CN109136359B - 鉴别诊断NOA患者睾丸内残存精子的试剂及piRNA在其中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及piRNA在制备诊断NOA患者是否存在睾丸内残存精子的试剂中的应用；还涉及一种用于诊断NOA患者是否存在睾丸内残存精子的试剂和试剂盒。将所述piRNA作为分子标志物，通过检测其表达水平来诊断NOA患者睾丸内是否存在精子，从而预先判断NOA患者通过micro‑TESE等方法手术取精成功率，可避免大约60％左右的NOA患者进行不必要的外科手术和睾丸创伤，具有较大的社会效益和经济效益。
Description
技术领域
本发明涉及人类生殖健康领域，更特别地，涉及piRNA在制备诊断NOA患者是否存在睾丸内残存精子的试剂中的应用，还涉及用于诊断NOA患者是否存在睾丸内残存精子的试剂和试剂盒。
背景技术
不孕不育是一类常见的生殖疾病，在育龄夫妇中的发病率约为15％。男性不育症中，最严重的一类是无精子症，约占育龄男性人口的1％。在所有导致男性的不育病因中，精子发生障碍是最为常见的因素，也是成年男性生殖健康面临的最主要威胁之一。精子发生障碍是一个多因素、多阶段的过程，主要临床表现为射出精液中精子密度的降低，按WHO标准可分为少精子症、无精子症等(WHO定义的无精子症为：三次精液常规分析，显微镜检查精液标本未见精子，经3000g离心15min，仍无精子)。其中非梗阻性无精子症(non-obstructive azoospermia，NOA)约占无精子症的60％，梗阻性无精子症(obstructiveazoospermia,OA)约占40％。
piRNA是一类小分子非编码单链RNA，长约24-32个核苷酸，于2006年在小鼠睾丸内发现并分离出来，因其能与Piwi蛋白家族成员结合发生相互作用，故称为Piwiinteracting RNAs，简称piRNAs。piRNA来源于单链RNA前体，普遍分布在整个基因组上，但具有高度的不连续性,5′端多具有尿嘧啶偏向性、多分布于动物生殖细胞和胚胎干细胞内,多数位于基因间隔区,少数分布在基因内含子和外显子中的特点。piRNA的生物功能多种多样,主要体现在沉默转座子、阻碍转录翻译、调节生育能力和影响遗传信息传递等方面。新近的一些研究发现，人精浆中存在多种piRNA，精浆piRNA主要是以游离于微囊泡之外的形式存在，游离的精浆piRNA与蛋白结合维持着精浆信使RNA(mRNA)的稳定性,而精浆piRNA表达谱的改变则有助于了解男性不育症的病理过程和可能的发病机制。
有研究发现，大约30～40％NOA患者睾丸组织中还残存有少量的“局灶性”精子发生，可以找到少量睾丸内残存精子，并借助于辅助生殖技术生育自己的遗传学后代。因此，目前对于NOA的处理方法主要是通过外科睾丸显微取精术(micro-dissection testicularsperm extraction,micro-TESE)配合辅助生殖技术(assisted reproductivetechnology，ART)来达到生育自己遗传学后代的目的。
然而，迄今报道的micro-TESE获取精子成功率大约只有40％左右，其原因在于，大部分NOA患者的睾丸生精小管中没有精子。micro-TESE手术需要切开睾丸并分离睾丸组织查找极为少量的具有一定精子发生能力的生精小管，对睾丸组织的创伤相对较大，可能破坏睾丸的血供，甚至形成瘢痕粘连，严重时甚至可能导致术后睾丸萎缩。对于没有睾丸内残存精子的NOA患者而言，进行micro-TESE手术显然不利于患者的身体健康。
然而，迄今尚无手术前预判睾丸内残存精子的非损伤性检测指标，也没有使用piRNA作为NOA患者睾丸内残存精子的预判指标的任何报道。
由于大部分NOA的病因尚不清楚，还缺乏有效的治疗手段。大多数NOA病人只能盲目选择micro-TESE和辅助生殖技术，这会给大部分病人造成不必要的身体上的伤害、心理上和经济上的负担。能否术前预判NOA患者睾丸睾丸内残存精子是本领域亟待解决的问题，也是精准医疗的发展方向。
因此，需要找到非损伤性、高灵敏性以及高特异性的生物学标志物，这些新的标志物及其指标变化可以作为NOA患者micro-TESE能否找到精子的预判指标。
发明内容
发明人在研究过程中发现，在具有睾丸内残存精子的NOA患者的睾丸组织和精浆中一些特殊的piRNA的表达水平与没有睾丸内残存精子的NOA患者之间具有显著性差异，这一发现使得进行无创伤性地预判NOA患者睾丸内是否存在精子成为可能，从而预先判断NOA患者通过micro-TESE等方法手术取精成功率。
基于以上发现，本发明提供了piRNA在制备诊断NOA患者是否存在睾丸内残存精子的试剂中的应用。
