CN115851916A

CN115851916A - 线粒体复合物ⅰ关键基因mt-nd6在系统性红斑狼疮诊断试剂盒中的应用

Info

Publication number: CN115851916A
Application number: CN202211607074.2A
Authority: CN
Inventors: 冯学兵; 孙凌云; 唐小军; 米合热阿依·阿布都克尤木
Original assignee: Nanjing Drum Tower Hospital
Current assignee: Nanjing Drum Tower Hospital
Priority date: 2022-12-14
Filing date: 2022-12-14
Publication date: 2023-03-28

Abstract

本发明公开了线粒体复合物Ⅰ关键基因MT‑ND6在系统性红斑狼疮诊断试剂盒中的应用，其生物标志物MT‑ND6的转录水平的表达量，其cDNA序列如SEQ ID No.1所示，本发明克服了系统性红斑狼疮基因诊断不能判断疾病活动性的缺陷，本发明采用实时荧光定量PCR的方法，具有快速、灵敏、准确等特点，通过实时荧光定量PCR检测MT‑ND6的表达，根据回归方程判断疾病的活动度，可为临床确诊疾病及判断疾病的危重情况提供重要的依据和参考价值，从而利于对该疾病的治疗方案的制定，具有普及和推广的应用价值。

Description

线粒体复合物Ⅰ关键基因MT-ND6在系统性红斑狼疮诊断试剂盒中的应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及线粒体复合物Ⅰ关键基因MT-ND6在系统性红斑狼疮诊断试剂盒中的应用。

背景技术

系统性红斑狼疮（SLE）是一种复杂的自身免疫性疾病，其临床发病源于遗传，临床表现为弥漫性结缔组织病，累及全身多系统，包括肾、皮肤、关节、神经系统、浆膜，是一类常见的致死致残的慢病疾病，如果能够在系统性红斑狼疮患者出现重要器官受累前进行早期诊断及疾病病情的评估对于系统性红斑狼疮的治疗，对改善患者的生活质量、提高患者生存率具有重大意义。

当前，临床上开展的系统性红斑狼疮相关诊断主要是自身抗体的检测，但是由于抗体的特异性及灵敏度不高，现有的血清中还没有较理想的指标。另外也有从DNA水平检测单核苷酸多态性，评价受试者罹患系统性红斑狼疮的风险，由于基因组比较稳定，检测结果不能够反应受试者目前疾病的状况。我们前期发现通过检测干扰素诱导基因的表达水平，可以用来诊断系统性红斑狼疮，但是干扰素诱导基因的表达水平并不随疾病活动性变化而改变。

近年来，越来越多证据表明，线粒体功能障碍在系统性红斑狼疮发病中的重要作用，包括影响线粒体DNA损伤、线粒体生物发生和能量代谢异常等； ND6全称为NADH-泛醌氧化还原酶6，该基因位于线粒体DNA中。ND6是线粒体L链上的唯一编码蛋白基因，编码的蛋白质为18kD，由172个氨基酸组成。是线粒体复合物Ӏ的关键成分；ND6的突变导致严重影响线粒体复合物Ӏ的活性、氧化损伤增加、改变线粒体形态等；目前的研究表明，系统性红斑狼疮患者存在线粒体功能障碍且线粒体DNA编码生物发生相关蛋白MT-ND6表达下降，这可能参与系统性红斑狼疮疾病发生且与疾病活动度存在相关性，可用于系统性红斑狼疮患者的诊断。

发明内容

为解决上述问题，本发明公开了目的在于克服目前系统性红斑狼疮基因诊断存在的不足，提供一种线粒体复合物Ⅰ关键基因MT-ND6在系统性红斑狼疮诊断试剂盒中的应用。

为达到上述目的，本发明的技术方案如下：

线粒体复合物Ⅰ关键基因MT-ND6在系统性红斑狼疮诊断试剂盒中的应用，其特征在于，所述线粒体NADH-泛醌氧化还原酶6（MT-ND6）的转录水平，所述MT-ND6基因名称包括MTND6、ND6、NU6M中的任意一种，所述MT-ND6基因位于线粒体12266-15887段，其转录后的cDNA序列如SEQ ID No.1所示：

