CN105349686A - 一种结直肠癌检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物医药领域，涉及一种结直肠癌检测试剂盒，更具体地为以粪便为检测样本的结直肠癌检测试剂盒，其特征在于含有Alu检测试剂和PvPP。本发明在众多结直肠癌标记物中经过多次探索，摸索出Alu在合适的简单前处理条件下，可以不经过细胞破碎、DNA提取等复杂步骤，即可直接将样品稀释进行PCR扩增检测，并获得良好的敏感度和特异性。

Description

一种结直肠癌检测试剂盒

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及一种结直肠癌检测试剂盒，尤其涉及一种以粪便为检测样本的简易的结直肠癌检测试剂盒。

背景技术

目前在结直肠癌筛查上主要有两种常用技术。

一种是大便隐血试验。通常肠癌的发生演变在早期可以没有任何征兆，癌细胞可在大肠肠壁上生长数十年再转移到其他部位，在没有任何症状前，增生的组织可渗出少量血液，血液进入大便被排出。而大便隐血试验就是检测大便中的血液成分(检测对象是血红蛋白)，若多次、持续的阳性反应提示消化道出血，应做进一步检查以警惕肠道肿瘤的发生。该法的优点是结果显示快、清晰，结果可以半定量。但其存在一系列缺点：首先，其特异性差，受饮食影响大。含亚铁离子的食物和药物对结果有干扰，假阳性率30％。隐血检查前，指导患者应避免服用铁剂、动物血、肝类、瘦肉以及大量绿叶蔬菜3天，如有牙龈出血，误咽下血性唾液，以防粪便隐血检查呈假阳性；其次，其敏感度低，出血量>90μg/ml才能检出；再次，该方法学限制条件多：患者提前准备时间长，由于取材部位不同，反应时间不同，对显色的判断不同，故在同一方法的试验中，也可产生误差，因此一般测试时候均要求患者采用不同天的粪便样品连续测定。

另一种方法是肠镜检查。目前肠镜检查对于肠内病变诊断而言，是最有效可靠的诊断方法。绝大多数早期肠癌患者可由内镜检查发现并确诊。它通过肛门插入可检查到直肠、乙状结肠、降结肠、横结肠、升结肠和盲肠以及与大肠相连的一小段小肠(回盲末端)。通过镜子不但可以清楚地发现肠道病变，还可对部分肠道病变进行治疗，如：大肠息肉等良性病变镜下直接摘除，对肠道出血进行镜下止血，对大肠内异物进行清除。肠镜检查技术是目前其它诊疗手段无法替代的主要手段。目前肠镜检查对于肠内病变诊断而言，是最有效可靠的诊断方法。然而，其也存在一系列的缺点：首先，其需要检查前准备，作肠镜需要在检查前3天开始进食流质或少渣半流质饮食，检查当天上午空腹，检查前一天开始服用甘露醇等导泻剂清洁肠道，服用的液体量通常高达2L，清洁灌肠以保证肠道的清洁度，之后不能再进食。检查时医生会通过肠镜向肠腔内注入一定量气体使肠道膨大便于观察。由于结肠结构迂回曲折，检查过程中被检查者会有不同程度的胀痛或牵拉感觉。对于过分紧张或高度肠痉挛的受检者，则需要使用镇静剂或解痉药物。对于不能配合的小儿，则需要在麻醉下进行。其次，其对医生的操作熟练水平有很高的要求，初学者容易在肠镜下遗漏病变部位造成漏诊。由于检查过程中需要注入气体，会使肠内压力增大，易引起穿孔。再次，病人在检查过程中费力，费时，有一定的痛苦。并且检查费用高，较难大规模推广。

除了上述两种方法之外，分子诊断方法是近年来发展迅速的癌症诊断方法。目前已报道的(伍勇等)结直肠癌分子诊断法中，有采用粪便DNA检测并结合FOBT联合诊断的方法，该方法需要首先对粪便中的DNA进行提取，再检测标记物APC、K-ras、p53。