由于这样的piRNA的表达水平在存在睾丸内残存精子的NOA患者与不存在睾丸内残存精子的NOA患者之间具有显著差异，所以，可将这些piRNA作为分子标志物，通过检测其精浆中表达水平来诊断NOA患者睾丸内是否存在精子，从而预先判断NOA患者通过micro-TESE等方法手术取精成功率，可避免大约60％左右的NOA患者进行不必要的外科手术和睾丸创伤，具有较大的社会效益和经济效益。
在一个优选实施方案中，所述piRNA为以下piRNA中的任一种或多种组合：hsa-piR-20830、hsa-piR-4731、has-piR-6254、has-piR-419、hsa-piR-7152、hsa-piR-7548、hsa-piR-5026、has-piR-14195、has-piR-11482、hsa-piR-17765、hsa-piR-17102、hsa-piR-6113、hsa-piR-13248、hsa-piR-6128、hsa-piR-18535、hsa-piR-938、hsa-piR-456、hsa-piR-17100、hsa-piR-9201、hsa-piR-11873、hsa-piR-2051、hsa-piR-7051。
本发明还提供了一种用于诊断NOA患者是否存在睾丸内残存精子的试剂，所述试剂为piRNA的表达水平的检测剂。
在一个优选实施方案中，所述piRNA为以下piRNA中的任一种或多种组合：hsa-piR-20830、hsa-piR-4731、has-piR-6254、has-piR-419、hsa-piR-7152、hsa-piR-7548、hsa-piR-5026、has-piR-14195、has-piR-11482、hsa-piR-17765、hsa-piR-17102、hsa-piR-6113、hsa-piR-13248、hsa-piR-6128、hsa-piR-18535、hsa-piR-938、hsa-piR-456、hsa-piR-17100、hsa-piR-9201、hsa-piR-11873、hsa-piR-2051、hsa-piR-7051。在一个实施方案中，所述试剂为所述piRNA的检测引物或探针。
piRNA的表达水平可以通过PCR的方法来检测，也可通过探针来检测。虽然本发明的实施例中仅列举了PCR的方法，但这仅仅是用于示范性的目的，并非用于限制本发明的范围。本领域技术人员可使用任何本领域已知或未来开发的方式来检测piRNA的表达水平，这些方法中使用的检测试剂都应落在本发明的保护范围内。
在一个优选实施方案中，所述试剂为所述piRNA中的检测引物对，所述检测引物对由所述piRNA中的一种的特异性正向引物和通用反向引物组成，所述试剂为所述piRNA中的检测引物对，所述检测引物对由所述piRNA中的一种的特异性正向引物和通用反向引物组成，hsa-piR-20830、hsa-piR-4731、has-piR-6254、has-piR-419、hsa-piR-7152、hsa-piR-7548、hsa-piR-5026、has-piR-14195、has-piR-11482、hsa-piR-17765、hsa-piR-17102、hsa-piR-6113、hsa-piR-13248、hsa-piR-6128、hsa-piR-18535、hsa-piR-938、hsa-piR-456、hsa-piR-17100、hsa-piR-9201、hsa-piR-11873、hsa-piR-2051、hsa-piR-7051的特异性正向引物序列依次如SEQ ID NO:23-44所示，所述通用反向引物根据加尾PCR法涉及引物时所加的序列来涉及，例如，本文的实施例中根据加尾法所加的序列设计的通用反向引物序列如SEQ ID NO:46所示。
本发明还提供了一种用于诊断NOA患者是否存在睾丸内残存精子的试剂盒，所述试剂盒包含上述用于诊断NOA患者是否存在睾丸内残存精子的试剂。
在一个优选实施方案中，所述试剂盒包含分别检测：hsa-piR-20830、hsa-piR-4731、has-piR-6254、has-piR-419、hsa-piR-7152、hsa-piR-7548、hsa-piR-5026、has-piR-14195、has-piR-11482、hsa-piR-17765、hsa-piR-17102、hsa-piR-6113、hsa-piR-13248、hsa-piR-6128、hsa-piR-18535、hsa-piR-938、hsa-piR-456、hsa-piR-17100、hsa-piR-9201、hsa-piR-11873、hsa-piR-2051、hsa-piR-7051中的一个或多个的表达水平的检测剂。
在一个优选实施方案中，所述试剂盒包含分别检测hsa-piR-5026、hsa-piR-6254、hsa-piR-17765和hsa-piR-11482的表达水平的检测剂。
