CN112553302B - 从粪便中提取dna样本的方法和结直肠癌相关基因的甲基化检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了从粪便中提取DNA样本的方法和结直肠癌相关基因的甲基化检测方法，涉及基因检测技术领域。该方法包括：离心粪便稀释液样本，得到第一上清液；粪便稀释液中的粪便取自于需要进行结直肠癌或结直肠癌前病变检测的主体；离心时，单个离心管中的粪便稀释液样本的体积不高于2mL。该提取方法操作简单，粪便用量少，不需要使用大型的离心设备即可提取，提取效果好，所提取的DNA样本用于后续甲基化检测时具有较好的灵敏度和特异性。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求申请日为2019年12月19日，申请号为201911314364.6，发明名称为“从粪便中提取DNA样本的方法和结直肠癌相关基因的甲基化检测方法”的中国发明专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本申请中。
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，具体而言，涉及从粪便中提取DNA样本的方法和结直肠癌相关基因的甲基化检测方法。
背景技术
结直肠癌是我国乃至世界范围内最常见的恶性肿瘤，我国每年新增发病人数约40万，其发病率居所有恶性肿瘤的第三位。早期结直肠癌患者手术5年生存率可高达90％以上，中、晚期患者5年生存率仅10％左右，且大多数结直肠肿瘤生长缓慢、保持沉默或无症状，直到它们达到了一定的大小或发展阶段。因此，结直肠癌是可以通过筛查进行干预的理想靶标。
肠镜检查是结直肠癌检测和确诊的金标准，但因其需要复杂的肠道准备过程、具有一定的侵入性且需要专业的技术人员，因此在一般人群中的普及率很低。无创检测方法如粪便潜血检查(FOBT)和粪便免疫化学检查(FIT)的灵敏度不高，尤其是在检测I期结直肠癌和进展期腺瘤方面灵敏性较低。甲基化是一种表观遗传修饰，其异常变化可引起DNA构象及DNA与蛋白质相互作用方式等发生改变，从而控制基因表达。DNA甲基化在基因表达调控、细胞增殖分化、发育和基因印记等方面起着重要作用，与肿瘤的发生与发展有密切关系。粪便中含有一定量的肠道脱落细胞，因此可通过检测这些脱落细胞中的某些DNA靶标继而对肠道的健康状况进行评估。越来越多的研究指出，粪便DNA甲基化检测在结直肠癌无创筛查方面显示出很大的优势，其灵敏性和特异性均优于血液甲基化检测和粪便潜血检测。2014年，FDA批准了第一款结直肠癌粪便DNA检测试剂盒Cologuard，该试剂盒可以同时检测粪便中的血红素、KRAS基因突变及另外两个基因的甲基化，其对结直肠癌的检测灵敏性和特异性分别为92％和87％。
良好的粪便DNA检测效果依赖于上游的粪便处理技术，包括粪便保存技术和粪便DNA提取技术等。例如，用于保存粪便DNA的试剂应尽可能保持粪便中人类基因组的稳定性，同时不受其他基因组的干扰，粪便DNA提取时应尽可能地获取到为数不多的目标DNA。现有的粪便DNA提取技术种类繁多，按照提取基因组的范围来分，可分为提取全部DNA的方法和靶向富集提取特定DNA的方法；按照提取试剂的种类，可分为机械法、磁珠法和化学法等。应当指出的是，不同的提取方法适用于不同的应用场景，产生的检测效果也不同。
粪便基质成分非常复杂，其中含有种类众多的细菌基因组DNA、植物来源DNA和动物来源DNA，肠道或其他消化道位置的脱落细胞含量相对较少，肠道脱落细胞DNA只占从粪便中回收到的总DNA的0.1％到0.01％，而人类DNA本身是高度异源的，肠道肿瘤细胞又只占肠道脱落细胞的1％，对于癌症早期的人体，还不到1％。不仅如此，粪便中还含有多聚糖、胆盐、腐殖质、胆酸等PCR抑制物，此时如果采用从粪便中提取全部基因组的做法(如现有技术CN201611113440)，庞大的基因背景和PCR抑制物将非常不利于肿瘤脱落细胞DNA的检测；现有技术CN201710332851使用探针富集人类基因组，虽然在一定程度上特异性地区分了人类基因组和其他基因组，但是仍未实现对人类特定基因的富集，且某些肿瘤来源的DNA片段化较严重，不能通过对人类基因组的整体富集实现对特定肿瘤基因的富集；另外，现有技术中还存在使用粪便量较多、要用到有机溶剂等问题，如CN201811636712，虽然使用较大的粪便量可能会增加目的基因的提取量，但这也不可避免地增加了步骤的繁琐性和成本：需要使用到特定的试剂耗材(如5mL、15mL和50mL离心管)和设备(大型离心机等)。这增加了复杂度，严重降低检测通量、增加检测时间和成本，对于产品的使用推广造成致命限制。然而，在同样的实验条件下减少粪便样本量势必会降低目标DNA的量，增加检测难度，因此现有技术在检测工艺和检测效果之间做取舍：即选择较大粪便稀释液样本体积提取，以保证检测效果。
综上，目前尚缺少能有效对靶基因进行富集、操作简单、对结直肠癌及其他消化道肿瘤检测灵敏性和特异性优异的粪便DNA提取方法。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供从粪便中提取DNA样本的方法和结直肠癌相关基因的甲基化检测方法。该提取方法操作简单，不需要使用大型的离心设备即可提取，提取成本低；所提取的DNA样本用于后续检测中具有较好的灵敏度和特异性，提取效果好。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明实施例提供一种从粪便中提取DNA样本的方法，所述DNA样本适用于结直肠癌相关基因的甲基化检测，其包括：