粪便是人或动物的食物残渣排泄物。粪便的四分之一是水分，其余大多是蛋白质、无机物、脂肪、未消化的食物纤维、脱了水的消化液残余、以及从肠道脱落的细胞和死掉的细菌，还有维生素K、维生素B、粪胆色素和尿胆素。正常情况下人的消化道上皮也会脱落一些细胞，这些正常方式脱落的细胞进行程序性坏死，使其细胞中含有的核酸自然降解掉，所以在正常人的粪便中基本检测不到人的核酸。但是当消化道出现病变，或者发生癌变时，消化道内会有大量的体细胞或者癌细胞，非正常脱落。这些细胞不会启动程序性坏死程序，其细胞内的核酸不会自发的降解掉。这些脱落的细胞随着肠道内容物向下游运动，并在肠道菌群的作用下细胞被破坏，其中的核酸释放出来被降解成短的片段DNA。这些短片段的人的DNA和肠道内的数以亿计的细菌以及食物残渣和代谢产物混合在一起形成粪便被排除体外。消化道的病变越严重或者是消化道肿物体积越大和肿瘤性质越恶变，肠道内混入的人的核酸就越多。

李建生等研究了定量检测粪便中长DNA片段在大肠癌诊断中的意义，其公开了通过荧光定量AluPCR检测粪便中长DNA片段，可以作为一种潜在的大肠癌筛查方法。典型的人基因组Alu序列长282bp，由两个同源但有差别的亚基构成。限制性剪切酶AluI可将其剪切成130bp和170bp两段，因此将其定名为Alu序列，平均每5kbDNA就有一个Alu序列。Alu序列一般散在分布，少数呈簇状分布。在细胞遗传学水平上观察，Alu重复序列集中在基因转录最活跃的染色体区段内。在所有已知的基因内含子中，几乎都发现了Alu序列。由于Alu序列的特殊性，使用特异的引物对该序列扩增可以将人类的基因组DNA与非人类基因组DNA区分开来。李建生等公开的该方法首先提取粪便中的DNA，再对其中的Alu进行检测，其诊断大肠癌总的敏感性为46.67％。

但由于粪便成份复杂，因此无法直接用PCR进行扩增。若要检测粪便中人的核酸通常的办法是采用核酸抽提的方法，先使用机械力使粪便充分的混匀和碎裂，然后使用有机溶剂或者是磁珠捕获的方式将全部的或者是需要的核酸富集起来，之后再经过纯化，然后才能进行PCR扩增实验，步骤繁琐、费时。

发明内容

本发明目的在于提供一种使用方便、前处理简单的结直肠癌检测试剂。

本发明所提供的结直肠癌诊断试剂可以简便地以粪便作为检测样本，对结直肠癌进行诊断。

发明通过以下技术方案实现上述目的：

首先，发明提供了一种结直肠癌检测试剂盒，其含有Alu(Arthrobacterluteus)检测试剂和PvPP。

本发明与现有技术最显著的区别在于提供一种操作方式极其简单的检测试剂。其不需要经过任何细胞破碎或DNA提取过程。这在此前的结直肠癌分子诊断中都是从未出现过的。

首先，发明找到了一种合适的样本，其为粪便样本，这种无创式的取样方式所获得的样本可以通过本发明首次发现的简便方法得以检测出肠癌标记物。

目前，几乎所有的分子标记检测方法都离不开DNA的提取，而这些方法几乎都需要使用酶类和有机溶剂，常用的DNA提取方法例如：

一、酚抽提法：先用蛋酶K、SDS破碎细胞，消化蛋白，然后用酚和酚-氯DNA大小为100-150kb；

二、异丙醇沉淀法：用二倍容积异丙醇替代乙醇，沉淀DNA，同时可去除小分子RNA(在异丙醇中可溶状态)；

三、表面活性剂快速制备法：用TritonX-100A或NP40表面活性剂破碎细胞，然后用蛋白酶K或酚去除蛋白，乙醇沉淀或透析；等等。

而在以粪便为检测样本的分子检测方法中，由于粪便中的基质成分非常复杂，DNA的提取更是其中必不可少的一步，并且其提取过程十分繁杂，如上述李建生等所采用的方法，就多达20步，其需要使用多种试剂，不可或缺的例如蛋白酶K、乙醇。

而本发明首次发现了一种可以无需进行粪便DNA提取，而是将未经DNA抽提的粪便或粪便混悬上清液进行简单前处理再直接进行PCR扩增来实现结直肠癌标记物的粪便检测的方法。因此本发明所提供的检测试剂盒不含酶类、有机溶剂等DNA提取试剂。这使得其在便于操作的同时也成为一种环境友好的试剂盒。

