CN113832142A - 粪便人类基因组dna提取方法及应用 - Google Patents

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CN113832142A CN202111222154.1A CN202111222154A CN113832142A CN 113832142 A CN113832142 A CN 113832142A CN 202111222154 A CN202111222154 A CN 202111222154A CN 113832142 A CN113832142 A CN 113832142A
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Abstract

本发明涉及产量高且重复性好的粪便人类基因组DNA提取方法、两种DNA甲基化标志物的同步检测和数据分析算法、及临床应用。本发明公开了一种粪便人类基因组DNA提取方法，包括以下步骤：粪便样本的采集，粪便样本的保存，粪便样本的处理，粪便样本的DNA提取。本发明还提供了利用粪便DNA样本进行的粪便DNA含量测定法，以及利用粪便DNA样本进行的粪便DNA甲基化检测法。本发明具有更好的灵敏度和特异性。

Description

粪便人类基因组DNA提取方法及应用
技术领域
本发明涉及粪便人类基因组DNA提取方法及应用。
背景技术
结直肠癌(colorectal cancer，CRC)是目前世界上最常见的恶性肿瘤之一。在中国，结直肠癌的发病率和死亡率呈逐年上升趋势。而结直肠癌患者生存期的长短与初诊时间有着直接的关系。在疾病早期阶段，结直肠癌患者的平均五年生存率可达90％以上，而在晚期转移性疾病中，五年生存率不到5％。研究表明，结直肠癌通常是由腺瘤发展为腺癌的过程，而这种发展过程是由基因和表观遗传改变积累而引起的。从腺瘤进展到癌可能需要十几年时间，这为早期发现结直肠癌提供了机会。因此，大规模的筛查将有助于结直肠癌患者的早期诊断和及时治疗。
目前有越来越多的检测措施用于结直肠癌的早期筛查和诊断。结肠镜是目前诊断的金标准，但其检测成本较高且具有侵入性，并有出血、穿孔等并发症，患者对结肠镜的接受程度较低，因而难以进行大规模开展。而非侵入性的筛查方法有愈创木酚粪隐血试验和粪便免疫化学实验，但其敏感性和特异性较低，易出现误诊和漏诊。
基于粪便的分子检测是近年来发展起来的一种无创检测结直肠癌的新技术。近年来一些研究表明DNA甲基化发生在癌症的早期阶段，因此对粪便中DNA甲基化标志物的研究为结直肠癌的诊断提供一种可能。美国精准医学公司研发的ColoGuard粪便检测试剂盒通过检测NDRG4和BMP3甲基化，并联合KRAS突变和血红蛋白实验来对结直肠癌进行早期筛查，其对美国结直肠癌人群筛查的敏感性和特异性分别为92.3％和86.8％。其他粪便甲基化标志物例如SDC2、TFPI2、SFRP等也被报道过可以作为结直肠癌筛查的潜在标志物。
然而，基于粪便DNA的甲基化检测目前仍面临着众多挑战，包括粪便DNA提取技术及DNA稳定性方面的优化。粪便中的DNA大部分来源于细菌和正常细胞。结肠粘膜剥落细胞的DNA仅占粪便总DNA的0.1％～0.01％。而结肠中的肿瘤细胞仅占剥落细胞的1％，在疾病的早期阶段，肿瘤细胞就更少了。同时，细菌DNA酶也会降解一部分DNA。另外，粪便中的降解物质、抑制物和食物残渣的存在都会影响下游检测方法PCR的扩增效率。因此，从粪便中获得最大产量的人类基因组DNA对于提高结直肠癌的筛查灵敏度是至关重要的。
在实际应用中也存在很多难题，由于粪便材料的特殊性，样本采集及处理方法的不同都可能会影响粪便DNA的提取结果。目前应用较多的粪便处理方法为直接刮取粪便固体，即用刀片刮取粪便固体的表面用于后续DNA的提取，但是由于粪便是不均一的物质，随机刮取所获的DNA产量重复性较差，受取材部位影响较大，且难以控制，存在较大的随机性。
从粪便中提取DNA的方法多种多样，目前市场上也有粪便DNA提取试剂盒，主要分为两大类，一类是以硅胶膜柱结合法，另一类是磁珠结合法。硅胶膜柱结合法在提取的过程中DNA与硅胶膜的接触面积有限，而且易发生堵塞。磁珠结合法则在溶液中DNA与磁珠结合的时间和面积都比较充分。目前已有研究表明磁珠结合法提取的粪便总DNA产量要高于硅胶膜柱结合法提取。但是这两种方法所提取的粪便DNA产量并没有在人类基因组DNA水平进行产量的比较和评估。
粪便DNA在结直肠癌的临床应用上，目前应用较多的是对粪便DNA甲基化的检测。广州市康立明生物科技有限责任公司发明的两种基于粪便的肠癌诊断试剂盒，一种是NDRG4基因甲基化检测试剂，其对结直肠癌检测的敏感性仅65.2％，特异性为97.8％(CN105543378 A)，另一种是SDC2基因甲基化检测试剂，其对结直肠检测的敏感性为87％，而特异性为98％(CN 105543354 B)。其对结直肠癌的检测仅包含单一基因，而结直肠癌的发生发展是由多个基因共同发生变化的结果，联合多个基因对结直肠癌进行检测可能会提高结直肠癌的检测效果。
发明内容
本发明要解决的问题是提供一种产量高且重复性好的粪便人类基因组DNA提取方法、两种DNA甲基化标志物的同步检测和数据分析算法、及临床应用。
本发明首先利用保存液对粪便先进行均质化，之后离心取上清溶液并采用磁珠结合法来进行DNA提取，该提取方法重复性好，且人类基因组DNA占比和纯度显著高于现有的方法。临床的应用采用联合SDC2基因和NDRG4基因DNA甲基化对结直肠癌粪便样本进行甲基化定量检测，同时采用线性回归模型将两个基因的检测结果进行合并处理，得到一个敏感性和特异性较高的结直肠癌检测模型。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种粪便人类基因组DNA提取方法，包括步骤一的粪便样本的采集以及步骤二的粪便样本的保存，还包括如下步骤：
步骤三、粪便样本的处理：
3.1)、对于低温冷冻保存(≤-80℃)的粪便样本储存液，先置于冰上充分解冻，然后将解冻后的粪便样本涡旋混匀(使粪便保存液与粪便充分均质化)，得到均质化后的粪便样本；
对于冷藏保存(0～4℃)的粪便样本，直接涡旋混匀(使粪便保存液与粪便充分均质化)，得到均质化后的粪便样本；
