JP4189495B2 - ゲノムdnaのメチル化検出方法 - Google Patents
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Description
(a) 被験ゲノムDNAと対照ゲノムDNAをそれぞれメチル化感受性制限酵素で消化してDNA断片を調製するステップ;
(b) 前記DNA断片の端部に結合するが、DNA断片との結合後に前記メチル化感受性制限酵素の認識配列を生成しないアダプターオリゴヌクレオチドを前記DNA断片の両端に結合させて[アダプター+DNA断片+アダプター]断片を調製するステップ;
(c) 前記[アダプター+DNA断片+アダプター]断片をPCR増幅するステップ;
(d) 増幅した[アダプター+DNA断片+アダプター]断片を、前記メチル化感受性制限酵素またはメチル化感受性制限酵素と同一の塩基配列を認識するメチル化非感受性制限酵素で消化して、[アダプター+DNA断片+アダプター]断片と、少なくとも一端にアダプターを持たないDNA断片を調製するステップ;
(e) 被験ゲノムDNAから得られた[アダプター+DNA断片+アダプター]断片をPCR増幅後あるいはPCR増幅中にシグナル特性αの標識物質で標識化し、対照ゲノムDNAから得られた[アダプター+DNA断片+アダプター]断片をPCR増幅後あるいはPCR増幅中にシグナル特性βの標識物質で標識化するステップ;および
(f) 前記[アダプター+DNA断片+アダプター]断片とハイブリダイズするプローブDNA断片を備えたマイクロアレイによって、被験ゲノムDNAから得られた[アダプター+DNA断片+アダプター]断片量と、対照ゲノムDNAから得られた[アダプター+DNA断片+アダプター]断片量とを比較するステップ、
を含む方法である。
(a') 被験ゲノムDNAと対照ゲノムDNAをそれぞれ、グループAに対するステップ(a)で使用するメチル化感受性酵素と同一の塩基配列を認識するメチル化非感受性制限酵素で消化してDNA断片を調製するステップ;
(b') 前記DNA断片の端部に結合するが、DNA断片との結合後に前記メチル化非感受性制限酵素の認識配列を生成しないアダプターオリゴヌクレオチドを前記DNA断片の両端に結合させて[アダプター+DNA断片+アダプター]断片を調製するステップ;
(c') 前記[アダプター+DNA断片+アダプター]断片をPCR増幅するステップ;
(d') 増幅した[アダプター+DNA断片+アダプター]断片を、前記メチル化非感受性制限酵素または前記メチル化感受性制限酵素で消化して、[アダプター+DNA断片+アダプター]断片を調製するステップ、
を行い、次いで以下のステップ:
(e') グループAの[アダプター+DNA断片+アダプター]断片をPCR増幅後あるいはPCR増幅中にシグナル特性αの標識物質で標識化し、グループBの[アダプター+DNA断片+アダプター]断片をPCR増幅後あるいはPCR増幅中にシグナル特性βの標識物質で標識化するステップ;および
(f') 前記[アダプター+DNA断片+アダプター]断片とハイブリダイズするプローブDNA断片を備えた一方のマイクロアレイによって、グループAとグループBのそれそれの被験ゲノムDNAから得られた[アダプター+DNA断片+アダプター]断片量を比較し、前記マイクロアレイと同一のプローブ構成からなる別のマイクロアレイによってグループAとグループBの対照ゲノムDNAから得られた[アダプター+DNA断片+アダプター]断片量を比較、さらに前者の比(A/B)と後者の比(A/B)を比較するステップ、
を含む方法である。
発明の定義
ステップ(a):
被験ゲノムDNAと対照ゲノムDNAをそれぞれメチル化感受性制限酵素で消化してDNA断片を調製する。
ステップ(b):
前記の各DNA断片の両端にアダプターオリゴヌクレオチドを結合させて[アダプター+DNA断片+アダプター]断片を調製する。
ステップ(c):
前記ステップ(C)で得られた各[アダプター+DNA断片+アダプター]断片をPCR増幅する。
ステップ(d):
増幅した各々の[アダプター+DNA断片+アダプター]断片を、前記メチル化感受性制限酵素またはメチル化感受性制限酵素と同一の塩基配列を認識するメチル化非感受性制限酵素で消化する。
ステップ(e):
ステップ(d)で得られた3種類の断片のうち、[アダプター+DNA断片+アダプター]断片のみをPCR増幅と標識化をおこなう。
ステップ(f):
被験ゲノムDNAから得られた[アダプター+DNA断片+アダプター]断片量と、対照ゲノムDNAから得られた[アダプター+DNA断片+アダプター]断片量とを比較する。
ステップ(a'):
被験ゲノムDNAと対照ゲノムDNAそれぞれのグループAに対しステップ(a)で使用するメチル化感受性酵素と同一の塩基配列を認識するメチル化非感受性制限酵素で消化してDNA断片を調製する。
ステップ(b'):
アダプターオリゴヌクレオチドを前記DNA断片の両端に結合させて[アダプター+DNA断片+アダプター]断片を調製する。
ステップ(c'):
前記[アダプター+DNA断片+アダプター]断片をPCR増幅する。このステップ(c')も基本的にグループAに対するステップ(c)と同一である。
ステップ(d'):