该技术的成功实施一方面离不开合适的结直肠癌标记物的筛选。同时，合适的前处理方式(添加PvPP)才能进一步促进Alu的顺利扩增。

在众多的结直肠癌标记物中，发明人成功地筛选出Alu这种标记物，其可以在合适的条件下，无需进行粪便总DNA提取而直接以PvPP前处理的方式进行PCR扩增及检测。

因此，发明人首次提供了一种以粪便为检测样本，可直接进行PCR扩增的结直肠癌检测试剂盒，其含有Alu检测试剂，同时特别优选地，需要同时配有交联聚乙烯吡咯烷酮(PvPP，polyvinyl-polypyrrolidone)。此时，在对粪便进行稀释之后，即可扩增出Alu，因此可选地该试剂盒中可配有对粪便样本进行直接稀释的稀释液，以更方便操作者的使用，但当然由于稀释液例如水的获取简单，因此，稀释液并非试剂盒的固定组分。

PvPP的存在可以保证稀释前处理后的待测样本能更顺利地进行扩增，从而获得很高的灵敏度和特异性。这对高准确率的结直肠癌筛查来说是非常重要的。而其简便的操作、环境友好及廉价的方式使其非常适合于作大规模的筛查手段，很有望发展成为大群体防范性的初步筛查。

交联聚乙烯吡咯烷酮(PvPP)，又称交联聚维酮。呈白色或近白色，具有吸湿性易流动的粉末，无臭或微臭，不溶于水、碱、酸及常用有机溶剂，具有很强的膨胀性能和与多类物质的络合能力。发明人通过将粪便样本进行直接稀释后加入PvPP，可去除PCR抑制物，并且Alu在经过PvPP处理过的粪便样本中可以直接进行PCR扩增和检测，此时无需进行任何DNA提取即可顺利实现Alu的检测。

在添加PvPP的情况下，只需要20倍的稀释度即可实现扩增；而在40倍的稀释度下扩增曲线则非常明显(图1b)。因此，在实际操作中，只需要取适量粪便样品在几十毫升甚至几毫升的容器中进行一次稀释，加入PvPP，再进行适当的离心，即可完成前处理，进而进行扩增。这样简便的20倍(或更优地40倍)稀释+PvPP的前处理方式即实现了粪便样品中分子标记物的扩增检测，超出了本领域技术人员的预期。

稀释液的体积与粪便样本的质量比为至少20:1；更优选为20:1～8000:1；更优选为20:1～4000:1；更优选为40:1～4000:1。

优选地，PvPP的含量与粪便样本质量比的1:10-10:1。

在本发明的可选的实施例中，PvPP可以是水的悬浊液或负载于离心管中。

在本发明的一个实施例中，所采用的PvPP为1％-50％浓度(w/w)的悬浊液。优选地为5％～20％。

在本发明的另一个实施例中，所述的PvPP负载于离心管，可通过以下方法获得：将1％-50％浓度的PvPP悬浊液加适量于离心管中，750g-17000g离心30s-15min，离心后吸走上层液体后而得。

更具体地讲，本发明所提供的试剂/试剂盒可通过以下的样本处理及检测方法，简便地实现结直肠癌的诊断。

样品的处理：

本方法使用的样品为新鲜的或者是添加了缓冲液(比如生理盐水，TE，PBS等不含有DNA降解成份的溶液)的粪便样品；

样品的使用量优选为粪便量最少10mg；

样品经过PvPP处理，所用到的PvPP可以是干粉状态或是与其它塑型剂混合而成的有一定形状，而装填在特定的器皿内或是其水悬浊液状态。

优选地所述PvPP的用量与粪便量的关系为：PvPP与粪便的质量比为1:10或以上，更优选1:5或以上。

优选地，采用稀释液(水或者TE缓冲液等)对样品进行稀释：将样品进行至少20倍以上的高度稀释；更优选100-2000倍，更优选200-800倍。也即是说，每g粪便的稀释液用量至少为20ml。