3.2)、将均质化后的粪便样本于常温下5000±500rpm条件下离心10±1min，取上清溶液；
步骤四、粪便样本的DNA提取
采用磁珠结合法提取粪便DNA，对上清溶液进行粪便DNA的提取；获得粪便DNA样本。
说明：此步骤可按照敏基TM基因组DNA提取试剂盒(粪便版)(购自南科征途，Cat.No.A181206)试剂盒的操作步骤，上清溶液的用量为0.2mL。
作为本发明的粪便人类基因组DNA提取方法的改进，所述步骤一的粪便样本的采集为：
收集1-10g新鲜粪便(刚脱离人体的粪便)作为样本放入粪便采集管中，并加入用于保存粪便的保存液，保存液与粪便体积比为1±0.1:1，得粪便样本储存液；
所述粪便保存液为：0.5mol/L Tris，0.15mol/L EDTA，0.01mol/L NaCl，余量为水；pH 9.0。
作为本发明的粪便人类基因组DNA提取方法的进一步改进，所述步骤二的粪便样本的保存为以下任一：
低温冷冻保存法：将采集好的粪便样本储存液立即放入≤-80℃冷冻保存；
冷藏保存：将采集好的粪便样本在冷藏(≤4℃，一般为0～4℃)条件下保存，并在采集时起的1h以内进行后续的步骤三。
本发明还提供了利用上述粪便DNA样本进行的粪便DNA含量测定法，包括以下步骤：
1)、粪便DNA样本含量测定：
采用微量紫外分光光度计对粪便DNA样本(提取的粪便总基因组)进行浓度和纯度的测定；
2)、采用实时荧光定量PCR方法对粪便人类基因组DNA含量进行测定，包括以下步骤：
2.1)、获取人类基因组DNA，并通过琼脂糖凝胶电泳进行DNA完整性鉴定和微量紫外分光光度计进行浓度和纯度的测定；
2.2)、利用已知浓度的组织人类基因组DNA进行梯度系列稀释制备获得人类基因组DNA标准品(例如稀释成25pg/μL、100pg/μL、500pg/μL、2000pg/μL和5000pg/μL)，并将系列稀释的组织人类基因组DNA标准品和粪便DNA样本同时进行实时荧光定量PCR；
依据系列稀释的人类基因组DNA标准品的CT值和对应的DNA浓度做标准曲线，得到标准曲线公式；依据标准曲线公式和粪便DNA样本的CT值，得到粪便样本的人类基因组DNA的浓度。
说明：将系列稀释的人类基因组DNA标准品和粪便DNA样本的实时荧光定量PCR方法的阈值定为相同。
作为本发明的粪便DNA含量测定法的改进：
实时荧光定量PCR方法中人类基因组DNA采用NQO1区域进行引物和探针的设计：
Figure BDA0003313013710000041
所述的实时荧光定量PCR法中探针5'端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团，所述的荧光报告基团选自VIC，所述荧光猝灭基团选自MGB；
PCR体系包括引物对、探针、PCR扩增反应液和DNA样本(1μL)，各引物的终浓度为300nM，探针的终浓度为100nM，PCR扩增反应液KAPA PROBE FAST qPCR Master Mix；
PCR方法的反应条件为：采用实时荧光定量PCR仪，95℃变性3min；95℃变性3s，60℃退火30s和72℃延伸30s，45个循环；
依据系列稀释的人类基因组DNA标准品的CT值和对应的DNA浓度做标准曲线，得到标准曲线公式Y＝-3.401X+38.818，X值为测定样本浓度的log10值，Y值为测定样本的CT值。
说明：R2为0.989，扩增效率为96.8％。
本发明还同时提供了利用上述粪便DNA样本进行的粪便DNA甲基化检测法，包括以下步骤：
1)、将粪便DNA样本采用亚硫酸盐转化试剂进行转化处理，得亚硫酸盐转化后的粪便DNA样本；
2)、对亚硫酸盐转化后的粪便DNA样本进行甲基化特异性实时荧光定量PCR扩增反应；
3)、粪便DNA的甲基化检测结果分析。
作为本发明的粪便DNA甲基化检测法的改进：
所述步骤3)中：将甲基化特异性实时荧光定量PCR扩增反应的靶基因和内参基因的阈值定为相同，内参基因的CT值高于阈值，本次检测有效；若内参基因的CT值低于阈值，视为本次检测无效。
作为本发明的粪便DNA甲基化检测法的进一步改进：所述步骤2)为：
所述的甲基化特异性实时荧光定量PCR扩增反应的靶基因为SDC2基因和/或NDRG4基因，同时包含内参基因ACTB，其引物和探针如下：
Figure BDA0003313013710000042
Figure BDA0003313013710000051
所述的探针5'端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团，所述的靶基因荧光报告基团选自FAM，所述的内参基因荧光报告基团选自VIC，所述荧光猝灭基团均选自MGB；
所述甲基化特异性实时荧光定量PCR扩增体系包括所述引物对、探针和PCR扩增反应液，靶基因各引物的终浓度为250nM，探针的终浓度为100nM，内参基因各引物的终浓度为60nM，探针的终浓度为50nM。
所述甲基化特异性实时荧光定量PCR扩增条件为：采用实时荧光定量PCR仪，95℃变性3min；95℃变性3s，60℃退火30s和72℃延伸30s，45个循环：
所述步骤3)为：
在检测有效的情况下，SDC2基因的甲基化水平定义为内参基因的CT值与SDC2基因的CT值的差值，即ΔCT(SDC2)＝CT(ACTB)-CT(SDC2)；NDRG4基因的甲基化水平定义为内参基因的CT值与NDRG4基因的CT值的差值，即ΔCT(NDRG4)＝CT(ACTB)-CT(NDRG4)；同时采用线性回归模型对两个靶基因的检测结果进行整合，获得新的检测模型，可以定量粪便DNA甲基化水平，即为y＝0.392*ΔCT(SDC2)+0.318*ΔCT(NDRG4)+3.096。
本发明，具体技术方案如下：
一、粪便人类基因组DNA提取方法
按照以下步骤进行：
步骤一、粪便样本的采集
人排出粪便后，立即收集1-10g新鲜粪便样本放入粪便采集管中，并加入用于保存粪便的保存液，保存液与粪便体积比为1:1，得粪便样本储存液；
所述粪便采集管来自SARSTEDT公司，规模76*20mm，货号80.734.311。
所述粪便保存液成分为0.5mol/L Tris，0.15mol/L EDTA，0.01mol/L NaCl，余量为水；pH 9.0。
步骤二、粪便样本的保存
采用低温保存法，将采集好的粪便样本储存液立即放入-80℃冰箱冷冻保存。
