CN108866045A - 一种人类粪便dna提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种简单快速、成本低、稳定性高的人粪便DNA提取方法。包括步骤一，粪便样品的采集；步骤二，粪便样品的运输；步骤三，粪便样品的取样；步骤四，粪便样本的DNA提取。本发明DNA提取过程方便快捷，所得DNA纯度与浓度符合要求，磁珠的应用可大大提高实验通量，可用于粪便DNA提取的自动化应用。

Description

一种人类粪便DNA提取方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及非损伤性取样材料中提取DNA的方法，具体涉及一种人类粪便DNA提取方法。
背景技术
肠道系统是人体最大的消化器官，也是人体最大的排毒器官，其可直接影响人体正常生理功能，与人体健康息息相关。人体携带有1014的细菌，总重量大约为1270g，这些细菌在人出生后就开始定植，并保持数量和种类的动态平衡。正常的微生物群大部分定植于肠道，它们参与宿主的生长发育，促进免疫系统的成熟，为宿主提供营养等。因而，肠道微生态系统也成为宿主生理系统中不可分割的组成部分。
与肠道有关的疾病有阑尾炎、肠梗阻、肠炎、息肉、肿瘤和癌症等，临床上可通过各种检测予以确诊，包括血液检测，彩超，组织活检等，其中肠镜检测最为准确，但其侵入性高，易造成受检查者身体创伤和痛苦，受检者接受度低。
肠道微生态系统包括多种多样的细菌微生物，其中包含大量人体有益菌群，亦有对人体有害的菌群，有越来越多的证据表明这些菌群与人自身免疫系统、肥胖、糖尿病、心血管疾病、血压调节、癌症等有关，加强肠道菌群的研究对防治、治疗和疾病预后都有重要的意义。
对粪便中肠道脱落细胞和细菌DNA的检测可得到大量相关信息，诸多证据显示脱落细胞DNA与多种癌症高度相关，而通过对细菌DNA的检测可判别其细菌种类及细菌的相对含量，从而给出对人体健康状况的解读。
然而要从粪便中得到高质量的DNA来进行相应的研究和转化应用还有很多问题亟待解决，例如在粪便的采集过程中可能会发生DNA的降解，粪便中也存在着各种PCR反应抑制剂(各种细菌、食物残渣、多糖、胆酸和消化液等)，严重影响后续的检测和试验。市场上已有的粪便DNA提取试剂盒以硅胶膜柱结合法为主，不能完全满足要求，且价格昂贵。
从粪便中提取DNA的方法多种多样，例如直接提取粪便DNA，富集肠壁脱落细胞后提取人基因组DNA等，其中直接提取法获得的DNA总量高，但人源DNA含量较少，不适合应用于对人源DNA模板数量要求高的下游检测方法；而富集肠壁脱落细胞后提取能保证提取的DNA全部来源于人，特异性高，抑制性成分去除彻底，但只能获得未凋亡细胞，DNA含量和多样性的损失较大，产量低且成本高。
发明内容
本发明的目的是解决以上提出的问题，提供一种简单快速、成本低、稳定性高的人粪便DNA提取方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明是一种人类粪便DNA提取方法，所述方法包括以下步骤：
步骤一，粪便样品的采集：
人排出粪便后，立即采集2-5g粪便样品放入采集管中，采集管中装有10-15mL粪便保存液，摇匀采集管使粪便样品与粪便保存液充分混匀；
所述粪便保存液成分：0.3-0.6M EDTA，3-6M NaCl，0.3-1.5M Tris；
步骤二，粪便样品的运输：
在常温(22-26℃)或低温(4℃及以下)条件下常规物流运输采集的粪便样品，并在3天内到达实验室进行处理；
步骤三，粪便样品的取样：