増幅した[アダプター+DNA断片+アダプター]断片を、前記メチル化非感受性制限酵素または前記メチル化感受性制限酵素で消化して、[アダプター+DNA断片+アダプター]断片を調製する。このステップ(d')も基本的にグループAに対するステップ(d)と同一である。ただしステップ(d)と同じ制限酵素で消化する方が好ましい。
ステップ(e'):
グループAの[アダプター+DNA断片+アダプター]断片を増幅後あるいは増幅中にシグナル特性αの標識物質で標識化し、グループBの[アダプター+DNA断片+アダプター]断片を増幅後あるいは増幅中にシグナル特性βの標識物質で標識化する。
ステップ(f'):
一方のマイクロアレイによって、グループAとグループBのそれそれの被験ゲノムDNAから得られた[アダプター+DNA断片+アダプター]断片量を比較し、前記マイクロアレイと同一のプローブ構成からなる別のマイクロアレイによってグループAとグループBの対照ゲノムDNAから得られた[アダプター+DNA断片+アダプター]断片量を比較する。そしてさらに前者の比(A/B)と後者の比(A/B)を比較する。
Claims (4)
- 被験ゲノムDNAが対照ゲノムDNAと比較してどの程度メチル化塩基を含んでいるかを検出する方法であって、以下のステップ:
(a) 被験ゲノムDNAと対照ゲノムDNAをそれぞれメチル化感受性制限酵素で消化してDNA断片を調製するステップ;
(b) 前記DNA断片の端部に結合するが、DNA断片との結合後に前記メチル化感受性制限酵素の認識配列を生成しないアダプターオリゴヌクレオチドを前記DNA断片の両端に結合させて[アダプター+DNA断片+アダプター]断片を調製するステップ;
(c) 前記[アダプター+DNA断片+アダプター]断片をPCR増幅するステップ;
(d) 増幅した[アダプター+DNA断片+アダプター]断片を、前記メチル化感受性制限酵素またはメチル化感受性制限酵素と同一の塩基配列を認識するメチル化非感受性制限酵素で消化して、[アダプター+DNA断片+アダプター]断片と、少なくとも一端にアダプターを持たないDNA断片を調製するステップ;
(e) 被験ゲノムDNAから得られた[アダプター+DNA断片+アダプター]断片をPCR増幅後あるいはPCR増幅中にシグナル特性αの標識物質で標識化し、対照ゲノムDNAから得られた[アダプター+DNA断片+アダプター]断片をPCR増幅後あるいはPCR増幅中にシグナル特性βの標識物質で標識化するステップ;および
(f) 前記[アダプター+DNA断片+アダプター]断片とハイブリダイズするプローブDNA断片を備えたマイクロアレイによって、被験ゲノムDNAから得られた[アダプター+DNA断片+アダプター]断片量と、対照ゲノムDNAから得られた[アダプター+DNA断片+アダプター]断片量とを比較するステップ、
を含む方法。 - 被験ゲノムDNAと対照ゲノムDNAそれぞれを2分割してグループAおよびグループBとし、被験ゲノムDNAと対照ゲノムDNAそれぞれのグループAには前記ステップ(a)から(d)を行い、被験ゲノムDNAと対照ゲノムDNAそれぞれのグループBに対しては、以下のステップ:
(a’) 被験ゲノムDNAと対照ゲノムDNAをそれぞれ、グループAに対するステップ(a)で使用するメチル化感受性酵素と同一の塩基配列を認識するメチル化非感受性制限酵素で消化してDNA断片を調製するステップ;
(b’) 前記DNA断片の端部に結合するが、DNA断片との結合後に前記メチル化非感受性制限酵素の認識配列を生成しないアダプターオリゴヌクレオチドを前記DNA断片の両端に結合させて[アダプター+DNA断片+アダプター]断片を調製するステップ;
(c’) 前記[アダプター+DNA断片+アダプター]断片をPCR増幅するステップ;
(d’) 増幅した[アダプター+DNA断片+アダプター]断片を、前記メチル化非感受性制限酵素または前記メチル化感受性制限酵素で消化して、[アダプター+DNA断片+アダプター]断片を調製するステップ、
を行い、次いで以下のステップ:
(e’) グループAの[アダプター+DNA断片+アダプター]断片をPCR増幅後あるいはPCR増幅中にシグナル特性αの標識物質で標識化し、グループBの[アダプター+DNA断片+アダプター]断片をPCR増幅後あるいはPCR増幅中にシグナル特性βの標識物質で標識化するステップ;および
(f’) 前記[アダプター+DNA断片+アダプター]断片とハイブリダイズするプローブDNA断片を備えた一方のマイクロアレイによって、グループAとグループBのそれそれの被験ゲノムDNAから得られた[アダプター+DNA断片+アダプター]断片量を比較し、前記マイクロアレイと同一のプローブ構成からなる別のマイクロアレイによってグループAとグループBの対照ゲノムDNAから得られた[アダプター+DNA断片+アダプター]断片量を比較、さらに前者の比(A/B)と後者の比(A/B)を比較するステップ
を含む請求項1の方法。 - 被験ゲノムDNAと対照ゲノムDNAが哺乳動物から単離されたゲノムDNAである請求項1または2の方法。
- メチル化感受性制限酵素とメチル化非感受性制限酵素の組合わせが、Hpa IIとMsp I、Ava IIとSin I、またはSau3A IとMbo IもしくはNde IIのいずれかである請求項3の方法。
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Publications (2)
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