实际操作时，也可直接将采集好的粪便样本在低温(≤4℃，一般为0～4℃)条件下立即(1h以内)送达实验室进行处理。
步骤三、粪便样本的处理
(1)对于-80℃所保存的粪便样本储存液，置于冰上，充分解冻，将解冻后的粪便样本涡旋混匀，使粪便保存液与粪便充分均质化，得到均质化后的粪便样本；
对于立即送达的粪便样本(≤4℃)，充分涡旋混匀，使粪便保存液与粪便充分均质化，得到均质化后的粪便样本；
(2)将均质化后的粪便样本常温5000rpm条件下离心10min，保留上清溶液，去除沉淀，吸取0.2mL上清溶液用于粪便DNA的提取。也可吸取更大体积的上清溶液用于粪便DNA的提取。
步骤四、粪便样本的DNA提取
采用磁珠结合法提取粪便DNA，按照敏基TM基因组DNA提取试剂盒(粪便版)(购自南科征途，Cat.No.A181206)试剂盒的操作步骤，对0.2mL上清溶液进行粪便DNA的提取；获得粪便DNA样本。
步骤五、粪便DNA样本含量测定
(1)采用微量紫外分光光度计对提取的粪便总基因组(粪便DNA样本)进行浓度和纯度的测定。
(2)采用实时荧光定量PCR方法对粪便人类基因组DNA含量进行测定。
首先，所述的人类基因组DNA标准品来自组织样本。使用QIAamp DNA Mini Kit(货号51304或51306)进行DNA提取。提取步骤按照试剂盒说明书进行。获得的组织人类基因组DNA通过琼脂糖凝胶电泳进行DNA完整性鉴定和微量紫外分光光度计进行浓度和纯度的测定。
其次，利用已知浓度的组织人类基因组DNA进行梯度系列稀释制备为人类基因组DNA标准品，稀释成25pg/μL、100pg/μL、500pg/μL、2000pg/μL和5000pg/μL，并将系列稀释的组织人类基因组DNA标准品和粪便DNA样本同时进行实时荧光定量PCR方法。
所述的实时荧光定量PCR方法中人类基因组DNA采用NQO1区域进行引物和探针的设计，其序列如下表1：
表1
Figure BDA0003313013710000061
Figure BDA0003313013710000071
所述的实时荧光定量PCR方法中探针5'端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团，所述的荧光报告基团选自VIC，所述荧光猝灭基团选自MGB。
所述的实时荧光定量PCR方法中包括上述引物对、探针、PCR扩增反应液和DNA样本，各引物的终浓度为300nM，探针的终浓度为100nM，DNA样本为系列稀释的人类基因组DNA标准品和粪便DNA样本均加入1μL。
即，PCR体系为下表2：
表2
Figure BDA0003313013710000072
所述的实时荧光定量PCR方法的反应条件为：采用实时荧光定量PCR仪，95℃变性3min；95℃变性3s，60℃退火30s和72℃延伸30s，45个循环。
人类基因组DNA含量测定结果分析如下：
将系列稀释的人类基因组DNA标准品和粪便DNA样本的实时荧光定量PCR方法的阈值定为相同，依据系列稀释的人类基因组DNA标准品的CT值和对应的DNA浓度做标准曲线，得到标准曲线公式；依据标准曲线公式和粪便DNA样本的CT值，得到粪便样本的人类基因组DNA的浓度。
所得结果如下：
依据系列稀释的人类基因组DNA标准品的CT值和对应的DNA浓度做标准曲线，得到标准曲线公式Y＝-3.401X+38.818，X值为测定样本浓度的log10值，Y值为测定样本的CT值，R2为0.989，扩增效率为96.8％
标准曲线结果如图4和下表3所述。
表3
Figure BDA0003313013710000081
注：每个样品重复3次
步骤六、粪便DNA的临床应用
将粪便提取的含DNA的溶液(即，步骤四所得的粪便DNA样本)进行亚硫酸盐转化，采用亚硫酸盐转化试剂(EZ DNA Methylation-Gold TM Kit，货号D5007)；
所述的亚硫酸盐转化试剂包括亚硫酸盐溶液、结合液、脱硫溶液、洗涤液和洗脱液；由试剂盒中提供，按其说明书进行操作；
其中亚硫酸盐溶液：NaHSO4 3.6M，对苯二酚0.1-1mM，pH 5.5；现配现用；
结合液：4-6M盐酸胍；
脱硫溶液：NaCl 0.1-0.5M，NaOH 0.1-0.5M，MOPS 5-50mM，乙醇30-50％，pH10.0-11.0；
洗涤液：NaCl 0.1-0.5M，MOPS 5-50mM，Tris 5-50mM，乙醇70％，pH 7.0；
洗脱液：无核酸酶水或者TE缓冲液中的一种；
具体转化过程按试剂盒说明书进行操作。
(1)粪便DNA的甲基化检测
对亚硫酸盐转化后的粪便DNA样本进行甲基化特异性实时荧光定量PCR扩增反应。
所述的甲基化特异性实时荧光定量PCR扩增反应的靶基因为SDC2基因和/或NDRG4基因，同时包含内参基因ACTB，其引物和探针的序列如下表4：
表4
Figure BDA0003313013710000091
所述的探针5'端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团，所述的靶基因荧光报告基团选自FAM，所述的内参基因荧光报告基团选自VIC，所述荧光猝灭基团均选自MGB。
所述的甲基化特异性实时荧光定量PCR扩增反应试剂包括上述引物对、探针和PCR扩增反应液，靶基因各引物的终浓度为250nM，探针的终浓度为100nM，内参基因各引物的终浓度为60nM，探针的终浓度为50nM。
即，PCR体系为下表5：
表5
Figure BDA0003313013710000092
Figure BDA0003313013710000101
说明：
SDC2的正、反引物混合为10uM“SDC2 Primer Mix”，探针为10uM“SDC2 Probe”；NDRG4的正、反向引物混合为10uM“NDRG4 Primer mix”，探针为10uM NDRG4 Probe；ACTB的正、反向共两条引物混合为10uM“ACTB Primer mix”,探针为10uM“ACTB Probe”。所述的甲基化特异性实时荧光定量PCR扩增反应的反应条件为：采用实时荧光定量PCR仪，95℃变性3min；95℃变性3s，60℃退火30s和72℃延伸30s，45个循环。
粪便DNA的甲基化检测结果分析：