在一个优选实施方案中，还包含内参的检测剂，所述内参为在具有睾丸内残存精子的NOA患者精浆中的表达水平与没有睾丸内残存精子的NOA患者精浆中的表达水平之间均没有差异的标志物。例如，hsa-miR-16。
附图说明
图1为分别使用下一代测序(Next Generation Sequencing,NGS)RNA-seq和RT-qPCR检测到的22种piRNA中的11种在存在睾丸内残存精子的NOA患者睾丸组织中的表达量相对于无睾丸内残存精子的NOA患者睾丸组织中表达量的倍数统计图；
图2为分别使用下一代测序(Next Generation Sequencing,NGS)RNA-seq和RT-qPCR检测到的22种piRNA中的另外11种在存在睾丸内残存精子的NOA患者睾丸组织中的表达量相对于无睾丸内残存精子的NOA患者睾丸组织中表达量的倍数统计图；
图3为hsa-piR-5026、hsa-piR-6254、hsa-piR-17765和hsa-piR-11482在不同睾丸组织样本中的表达量统计图；A组睾丸未找到精子组,B组代表睾丸找到精子组；
图4为hsa-piR-5026、hsa-piR-6254、hsa-piR-17765和hsa-piR-11482在不同精浆样本中的表达量的统计图；A组代表睾丸未找到精子组,B组代表睾丸找到精子组，C组代表正常人组；
图5为存在睾丸内残存精子的NOA患者和无睾丸内残存精子NOA患者精浆中hsa-piR-5026、hsa-piR-6254、hsa-piR-17765和hsa-piR-11482的表达量四分位数评分的受试者工作特征曲线图(receiver operating characteristic curve,简称ROC曲线)。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
1.样本采集与分组
所有睾丸组织标本来自华中科技大学同济医学院生殖医学中心，研究通过伦理委员会审议批准并征得患者知情同意。micro-TESE手术找到精子组的睾丸组织标本为NOA患者已经在本生殖医学中心通过辅助生殖技术治疗生育正常后代之后的多余废弃睾丸组织，未找到精子组的睾丸组织标本为在本生殖医学中心进行micro-TESE手术后未找到精子的废弃睾丸组织。根据micro-TESE是否获得精子，将NOA患者分为两组：A组为未找到精子组，B组为找到精子组，收集两组的废弃的睾丸组织和精液样品，快速冷冻并储存在液氮中。此外，还采集了40例正常人的精液样品为C组，作为对照。
A组：NOA患者micro-TESE术中未找到精子组(5例睾丸组织进行非编码小RNA高通量测序并且RT-qPCR验证，20例NOA患者精浆RT-qPCR验证)，A组患者满足以下条件：年龄在22至34岁间；男性不育一年以上；除无精子症之外无其它全身性疾病；三次射精精液经离心无精子，精浆生化指标以及生殖系统彩色超声检查排除梗阻性病因；micro-TESE术中未找到睾丸内残存精子。
B组：NOA患者micro-TESE手术中找到精子组(5例睾丸组织进行非编码小RNA高通量测序并且采用RT-qPCR验证，20例NOA患者精浆RT-qPCR验证)，B组的患者满足以下条件：年龄在22至34岁间；男性不育一年以上；除无精子症之外无其它全身性疾病；三次射精精液经离心无精子，精浆生化指标以及生殖系统彩色超声检查排除梗阻性病因；micro-TESE术中找到睾丸内残存精子。
C组：健康生育男性精浆样本对照组，满足以下条件：年龄在22至30岁间；无生殖和内分泌系统疾病；无全身其他疾病；性功能正常；三次精液分析质量正常；至少已经生育一胎。
2.piRNA文库构建
分别从A组和B组的睾丸组织中提取总RNA，用Nanodrop仪器(美国Thermo公司)对所提取的总RNA定量并质检，分别加3’和5’接头，通过RT-PCR扩增，电泳回收145-160bp的目的条带，即得到piRNA文库。
3.RNA-Seq高通量测序筛选差异piRNA
Qubit(美国invitrogen公司)定量piRNA文库，用Start cBot仪器进行簇生成，然后用Hiseq2500(美国illumnia公司)进行测序。
结果如图1和2所示，以下piRNA在两组间的表达具有极其显著的差异，而且读序数(reads)大于1500：hsa-piR-20830、hsa-piR-4731、has-piR-6254、has-piR-419、hsa-piR-7152、hsa-piR-7548、hsa-piR-5026、has-piR-14195、has-piR-11482、hsa-piR-17765、hsa-piR-17102、hsa-piR-6113、hsa-piR-13248、hsa-piR-6128、hsa-piR-18535、hsa-piR-938、hsa-piR-456、hsa-piR-17100、hsa-piR-9201、hsa-piR-11873、hsa-piR-2051、hsa-piR-705。这些piRNA的序列如表1所示。