样品的检测：

使用一般的荧光定量PCR体系(使用聚合酶，饱和或者非饱和的荧光染料，以及相适应的Mg²⁺，dNTPs或者其它添加剂)和相应的荧光定量PCR仪进行检测。

按照行业内技术人员通用的PCR反应体系进行扩增。反应的升降温程序适应较广，按照业内技术人员通用的2步法或3步法扩增。

发明所采用的引物可以是通过常规方法设计所得的引物。采用针对Alu的多种引物，均可采用本发明简单的样品处理方法扩增出粪便样品中的肠癌标记物。例如：

SEQIDNO.1：GCCTGTAATCCCAGCACTTT，

SEQIDNO.2：CTCACTGCAACCTCCACCTC；或者，

SEQIDNO.3:TCGCCCAGGCTGGAGTGCA，

SEQIDNO.4:ACGCCTGTAATCCCAGCACTT；或者，

SEQIDNO.5：GGAGTTCTGGGCTGTAGTGC，

SEQIDNO.6：ATCAGCACGGGAGTTTTGAC；或者，

SEQIDNO.7：CCAGGAGTTCTGGGCTGTAG，

SEQIDNO.6：ATCAGCACGGGAGTTTTGAC；或者，

SEQIDNO.5：GGAGTTCTGGGCTGTAGTGC，

SEQIDNO.8：AAGAGACGGGGTCTCGCTAT；或者

SEQIDNO.5：GGAGTTCTGGGCTGTAGTGC，

SEQIDNO.9：CTGATCAGCACGGGAGTTTT；或者

SEQIDNO.10：GTGCCTGTAGTCCCAGCTA，

SEQIDNO.11：ACTCCTGGACTCAAGCGATC；或者

SEQIDNO.12：CTACTCGGGAGGCTGAGGT，

SEQIDNO.13：CTGGACTCAAGCGATCCTCC。

在本发明一个特别优选的实施例中，扩增体系中采用的引物为：

SEQIDNO.1：GCCTGTAATCCCAGCACTTT

SEQIDNO.2：CTCACTGCAACCTCCACCTC

与现有技术相比，本发明具有以下优势：

1.本发明方案无需进行繁琐的样品处理，省时，省力。本方法直接对样品进行稀释后使用，优选地进行PvPP处理。整个过程操作简单，耗用时间短，处理好一个样品平均只需花费2min的时间。而传统方法若要检测粪便中人的核酸通常的办法是采用核酸抽提的方法，先使用机械力使粪便充分的混匀和碎裂，然后使用有机溶剂或者是磁珠捕获的方式将全部的或者是需要的核酸富集起来，之后再经过纯化，然后才能进行PCR扩增实验，整个过程处理单个样品大概花费4个小时左右。传统方法不仅耗时，耗力，而且由于操作步骤繁琐，极易造成样品间的污染和差错。

2.使用荧光定量PCR仪扩增，直接检测粪便中的DNA片段，操作简便，灵敏度高。传统结直肠癌筛查的方法是通过化学法或者是免疫法检测粪便中的血红蛋白的含量，该种方法只有在肠道出血后才能在粪便中检测到，无法检测到肠道病变早期以及病变未引起出血的情况，而且使用化学法检测的灵敏度低，使用免疫法检测虽然可以获得较高的灵敏度但是检测方法耗时长，一般需要3个小时左右。采用荧光定量PCR的方法扩增核酸使原有的粪便中的核酸量呈数以亿计倍的放大，产生非常明显的信号。而且整个PCR扩增过程时间短，最快可在40min内完成近百份样品的扩增。

3.本发明使用的检测样本是病人的粪便样本。样品获得非常容易，而且不会对病人造成任何的痛苦和不便。

4.使用样本量极少，取样过程简单方便。同时样品便于邮寄或者是随身带到医院做检查。

5.该方法成本低廉，操作过程非常简单，对人员和设备要求低，检测速度快，对病变的预测性好，有利于推广。

附图说明

图1(a)为不使用PvPP处理的样品在5,10,20,40,80,250,500,1000,2000,4000倍稀释度下的扩增结果图；

图1(b)为使用PvPP处理的样品在5,10,20,40,80,250,500,1000,2000,4000倍稀释度下的扩增结果图；

图1(c)为样本稀释度数和扩增后荧光值之间的关系图；

图1(d)为样本稀释度数和扩增后Ct值之间的关系图。

图2(a)为使用经过PvPP处理的同一份样本进行5,10,20,40,80,250,500,1000,2000,4000不同的稀释度，然后进行Alu序列的扩增结果图；