将甲基化特异性实时荧光定量PCR扩增反应的靶基因和内参基因的阈值定为相同，内参基因的CT值高于阈值，本次检测有效；若内参基因的CT值低于阈值，视为本次检测无效。在检测有效的情况下，SDC2基因的甲基化水平定义为内参基因的CT值与SDC2基因的CT值的差值，即ΔCT(SDC2)＝CT(ACTB)-CT(SDC2)；NDRG4基因的甲基化水平定义为内参基因的CT值与NDRG4基因的CT值的差值，即ΔCT(NDRG4)＝CT(ACTB)-CT(NDRG4)；同时采用线性回归模型对两个靶基因的检测结果进行整合，获得新的检测模型，可以定量粪便DNA甲基化水平，即为y＝0.392*ΔCT(SDC2)+0.318*ΔCT(NDRG4)+3.096。
本发明技术方案具有如下技术优势：
1、本发明通过对粪便样本均质化，离心取上清的粪便处理方法用于后续DNA的提取，此处理方法所获得的粪便DNA具有较高的重复性。在18例志愿者进行两次从粪便处理到粪便DNA提取的重复性提取，两次提取结果的log2值离散度要比直接刮取粪便固体处理所得的DNA结果的离散度要小(图1D；图2D)。
2、本发明通过对粪便样本均质化，离心取上清的粪便处理方法用于后续DNA的提取，此提取方法所获得的粪便DNA产量和纯度均高于均质化后离心取沉淀所获得的DNA产量。在18例志愿者中，无论后续采用硅胶膜柱结合法或磁珠结合法，采用上清所提取的总DNA要明显低于采用沉淀所提取的总DNA(图2A)，而在人类基因组DNA产量上，两者没有显著性差异(图2B)，在人类基因组DNA与总DNA的比值上，上清所提取的比值明显高于沉淀所提取的比值(图2C)，上清所获得的DNA纯度较高，其人类基因组DNA占比较大，更利于后续基于人类基因组DNA的临床应用检测。
3、本发明通过采用均质化后获得的上清溶液进行样本处理和磁珠结合法进行DNA提取，所获得的粪便总DNA和人类基因组DNA产量明显高于硅胶膜柱结合法。在18例志愿者中，上清溶液采用磁珠结合法提取的总DNA浓度中位数为26.07μg/g粪便，范围为13.11-132.18μg/g粪便(图2A)，人类基因组DNA中位数为476.19ng/g粪便，范围为12.25-92922ng/g粪便(图2B)，而同样的上清溶液采用硅胶膜柱结合法提取的总DNA浓度中位数为11.07μg/g粪便，范围为5.03-65.03μg/g粪便(图2A)，人类基因组DNA中位数为151,61μg/g粪便，范围为0-26,780μg/g粪便(图2B)。
4、本发明所采用实时荧光定量PCR方法是采用NQO1基因，其引物和探针是针对人类基因组DNA的特异性区域设计的序列，能够准确对人类基因组DNA进行定量，经过验证其扩增效率可达到96.8％。
5、本发明所取得的粪便DNA在亚硫酸盐转化后，能够成功进行甲基化基因和/或内参基因的扩增。
因此，根据本发明的技术方案，能获得以下总结性结论：
1、粪便直接刮取法中，加入磁珠相较于无磁珠，DNA提取效果好；
2、粪便均质法中，上清液相较于沉淀，DNA提取提取效果好；
3、DNA提取，硅胶膜柱结合法人类基因组DNA产量高，磁珠结合法DNA产量稳定；
4、本发明利用自行设计的NQO1基因引物和探针构建标准曲线，应用于粪便多种复杂的DNA背景中检测人类基因组DNA；本发明设定的SDC2引物和探针，NDRG4探针及内参基因ACTB的引物和探针，用于检测粪便人类基因组DNA的肿瘤的甲基化标志物。
5、本发明中，肠癌甲基化标志物SDC2和NDRG4基因联合使用评估甲基化水平，相较于单个基因评估甲基化水平，具有更好的灵敏度和特异性。
综上所述，本发明的粪便DNA临床应用是采用甲基化特异性实时荧光定量PCR技术，通过定量检测SDC2基因和DNRG4基因的甲基化水平，并通过线性回归模型将两个靶基因的甲基化水平进行整合，建立一个新的结直肠癌检测模型，在33例结直肠癌和16例健康人粪便样本的检测中，其敏感性可达81.81％，特异性可达93.75％，ROC曲线下面积可达0.913(图3)，保证了临床检测性能的要求。而下游分析所需要的正是高产量的人类基因组DNA，并且需要较少的菌基因组等背景的干扰。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1直接刮取粪便固体提取的粪便DNA产量的评估；
图1中：
A：SoCC提取的总DNA高于SoC(P<0.01)；
B：SoCC提取出的hgDNA高于SoC(P≤0.001)；
C：SoCC和SoC两种提取方法的hgDNA/总DNA比值无显著性差别；
D：SoCC方法两次提取粪便DNA评估，hgDNA/总DNA,hgDNA，总DNA的log2值四分位数间距(P75-P25)进行比较；
SoCC：直接刮取的粪便加陶瓷珠处理所提取的粪便DNA的产量；
SoC：直接刮取的粪便不加陶瓷珠处理所提取的粪便DNA的产量；
**p<0.01；配对样本秩和检验。
图2均质化粪便样本提取的粪便DNA产量的评估；
图2中：
A：均质化后的粪便样本离心后的沉淀，PeM方法提取的总DNA高于PeC(P<0.05)；均质化后的粪便样本离心后的上清，SuM方法提取的总DNA高于SuC(P<0.01)；同时，PeC方法提取的总DNA高于SuC(P<0.01)，PeM方法提取的总DNA高于SuM(P<0.01)；
B：均质化后的粪便样本离心后的沉淀，PeM方法提取的hgDNA与PeC无显著性差异；均质化后的粪便样本离心后的上清，SuM方法提取的hgDNA高于SuC(P<0.01)；同时，SuM方法提取的hgDNA高于PeC；
C：均质化后的粪便样本hgDNA/总DNA水平比值，SuC方法高于PeC方法(P<0.01)SuM方法高于PeM方法(P<0.01)；
D：SuM方法两次提取粪便DNA评估，hgDNA/总DNA,hgDNA，总DNA的log2值四分位数间距(P75-P25)进行比较；
E：SuC方法两次提取粪便DNA评估，hgDNA/总DNA,hgDNA，总DNA的log2值四分位数间距(P75-P25)进行比较；
PeC：均质化后的粪便样本离心取沉淀，进行硅胶膜柱结合法提取粪便DNA；
PeM：均质化后的粪便样本离心取沉淀，进行磁珠结合法提取粪便DNA；
SuC：均质化后的粪便样本离心取上清，进行硅胶膜柱结合法提取粪便DNA；
SuM：均质化后的粪便样本离心取上清，进行磁珠结合法提取粪便DNA；