SEQ ID No.1

CCTATTCCCCCGAGCAATCTCA ATTACAATAT ATACACCAAC AAACAATGTT CAACCAGTAACTACTACTAATCAACGCCCATAATCATACAAAGCCCCCGCACCAATAGGATCCTCCCGAATCAACCCTGACCCCTCTCCTTCATAAATTATTCAGCTTCCTACACTATTAAAGTTTACCACAACCACCACCCCATCATACTCTTTCACCCACAGCACCAATCCTACCTCCATCGCTAACCCCACTAAAACACTCACCAAGACCTCAACCCCTGACCCCCATGCCTCAGGATACTCCTCAATAGCCATCGCTGTAGTATATCCAAAGACAACCATCATTCCCCCTAAATAAATTAAAAAAACTATTAAACC CATATAACCTCCCCCAAAAT TCAGAATAAT AACACACCCG ACCACACCGCTAACAATCAATACTAAACCCCCATAAATAGGAGAAGGCTTAGAAGAAAACCCCACAAACCCCATTACTAAACCCACACTCAACAGAAACA AAGCATACATCAT。

进一步地，所述包括有用于扩增MT-ND6引物以及管家基因GAPDH引物，正常对照组样本，以及扩增试剂。

进一步地，所述各基因引物序列分别为：

MT-ND6-F：CCCCATGCCTCAGGATACTC；

MT-ND6-R：GGTGTGGTCGGGTGTGTTAT；

GAPDH-F：ATCCCATCACCATCTTCCAG；

GAPDH-R：GAGTCCTTCCACGATACCAA。

进一步地，所述试剂盒的使用具体包括以下步骤：

（1）分离受试者外周血单个核细胞；

（2）抽提受试者外周血单个核细胞总RNA；

（3）将总RNA逆转录成cDNA；

（4）特异性PCR引物实时定量PCR扩增受试者cDNA和标准品；

（5）分析检测结果。

PCR扩增的反应体系由以下组分组成：cDNA 1.0μl，PCR扩增试剂5μl，上游引物0.2μl，下游引物0.2μl，去核酸酶水3.6μl。

进一步地，所述实时荧光定量PCR扩增试剂预混料包括PCR缓冲液、dNTPs、高效Taq酶、Rox惰性参比染料以及去核酸酶水。

进一步地，所述实时荧光定量PCR扩增试剂预混料中的PCR缓冲液为 2×PCR缓冲液，所述2×PCR缓冲液包括20mM pH 8 .3的Tris-HCl、3mM Mg2+和100mM KCl。

所述通过实时荧光定量PCR技术检测MT-ND6的表达，取3次检测值的平均数计算荧光信号达到设定阈值时的循环数，减去管家基因GAPDH达到阈值的循环数的差值，再通过2-差异值计算MT-ND6的相对表达量，再用受试者的MT-ND6的相对表达值/正常对照样本的相对表达值，计算受试者的MT-ND6的表达标化值。

所述通过MT-ND6的相对表达量结合回归方程计算疾病的活动度。

所述的回归方程为，Y = -20.08*X + 15.41其中X为MT-ND6的表达标化值，Y为疾病的活动度。

本发明的有益效果为：

克服了系统性红斑狼疮基因诊断不能判断疾病活动性的缺陷,通过实时荧光定量PCR检测线粒体基因MT-ND6的相对表达量，结合回归方程，有助于系统性红斑狼疮患者的疾病诊断及疾病活动度的评价，可为临床对疾病的评估提供重要的依据和参考价值，从而利于该疾病的诊断及治疗，具有普及和推广应用的价值。

附图说明

图1本发明提供的线粒体关键基因MT-ND6基因水平结果示意图；

图2本发明提供的线粒体关键基因MT-ND6蛋白水平结果示意图；

图3为疾病对照组与系统性红斑狼疮组MT-ND6基因的表达水平；

图4本发明提供的检测MT-ND6的相对表达量与疾病活动度相关性及血沉相关性分析图；

图5为本发明提供的检测MT-ND6的相对表达量与患者24小时尿蛋白水平相关性图及合并与未合并狼疮性肾炎的患者MT-ND6相对表达量比较结果示意图；

图6本发明提供的检测MT-ND6的相对表达量与患者血清甘油三酯水平相关性分析图；

图7为本发明提供的检测MT-ND6的相对表达量的ROC曲线下的面积示意图；

图8本发明提供的检测MT-ND6的相对表达量联合抗Sm抗体及抗dsDNA抗体的ROC曲线。下的面积示意图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式，进一步阐明本发明，应理解下述具体实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1：基因的确定与引物优化