粪便样品到达实验室后，充分混匀，吸取800μL-2000μL粪便样本放入离心管中，再次混匀；
步骤四，粪便样本的DNA提取：
(1)细胞沉淀
将装有粪便样本的离心管在10000rpm-13000条件下离心2-5分钟，保留沉淀，去除上清液；
(2)细胞裂解释放DNA
向步骤(1)的离心管中加入800-1000μL粪便裂解液，在68-75℃条件下温育10分钟，裂解肠道脱落细胞，释放DNA至液体中；
所述粪便裂解液成分：0.5-1.2％(m/v)CTAB，0.8-1.4M NaCl，0.08-0.12％(m/v)Tris，10-15mM EDTA，0.1-0.2M异巯基乙醇；
(3)沉淀杂质
将步骤(2)的离心管在10000-13000rpm条件下离心1分钟，此时肠道脱落细胞已经裂解，DNA已释放到上清液中，沉淀多为杂质，将上清液转移至新的离心管中，除去沉淀杂质，若上清中有残留杂质，则转移时弃去颗粒状杂质；
(4)去杂质纯化DNA
在步骤(3)得到的上清液中加入杂质分离液500-600μL，彻底混匀5-10分钟，然后在10000-13000rpm条件下离心5-10分钟，液体分为三层，上层即是含有DNA的溶液，杂质已沉淀至中下层，将上层清液转移至新的离心管中，除去中下层沉淀杂质，此步骤中转移上层清液需在生物安全柜中进行，吸取时保留一部分上层清液防止吸到中层白膜；
所述杂质分离液成分：氯仿；
(5)磁珠结合DNA
向步骤(4)得到的上清液中加入磁珠结合液600-800μL，磁珠30-100μL，室温条件下孵育15-30分钟，得到磁珠混合液；
所述磁珠结合液成分：异丙醇；
(6)磁珠洗涤及DNA洗脱
将步骤(5)得到的磁珠混合液放置于磁力架上3-10分钟，待磁珠彻底吸附后使用磁珠洗涤液清洗2次，加入100-200μL磁珠洗脱液，室温洗脱10分钟后置于磁力架上，待磁珠吸附后，吸取洗脱液到新的离心管中，该洗脱液即为含DNA的溶液。
所述磁珠洗涤液成分：体积分数为75％-80％的乙醇；
所述磁珠洗脱液成分：无核酸酶水。
本发明的有益效果如下：
1、本发明得到的DNA片段长度大于20Kb，OD260/OD280比值大于1.8，可直接用于PCR扩增和其它分子生物学用途。
2、本发明DNA提取过程方便快捷，所得DNA纯度与浓度符合要求，磁珠的应用可大大提高实验通量，可用于粪便DNA提取的自动化应用，迅速从800μL-2000μL体积样品中提取到高质量可用于PCR扩增及高通量测序的DNA。
3、本发明具有较高的重复性及稳定性，在96例样品DNA提取中，只需一次提取即可得到所需的高质量DNA，采用荧光定量PCR法进行细胞内参基因ACTB的扩增，均可产生正常的扩增曲线，且DNA片段大小符合预期。
4、与市售商品化粪便DNA提取试剂盒比较，按照试剂盒要求步骤进行操作，在26个样本中，其平均浓度为67.3ng/μL，OD260/OD280平均比值为1.8，同样的样本使用本发明方法所得平均浓度为172.5ng/μL，OD260/OD280平均比值为1.94；分别取等量的两种方法提取的DNA，采用荧光定量PCR法进行内参基因扩增实验，两者都有正常扩增曲线，且Ct值区别小于1(△Ct<1)，说明两种提取方法所得DNA质量无显著性差异。
附图说明
图1：实例1中采用本发明方法提取的粪便总DNA分子量大小分布；
图2：实例3中分别采用商业试剂盒Q方法和本发明方法提取DNA的琼脂糖凝胶电泳图，Q方法拖尾现象严重，DNA有降解，本发明方法则无此现象。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的实施例进行进一步详细说明：