预处理步骤：离心粪便稀释液样本，得到第一上清液；所述粪便稀释液中的粪便取自于需要进行结直肠癌或结直肠癌前病变检测的主体；
离心时，单个离心管中的粪便稀释液样本的体积不高于2mL，优选为0.5-1.8mL，进一步优选为1.8mL；
所述样本稀释液包含100-500mmol/L EDTA、50-300mmol/L Tris·HCl和50-200mmol/L NaCl；所述粪便稀释液样本由粪便和粪便保存液按照质量体积比为1:(3-5)的比例(1g粪便对应使用3-5ml粪便保存液)混合而成，优选为1:3。
现有技术的粪便DNA提取过程，通常都使用5mL、15mL或25mL规格的离心管稀释样本进行离心预处理，进而需要使用大型的离心设备。因此具有以下弊端：(1)针对大体积类型样本，大型的离心设备离心力较低，单次离心时间长；(2)离心过程中需要配平，如果不能较好地配平，还容易出现机器故障；(3)使用大型离心设备时每次离心管数较少，离心通量低；(4)预处理过程通常需要多次离心，操作复杂，人力成本及设备成本高。而本发明提供的方法在提取过程中，控制粪便稀释液样本体积不高于2mL，进而可以选用2mL和1.5mL规格的离心管进行离心，进而避免了使用大型的离心设备，有利于加快提取过程，提高提取过程的便捷性，虽然相较于现有的提取方法粪便使用量减少，但同样可取得很好的提取效果，所提取的DNA样本可用于后续甲基化检测中，通过检测结果可以反应主体结直肠癌患病情况或结直肠癌前病变情况，具有较好的灵敏度和特异性。
在可选的实施方式中，离心的参数设置如下：
转速10000-13000rpm、时间10s-5min。
在可选的实施方式中，所述方法还包括：
吸附步骤：将吸附剂与所述第一上清液混匀以去除所述上清液中的杂质，得到第一混合液，对所述第一混合液离心，得到第二上清液。
粪便中杂质较多，通过吸附剂的使用，可以较好地去除其中的杂质，有利于后续步骤例如捕获步骤中探针对DNA样本的富集。
在可选的实施方式中，所述吸附剂选自交联聚乙烯吡咯烷酮。
在可选的实施方式中，所述交联聚乙烯吡咯烷酮为交联聚乙烯吡咯烷酮粉末或交联聚乙烯吡咯烷酮片剂。
在可选的实施方式中，所述吸附剂与所述第一上清液的质量体积比为1:(2-4)；进一步优选为1:4。
本发明的研究发现，吸附剂的用量是影响提取效果的因素之一，优选地，控制吸附剂与所述第一上清液的质量体积比为1:(2-4)，优选为1:4时，具有较好的提取效果。
在可选的实施方式中，所述方法还包括：
核酸变性步骤：将上述第二上清液进行变性处理以使DNA双链结构形成单链结构。
通过变性处理，使DNA双链结构形成单链结构，在后续捕获步骤有利于探针与目标DNA片段的结合，进而可以富集大量的单链DNA，使得提取效果更好，也有利于提高后续的甲基化检测效果。
在可选的实施方式中，所述变性处理的温度85-95℃，时间为5-15min，进一步优选为10min。
本发明的研究发现，变性处理的时间对后续的检测效果有影响，变性时间控制在5-15min的范围内，具有较好的提取效果，优选为10min，提取效果更佳。
在可选的实施方式中，在核酸变性步骤中，在所述变性处理前，往所述第二上清液中加入异硫氰酸胍。
在可选的实施方式中，所述方法还包括：
捕获步骤：往所述第二上清液中加入捕获剂，得到第二混合液；其中，所述捕获剂含有偶联有探针的磁珠，所述探针与待提取的基因序列某一段互补。
需要说明的是，探针的序列与待检测的结直肠癌相关基因相关，本领域技术人员可以根据检测的需要，选择合适的结直肠癌相关基因，探针的序列根据所选择的结直肠癌相关基因设计即可。
需要说明的是，待检测的结直肠癌相关基因可以是一种，也可以是多种，本领域技术人员可以根据检测的需要，选择合适种类的结直肠癌相关基因。
需要说明的是，上述的待检测的结直肠癌甲基化相关基因包括但不限于SDC2、TFPI2、VIM、NDRG4、SFRP1、SFRP2、BMP3、MGMT、SPG20和SEPT9。
采用本发明提取的方法所提取的DNA样本适用于各种结直肠癌甲基化相关基因的甲基化检测，包括但不限于SDC2、TFPI2、VIM、NDRG4、SFRP1、SFRP2、BMP3、MGMT、SPG20和SEPT9。
在可选的实施方式中，所述捕获剂通过如下方法制得：
将含有磁珠的磁珠液与所述探针的探针液混合，得到磁珠-探针混合液，其体积记为V1，混匀磁珠-探针混合液以使所述探针与磁珠偶联，再所述磁珠-探针混合液置于磁力架上进行吸附，弃上清后，加入体积为V1的缓冲液重悬磁珠，即得所述捕获剂；所述缓冲液含有200mmol/L Tris·HCl和100mmol/L NaCl；
其中，所述磁珠液中的磁珠的浓度为9-11mg/mL，所述探针液中的所述探针的浓度为9-11uM；所述磁珠液的用量满足如下公式：V＝N*M；公式中，V代表所述磁珠液的体积，N代表待提取基因的种类数量，M＝3-7，单位为μL，优选的，M＝5。M含义可以理解为单个待提取基因的磁珠液的最佳使用体积。