表1 22条piRNA的序列
| piRNA名称 | piRNA序列 |
| hsa-piR-20830 | GUUUGAGCUGGACCUCGAAAGAUGGC(SEQ ID NO:1) |
| hsa-piR-4731 | UCCUGGGCUGUUUUCUCAUAGAAGAGGAUC(SEQ ID NO:2) |
| has-piR-6254 | UGAAACCGGAAGCAGAAGCUGAGUGUGGU(SEQ ID NO:3) |
| has-piR-419 | ACCGGAAGCAGAAGCUGAGUGUGGUGAGU(SEQ ID NO:4) |
| hsa-piR-7152 | UGACCGAUCCUUUUCACUCUGAAUGAUUUU(SEQ ID NO:5) |
| hsa-piR-7548 | UGAGACUCAACUGGGCCUGUAGCUACUGGU(SEQ ID NO:6) |
| has-piR-14195 | UGGGUAAUGGUGACAUUGUGGGCUCACGGCA(SEQ ID NO:7) |
| hsa-piR-5026 | UCGGAAACGUAAUGGUAGAUCAGCUA(SEQ ID NO:8) |
| has-piR-11482 | UGCUACUGUAAGGGUAAAGGGGUAACUGGG(SEQ ID NO:9) |
| hsa-piR-17765 | UUCCUGGUCUGGCCACAUUUGACUGUGUC(SEQ ID NO:10) |
| hsa-piR-17102 | CUCGUUCCCACGCUAGUGCAGGUUGGACAGCA(SEQ ID NO:11) |
| hsa-piR-6113 | UCUUGGGAAAUGCAACAUUUGGGCAGGAAA(SEQ ID NO:12) |
| hsa-piR-13248 | UGGCCUAGGAUGUGGCUAGAGAACGGA(SEQ ID NO:13) |
| hsa-piR-6128 | UCUUGUAAAGAAACGUCUUGUGCUCUCUGU(SEQ ID NO:14) |
| hsa-piR-18535 | UUGGUCUCAGGUGAAAUGGUGUCUGACCAC(SEQ ID NO:15) |
| hsa-piR-938 | AGGAUGUGUUUAGAGAGCUGAUUGGAACA(SEQ ID NO:16) |
| hsa-piR-456 | ACCUGUUGCUGACUACAAGAGAUGAGAGU(SEQ ID NO:17) |
| hsa-piR-17100 | CUCGUUCCCACGCGAGUACAGGUUGGACAGCA(SEQ ID NO:18) |
| hsa-piR-9201 | CAGGUUCCGAUGCGAGUACAGGUUGGACAGCA(SEQ ID NO:19) |
| hsa-piR-11873 | UGCUGGGACUGGUAGCAUGAAUGCUGUGUA(SEQ ID NO:20) |
| hsa-piR-20511 | GGGUAAUGGUGACAUUGUGGGCUCACGGC(SEQ ID NO:21) |
| hsa-piR-7051 | UGACAUUAGAAAACUGGUUGGGAGAUAGUGC(SEQ ID NO:22) |
4.RT-qPCR方法测量验证睾丸组织piRNA表达量
针对以上22个piRNA，运用加尾PCR法，设计引物对A组和B组的睾丸组织进行piRNA的定量qRT-PCR检测,以hsa-miR-16为内参(该piRNA在研究中被确定在A和B两组未发生差异表达)。
1)提取总RNA，反转录成cDNA；
2)取cDNA进行RT-qPCR反应，检测引物如表2所示，以hsa-miR-16为内参。其中，检测引物包括针对各piRNA的特异性上游引物和通用反向引物。每条piRNA均采用由针对该piRNA的特异性上游引物和通用反向引物构成的引物对进行扩增。
结果如图1和2所示，这22条piRNA在两组间均有极显著差别。可见这22条piRNA的表达情况可用作诊断NOA患者的睾丸组织中是否具有睾丸内残存精子，从而评价这样的患者是否适合进行手术睾丸取精结合辅助生殖技术来生育自己的后代。
选取hsa-piR-5026、hsa-piR-6254、hsa-piR-17765和hsa-piR-11482，对qRT-PCR测定的这四种piRNA在A组和B组的睾丸组织中的表达量进行统计，并用A组的表达量对B组的表达进行归一化，结果如图2所示，这四种piRNA在B组中相对于在A组中的表达倍数均高于3倍，因此，
表2 22条piRNA和内参piRNA的正向引物和通用反向引物的序列