实施例1：
以一正常人粪便为例，实施叙述如下：
步骤一，粪便样品的采集：
采集人刚排出的粪便样品2g放入装有15mL粪便保存液的采集管中，摇匀采集管使粪便样品与粪便保存液充分混匀；
粪便保存液成分：0.4M EDTA，4MNaCl，0.4M Tris；
步骤二，
在常温条件下常规物流运输，将采集的粪便样品送到实验室，3天内到达实验室进行处理即可；
步骤三，粪便样品的取样：
粪便样品到达实验室后，充分混匀，吸取800μL粪便样本放入离心管中，再次混匀；
步骤四，粪便样本的DNA提取：
(1)细胞沉淀
将装有粪便样本的离心管在10000rpm条件下离心5分钟，沉淀肠道脱落细胞到管底，保留沉淀，去除上清液；
(2)细胞裂解释放DNA
向步骤(1)的离心管中加入800μL粪便裂解液，在70℃条件下温育10分钟，裂解肠道脱落细胞，释放DNA至液体中；
粪便裂解液成分：0.9％(m/v)CTAB，1M NaCl，0.09％(m/v)Tris，10mM EDTA，0.1M异巯基乙醇；
(3)沉淀杂质
在常温下将步骤(2)的离心管在10000rpm条件下离心1分钟，此时肠道脱落细胞已经裂解，DNA已释放到上清液中，沉淀多为杂质，将上清液转移至新的离心管中，除去沉淀杂质；
(4)去杂质纯化DNA
在步骤(3)得到的上清液中加入杂质分离液500μL，彻底混匀10分钟，然后在13000rpm条件下离心10分钟，液体分为三层，上层即是含有DNA的溶液，杂质已沉淀至中下层，吸取上层清液转移至新的离心管中，除去中下层沉淀杂质，此步骤中转移上层清液需在生物安全柜中进行，吸取时保留一部分上层清液防止吸到中层白膜；
杂质分离液成分：氯仿；
(5)磁珠结合DNA
向步骤(4)得到的上清液中加入磁珠结合液600μL和磁珠30μL，室温条件下孵育15分钟，得到磁珠混合液；
磁珠结合液成分：异丙醇；
(6)磁珠洗涤及DNA洗脱
将步骤(5)得到的磁珠混合液放置于磁力架上3分钟，待磁珠彻底吸附后使用1mL磁珠洗涤液清洗2次；
然后加入200μL磁珠洗脱液，室温洗脱10分钟后置于磁力架上，待磁珠吸附后，吸取洗脱液到新的离心管中，该洗脱液即为含DNA的溶液；
磁珠洗涤液成分为75％乙醇，磁珠洗脱液成分为无核酸酶水。
采用Qubit仪器测定最后得到溶液的DNA浓度，为145ng/μL，使用Nanodrop2000测定其260/280比值，为1.91。同时对DNA进行毛细管电泳检测，结果见图1。
实施例2：
以一直肠癌患者粪便为例，实施叙述如下：
步骤一，粪便样品的采集：
采集人刚排出的粪便样品5g放入装有15mL粪便保存液的采集管中，摇匀采集管使粪便样品与粪便保存液充分混匀；
粪便保存液成分：0.6M EDTA，5MNaCl，1M Tris；
步骤二，
在常温条件下常规物流运输，将采集的粪便样品送到实验室，在3天内到达实验室进行处理即可；
步骤三，粪便样品的取样：
粪便样品到达实验室后，充分混匀，吸取1000μL粪便样本放入离心管中，再次混匀；
步骤四，粪便样本的DNA提取：
(1)细胞沉淀
将装有粪便样本的离心管在10000rpm条件下离心5分钟，沉淀肠道脱落细胞到管底，保留沉淀，去除上清液；
(2)细胞裂解释放DNA
向步骤(1)的离心管中加入1000μL粪便裂解液，在75℃条件下温育10分钟，裂解肠道脱落细胞，释放DNA至液体中；
粪便裂解液成分：1％(m/v)CTAB，1M NaCl，0.1％(m/v)Tris，15mM EDTA，0.2M异巯基乙醇；
(3)沉淀杂质