*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001；配对样本秩和检验。
图3为靶基因在粪便样本中的甲基化水平；
图3中：
A：结直肠癌患者的SDC2和NDRG4两个基因的甲基化水平均高于健康人(P≤0.001)；
B：SDC2、NDRG4及包含这两个基因的逻辑回归模型在结直肠癌患者的粪便样本中甲基化水平的ROC曲线分析。
图4为根据人基因组DNA标准品绘制的标准曲线。经分析可得，标准曲线公式为Y＝-3.401X+38.818，X值为测定样本浓度的log10值，Y值为测定样本的Cq值，R2为0.989，扩增效率为96.8％。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：
在本文提供的本技术的实施方案的开发过程中，进行试验评估了直接刮取粪便固体对粪便样本产量的影响。本发明分别对直接刮取的粪便固体进行了加和不加陶瓷珠的处理，陶瓷珠会增加粪便样本的均质化。
1.1粪便样本的收集
1.1.1健康人粪便样本的收集：无肠癌家族史、肠癌疾病史的健康人群粪便样本5例；
1.1.2结直肠癌患者粪便样本收集：取临床上后经肠镜及细胞学鉴定为结直肠癌患者的粪便样本11例；
1.1.3肠息肉患者粪便样本收集：取临床上后经肠镜及细胞学鉴定为肠息肉患者的粪便样本5例；
1.1.4人排出粪便后，立即收集1-10g新鲜粪便样本放入粪便采集管中，并加入粪便保存液，保存液与粪便体积比为1:1。
所述粪便采集管来自SARSTEDT公司，规模76*20mm，货号80.734.311。
所述粪便保存液成分为0.5mol/L Tris,0.15mol/L EDTA and 0.01mol/L NaCl,pH 9.0。
1.2粪便样本的保存
采用低温冷冻保存法：将采集好的粪便样本立即放入-80℃冰箱冷冻保存。
1.3粪便样本的处理
1.3.1从-80℃冰箱中取出粪便样本，置于冰上；
1.3.2用刀片刮去粪便表面冰冻的粪便保存液，暴露出粪便实性固体；
1.3.3用刀片随机刮取200mg粪便固体于2mL Eppendorf管中，刮取另一200mg粪便固体于另一2mL的涡旋专用样本管(购自杭州奥盛仪器有限公司)中，并加入3颗2.8mm陶瓷珠。
1.4粪便DNA的提取
在上述的2mL Eppendorf管，置于涡旋振荡器上充分涡旋混匀；作为SoC实验组；
在上述的涡旋专用样本管中加入3颗3mm陶瓷珠，并置于生物样本均质器Bioprep-24中，5.5m/s，40s on/30s off，4cycles，至粪便样品彻底均质化，作为SoCC实验组；
将SoC实验组和SoCC实验组，后续按照QIAamp Stool Mini Kit(购自QIAGEN，货号51604)试剂盒操作步骤提取粪便总DNA。
1.5粪便中总DNA和人类基因组DNA的定量
1.5.1采用NanoDrop对提取的粪便总DNA(total DNA)进行浓度和纯度的测定。
1.5.2采用实时荧光定量PCR方法对人类基因组DNA含量进行测定，对已知浓度的人类基因组DNA标准品进行不同浓度梯度的系列稀释，稀释成5000pg/μL、2000pg/μL、500pg/μL、100pg/μL和25pg/μL，并将系列稀释的人类基因组DNA标准品和粪便DNA样本同时进行实时荧光定量PCR方法进行定量分析。
所述的实时荧光定量PCR方法中人类基因组DNA采用NQO1区域进行引物和探针的设计，其序列如下：
Figure BDA0003313013710000141
所述的实时荧光定量PCR方法中探针5'端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团，所述的荧光报告基团选自VIC，所述荧光猝灭基团选自MGB。
所述的实时荧光定量PCR方法中包括上述引物对、探针、PCR扩增反应液和DNA样本，各引物的终浓度为300nM，探针的终浓度为100nM，PCR扩增反应液KAPA PROBE FASTqPCR Master Mix，DNA样本为系列稀释的人类基因组DNA标准品和粪便DNA样本均加入1μL。
PCR体系为：
Figure BDA0003313013710000142
Figure BDA0003313013710000151
所述的实时荧光定量PCR方法的反应条件为：采用实时荧光定量PCR仪，95℃变性3min；95℃变性3s，60℃退火30s和72℃延伸30s，45个循环。
所述的人类基因组DNA标准品来自组织样本。
1.6粪便中总DNA和人类基因组DNA的定量结果
将系列稀释的人类基因组DNA标准品和粪便DNA样本的实时荧光定量PCR方法的阈值均定为20.127，依据系列稀释的人类基因组DNA标准品的CT值和对应的DNA浓度做标准曲线，得到标准曲线公式Y＝-3.401X+38.818，X值为测定样本浓度的log10值，Y值为测定样本的CT值，R2为0.989，扩增效率为96.8％；依据标准曲线公式和粪便DNA样本的CT值，得到粪便样本的人类基因组DNA的浓度。
如图1所示，直接刮取的粪便加陶瓷珠处理所提取的粪便DNA的产量在总DNA和人类基因组DNA水平上均显著高于直接刮取的粪便不加陶瓷珠处理。同时对21个粪便样本进行重复性提取，从粪便刮取到DNA定量，用log2值对两次提取结果进行观察，其两次提取结果的log2值离散程度较大，说明直接刮取粪便固体来进行DNA提取的重复性较差，但是直接刮取粪便固体并加入陶瓷珠能够增加DNA的产量。
实施例2
在本文提供的本技术的实施方案的开发中，进行试验比较均质化后粪便样本沉淀和上清对DNA提取产量的影响，及硅胶膜柱结合法和磁珠结合法对粪便DNA产量的差距。
2.1粪便样本的收集
2.1.1健康人粪便样本的收集：无肠癌家族史、肠癌疾病史的健康人群粪便样本2例；
2.1.2结直肠癌患者粪便样本收集：取临床上后经肠镜及细胞学鉴定为结直肠癌患者的粪便样本11例；
2.1.3肠息肉患者粪便样本收集：取临床上后经肠镜及细胞学鉴定为肠息肉患者的粪便样本5例；
2.1.4人排出粪便后，立即收集1-10g新鲜粪便样本放入粪便采集管中，并加入粪便保存液，保存液与粪便体积比为1:1。
所述粪便采集管来自SARSTEDT公司，规模76*20mm，货号80.734.311。