图2(b)为使用经过PvPP处理的同一份样本进行5,10,20,40,80,250,500,1000,2000,4000不同的稀释度，然后进行ACTB序列的扩增结果图。

图3为对146份粪便样品,其中结直肠癌(Ca)73例，正常(Norm)73例,按照上述的方法进行Alu检测的结果分析图。

图4为对146份粪便样品,其中结直肠癌(Ca)73例，正常(Norm)73例,按照上述的方法进行Alu的测定，并以粪便样品来源的患者的肠镜结果为判断标准进行受试者工作特征曲线分析(ROC分析)。

图5(A)为同一份样品按照上述的方法进行处理，分别进行Alu序列和KRAS序列检测，PCR扩增结果图；

图5(B)为同一份样品按照上述的方法进行处理，分别进行Alu序列和p53序列检测，PCR扩增结果图；

图5(C)为同一份样品按照上述的方法进行处理，分别进行Alu序列和APC序列检测，PCR扩增结果图。

图6为当PvPP是负载于离心管中时，所用的离心管的一种实施例。

具体实施方式

以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。

实施例1.样品处理方法1

①使用无核酸酶的水配制质量分数为10％的PvPP悬浊液。充分摇匀PvPP悬浊液。

②取无核酸酶的离心管，向离心管中加入0.5ml的10％的PvPP悬浊液。

③将上述的离心管置于离心机中，12000g离心1min(也可以在较小的离心力下离心较长的时间)。

④离心后装入离心管中的PvPP悬浊液将分为上下两层，使用移液器，小心的将PvPP沉淀层上的液体吸出，从而得到较为干燥的PvPP。

⑤将收集到的粪便样本使用无核酸酶的水按照1g粪便加入4ml无核酸酶的水的比例充分混匀后(如果含有缓冲液则无须加入无核酸酶的水)，吸取0.5ml置于新的离心管中，于离心机上750g离心10min。

⑥将离心得到的上清液，吸取转移到第④步制备的装有PvPP干粉的离心管中。

⑦在涡旋仪上充分混匀，并剧烈振荡30min。

⑧将振荡好的离心管于离心机上750g，离心6min。

⑨吸取上清1ul进行100倍稀释，得到稀释度为500倍的样品。

实施例2.样品处理方法2

①将收集到的粪便样本按照1g样本加入4ml液体的比例加入无核酸酶的水，然后充分混匀(如果含有缓冲液则无须加入无核酸酶的水)。

②使用无核酸酶的水配制质量分数为10％的PvPP悬浊液。充分摇匀PvPP悬浊液。

③向离心柱(如图6所示的装置)加入0.5ml的10％的PvPP悬浊液，PvPP的总用量为0.05g，置于离心机中，最大转速离心30s。

④将离心柱置于新的1.5ml的离心管上，在离心柱中加入10ul以上的样本，将离心柱于离心机上最高转速离心1min。

⑤吸取离心管中1ul液体进行80倍稀释，得到稀释度为400倍的样品。

实施例3.PCR扩增实验和结果分析

①从冰箱中取出2xSYBRGreenIMasterMix，前后向引物，以及无核酸酶的水置于冰上融化。

②待试剂融化后，按照如下的体系配制QPCR反应体系：

成份	加入量
		2xSYBR Green I MasterMix	10ul
引物1(10uM)(SEQ ID NO.1)	0.5ul
		引物2(10uM)(SEQ ID NO.2)	0.5ul
无核酸酶的水	8ul
		DNA模板	1ul
总计	20ul

③向配好的反应体系中加入1ul处理后的样品。

④按照如下的反应体系在荧光定量PCR仪上进行扩增：

实施例4.梯度稀释实验

采用PvPP处理的梯度稀释实验：

①使用无核酸酶的水配制质量分数为10％的PvPP悬浊液。充分摇匀PvPP悬浊液。

②取无核酸酶的离心管，向离心管中加入0.5ml的10％的PvPP悬浊液。

③将上述的离心管置于离心机中，12000g离心1min(也可以在较小离心力下离心较长的时间)。

④离心后装入离心管中的PvPP悬浊液将分为上下两层，使用移液器，小心的将PvPP沉淀层上的液体吸出，从而得到较为干燥的PvPP。

⑤将收集到的粪便样本使用无核酸酶的水充分混匀后(如果含有缓冲液则无须加入无核酸酶的水)，吸取0.5ml置于新的离心管中，于离心机上750g离心10min。

⑥将离心得到的上清液，吸取转移到第④步制备的装有PvPP干粉的离心管中。

⑦在涡旋仪上充分混匀，并剧烈振荡30min。

⑧将振荡好的离心管于离心机上750g，离心6min。

⑨吸取上清20ul得到5倍稀释的样品，然后使用无核算酶的水分别再进行2,4,8,16,50,100,200,400,800倍稀释，获得稀释度为5,10,20,40,80,250,500,1000,2000,4000倍不同稀释度的样品。