在常温下将步骤(2)的离心管在13000rpm条件下离心1分钟，此时肠道脱落细胞已经裂解，DNA已释放到上清液中，沉淀多为杂质，将上清液转移至新的离心管中，除去沉淀杂质；
(4)去杂质纯化DNA
在步骤(3)得到的上清液中加入杂质分离液500μL，彻底混匀10分钟，然后在13000rpm条件下离心10分钟，液体分为三层，上层即是含有DNA的溶液，杂质已沉淀至中下层，将上层清液转移至新的离心管中，除去中下层沉淀杂质，此步骤中转移上清液需在生物安全柜中进行，吸取时保留一部分上层清液防止吸到中层白膜；
杂质分离液成分：氯仿；
(5)磁珠结合DNA
向步骤(4)得到的上清液中加入磁珠结合液800μL和磁珠80μL，室温条件下孵育15分钟，得到磁珠混合液；
磁珠结合液成分：异丙醇；
(6)磁珠洗涤及DNA洗脱
将步骤(5)得到的磁珠混合液放置于磁力架上3分钟，待磁珠彻底吸附后使用1mL磁珠洗涤液清洗2次；
加入200μL磁珠洗脱液，室温洗脱10分钟后置于磁力架上，待磁珠吸附后，吸取洗脱液到新的离心管中，该洗脱液即为含DNA的溶液；
磁珠洗涤液成分为80％乙醇，磁珠洗脱液成分为无核酸酶水。
采用Qubit仪器测定最后得到溶液的DNA浓度，为230ng/μL，使用Nanodrop2000测定其260/280比值为1.98。
实施例3：
以五份不同未知来源人的粪便为例，实施叙述如下：
步骤一，粪便样品的采集：
采集人刚排出的粪便样品2g放入装有15mL粪便保存液的采集管中，摇匀采集管使粪便样品与粪便保存液充分混匀；
粪便保存液成分：0.5M EDTA，6MNaCl，1.2M Tris；
步骤二，
在常温条件下常规物流运输，将采集的粪便样品送到实验室，在3天内到达实验室进行处理即可；
步骤三，粪便样品的取样：
粪便样品到达实验室后，充分混匀，吸取800μL粪便样本放入离心管中，取两份粪便样本，再次吸打混匀；
步骤四，粪便样本的DNA提取：
(1)细胞沉淀
将装有粪便样本的离心管在10000rpm条件下离心5分钟，沉淀肠道脱落细胞到管底，保留沉淀，去除上清液；
(2)细胞裂解释放DNA
向步骤(1)的离心管中加入800μL粪便裂解液，在75℃条件下，温育10分钟，裂解肠道脱落细胞，释放DNA至液体中；
粪便裂解液成分：1.2％(m/v)CTAB，1.2M NaCl，0.08％(m/v)Tris，12mM EDTA，0.2M异巯基乙醇；
(3)沉淀杂质
在常温下将步骤(2)的离心管在13000rpm条件下离心1分钟，此时肠道脱落细胞已经裂解，DNA已释放到上清液中，沉淀多为杂质，将上清液转移至新的离心管中，除去沉淀杂质，若上清中有残留杂质，则转移时弃去颗粒状杂质；
(4)去杂质纯化DNA
在步骤(3)得到的上清液中加入杂质分离液500μL，彻底混匀10分钟，然后在13000rpm条件下离心10分钟，液体分为三层，上层即是含有DNA的溶液，杂质已沉淀至中下层，将上层清液转移至新的离心管中，除去中下层沉淀杂质，此步骤中转移上层清液需在生物安全柜中进行，吸取时保留一部分上层清液防止吸到中层白膜；
杂质分离液成分：氯仿；
(5)磁珠结合DNA
向步骤(4)得到的上清液中加入磁珠结合液800μL和磁珠90μL，室温条件下孵育15分钟，得到磁珠混合液；
磁珠结合液成分：异丙醇；
(6)磁珠洗涤及DNA洗脱
将步骤(5)得到的磁珠混合液放置于磁力架上10分钟，待磁珠彻底吸附后使用1mL磁珠洗涤液清洗2次；
加入200μL磁珠洗脱液，室温洗脱10分钟后置于磁力架上，待磁珠吸附后，吸取洗脱液到新的离心管中，该洗脱液即为含DNA的溶液；