5.NOA患者射出精浆的piRNA表达量的稳定性分析
为了研究方便，发明人从以上22条piRNA中取了4条，分别为：hsa-piR-5026、hsa-piR-6254、hsa-piR-17765和hsa-piR-11482。对40例成年男性NOA患者精浆(20例找到精子，20例未找到精子)中的这4条piRNA水平的稳定性进行评价，以hsa-miR-16为内参。引物见表2。
1)提取精浆的总RNA，反转录成cDNA；
2)取cDNA进行RT-qPCR反应，检测引物如表2所示，以hsa-miR-16为内参。其中，检测引物包括针对各piRNA的特异性正向引物和通用反向引物。每条piRNA均采用由针对该piRNA的特异性正向引物和通用反向引物构成的引物对进行扩增。
结果如图4所示，这4个piRNA在精浆中的水平也具有极其显著的组间差异，且差异水平较稳定。
6.使用组合piRNA诊断NOA患者睾丸是否存在精子
ROC曲线是根据一系列不同的二分类方式(分界值或决定阈)，以真阳性率(灵敏度)为纵坐标，假阳性率(1-特异度)为横坐标绘制的曲线。ROC曲线下的面积值在1.0和0.5之间。在AUC>0.5的情况下，AUC越接近于1，说明诊断效果越好。AUC在0.5～0.7时有较低准确性，AUC在0.7～0.9时有一定准确性，AUC在0.9以上时有较高准确性。AUC＝0.5时，说明诊断方法完全不起作用，无诊断价值。AUC<0.5不符合真实情况，在实际中极少出现。发明人通过对micro-TESE找到精子组和未找到精子组精浆样品中的多个piRNA表达水平的进行分析，以找到精子组piRNA表达量的四分位数为阈值，并将所述多个piRNA表达水平的得分相加，进一步求得总得分，以此绘制R0C曲线来评估预测的灵敏性和特异性，进而评估这所述多个piRNA表达对micro-TESE能否找到精子评估能力。根据其中4条piRNA组合的ROC曲线以及分层评分法，我们得出初步的预判参考值为8分(图5),提示该标志物组合具备鉴别有无生精位点的预判价值。下文中，将以4条piRNA的组合(hsa-piR-5026、hsa-piR-6254、hsa-piR-17765和hsa-piR-11482)实例验证。
根据hsa-piR-5026、hsa-piR-6254、hsa-piR-17765和hsa-piR-11482这4个标志物的表达水平分别进行评分。按表达量的四分位数分为0分、1分、2分、3分。对20例确认具有睾丸内残存精子的NOA患者和20例确认没有睾丸内残存精子的患者进行四分位数评分并求和，结果如表3所示。四分位数评分法的方法如下：针对每个piRNA，将其在A组的20个精浆样本和B组的20精浆样本中表达量2-Δct值从小到大排列，分别找出其四分位数Q1，Q2和Q3作为评分标准，然后评估其在每个样本表达量2-Δct值，小于Q1，记为0分，Q1-Q2记为1分，Q2-Q3记为2分，大于等于Q3记为3分，其他三个piRNA同此，然后将这四个piRNA在同一样本中的评分求和，得到该标志物组合对该样本能否找到精子的评价。
表3具有睾丸内残存精子的NOA患者和没有睾丸内残存精子的患者的四分位数分层评分统计表
根据得分判断其分组，高分组基本可判定为NOA患者具有睾丸内残存精子组，低分组基本可判定为NOA患者不具有睾丸内残存精子组；比较而言，≥8分为高分，≤4分为低分。
需要说明的是这个评分值是初步评估参考值，需要未来进一步大样本的临床验证。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华中科技大学同济医学院
<120> 鉴别诊断NOA患者睾丸内残存精子的试剂及piRNA在其中的应用
<130> 1
<160> 46
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 26
<212> RNA
<213> 人
<400> 1
guuugagcug gaccucgaaa gauggc 26
<210> 2
<211> 30
<212> RNA
<213> 人
<400> 2
uccugggcug uuuucucaua gaagaggauc 30
<210> 3
<211> 29
<212> RNA
<213> 人
<400> 3
ugaaaccgga agcagaagcu gaguguggu 29
<210> 4
<211> 29
<212> RNA
<213> 人
<400> 4
accggaagca gaagcugagu guggugagu 29
<210> 5
<211> 30
<212> RNA
<213> 人
<400> 5
ugaccgaucc uuuucacucu gaaugauuuu 30
<210> 6
<211> 30
<212> RNA
<213> 人
<400> 6