根据前期研究确定与系统性红斑狼疮诊断及疾病活动度相关的基因为MT-ND6，通过循环往复的大量试验，并结合模板量、引物的Tm值进行优化。

1.确定扩增MT-ND6的引物和扩增管家基因GAPDH的引物：

具体引物序列经序列表（MT-ND6: SEQ ID NO. 2-3; GAPDH: SEQ ID. NO.4-5）

MT-ND6-F：CCCCATGCCTCAGGATACTC；SEQ ID NO. 2-3

MT-ND6-R：GGTGTGGTCGGGTGTGTTAT；

GAPDH-F：ATCCCATCACCATCTTCCAG；SEQ ID. NO.4-5

GAPDH-R：GAGTCCTTCCACGATACCAA。

2. 待测样本处理：清晨空腹静息状态下以EDTA静脉真空一次性血常规采血管（石家庄康卫仕医疗器械有限公司）采集静脉全血2-3ml，随即应用总RNA提取试剂盒（南京诺唯赞生物科技有限公司）提取RNA，再以逆转录试剂盒（南京诺唯赞生物科技有限公司）逆转录为cDNA, 储存于-70℃备用；

3. 实时荧光定量PCR：将备检的cDNA加入384孔板，1μl/孔，分别加入MT-ND6和管家基因GAPDH引物，再加入扩增试剂（南京诺唯赞生物科技有限公司），共10μl，置入QuantStudio™ 6 Flex实时荧光定量PCR检测系统（美国Applied Biosystems）进行PCR反应，每个基因反应重复3次，扩增条件为95℃预变性30秒，之后95℃变性10秒、60℃变性30秒，共进行40循环反应；

4. 数据分析：通过QuantStudio™ 6 Flex（美国Applied Biosystems）获取MT-ND6和管家基因GAPDH表达的Ct值，计算3次重复的平均值。以MT-ND6基因Ct值减去管家基因GAPDH的Ct值，计算两者差异值，再通过2-差异值计算MT-ND6的相对表达量。

所述扩增试剂包括预混有PCR缓冲液、dNTPs、高效Tag酶以及Rox惰性参比染料和去核酸酶水；反应体系由以下组分组成：cDNA 1.0μl，PCR扩增试剂5μl，上游引物0.2 μl，下游引物0.2μl，去核酸酶水3.6μl。通过实时定量PCR技术检测MT-ND6和GAPDH的表达，取3次检测值的平均数计算荧光信号达到设定阈值时的循环数，减去管家基因GAPDH达到设定阈值时的循环数计算差异值，再通过2-差异值计算MT-ND6的相关表达值。

所述通过计算MT-ND6相对表达值进行结果判断，但值小于等于0.5034时，诊断为系统性红斑狼疮，其敏感性和特异性分别为93.75%和87.1%；当MT-ND6的相对表达值小于0.5034时，代入疾病活动度评价回归方程：Y = -20.08*X + 15.41（其中X为MT-ND6的相关表达值，Y为疾病的活动度）计算疾病的活动度。

实施例2

比较系统性红斑狼疮患者与正常人群和其他自身免疫病患者MT-ND6的相对表达量。

分别采集正常人、系统性红斑狼疮患者和其他自身免疫病患者血样，按实施例1获取MT-ND6相对表达值。与正常人和其他自身免疫患者相比，系统性红斑狼疮患者的MT-ND6的相对表达量表达显著低于正常组（P＜0.0001，参照图1所示），而其他自身免疫病与正常组差异较小或者没有显著差异，参照图3所示；从蛋白水平分析，western blot结果显示系统性红斑狼疮组MT-ND6蛋白水平显著低于健康对照组，参照图2所示，与MT-ND6 mRNA水平的结果一致。

