由来のインスリン遺伝子に基づくｃｆＤＮＡが血中に認められた。
最終的なＰＣＲを４０サイクル増幅していることから、ＰＣＲの元の溶液に１コピー陽性サンプルが存在すると理論上２８サイクルで陽性になる。従って、ＰＣＲ溶解波形解析で膵β細胞、ＣｐＧが膵β細胞と同じ配列をしたプラスミドと同じパターンを呈しているものを陽性とした。
成人１型糖尿病患者のサンプルでは、５４検体中４検体で強陽性、１７例で弱陽性で、シークエンス解析でこれら２１例の陽性のサンプル中１９例で陽性となった。これらシークエンス解析の結果から２回目のＰＣＲでは３５サイクル以下で陽性となることが示された。
小児１型糖尿病患者のサンプルでは１０検体中９検体で強陽性、１例で弱陽性となった。
一方、健常人のサンプルでは２１検体中１検体で強陽性、６検体で弱陽性となった。
以上の結果から、平均罹病期間の短く、残存インスリン分泌を表すとされる血中Cペプチド濃度の保たれている小児1型糖尿病検体で強陽性が多く、平均罹病期間の長く、血中Cペプチド濃度の低下した成人1型糖尿病検体で陽性例が少ないのは病態と反映していると考えられた。健常人でも陽性になるのは健常な膵β細胞のリニューアルに伴うもの、あるいは1型糖尿病前段階であることも否定できないが、循環血中に膵β細胞に由来するインスリン遺伝子を検出できるということは、高血糖に先行して膵β細胞が破壊されることを示すと考えられた。従って、本発明の検出方法により、全体の約80%以上の膵β細胞の破壊による高血糖前段階から膵β細胞傷害を検出できるということを示している。
以上のように、本発明のＡＲＭＳ法（第１段階でＦ３Ｒ１を使用し、第２段階でＦ１Ｒ１のプライマーの組合せを使用する方法）により、患者および健常者のｃｆＤＮＡから膵β細胞に由来するインスリン遺伝子を的確に検出し評価できることが明らかとなった。

本発明の膵β細胞由来のｃｆＤＮＡの検出方法により、１型糖尿病患者の早期発見が可能となり、早期治療が可能になった。しかも、本発明の検出方法では、膵β細胞の損傷改善の状況が確認できることから、１型糖尿病に対する治療の適合性を評価する方法としても使用できる。更には、膵臓あるいは膵島移植された１型糖尿病患者における移植後の膵β細胞傷害を評価できる指標として、本発明の検出方法を用いることができると考えられる。