所述粪便保存液成分为0.5mol/L Tris,0.15mol/L EDTA and 0.01mol/L NaCl,pH 9.0。
2.2粪便样本的保存
采用低温保存法，将采集好的粪便样本立即放入-80℃冰箱冷冻保存。
2.3粪便样本的处理
2.3.1对于所保存的粪便样本，置于冰上，充分解冻；
2.3.2将解冻后的粪便样本涡旋混匀，使粪便保存液与粪便充分均质化，得到均质化后的粪便样本；
2.3.3将均质化后的粪便样本常温5000rpm条件下离心10min，分离上清溶液和沉淀，吸取0.2
mL上清溶液和收集0.2mg沉淀用于粪便DNA的提取。
2.4粪便DNA的提取
硅胶膜柱结合法按照QIAamp Stool Mini Kit(购自QIAGEN，货号51604)试剂盒操作步骤，对0.2mL上清溶液和0.2mg沉淀进行粪便DNA的提取。
磁珠结合法按照敏基TM基因组DNA提取试剂盒(粪便版)(购自南科征途，货号A181206)试剂盒操作步骤，对0.2mL上清溶液和0.2mg沉淀进行粪便DNA的提取。
2.5粪便中总DNA和人类基因组DNA的定量
采用NanoDrop对提取的粪便总DNA进行浓度和纯度的测定，采用实时荧光定量PCR方法对人类基因组DNA含量进行测定，同实施例1。
如图2所示，将均质化后的粪便样本离心取沉淀，分别进行硅胶膜柱结合法和磁珠结合法提取粪便DNA，缩写为PeC和PeM，将均质化后的粪便样本离心取上清，分别进行硅胶膜柱结合法和磁珠结合法提取粪便DNA，缩写为SuC和SuM。
PeM方法提取的总DNA(中位数，147.9μg/g stool；范围33.1-384.7)明显高于PeC(中位数，75.9μg/g stool；范围7.5-208.3；P<0.05，图2A)；PeM提取的hgDNA(中位数，235.14ng/g stool；范围0-90792)与PeC(中位数，116.34ng/g stool；范围0-19972，图2B)无显著性差异。两者在hgDNA/总DNA上无显著性差异。
SuM提取的总DNA(中位数，26.07μg/g stool；范围13.11-132.18)明显高于SuC(中位数，11.07μg/g stool；范围5.03-65.03；P<0.01，图2A)；SuM提取的hgDNA(中位数，476.19ng/g stool；范围12.25-92922)也明显高于SuC(中位数，151.61ng/g stool；范围0-26780；P<0.01，图2B)。采用均值化后的上清所获得的人类基因组DNA与总DNA的比值也显著高于均质化后的沉淀。
如图2D和图2E所示，使用SuM和SuC对18个粪便便样本进行重复性提取，从粪便刮取到DNA定量，用log2值对两次提取结果进行观察，其两次提取结果的log2值离散程度较实例1中的要小，说明采用均值化的粪便样本上清其DNA提取产量的复现性较好。
根据图2，可知：SuC方法提取出的粪便人类基因组DNA含量较高，且总DNA含量较少，说明此方法提取出的人类基因组DNA纯度较好，在总DNA中占的比值较大，受粪便中细菌DNA的影响较少；同时SuM提取方法在hgDNA的稳定性上更好。
实施例3
本实施例采用实施例2中的均质化后粪便样本上清和磁珠结合法来提取粪便DNA，并用于结直肠癌的检测。
3.1粪便样本的收集
3.1.1健康人粪便样本的收集：无肠癌家族史、肠癌疾病史的健康人群粪便样本16例；
3.1.2结直肠癌患者粪便样本收集：取临床上后经肠镜及细胞学鉴定为结直肠癌患者的粪便样本33例；
3.1.3人排出粪便后，立即收集1-10g新鲜粪便样本放入粪便采集管中，并加入粪便保存液，保存液与粪便体积比为1:1。
所述粪便采集管来自SARSTEDT公司，规模76*20mm，货号80.734.311。
所述粪便保存液成分为0.5mol/L Tris,0.15mol/L EDTA and 0.01mol/L NaCl,pH 9.0。
3.2粪便样本的保存
采用低温保存法，将采集好的粪便样本立即放入-80℃冰箱冷冻保存。
3.3粪便样本的处理
3.3.1对于所保存的粪便样本，置于冰上，充分解冻；
3.3.2将解冻后的粪便样本涡旋混匀，使粪便保存液与粪便充分均质化，得到均质化后的粪便样本；
3.3.3将均质化后的粪便样本常温5000rpm条件下离心10min，保留上清溶液，去除沉淀，吸取0.2mL上清溶液用于粪便DNA的提取。
3.4粪便样本的DNA提取
采用磁珠结合法提取粪便DNA，按照敏基TM基因组DNA提取试剂盒(粪便版)(购自南科征途)试剂盒的操作步骤，对0.2mL上清溶液进行粪便DNA的提取。
3.5粪便DNA的亚硫酸盐转化
按照EZ DNA Methylation-Gold TM Kit(ZYMO)试剂盒的操作步骤，对提取的粪便DNA进行亚硫酸盐转化。
3.6粪便DNA的甲基化检测
3.6.1将亚硫酸盐转化后的粪便人类基因组DNA浓度用H2O稀释成5ng/μL；
3.6.2取2μL稀释后的粪便人类基因组DNA加入到25μL的甲基化特异性实时荧光定量PCR扩增反应体系(表5)中，甲基化特异性实时荧光定量PCR扩增反应试剂各基因引物对、探针和PCR扩增反应液，靶基因各引物的终浓度为250nM，探针的终浓度为100nM，内参基因各引物的终浓度为60nM，探针的终浓度为50nM，PCR扩增反应液为KAPA PROBE FAST qPCRMaster Mix。
3.6.3扩增反应的反应条件为：采用实时荧光PCR仪，95℃变性3min；95℃变性3s，60℃退火30s和72℃延伸30s，45个循环。
说明：
SDC2探针用FAM标记，NDRG4探针用FAM标记，ACTB探针用VIC标记；
SDC2与ACTB一起检测，得到一个FAM Ct值，一个VIC Ct值；
NDRG4与ACTB一起检测，得到一个FAM Ct值，一个VIC Ct值。根据下述步骤3.7进行计算。
3.7样本检测结果判定：
甲基化水平采用ΔCT进行评估，ΔCT＝CT(VIC)-CT(FAM)，FAM为靶基因的信号，VIC为内参基因的信号，将甲基化特异性实时荧光PCR的阈值均定为0.053。
3.8临床样本的检测结果统计
通过内参基因与3.7中确定的阈值0.053进行比较，来判断检测是否有效；内参基因的CT值高于阈值，本次检测有效；若内参基因的CT值低于阈值，视为本次检测无效。