例如，当待提取基因为一种的时候，磁珠液的用量即为1*M，也就说是，磁珠液的用量为3-7μL，当待提取的基因为两种的时候，所述磁珠液的用量即为2*M，也就说是，磁珠液的用量为6-14μL，以此类推。即磁珠液的用量由待提取基因的种类数量确定。
本发明的研究发现，磁珠液的使用量对提取效果具有影响，当待提取基因为一种的时候，9-11mg/mL的磁珠液的使用量控制在3-7μL的范围下，具有较高的提取效果，尤其是在5μL的用量，可以取得更好的提取效果。
在可选的实施方式中，所述磁珠液与所述探针液的体积比为1:(1-1.5)，优选为1:1。
本发明的研究还发现，磁珠液与探针液的体积比是影响提取效果的因素之一，将磁珠液与探针液的体积比控制在1:(1-1.5)的范围下具有较好的提取效果，尤其是控制在1:1的比值下，具有更高的提取效果。
在可选的实施方式中，所述磁珠上标记有链霉亲和素，所述探针标记有生物素。
需要说明的是，链霉亲和素和生物素是本领域常见的偶联系统，本领域技术人员可以理解，为了使磁珠与探针偶联还可以采用其他的偶联系统例如地高辛与地高辛抗体等，无论采用何种偶联系统将探针与磁珠偶联，均属于本发明的保护范围。
在可选的实施方式中，所述方法还包括：
孵育步骤：将所述第二混合液静置孵育40-90min，优选为40min。
需要说明的时，本发明对孵育的温度不作限定，在室温下进行孵育也是可行的。
本发明的研究发现，孵育的时间对提取效果的有影响，将孵育时间控制在40-90min的范围下，可以取得较好的提取效果；优选地，控制孵育在40min，其提取效果更佳。
第二方面，本发明实施例提供一种与结直肠癌相关基因的甲基化检测方法，该方法以非疾病的诊断为目的，其包括：采用前述实施方式任一项所述的方法提取得到适用于结直肠癌相关基因的甲基化检测的DNA样本。
在可选的实施方式中，所述结直肠癌相关基因选自：SDC2、TFPI2、VIM、NDRG4、SFRP1、SFRP2、BMP3、MGMT、SPG20和SEPT9。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为：SDC2基因甲基化区分结直肠癌和正常样本的ROC曲线；
图2为：SDC2基因甲基化区分结直肠腺瘤和正常样本的ROC曲线；
图3为：TFPI2基因甲基化区分结直肠癌和正常样本的ROC曲线；
图4为：TFPI2基因甲基化区分结直肠腺瘤和正常样本的ROC曲线。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供的从粪便中提取适用于结直肠癌相关基因的甲基化检测的DNA样本的方法，其包括如下步骤：
(1)收集粪便样本，按照比例加入粪便保存液，充分振荡混匀，得到粪便稀释液样本；
粪便和粪便保存液按照质量体积比(g：ml)为1:3(1mg：3mL)，即每g粪便对应使用3ml保存液；
粪便保存液含有：300mmol/L EDTA、200mmol/L Tris·HCl和150mmol/L NaCl。
粪便保存液的配置方法为：取800mL无菌超纯水，加入24.23g Tris碱粉末后搅拌至完全溶解,加入8.77g NaCl后搅拌至完全溶解，加入100.86g EDTA二钠盐充分搅拌，测量pH值，用浓盐酸或氢氧化钠溶液将pH调节至8.0，定容至1L，充分搅拌。
(2)取1.8mL粪便稀释液样本至一洁净的2mL离心管中，12000rpm离心2min，从离心机中轻轻取出离心管，小心吸取1.2mL上清至一洁净的2mL离心管中。
(3)向1.2mL的样本上清中加入吸附剂，吸附剂与上清液的质量体积比为1:4(g:mL)涡旋振荡，使其充分混匀，12000rpm离心2min。
其中，所用吸附剂为交联聚乙烯吡咯烷酮粉末或交联聚乙烯吡咯烷酮片剂。
(4)将上清转移至一洁净2mL离心管中，等体积加入5mol/L的异硫氰酸胍，轻柔地颠倒混匀。
(5)将步骤(4)得到的含有上清的离心管置于90℃变性10min。
(6)捕获剂制备：
根据所要检测的基因的种类数量(即为提取的基因数量)，计算磁珠液(磁珠浓度为10mg/mL，标记有链霉亲和素)的使用量(磁珠液的用量确定后，捕获剂使用量即可确定)，当待测基因为一种时，磁珠液(浓度为10mg/mL)用量为3-7μL，本实施例优选为5μL；
即磁珠液的用量满足如下公式：V＝N*M；公式中，V表磁珠液的体积，N代表待提取基因的种类数量；M取值范围为3-7，单位为μL，本实施例优选为M＝5；
计算好磁珠液的用量后，按体积比为1:1的比例，将磁珠液与的探针液(探针浓度10uM，标记有生物素)混合，得到磁珠-探针混合液，体积记为V1，震荡混匀以使探针与磁珠偶联，再将磁珠-探针混合液置于磁力架上进行吸附，弃上清后加入缓冲液重悬一次，震荡混匀30s，瞬时离心1s，即得捕获剂。
上述的探针与待提取的结直肠癌相关基因的序列互补，其序列由需要提取的结直肠癌相关基因序列设计而得。结直肠癌相关基因的种类数量和对应的探针序列均可以根据实际需求确定。
(7)杂交孵育：将步骤(6)制得的经过重悬的捕获剂迅速向步骤(5)变性后的上清液中加入，颠倒混匀，孵育40min。
(8)吸磁分离：步骤(7)的混合液6min吸磁，弃上清，取磁珠沉淀。
(9)漂洗：向步骤(9)的2mL离心管加入1mL漂洗液(EDTA(PH8.0，5mM)、Tris-HCl(PH8.0，20mM))，震荡混匀5s，瞬时离心2～4s，置于磁力架上吸磁2min，弃上清。