ugagacucaa cugggccugu agcuacuggu 30
<210> 7
<211> 31
<212> RNA
<213> 人
<400> 7
uggguaaugg ugacauugug ggcucacggc a 31
<210> 8
<211> 26
<212> RNA
<213> 人
<400> 8
ucggaaacgu aaugguagau cagcua 26
<210> 9
<211> 30
<212> RNA
<213> 人
<400> 9
ugcuacugua aggguaaagg gguaacuggg 30
<210> 10
<211> 29
<212> RNA
<213> 人
<400> 10
uuccuggucu ggccacauuu gacuguguc 29
<210> 11
<211> 32
<212> RNA
<213> 人
<400> 11
cucguuccca cgcuagugca gguuggacag ca 32
<210> 12
<211> 30
<212> RNA
<213> 人
<400> 12
ucuugggaaa ugcaacauuu gggcaggaaa 30
<210> 13
<211> 27
<212> RNA
<213> 人
<400> 13
uggccuagga uguggcuaga gaacgga 27
<210> 14
<211> 30
<212> RNA
<213> 人
<400> 14
ucuuguaaag aaacgucuug ugcucucugu 30
<210> 15
<211> 30
<212> RNA
<213> 人
<400> 15
uuggucucag gugaaauggu gucugaccac 30
<210> 16
<211> 29
<212> RNA
<213> 人
<400> 16
aggauguguu uagagagcug auuggaaca 29
<210> 17
<211> 29
<212> RNA
<213> 人
<400> 17
accuguugcu gacuacaaga gaugagagu 29
<210> 18
<211> 32
<212> RNA
<213> 人
<400> 18
cucguuccca cgcgaguaca gguuggacag ca 32
<210> 19
<211> 32
<212> RNA
<213> 人
<400> 19
cagguuccga ugcgaguaca gguuggacag ca 32
<210> 20
<211> 30
<212> RNA
<213> 人
<400> 20
ugcugggacu gguagcauga augcugugua 30
<210> 21
<211> 29
<212> RNA
<213> 人
<400> 21
ggguaauggu gacauugugg gcucacggc 29
<210> 22
<211> 31
<212> RNA
<213> 人
<400> 22
ugacauuaga aaacugguug ggagauagug c 31
<210> 23
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
gtttgagctg gacctcgaa 19
<210> 24
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
tcctgggctg ttttctcat 19
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
tgaaaccgga agcagaagc 19
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
accggaagca gaagctgag 19
<210> 27
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
tgaccgatcc ttttcactc 19
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<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
tgagactcaa ctgggcctg 19
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
tgggtaatgg tgacattgtg 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
tcggaaacgt aatggtagat 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