本次检测有效。
如图3A所示SDC2在结直肠癌粪便中的甲基化水平均值为0.22，范围为-8.66-3.67，在健康人中的甲基化水平均值为-6.09，范围为-13.07-0.99；
NDRG4在结直肠癌粪便中甲基化水平均值为-2.28，范围为-10.37-1.82，在健康人中的甲基化水平均值为-6.18，范围为-12.91至-0.81，这两个靶基因在结直肠癌和健康人中的甲基化水平均有显著性差异。
如图3B所示SDC2的ROC曲线下面积为0.894，敏感性为90.91％，特异性为75％；NDRG4的ROC曲线下面积为0.822，敏感性为84.95％，特异性为68.75％。
采用线性回归模型对SDC2和NDRG4这两个基因进行整合，计算其系数，得到模型公式y＝0.392*ΔCT(SDC2)+0.318*ΔCT(NDRG4)+3.096，ROC曲线下的面积为0.913，对结直肠癌样本检测的敏感性为81.81％，特异性为93.75％，相比单一基因进行检测的敏感性和特异性均有所提高。
CRC：结直肠癌患者粪便样本中的甲基化水平；
Control：健康人粪便样本中的甲基化水平；
***P≤0.001，非配对秩和检验。
因此，可获得如下的检测判断标准：
当结果≥1.115时，判定为阳性，反之，当结果＜1.115时，判定为阴性。
说明：本发明将预先已知是结直肠癌患者的粪便样本、胃癌患者的粪便样本、健康人的粪便样本，按照上述实施例3所述方法进行检测，所得结果完全满足实施例3给出的判断规则。
对比例1、
本发明申请中，目的基因SDC2的甲基化特异性引物和探针均为自行设计。为了进一步证明本设计的引物对于目的片段的扩增具有较好的效果，在该引物设计区域进行了位置移动和碱基更改。测试采用SYBR Green试剂盒，未使用探针。
供测试的两对引物对序列如下：
SDC2测试引物对1
比较引物-正向：5’-AATCGTTGTGGTATTTTGTTT-3’
比较引物-反向1：5’-CCTACCCAACGCTCAAC-3’
SDC2测试引物对2
比较引物-正向：5’-AATCGTTGTGGTATTTTGTTT-3’
比较引物-反向2：5’-CCTACCCAACACTCAAC-3’
使用SDC2引物对、SDC2测试引物对1和SDC2测试引物对2，共三对引物，分别选用了100％甲基化、10％甲基化和0％甲基化的DNA样本，同时实验进行比较。
扩增条件如下：
Figure BDA0003313013710000191
甲基化特异性实时荧光定量PCR扩增反应的反应条件如下：50℃UDG激活2min；95℃聚合酶激活2min；95℃变性15s，60℃退火15s和72℃延伸1min，40个循环。之后用PCR仪默认程序进行熔解曲线分析。
结果如下表所示：SDC2测试引物对1和SDC测试引物对2对于100％甲基化的DNA样本扩增效率很差，扩增敏感性降低；且对0％甲基化的DNA样本存在非甲基化信号扩增，说明其扩增特异性降低。因此，引物设计对于甲基化DNA检测方法的敏感性和特异性都非常重要。
所测试的引物 所测试的样本 Ct值 熔解曲线温度(℃)
SDC2引物对 100％meth 32.65 80.48
10％meth 36.20 80.29
0％meth 37.19 79.18
SDC2测试引物对1 100％meth 38.11 78.25
10％meth 39.39 76.57
0％meth 38.97 76.20
SDC2测试引物对2 100％meth 37.05 75.64
10％meth 37.28 75.27
0％meth 35.34 75.27
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
序列表
<110> 浙江中创生物医药有限公司
<120> 粪便人类基因组DNA提取方法及应用
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccagcacccc aggattca 18
<210> 2
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgtccggccc gtttga 16
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ttgtaggctg tccacctc 18
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atcgttgcgg tattttgttt c 21
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctacccaacg ctcgacg 17
<210> 6
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
cacgaatccg aaaca 15
<210> 7
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cggttttcgt tcgttttttc g 21
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gtaacttccg ccttctacgc 20
<210> 9
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ctaaaatacc cgataaac 18
<210> 10
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gagggaggaa gttatggtag gtttt 25
<210> 11
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tcctaaccac cttctcaacc ttaaa 25
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
agaaggtagt ttgaagttgg t 21

Claims (8)

1.粪便人类基因组DNA提取方法，包括步骤一的粪便样本的采集以及步骤二的粪便样本的保存，其特征在于还包括如下步骤：