(10)重复步骤(9)。
(11)洗脱：向步骤(10)的2mL离心管中加入40μL洗脱液，轻轻震荡混匀，吸磁2min，将上清转移至一洁净离心管中，即得所需DNA样本，该DNA可以用于后续结直肠癌相关基因的甲基化检测，根据甲基化的检测结果即可反应主体的结直肠癌患病情况或结直肠癌前病变情况。
当然，需要说明的是，所提取的DNA也可以进行其他类型的检测，并不限于甲基化检测，如一些基因的突变和结直肠癌的发生和发展相关，这些基因包括但不限于KRAS和TP53。
当然，所提取的DNA也可以进行其他肿瘤的检测，例如消化道肿瘤食管癌、胃癌、胰腺癌和胆囊癌等。
实施例2
本实施例提供了结直肠癌的检测方法，其包括如下步骤：
(a)从粪便中提取DNA样本
采用实施例1的方法从粪便中提取DNA样本，以SDC2和TFPI2基因为目标提取基因，在步骤(6)的捕获探针序列如下：
SDC2：TGCTTGCGGCACTCCCGTGTAACTCCTATG；
TFPI2：AAACTTTCTCCTGTAGTCCAGACGGGGACG。
得到以SDC2基因甲基化检测为主的DNA样本。
另外，在检测SDC2和TFPI2基因时，需要同时检测看家基因β-actin以作为内参，以β-actin为目标提取基因时，在步骤(6)的捕获探针序列如下：
ATTGGCAAGAGCCCGGCTCAGACAAAGACCC。
(b)亚硫酸盐转化
亚硫酸盐可将未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变，通过这种方法实现甲基化与非甲基化序列的区分，本实施例所用核酸转化试剂盒为ZYMORESEARCH的EZ DNA Methylation-Gold TM Kit，具体实验操作参见厂家说明书。
需要说明的是，在其他的实施方式中，可以通过其它方法检测标志物的甲基化情况，如亚硫酸盐测序、亚硫酸盐焦磷酸测序、微数组、质谱分析、变性高液相层析法、焦磷酸测序法、甲基化DNA免疫沉淀法与定量聚合酶链式反应、甲基化DNA免疫沉淀测序法或纳米孔测序法等。
(c)甲基化特异性PCR(Methylation Specific PCR,MSP)
对经步骤(b)转化后获得的DNA，采用MSP方法对SDC2和TFPI2基因的甲基化敏感位点进行检测，β-actin作为内参基因，SDC2、TFPI2和β-actin引物和探针序列见下表1，PCR反应体系见表2，PCR反应条件见表3。
表1 SDC2、TFPI2和β-actin引物和探针序列
上述SDC2探针、TFPI2和β-actin探针的5'端标记有荧光基团，3'端标记有淬灭基团，其中SDC2探针的荧光基团为FAM，淬灭基团为MGB-NFQ，TFPI2探针的荧光基团为ROX，猝灭基团为MGB-NFQ，β-actin探针的荧光基团为VIC，淬灭基团为MGB-NFQ。
表2 MSP反应体系
| 组分 | 规格 | 体积(μL) |
| 缓冲液 | 10× | 2.5 |
| dNTPs | 各2.5mM | 2 |
| SDC2正向引物 | 10μM | 0.5 |
| SDC2反向引物 | 10μM | 0.5 |
| SDC2探针 | 10μM | 0.5 |
| TFPI2正向引物 | 10μM | 0.5 |
| TFPI2反向引物 | 10μM | 0.5 |
| TFPI2探针 | 10μM | 0.5 |
| β-actin正向引物 | 10μM | 0.5 |
| β-actin反向引物 | 10μM | 0.5 |
| β-actin探针 | 10μM | 0.5 |
| DNA酶 | 5U/μL | 0.5 |
| 待测样本DNA | / | 5 |
| 纯化水 | / | 补至25 |
表3 MSP反应条件
质量控制：在每次检测时对阴性对照和阳性对照进行同步检测，其中阴性对照为超纯水，阳性对照为SDC2甲基化质粒、TFPI2甲基化质粒和β-actin质粒的混合物，其中这三种质粒的浓度均为1×104copies/μL。阴性对照要无明显指数增长期，Ct值为Undet/NoCt或Ct>40，阳性对照要有明显的指数增长期，且SDC2、TFPI2和β-actin的Ct值满足26≤Ct≤30。除阴性对照、阳性对照以外，检测样本的内参基因Ct值需满足Ct≤35；若Ct值>35，则表明加入的样本DNA含有PCR抑制剂或DNA加入量过少，需重新制备DNA或增加DNA上样量再进行检测。阴性对照、阳性对照及内参基因均满足上述要求后，表明本次实验有效，可进行下一步样本结果的判定。否则，当次实验无效，须重新进行检测。
(d)结果判定：通过阳性判断值确定待测样本的Ct值的cut-off值，待测样本SDC2基因Ct值若满足Ct≤38，则该样本为SDC2甲基化阳性(SDC2+)；若Ct>38，则该样本为SDC2甲基化阴性(SDC2－)；待测样本TFPI2基因Ct值若满足Ct≤38，则该样本为TFPI2甲基化阳性(TFPI2+)；若Ct>38，则该样本为TFPI2甲基化阴性(TFPI2－)。值得注意的是，只有当SDC2和TFPI2同时为甲基化阴性时(SDC2-TFPI2-)，则判断为阴性，当SDC2和TFPI2至少有一个为甲基化阳性时(SDC2+TFPI2-/SDC2-TFPI2+/SDC2+TFPI2+)，则判断为阳性。