Claims

被験者の血中ｃｆＤＮＡの中の膵β細胞由来のインスリン遺伝子の検出方法であって、
ａ）２段階のＡＲＭＳ−ＰＣＲ法でインスリン遺伝子エクソン２領域の遺伝子増幅を行い、
ｂ）第一段階で次のプライマーセットを使用し、
Ｆｏｒｗａｒｄ側：５‘−ＴＡＧＴＴＴＴＴＧＴＧＡＡＴＴＡＡＴＡＴＴＴＧＴＴＴＧ−３’（配列番号１）、
Ｒｅｖｅｒｓｅ側：５‘−ＣＣＴＡＣＡＡＡＴＣＣＴＣＴＡＣＣＴＣＣＧＡＡ−３’（配列番号２）、
ｃ）第二段階で次のプライマーセットを使用する
Ｆｏｒｗａｒｄ側：５‘−ＴＴＴＧＧＴＧＧＡＡＧＴＴＴＴＴＴＡＴＴＴＡＧＴＧＴＣＴＧ−３’（配列番号３）、
Ｒｅｖｅｒｓｅ側：５‘−ＡＡＴＣＴＴＡＡＡＴＡＴＡＴＡＡＡＡＡＡＡＡＣＣＴＧＡＴ−３’（配列番号４）、
ことを特徴とする、膵β細胞由来インスリン遺伝子の血中ｃｆＤＮＡの検出方法。
上記２段階のＡＲＭＳ−ＰＣＲ法に先立ち、インスリン遺伝子ｃｆＤＮＡのエクソン２領域（＋３０１〜＋４２９部分）の遺伝子増幅を次のプライマーセットで行う
Ｆｏｒｗａｒｄ側：５‘−ＡＧＴＴＧＴＡＧＴＴＴＴＴＧＴＧＡＡＴＴＡＡＴＡＴＴＴＧ−３’（配列番号５）、
Ｒｅｖｅｒｓｅ側：５‘−ＴＣＡＣＣＣＴＡＣＡＡＡＴＣＣＴＣＴＡＣＣ−３’（配列番号６）、
ことを特徴とする、請求項１に記載の膵β細胞由来インスリン遺伝子の血中ｃｆＤＮＡの検出方法。
第一段階のプライマーセットが、
Ｆｏｒｗａｒｄ側が少なくとも、５‘−ＡＡＴＴＡＡＴＡＴＴＴＧＴＴＴＧ−３’（配列番号７）の塩基配列であり、
Ｒｅｖｅｒｓｅ側が少なくとも、５‘−ＡＴＣＣＴＣＴＡＣＣＴＣＣＧＡＡ−３’（配列番号８）の塩基配列である、
第二段階のプライマーセットが、
Ｆｏｒｗａｒｄ側が少なくとも、５‘−ＴＴＴＴＡＴＴＴＡＧＴＧＴＣＴＧ−３’（配列番号９）の塩基配列であり、
Ｒｅｖｅｒｓｅ側が少なくとも、５‘−ＡＴＡＡＡＡＡＡＡＡＣＣＴＧＡＴ−３’（配列番号１０）の塩基配列である
ことを特徴とする、請求項１又は２に記載の膵β細胞由来インスリン遺伝子の血中ｃｆＤＮＡの検出方法。
２段階のＡＲＭＳ−ＰＣＲ法において、第一段階のＰＣＲを１５サイクルで行い、第二段階のＰＣＲを４０回で行うことを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の膵β細胞由来インスリン遺伝子の血中ｃｆＤＮＡの検出方法。
血中の膵β細胞由来のｃｆＤＮＡを検出するための２段階ＡＲＭＳ−ＰＣＲ法のプライマーセットであって、
ａ）第一段階のプライマーセットとして、
Ｆｏｒｗａｒｄ側が、５‘−ＴＡＧＴＴＴＴＴＧＴＧＡＡＴＴＡＡＴＡＴＴＴＧＴＴＴＧ−３’（配列番号１）の塩基配列であり、
Ｒｅｖｅｒｓｅ側が、５‘−ＣＣＴＡＣＡＡＡＴＣＣＴＣＴＡＣＣＴＣＣＧＡＡ−３’（配列番号２）の塩基配列である、
ｂ）第二段階のプライマーセットとして、
Ｆｏｒｗａｒｄ側が、５‘−ＴＴＴＧＧＴＧＧＡＡＧＴＴＴＴＴＴＡＴＴＴＡＧＴＧＴＣＴＧ−３’（配列番号３）の塩基配列であり、
Ｒｅｖｅｒｓｅ側が、５‘−ＡＡＴＣＴＴＡＡＡＴＡＴＡＴＡＡＡＡＡＡＡＡＣＣＴＧＡＴ−３’（配列番号４）の塩基配列である
ことを特徴とする、プライマーセット。
血中の膵β細胞由来のｃｆＤＮＡを検出するための２段階ＡＲＭＳ−ＰＣＲ法のプライマーセットであって、
ａ）第一段階のプライマーセットが、
Ｆｏｒｗａｒｄ側が少なくとも、５‘−ＡＡＴＴＡＡＴＡＴＴＴＧＴＴＴＧ−３’（配列番号７）の塩基配列であり、
Ｒｅｖｅｒｓｅ側が少なくとも、５‘−ＡＴＣＣＴＣＴＡＣＣＴＣＣＧＡＡ−３’（配列番号８）の塩基配列である、
ｂ）第二段階のプライマーセットが、
Ｆｏｒｗａｒｄ側が少なくとも、５‘−ＴＴＴＴＡＴＴＴＡＧＴＧＴＣＴＧ−３’（配列番号９）の塩基配列であり、
Ｒｅｖｅｒｓｅ側が少なくとも、５‘−ＡＴＡＡＡＡＡＡＡＡＣＣＴＧＡＴ−３’（配列番号１０）の塩基配列である
ことを特徴とする、プライマーセット。
血中の膵β細胞由来のｃｆＤＮＡを検出するために、ヒトインスリン遺伝子のエクソン２領域の遺伝子配列（＋３０１〜＋４２９）を増幅するためのプローブであって、
Ｆｏｒｗａｒｄ側：５‘−ＡＧＴＴＧＴＡＧＴＴＴＴＴＧＴＧＡＡＴＴＡＡＴＡＴＴＴＧ−３’（配列番号５）、
Ｒｅｖｅｒｓｅ側：５‘−ＴＣＡＣＣＣＴＡＣＡＡＡＴＣＣＴＣＴＡＣＣ−３’（配列番号６）、
であることを特徴とする、プライマーセット。
以下のａ）、ｂ）から、少なくともａ）を含む、血中の膵β細胞インスリン遺伝子由来のｃｆＤＮＡを検出方法するための試薬又はキット。
１）請求項５又は６に記載のプライマーセット
２）請求項７に記載のプライマーセット