磁珠洗涤液成分为80％乙醇，磁珠洗脱液成分为无核酸酶水。
采用Qubit仪器测定最后得到溶液的DNA浓度平均为97ng/μL，使用Nanodrop 2000测定其260/280比值平均为1.91。同时将同样五份样本用商业试剂盒Q提取粪便，采用其推荐步骤，其浓度为平均为74ng/μL，Nanodrop 2000测定其260/280比值平均为1.89。将两种方法得到的DNA进行琼脂胶电泳比较，结果如图2显示，Q方法DNA有拖尾现象，即DNA有降解现象，本发明方法无此现象。
以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域中的普通技术人员来说，在不脱离本发明核心技术特征的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种人类粪便DNA提取方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤一，粪便样品的采集：
人排出粪便后，立即采集2-5g粪便样品放入采集管中，采集管中装有10-15mL粪便保存液，摇匀采集管使粪便样品与粪便保存液充分混匀；
所述粪便保持液成分：0.3-0.6M EDTA，3-6M NaCl，0.3-1.5M Tris；
步骤二，粪便样品的运输：
在常温或低温条件下常规物流运输采集的粪便样品，并在3天内到达实验室进行处理；
步骤三，粪便样品的取样：
粪便样品到达实验室后，充分混匀，吸取800μL-2000μL粪便样本放入离心管中，再次混匀；
步骤四，粪便样本的DNA提取：
(1)细胞沉淀
将装有粪便样本的离心管在10000-13000rpm条件下离心2-5分钟，保留沉淀，去除上清液；
(2)细胞裂解释放DNA
向步骤(1)的离心管中加入800-1000μL粪便裂解液，使其与沉淀彻底混匀后，在68-75℃条件下温育10分钟；
所述粪便裂解液成分：0.5-1.2％(m/v)CTAB，0.8-1.4MNaCl，0.08-0.12％(m/v)Tris，10-15mM EDTA，0.1-0.2M异巯基乙醇；
(3)沉淀杂质
将步骤(2)的离心管在10000-13000rpm条件下离心1分钟，将上清液转移至新的离心管中，除去沉淀杂质；
(4)去杂质纯化DNA
在步骤(3)得到的上清液中加入杂质分离液500-600μL，彻底混匀5-10分钟，然后在10000-13000rpm条件下离心5-10分钟，液体分为三层，将上层清液转移至新的离心管中，除去中下层沉淀杂质，此步骤中转移上层清液需在生物安全柜中进行；
所述杂质分离液成分：氯仿；
(5)磁珠结合DNA
向步骤(4)得到的上清液中加入磁珠结合液600-800μL，磁珠30-100μL，室温条件下孵育15-30分钟，得到磁珠混合液；
所述磁珠结合液成分：异丙醇；
(6)磁珠洗涤及DNA洗脱
将步骤(5)得到的磁珠混合液放置于磁力架上3-10分钟，待磁珠彻底吸附后使用磁珠洗涤液清洗2次，加入100-200μL磁珠洗脱液，室温洗脱10分钟后置于磁力架上，待磁珠吸附后，吸取洗脱液到新的离心管中，该洗脱液即为含DNA的溶液；
所述磁珠洗涤液成分：体积分数为75％-80％的乙醇；
所述磁珠洗脱液成分：无核酸酶水。
2.根据权利要求1所述的人类粪便DNA提取方法，其特征在于，所述粪便裂解液成分为1％CTAB，1M NaCl，0.1％Tris，15mMEDTA，0.2M异巯基乙醇。
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