实验例1
验证实施例2的方法的灵敏度和特异性
从武汉大学中南医院收集了696例粪便样本，其中289例为结直肠癌样本，190例为结直肠腺瘤样本，217例为正常样本，粪便样本的临床信息如表4所示，粪便样本的SDC2和TFPI2甲基化检测结果如表5所示。
统计分析：根据SDC2和TFPI2的检测结果，按照如下公式计算得到敏感性和特异性，应用SPSS23.0软件进行统计分析，针对结直肠癌粪便样本检测结果利用ROC(ReceiverOperating Characteristic)曲线对SDC2和TFPI2的分群效能进行评估，计算AUC(Areaunder Curve)曲线下面积、敏感性和特异性。
敏感性(Sensitivity)＝真阳性人数/(真阳性人数+假阴性人数)*100％；
特异性(Specificity)＝真阴性人数/(真阴性人数+假阳性人数)*100％。
表4 696例粪便样本的临床信息
表5 696例粪便样本的SDC2和TFPI2甲基化检测结果
SDC2区分结直肠癌样本和正常样本的ROC曲线如图1所示，区分结直肠腺瘤样本和正常样本的ROC曲线如图2所示；TFPI2区分结直肠癌样本和正常样本的ROC曲线如图3所示，区分结直肠腺瘤样本和正常样本的ROC曲线如图4所示。
上述结果显示，实施例2的方法检测SDC2和TFPI2时均具有较高的AUC，可以实现对结直肠癌或癌前病变的诊断。
实施例3
本实施例提供的从粪便中提取适用于结直肠癌相关基因的甲基化检测的DNA样本的方法与实施例1基本相同，不同的是，在步骤(3)中，吸附剂与上清液的质量体积比为1:2(g:mL)。
对比例1
本对比例提供的从粪便中提取适用于结直肠癌相关基因的甲基化检测的DNA样本的方法与实施例1基本相同，不同的是，在步骤(3)中，吸附剂与上清液的质量体积比为1:6(g:mL)。
对比例2
本对比例提供的从粪便中提取适用于结直肠癌相关基因的甲基化检测的DNA样本的方法与实施例1基本相同，不同的是，在步骤(3)中，吸附剂与上清液的质量体积比为1:8(g:mL)。
实验例2
检测实施例1、实施例3、对比例1和2的提取效果
选取三例结直肠癌(样本1、2、3)、三例结直肠腺瘤(样本10、11、12)和三例健康人(样本19、20、21)的粪便样本(样本信息见表6)，采用实施例1、实施例3、对比例1和2的方法提取DNA样本，以SDC2和TFPI2基因作为检测基因，β-actin基因为内参，并参考实施例2中的甲基化检测方法检测Ct值，结果见如下表7。
表6样本信息
| 样本编号 | 性别 | 年龄 | 肠镜/病理 |
| 样本1 | 男 | 65 | 结直肠癌 |
| 样本2 | 女 | 71 | 结直肠癌 |
| 样本3 | 男 | 56 | 结直肠癌 |
| 样本4 | 男 | 78 | 结直肠癌 |
| 样本5 | 女 | 80 | 结直肠癌 |
| 样本6 | 女 | 66 | 结直肠癌 |
| 样本7 | 男 | 63 | 结直肠癌 |
| 样本8 | 男 | 84 | 结直肠癌 |
| 样本9 | 男 | 78 | 结直肠癌 |
| 样本10 | 男 | 77 | 结直肠腺瘤 |
| 样本11 | 女 | 75 | 结直肠腺瘤 |
| 样本12 | 女 | 69 | 结直肠腺瘤 |
| 样本13 | 男 | 71 | 结直肠腺瘤 |
| 样本14 | 男 | 76 | 结直肠腺瘤 |
| 样本15 | 女 | 81 | 结直肠腺瘤 |
| 样本16 | 女 | 54 | 结直肠腺瘤 |
| 样本17 | 男 | 63 | 结直肠腺瘤 |
| 样本18 | 男 | 67 | 结直肠腺瘤 |
| 样本19 | 男 | 51 | 健康 |
| 样本20 | 男 | 57 | 健康 |
| 样本21 | 女 | 62 | 健康 |
| 样本22 | 女 | 49 | 健康 |
| 样本23 | 女 | 33 | 健康 |
| 样本24 | 男 | 41 | 健康 |
| 样本25 | 女 | 71 | 健康 |
| 样本26 | 女 | 68 | 健康 |
| 样本27 | 男 | 54 | 健康 |
| 样本28 | 男 | 62 | 健康 |
| 样本29 | 男 | 59 | 健康 |
表7
从上表可以看出，实施例3和实施例1中的β-actin和SDC2基因的Ct值较低，均小于对比例1和对比例2，其中实施例1的Ct值最小(P<0.05)，表明实施例3和实施例1的目标基因的DNA样本含量高，提取效果好。
需要说明的是，目标基因的含量一般情况下非常少，不合适用紫外分光光度计测浓度，另外浓度低加上一些基因会有碎片化，琼脂糖凝胶电泳也无法区分浓度差别，再加上残留的微量磁珠也可能会对测出的浓度值有影响，使用这些指标反映提取效果非常不准，没有参考意义。因此，我们采用Ct值反映不同提取方法效果的优劣，更具有参考意义，Ct值越大，代表目标基因的含量越低，说明提取效果较差，Ct值越小，代表目标基因的含量较高，说明提取效果较好。
实施例4
本实施例提供的从粪便中提取适用于结直肠癌相关基因的甲基化检测的DNA样本的方法与实施例1基本相同，不同的是，在步骤(5)中的变性时间为15min。
对比例3
本对比例提供的从粪便中提取适用于结直肠癌相关基因的甲基化检测的DNA样本的方法与实施例1基本相同，不同的是，在步骤(5)中的变性时间为6min。