步骤三、粪便样本的处理：
3.1)、对于低温冷冻保存的粪便样本储存液，先置于冰上解冻，然后将解冻后的粪便样本涡旋混匀，得到均质化后的粪便样本；
对于冷藏保存的粪便样本，直接涡旋混匀，得到均质化后的粪便样本；
3.2)、将均质化后的粪便样本于常温下5000±500rpm条件下离心10±1min，取上清溶液；
步骤四、粪便样本的DNA提取
采用磁珠结合法提取粪便DNA，对上清溶液进行粪便DNA的提取；获得粪便DNA样本。
2.根据权利要求1所述的粪便人类基因组DNA提取方法，其特征在于所述步骤一的粪便样本的采集为：
收集1-10g新鲜粪便作为样本放入粪便采集管中，并加入用于保存粪便的保存液，保存液与粪便体积比为1±0.1:1，得粪便样本储存液；
所述粪便保存液为：0.5mol/L Tris，0.15mol/L EDTA，0.01mol/L NaCl，余量为水；pH9.0。
3.根据权利要求2所述的粪便人类基因组DNA提取方法，其特征在于所述步骤二的粪便样本的保存为以下任一：
低温冷冻保存法：将采集好的粪便样本储存液立即放入≤-80℃冷冻保存；
冷藏保存：将采集好的粪便样本在冷藏条件下保存，并在采集时起的1h以内进行后续的步骤三。
4.利用如权利要求1～3任一所得的粪便DNA样本进行的粪便DNA含量测定法，其特征在于包括以下步骤：
1)、粪便DNA样本含量测定：
采用微量紫外分光光度计对粪便DNA样本进行浓度和纯度的测定；
2)、采用实时荧光定量PCR方法对粪便人类基因组DNA含量进行测定，包括以下步骤：
2.1)、获取人类基因组DNA，并通过琼脂糖凝胶电泳进行DNA完整性鉴定和微量紫外分光光度计进行浓度和纯度的测定；
2.2)、利用已知浓度的组织人类基因组DNA进行梯度系列稀释制备获得人类基因组DNA标准品，并将系列稀释的组织人类基因组DNA标准品和粪便DNA样本同时进行实时荧光定量PCR；
依据系列稀释的人类基因组DNA标准品的CT值和对应的DNA浓度做标准曲线，得到标准曲线公式；依据标准曲线公式和粪便DNA样本的CT值，得到粪便样本的人类基因组DNA的浓度。
5.根据权利要求4所述的粪便DNA含量测定法，其特征在于：
实时荧光定量PCR方法中人类基因组DNA采用NQO1区域进行引物和探针的设计：
Figure FDA0003313013700000021
所述的实时荧光定量PCR法中探针5'端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团，所述的荧光报告基团选自VIC，所述荧光猝灭基团选自MGB；
PCR体系包括引物对、探针、PCR扩增反应液和DNA样本，各引物的终浓度为300nM，探针的终浓度为100nM，PCR扩增反应液KAPA PROBE FAST qPCR Master Mix；
PCR方法的反应条件为：采用实时荧光定量PCR仪，95℃变性3min；95℃变性3s，60℃退火30s和72℃延伸30s，45个循环；
依据系列稀释的人类基因组DNA标准品的CT值和对应的DNA浓度做标准曲线，得到标准曲线公式Y＝-3.401X+38.818，X值为测定样本浓度的log10值，Y值为测定样本的CT值。
6.利用如权利要求1～3任一所得的粪便DNA样本进行的粪便DNA甲基化检测法，其特征在于包括以下步骤：
1)、将粪便DNA样本采用亚硫酸盐转化试剂进行转化处理，得亚硫酸盐转化后的粪便DNA样本；
2)、对亚硫酸盐转化后的粪便DNA样本进行甲基化特异性实时荧光定量PCR扩增反应；
3)、粪便DNA的甲基化检测结果分析。
7.根据权利要求6所述的粪便DNA甲基化检测法，其特征在于：
所述步骤3)中：将甲基化特异性实时荧光定量PCR扩增反应的靶基因和内参基因的阈值定为相同，内参基因的CT值高于阈值，本次检测有效；若内参基因的CT值低于阈值，视为本次检测无效。
8.根据权利要求7所述的粪便DNA甲基化检测法，其特征在于：
所述步骤2)为：
所述的甲基化特异性实时荧光定量PCR扩增反应的靶基因为SDC2基因和/或NDRG4基因，同时包含内参基因ACTB，其引物和探针如下：
基因 引物名称 名称 序列5’→3’ SDC2 SDC2-F 前向引物 ATCGTTGCGGTATTTTGTTTC SDC2 SDC2-R 后向引物 CTACCCAACGCTCGACG SDC2 SDC2-P 探针 CACGAATCCGAAACA NDRG4 NDRG4-F 前向引物 CGGTTTTCGTTCGTTTTTTCG NDRG4 NDRG4-R 后向引物 GTAACTTCCGCCTTCTACGC NDRG4 NDRG4-P 探针 CTAAAATACCCGATAAAC ACTB ACTB-F 前向引物 GAGGGAGGAAGTTATGGTAGGTTTT ACTB ACTB-R 后向引物 TCCTAACCACCTTCTCAACCTTAAA ACTB ACTB-P 探针 AGAAGGTAGTTTGAAGTTGGT
所述的探针5'端标记有荧光报告基团，3'端标记有荧光淬灭基团，所述的靶基因荧光报告基团选自FAM，所述的内参基因荧光报告基团选自VIC，所述荧光猝灭基团均选自MGB；
所述甲基化特异性实时荧光定量PCR扩增体系包括所述引物对、探针和PCR扩增反应液，靶基因各引物的终浓度为250nM，探针的终浓度为100nM，内参基因各引物的终浓度为60nM，探针的终浓度为50nM；
所述甲基化特异性实时荧光定量PCR扩增条件为：采用实时荧光定量PCR仪，95℃变性3min；95℃变性3s，60℃退火30s和72℃延伸30s，45个循环：
所述步骤3)为：
在检测有效的情况下，SDC2基因的甲基化水平定义为内参基因的CT值与SDC2基因的CT值的差值，即ΔCT(SDC2)＝CT(ACTB)-CT(SDC2)；NDRG4基因的甲基化水平定义为内参基因的CT值与NDRG4基因的CT值的差值，即ΔCT(NDRG4)＝CT(ACTB)-CT(NDRG4)；同时采用线性回归模型对两个靶基因的检测结果进行整合，获得新的检测模型，可以定量粪便DNA甲基化水平，即为y＝0.392*ΔCT(SDC2)+0.318*ΔCT(NDRG4)+3.096。
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