tgctactgta agggtaaagg 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 32
ttcctggtct ggccacattt 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 33
ctcgttccca cgctagtgca 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
tcttgggaaa tgcaacattt 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
tggcctagga tgtggctaga 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
tcttgtaaag aaacgtcttg 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
ttggtctcag gtgaaatggt 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
aggatgtgtt tagagagctg 20
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
acctgttgct gactacaaga 20
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
ctcgttccca cgcgagtaca 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
caggttccga tgcgagtaca 20
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
tgctgggact ggtagcatga 20
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<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
gggtaatggt gacattgtgg 20
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
tgacattaga aaactggttg 20
<210> 45
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
tagcagcacg taaatattgg cg 22
<210> 46
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 46
gctgtcaacg atacgctacg t 21
Claims (5)
1.piRNA在制备诊断NOA患者是否存在睾丸内残存精子的试剂中的应用，所述piRNA为以下piRNA的组合：hsa-piR-5026、has-piR-6254、hsa-piR-17765和has-piR-11482，其中hsa-piR-5026的序列如SEQ ID NO:8 所示，has-piR-6254的序列如 SEQ ID NO:3所示，hsa-piR-17765的序列如SEQ ID NO:10 所示，has-piR-11482的序列如SEQ ID NO:9 所示。
2.一种用于诊断NOA患者是否存在睾丸内残存精子的试剂，其特征在于，所述试剂为piRNA的表达水平的检测剂，其中，所述试剂为所述piRNA的检测引物或探针，所述piRNA为以下piRNA的组合：hsa-piR-5026、has-piR-6254、hsa-piR-17765和has-piR-11482。
3.根据权利要求2所述的试剂，其特征在于，所述试剂为所述piRNA的检测引物对，所述检测引物对由所述piRNA的特异性正向引物和通用反向引物组成。
4.一种用于诊断NOA患者是否存在睾丸内残存精子的试剂盒，其特征在于，包含如权利要求2或3所述的试剂。
5.根据权利要求 4所述的试剂盒，其特征在于，还包含内参的检测剂，所述内参为在具有睾丸内残存精子的NOA患者精浆中的表达水平与没有睾丸内残存精子的NOA患者精浆中的表达水平之间均没有差异的标志物， 所述标志物为hsa-miR-16。
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Applications Claiming Priority (1)
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