对比例4
本对比例提供的从粪便中提取适用于结直肠癌相关基因的甲基化检测的DNA样本的方法与实施例1基本相同，不同的是，在步骤(6)中的变性时间为8min。
实验例3
检测实施例1、实施例4、对比例3和4的提取效果
选取三例结直肠癌(样本1、2、3)、三例结直肠腺瘤(样本10、11、12)和三例健康人(样本19、20、21)粪便样本(样本信息见表6)，采用实施例1、实施例4、对比例3和4的方法提取DNA样本，以SDC2基因作为检测基因，β-actin基因为内参，并参考实施例2中的甲基化检测方法检测Ct值，结果见如下表8。
表8
表8结果显示，相较于对比例3和4，实施例1和实施例4的Ct值较小(P<0.05)，说明变性时间控制在10-15min具有较好的提取效果，在10-15min的范围内，从节约时间成本的角度考虑，可将变性时间定为10min。
实施例5
本实施例提供的从粪便中提取适用于结直肠癌相关基因的甲基化检测的DNA样本的方法与实施例1基本相同，不同的是，在步骤(6)中，磁珠液体积为3uL。
实施例6
本实施例提供的从粪便中提取适用于结直肠癌相关基因的甲基化检测的DNA样本的方法与实施例1基本相同，不同的是，在步骤(6)中，磁珠液体积为7uL。
实验例4
检测实施例1、实施例5和实施例6的提取效果
选取三例结直肠癌(样本4、5、6)、三例结直肠腺瘤(样本13、14、15)和三例健康人(样本22、23、24)的粪便样本(见表6)，采用实施例1、实施例5和6的方法提取DNA样本，以SDC2和TFPI2基因作为检测基因，β-actin基因为内参，并参考实施例2中的甲基化检测方法检测Ct值，结果见如下表9。
表9
从表9可以看出，实施例1较实施例5和6具有较小的Ct值(P<0.05)，说明实施例1的提取效果更高。
实施例7
本实施例提供的从粪便中提取适用于结直肠癌相关基因的甲基化检测的DNA样本的方法与实施例1基本相同，不同的是，在步骤(6)中，磁珠液与探针液体积比为1:1.5。
对比例5
本对比例提供的从粪便中提取适用于结直肠癌相关基因的甲基化检测的DNA样本的方法与实施例1基本相同，不同的是，磁珠液与探针液体积比为1:0.5。
对比例6
本对比例提供的从粪便中提取适用于结直肠癌相关基因的甲基化检测的DNA样本的方法与实施例1基本相同，不同的是，磁珠液与探针液体积比为1:2。
实验例5
检测实施例1、实施例7和对比例5-6的提取效果
选取三例结直肠癌(样本4、5、6)、三例结直肠腺瘤(样本13、14、15)和三例健康人(样本22、23、24)的粪便样本(见表6)，采用实施例1、实施例7和对比例5-6的方法提取DNA样本，以SDC2和TFPI2基因作为检测基因，β-actin基因为内参，并参考实施例2中的甲基化检测方法检测Ct值，结果见如下表10。
表10
表10结果显示，实施例1和7的Ct值比对比例5和6的Ct值更小(P<0.05)，说明将磁珠液与探针液的体积比控制在1:1-1.5的范围具有更好的提取效果，尤其是实施例1的Ct值最小，说明磁珠液与探针液的体积比控制在1:1，具有更佳的提取效果。
实施例8
本实施例提供的从粪便中提取适用于结直肠癌相关基因的甲基化检测的DNA样本的方法与实施例1基本相同，不同的是，在步骤(7)中，杂交孵育的时间为60min。
实施例9
本实施例提供的从粪便中提取适用于结直肠癌相关基因的甲基化检测的DNA样本的方法与实施例1基本相同，不同的是，在步骤(7)中，杂交孵育的时间为90min。
对比例7
本对比例提供的从粪便中提取适用于结直肠癌相关基因的甲基化检测的DNA样本的方法与实施例1基本相同，不同的是，在步骤(7)中，杂交孵育的时间为20min。
实验例6
检测实施例1、实施例8、实施例9和对比例7的提取效果
选取三例结直肠癌(样本7、8、9)、三例结直肠腺瘤(样本16、17、18)和三例健康人(样本25、26、27)的粪便样本(见表6)，采用实施例1、实施例8、实施例9和对比例7的方法提取DNA样本，以SDC2和TFPI2基因作为检测基因，β-actin基因为内参，并参考实施例2中的甲基化检测方法检测Ct值，结果见如下表11。
表11
从表11可以看出，实施例1、8和9的Ct值明显低于对比例7(P<0.05)，说明实施例1、8和9的提取效果较好，需要注意的是，实施例1的Ct值又低于实施例8和9，说明将孵育时间控制在40min，其提取效果更佳。
实施例10
本实施例提供的从粪便中提取适用于结直肠癌相关基因的甲基化检测的DNA样本的方法与实施例1基本相同，不同的是，在步骤(2)中，粪便稀释液样本的体积为1.5mL。
实施例11
本实施例提供的从粪便中提取适用于结直肠癌相关基因的甲基化检测的DNA样本的方法与实施例1基本相同，不同的是，在步骤(2)中，粪便稀释液样本的体积为1mL。
实施例12
本实施例提供的从粪便中提取适用于结直肠癌相关基因的甲基化检测的DNA样本的方法与实施例1基本相同，不同的是，在步骤(2)中，粪便稀释液样本的体积为0.5mL。
实验例7
检测实施例1、实施例10-12的提取效果
选取三例结直肠癌(样本7、8、9)、三例结直肠腺瘤(样本16、17、18)和三例健康人(样本25、26、27)的粪便样本见表6)，采用实施例1、实施例10-12的方法提取DNA样本，以SDC2和TFPI2基因作为检测基因，β-actin基因为内参，并参考实施例2中的甲基化检测方法检测Ct值，结果见如下表12。