分析MT-ND6的相对表达量与受试者的疾病活动度的相关性。

采用系统性红斑狼疮疾病活动度评分（SLE disease activity index-2000, SLEDAI 2000）评价系统性红斑狼疮患者的疾病活动度，根据标准进行中枢神经系统、循环系统、泌尿系统、运动系统、结缔组织、皮肤及免疫系统的评分，计算各分项的总分：0~4分为基本无活动、5~9分为轻度活动、10~14分中度活动，而≥15分为重度活动。将受试者的MT-ND6基因的相对表达量与系统性红斑狼疮疾病活动度SLE DAI 2000进行线性相关性分析，结果显示MT-ND6相对表达量与SLE DAI 2000评分结果存在显著相关性，且呈显著负相关（P=0.0012 r=-0.554）参照图4所示，且分析得，MT-ND6的相对表达量与患者血沉水平呈显著负相关（P=0.0152 r=-0.462）

3．系统性红斑狼疮组中不同临床特征患者外周血MT-ND6表达的比较及相关性分析。

根据系统性红斑狼疮患者病历资料收集以下临床特征资料：是否合并LN、呼吸系统、泌尿系统、血液系统及皮肤受累。LN由24小时尿蛋白定量或者随机尿检尿蛋白+++、血尿及管型尿等指标诊断。呼吸系统的表现主要是胸膜炎、胸腔积液、慢性间质性肺病及肺动脉高压。血液系统受累的表现包括溶血性贫血、白细胞及血小板减少等。皮肤受累的表现包括颊部红斑、盘状红斑及光过敏。

结果显示，系统性红斑狼疮组合并狼疮性肾炎（LN）的患者MT-ND6的相对表达量显著低于未合并LN的患者（P=0.0403）参照图5所示；且将系统性红斑狼疮组患者MT-ND6的相对表达量与24小时尿蛋白进行线性相关性分析，结果呈显著负相关（P=0.042 r=-0.569）参照图5所示；而其余血液系统受累与血液系统未受累、皮肤受累与皮肤未受累以及有其他临床指标的患者相比，MT-ND6的相对表达没有明显差异。以上结果表明，MT-ND6在狼疮发病尤其是有肾脏累及时的临床诊断和疾病活动评价中可能具有一定的价值。

而有报道MT-ND6的表达水平与高脂血症有一定的相关性，因此，我们同时分析了收集患者样本中甘油三酯等高脂血症的主要临床指标与MT-ND6基因相对表达量的相关性，发现没有显著相关，参照图6所示。

实施例3

1．MT-ND6相对表达量在诊断系统性红斑狼疮的敏感性和特异性研究

与对照组相比，系统性红斑狼疮的ROC曲线分析AUC为0.9553，标准误为0.01672，在截断值为0.5034时，特异性为87.1%，敏感性为93.75%，有显著意义（P＜0.0001），参照图7所示。

MT-ND6的相对表达量联合自身抗体在诊断系统性红斑狼疮的敏感性和特异性研究

绘制系统性红斑狼疮组抗Sm抗体的ROC工作曲线，分析的系统性红斑狼疮组抗Sm抗体的AUC为0.8000。MT-ND6联合抗Sm抗体的AUC为0.9952.在截断值为0.5658时，特异性为93.62%，敏感性为100%，参照图8所示。

同理得抗dsDNA抗体的AUC为0.6872。MT-ND6联合抗dsDNA抗体的AUC为0.9952。在截断值为0.5658时，特异性为93.62%，敏感性为100%，参照图8所示。

需要说明的是，以上内容仅仅说明了本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰均落入本发明权利要求书的保护范围之内。

Claims

1.线粒体复合物Ⅰ关键基因MT-ND6在系统性红斑狼疮诊断试剂盒中的应用，其特征在于，所述线粒体NADH-泛醌氧化还原酶6，即MT-ND6的转录水平，所述MT-ND6基因位于线粒体12266-15887段，其转录后的cDNA序列如SEQ ID No.1所示。

2.如权利要求1所述的线粒体复合物Ⅰ关键基因MT-ND6在系统性红斑狼疮诊断试剂盒中的应用，其特征在于，包括有用于扩增MT-ND6特异性引物和管家基因GAPDH特异性引物，所述MT-ND6特异性引物正向和反向序列序列如SEQ ID No.2-3所示，所述管家基因GAPDH特异性引物正向和反向序列如SEQ ID No.4-5所示。

3.如权利要求1-2任意一项所述线粒体复合物Ⅰ关键基因MT-ND6在系统性红斑狼疮诊断试剂盒中的应用，其特征在于，所述应用测定受试者外周血单个核细胞中MT-ND6的转录水平。