不采用PvPP处理的梯度稀释实验：

①将收集到的粪便样本使用无核酸酶的水充分混匀后(如果含有缓冲液则无须加入无核酸酶的水)，吸取0.5ml置于新的离心管中，于离心机上750g离心10min。

②取离心后的上清20ul得到5倍稀释的样品，然后再使用无核算酶的水分别进行2,4,8,16,50,100,200,400,800倍稀释，获得稀释度为5,10,20,40,80,250,500,1000,2000,4000倍不同稀释度的样品。

将实施例4中稀释处理后的样品进行如实施例3的扩增实验和结果分析。

结果如图1所示。

图1(a)扩增曲线表示未使用PvPP处理的同一份样品分别在稀释5,10,20,40,80,250,500,1000,2000,4000倍时的PCR扩增曲线，图中可以看出样品经过稀释液直接稀释后进行PCR扩增可以得到理想的扩增图，可以实现Alu的检测。

图1(b)中的扩增线表示使用PvPP处理的样本分别在稀释5,10,20,40,80,250,500,1000,2000,4000倍时的PCR扩增曲线，图中可以看出在稀释度相对较低的情况下，样品经过PvPP处理的PCR扩增曲线比未使用PvPP处理时，Ct值靠前，荧光值升高；在稀释度相对较高的情况下，样品经过PvPP处理和未经过PvPP处理后的PCR扩增曲线的Ct值没有变化，荧光值有少量升高，说明使用PvPP进行处理后样品中的抑制物更少了，可以使Alu检测在一定程度上更理想。

图1(c)分别比较同种处理样品不同稀释度间的扩增曲线的终末荧光值(经PvPP处理)，从图中可以看出随着稀释度的增大，扩增曲线的终末荧光值不断的升高；图1(d)中随着稀释度的增加，样品PCR扩增得到的Ct值增大；以上2张图说明在一定稀释度范围内可以实现理想的PCR扩增，当稀释液的体积与粪便样本的质量比小于20：1的时候，粪便样本中存有过多的PCR抑制物，会抑制后续的PCR扩增，无法得到扩增曲线，影响结果判读；当稀释液的体积与粪便样本的质量比过大的时候，PCR扩增曲线Ct值会增大，增大了阳性样本被错判为阴性的可能，因此优选的稀释度为20～4000。(图1c和1d所示结果均是经过PvPP处理的实验组)。

实施例5.使用本专利所述方法扩增ACTB基因的实验

按照实施例2.样品处理方法2所述的方法对样品进行处理，获得一系列不同稀释度的模板，然后按照实施例3所述荧光定量PCR扩增体系，对同一份样品的不同稀释度模板分别使用各自的引物测定其中的Alu基因和ACTB基因。

结果如图2所示。图2(a)结果显示对Alu基因的扩增，结果说明，在一定的稀释度下，使用本方法能够扩增Alu片段。图2(b)结果显示使用本方法对于扩增ACTB基因的效果，从结果上看无论模板的稀释度为多少，使用本方法检测ACTB均没有扩增曲线。

实施例6.检测粪便中的Alu水平对结直肠癌的检测效果实验

本实施例中使用了146例临床收集的粪便样本(其中73例样品的肠镜结果诊断为结直肠癌(Ca)，73例样品的肠镜结果显示无异常(Norm))，按照本申请专利中实施例1.样品处理方法1中的方法对这146例样本进行处理，然后按照实施例3.所述的QPCR反应体系和反应程序进行QPCR定量检测，其结果如图3，图4所示。

图3、图4的结果可以看出，在结直肠癌样本中的Alu水平比正常样本有明显的升高，并且和正常组有显著的差异。统计上述的数据，按照本方法进行结直肠癌的早期筛查，本方法能够很好的区分正常和结直肠癌患者，其检测灵敏度为71.5％，特异性是90.3％，受试者曲线下面积为0.875。