表12
从表12可以看出，采用少量的粪便稀释液样本，其Ct值均较小，根据各实施例得到的DNA样本的甲基化检测结果所判断的结直肠癌患病情况与预期结果(即各样本在表6中的肠镜结果)完全一致，说明本发明实施例的方法采用较少的粪便稀释液样本其提取效果较好，其仍然可以取得较为准确的检测效果。
实验例8
比较实施例1的提取方法与现有市面上的试剂盒的提取方法的提取效果
选取三例结直肠癌(样本7、8、9)、三例结直肠腺瘤(样本16、17、18)和三例健康人(样本25、26、27)的粪便样本(见表6)，对这9例粪便样本采取两种DNA提取方式，一种为实施例1的提取方法；一种为粪便全基因组提取方式，所用试剂盒为QIAamp DNA Stool Minikit(QIAGEN)，具体操作步骤参见厂家说明书。以SDC2和TFPI2基因作为检测基因，β-actin基因为内参，并参考实施例2中的甲基化检测方法检测Ct值，结果见如下表13。
表13
表13的结果表明，实施例1的β-actin基因和SDC2基因的Ct值更小(P<0.05)，全基因组提取的方法获得的β-actin基因的Ct值多数(7/9)大于35或者无法检测，基本等同于该样本无效检测；对于检测基因SDC2基因或TFPI2基因则均有50％以上的阳性样本无法检测，说明实施例1的提取效果更好，明显优于全基因组提取方式。
实验例9
配置12种粪便保存液(1-12)，各个保存液(1-12)的成分浓度如下表14所示。
表14
可以看出，粪便保存液1-4的区别在于EDTA-2Na的浓度不同，其余两种组分的浓度相同；粪便保存液5-8的区别仅在于Tris·HCl的浓度不同，其余两种组分的浓度相同；粪便保存液9-12的区别仅在于NaCl的浓度相同，其余两种组分的浓度相同。
收集两例健康人的粪便样本(样本28和样本29)，对每例样本进行12组实验：即将每例样本分成12份，每份分别按照质量(g)体积(mL)比1:3的比例分别加入保粪便保存液1-12，按照前述步骤提取转化粪便中的β-Actin基因，并对转化后的序列进行PCR扩增，读取每组实验的Ct值，每组实验设置两个复孔，取两个复孔Ct值的平均值。结果如下表15所示。
表15
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | |
| 样本28 | 32.35 | 31.74 | 31.27 | 31.50 | 31.80 | 31.54 | 31.29 | 31.18 | 32.05 | 31.40 | 31.25 | 31.17 |
| 样本29 | 34.11 | 33.70 | 33.56 | 33.41 | 33.90 | 33.62 | 33.48 | 33.52 | 34.08 | 33.56 | 33.70 | 33.43 |
从上述结果可以看出，当EDTA-2Na、Tris·HCl和NaCl的浓度降低时，样本的Ct值有延后的趋势(比较表15中第1列和第4列的数据、第5列和第8列的数据及第9列和第12列的数据)，但延后的范围在1个Ct值之内。整体来看，当EDTA-2Na浓度在100-300mmol/L范围内、Tris·HCl浓度在50-300mmol/L范围内、NaCl的浓度在50-200mmol/L范围内时，使用不同配比的粪便保存液均能实现较为一致的检测结果，表明这些浓度范围内的保存液能有效抑制核酸酶、缓冲溶液pH及抑制细菌生长。
综上结果，本发明实施例提供的提取方法具有如下优点：
1.目前粪便DNA提取的方法大多是全DNA提取，采用这种方式提取的DNA背景较复杂，特异性差，不利于下游分析，实验例8对比了全基因组提取和特定基因富集提取这两种方法，结果表明探针富集法对结直肠癌的检测效果显著优于全基因组提取法。
2.本发明实施例提供的提取方法通过优化DNA提取过程中的重要参数，达到了仅用少量样本便可实现对结直肠癌的早期检测的目的，准确性高，其中SDC2基因甲基化对结直肠癌的灵敏性高达86.9％，对结直肠腺瘤的检测灵敏性为56.3％，特异性高达95.9％；TFPI2基因甲基化对结直肠癌的灵敏度高达90.3％，对结直肠腺瘤的检测灵敏度为62.1％，特异性高达94.0％。
3.有极少数现有技术采用磁珠富集靶标DNA的方式，但所用的粪便溶液体积较大，导致需要用到特殊的耗材和设备(如5mL、15mL和50mL的离心管及相应的离心机等)且操作步骤繁琐、耗时(如一台大型离心机一次只能离心少量样本等)，本发明实施例的提取方法采用小体积(不高于2mL)提取的方式，仅需要使用至少0.5-1.8mL的粪便样本，便能实现对目标DNA的有效富集，大大简化了操作步骤，显著节约了实验操作时间。另外，本发明实施例的提取方法中仅需用到2mL、1.5mL EP管和普通的小型离心机，大大节约了成本，同时显著提升了检测通量。
以24例粪便样本的提取实验为例，说明小体积提取和大体积提取相比的优势，具体见下表：
从表中可以看出，由于1个样本在一次实验中通常至少需要离心2-3次，当提取24例样本时，小体积提取比大体积提取可平均节约人力时间2小时、节约离心管费用60元左右，当把样本量扩大到数十万甚至数百万级别时，小体积提取方法产生的经济效益是巨大的。
4.本发明提供的方法可搭配自动化仪器或平台使用，可进一步提升粪便DNA的提取效率。
5.现有技术在DNA提取过程中多会使用到有机溶剂，本发明提供的提取方法为磁珠法，不涉及有机溶剂，操作安全简便，通过对目的基因的富集，大大提升了DNA提取的特异性。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 武汉艾米森生命科技有限公司
<120> 从粪便中提取DNA样本的方法和结直肠癌相关基因的甲基化检测方法
<150> 201911314364.6
<151> 2019-12-19
<160> 9
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ccagttttta aatcctgagt caagc 25
Claims (11)
1.一种从粪便中提取DNA样本的方法，所述DNA样本适用于结直肠癌或结直肠癌前病变相关基因的甲基化检测，其特征在于，其包括：预处理步骤、吸附步骤、捕获步骤、核酸变性步骤和孵育步骤；
预处理步骤：离心粪便稀释液样本，得到第一上清液；所述粪便稀释液样本中的粪便取自于需要结直肠癌检测的主体；离心时，单个离心管中的粪便稀释液样本的体积为0.5-1.8mL；所述粪便稀释液样本由粪便和粪便保存液按照质量体积比为1:3的比例混合而成；
吸附步骤：将吸附剂与所述第一上清液混匀以去除所述上清液中的杂质，得到第一混合液，对所述第一混合液离心，得到第二上清液；所述吸附剂与所述第一上清液的质量体积比为1:（2-4）；
捕获步骤：往所述第二上清液中加入捕获剂，得到第二混合液；其中，所述捕获剂含有偶联有探针的磁珠，所述探针与待提取基因序列的某一段互补；所述待提取基因包括SDC2和TFPI2基因；所述探针序列如下：
SDC2：TGCTTGCGGCACTCCCGTGTAACTCCTATG；
TFPI2：AAACTTTCTCCTGTAGTCCAGACGGGGACG；
所述捕获剂通过如下方法制得：
将含有磁珠的磁珠液与所述探针的探针液混合，得到磁珠-探针混合液，其体积记为V1，混匀磁珠-探针混合液以使所述探针与磁珠偶联，再将所述磁珠-探针混合液置于磁力架上进行吸附，弃上清后，加入体积为V1的缓冲液重悬磁珠，即得所述捕获剂；
其中，所述磁珠液中的磁珠的浓度为9-11mg/mL，所述探针液中的所述探针的浓度为9-11uM；所述磁珠液的用量满足如下公式：V=N*M；公式中，V代表所述磁珠液的体积，N代表待提取基因的种类数量，M=5，单位为μL；所述磁珠液与所述探针液的体积比为1:(1-1.5)；所述缓冲液含有：200mmol/LTris·HCl和100mmol/LNaCl；
核酸变性步骤：对第二上清液进行变性处理以使DNA双链结构形成单链结构；所述变性处理的温度85-95℃，时间为10-15min；
孵育步骤：将所述第二混合液静置孵育40-90min。
2.根据权利要求1所述的从粪便中提取DNA样本的方法，其特征在于，所述预处理步骤中，离心时单个离心管中的粪便稀释液样本的体积为1.8mL。
3.根据权利要求1所述的从粪便中提取DNA样本的方法，其特征在于，所述预处理步骤中，离心的参数设置如下：
转速10000-13000rpm，时间10s-5min。
4.根据权利要求1所述的从粪便中提取DNA样本的方法，其特征在于，所述吸附剂选自交联聚乙烯吡咯烷酮。
5.根据权利要求4所述的从粪便中提取DNA样本的方法，其特征在于，所述交联聚乙烯吡咯烷酮为交联聚乙烯吡咯烷酮粉末或交联聚乙烯吡咯烷酮片剂。
6.根据权利要求5所述的从粪便中提取DNA样本的方法，其特征在于，所述吸附剂与所述第一上清液的质量体积比为1:4。
7.根据权利要求1所述的从粪便中提取DNA样本的方法，其特征在于，所述变性处理的时间为10min。
8.根据权利要求1所述的从粪便中提取DNA样本的方法，其特征在于，所述磁珠液与所述探针液的体积比为1:1。
9.根据权利要求8所述的从粪便中提取DNA样本的方法，其特征在于，所述磁珠上标记有链霉亲和素，所述探针标记有生物素。
10.根据权利要求1所述的从粪便中提取DNA样本的方法，其特征在于，所述第二混合液静置孵育的时间为40min。
11.一种结直肠癌相关基因的甲基化检测方法，该方法以非疾病的诊断为目的，其特征在于，其包括：采用权利要求1-10任一项所述的方法提取得到适用于结直肠癌或结直肠癌前病变相关基因的甲基化检测的DNA样本。
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Denomination of invention: A method for extracting DNA samples from feces and a methylation detection method for colorectal cancer related genes Granted publication date: 20230217 Pledgee: Wuhan Optics Valley Small and Medium Duty Venture Capital Co.,Ltd. Pledgor: WUHAN AIMISEN LIFE TECHNOLOGY Co.,Ltd. Registration number: Y2024980014407 |