实施例7.标记物筛选试验示例

在探索本发明技术方案的过程中，发明人探索了多种肠癌标记物。

按照本发明所述实施例1的方法，使用经过PvPP处理好的样品分别稀释5,10,20,40,80,250,500,1000,2000,4000稀释后，将得到不同稀释度的样品分别用来测定Alu和一些与结直肠癌发生预测相关的基因，如Kras，P53，APC等基因。

PCR体系：

引物：

Kras引物：

SEQIDNO.14:Fp：TGAGATTTTGGGGTGGTGGT

SEQIDNO.15:Rp：TTCACCTCACCATGCCATCT

APC引物：

SEQIDNO.16:Fp：TGCGACAGTCTGGATGTCTT

SEQIDNO.17:Rp：GAAGGACTCGGATTTCACGC

P53引物：

SEQIDNO.18:Fp：CTCTCCCCAGCCAAAGAAGA

SEQIDNO.19:Rp：AGCTACAACCAGGAGCCATT

PCR体系如下：

PCR反应程序如下：

扩增结果如图5所示。

图5A是处理结肠癌患者粪便样品后进行样品中Alu和Kras基因的扩增结果对比。从测得的结果上看，本方法测定Alu的效果非常好，在20倍稀释度下就开始有扩增曲线，并且随着稀释度数的增大扩增曲线向后移动。而使用检测Kras基因的引物使用相同的模板无论在何稀释度下皆不能产生有效的扩增。

图5B是处理结肠癌患者粪便样品后测定样品中Alu和P53基因的扩增结果对比。从测定的结果上看，使用本方法对测定Alu的效果非常好，在20倍的稀释度下就开始产生扩增曲线，并且随着稀释对的增大扩增曲线向后移动，而检测P53基因的引物扩增相同的模板，无论在何种稀释度下皆不能产生有效的扩增。

图5C是处理结肠癌患者粪便样品后测定样品中Alu和APC基因的扩增结果对比。从测定的结果上看，使用本方法对测定Alu的效果非常好，在20倍的稀释度下就开始产生扩增曲线，并且随着稀释对的增大扩增曲线向后移动，而是用检测APC基因的引物扩增相同的模板，无论在何种稀释度下皆不能产生有效的扩增。

本发明在众多结直肠癌标记物中经过多次未知性的探索，摸索出Alu在合适的简单前处理(稀释液直接稀释或)条件下，可以不经过细胞破碎、DNA提取等复杂步骤，即可直接将样品进行PCR扩增检测的方法。更加难得的是，该简单的处理方式不仅没有降低检测方法的敏感性，对比现有技术的DNA提取总DNA再进行Alu检测的方法(敏感度46.67％)，本方法的敏感度反而能提升至71.5％。

上述实施例仅显示了本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均未脱离本发明的内容，都包含在本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.一种结直肠癌检测试剂盒，其特征在于含有Alu检测试剂和PvPP。

2.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于所述检测试剂盒以粪便为检测样本；优选地，所述的样本为未经DNA抽提的粪便或粪便混悬上清液。

3.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于所述的PvPP是与水的悬浊液或者固体干粉或者负载于离心管中。

4.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于所述的负载于离心管的PvPP通过以下方法获得：将质量分数1％或以上的PvPP悬浊液加于离心管中，750g-15000g离心30s-15min，离心后吸走上层液体而得。

5.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于所述PvPP悬浊液质量分数1％～50％；更优选5％～20％。

6.如权利要求1所述的检测试剂盒，PvPP的含量与粪便样本的质量比为1:10或以上。

7.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，还进一步含有稀释液。

8.如权利要求7所述的检测试剂盒，其特征在于，所述稀释液为水、生理盐水、TE、或PBS等的一种或多种。

9.如权利要求7所述的检测试剂盒，其特征在于，所述稀释液的体积与粪便样本的质量比至少为20:1，更优选为20:1～8000:1；更优选为20:1～4000:1；更优选为40:1～4000:1。

10.如权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于所述的Alu检测试剂包括引物，所述的引物序列如SEQIDNO.1～SEQIDNO.13任一所示；优选地，所述的引物如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2所示。