CN110373470A - 结直肠肿瘤特异性甲基化检测的引物、探针及试剂盒 - Google Patents

结直肠肿瘤特异性甲基化检测的引物、探针及试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN110373470A
CN110373470A CN201910719918.4A CN201910719918A CN110373470A CN 110373470 A CN110373470 A CN 110373470A CN 201910719918 A CN201910719918 A CN 201910719918A CN 110373470 A CN110373470 A CN 110373470A
Authority
CN
China
Prior art keywords
probe
primer
gene
actb
colorectal carcinoma
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910719918.4A
Other languages
English (en)
Inventor
袁青
郭文浒
薛怡婷
陈浩
段佳丽
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ajian (fuzhou) Gene Medical Laboratory Co Ltd
Original Assignee
Ajian (fuzhou) Gene Medical Laboratory Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ajian (fuzhou) Gene Medical Laboratory Co Ltd filed Critical Ajian (fuzhou) Gene Medical Laboratory Co Ltd
Priority to CN201910719918.4A priority Critical patent/CN110373470A/zh
Publication of CN110373470A publication Critical patent/CN110373470A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/154—Methylation markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/166—Oligonucleotides used as internal standards, controls or normalisation probes

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种结直肠肿瘤特异性甲基化检测的引物、探针及试剂盒，属于生物检测技术领域，引物和探针包括SDC2基因的正向引物、反向引物和探针；SFRP2基因的正向引物、反向引物和探针；ACTB内参基因的正向引物、反向引物和探针；所述试剂盒包含上述引物和探针。本发明提供的结直肠肿瘤特异性甲基化检测的引物、探针及试剂盒，针对国人设计，使用粪便为样本，取样无创便捷，具有特异性和灵敏度高的优点，选用ACTB作为内参基因，并和SFRP2基因和SDC2基因一管同时检测，检测结果更加准确，对于癌前病变和早期结直肠癌的早期发现具有重要意义。

Description

结直肠肿瘤特异性甲基化检测的引物、探针及试剂盒
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种用于人的结直肠肿瘤特异性甲基化检测的引物、探针及试剂盒。
背景技术
结直肠癌(Colorectal cancer，CRC)消化道中常见的恶性肿瘤，包括结肠癌和直肠癌，又称大肠癌，是威胁人类健康的主要癌症之一。大肠癌最常见的临床症状是便血、腹痛、腹胀、排便习惯与粪便性质改变等症状。
据2018年国家癌症中心发布的全国癌症统计数据显示：2014年我国结直肠癌新发病例为37.0万，发病率为27.08/10万，高居恶性肿瘤发病率第三位；结直肠癌死亡病例为18.0万，死亡率为13.13/10万，高居恶性肿瘤死亡率第五位，且发病率和死亡率仍呈上升趋势。由于早期肠癌通常没有明显症状，患者感到不适去医院就诊时，往往已经发展到中晚期，当疾病进展到中晚期时，治疗费用大、预后差，不仅会影响患者生命质量，还会给家庭、社会带来沉重的经济负担，危害极大。
结直肠癌的发生是多因素、多步骤、内外因交互作用的结果，经诱癌、促癌及演进等多个阶段。与CRC发病有关的因素主要包括：饮食因素、疾病因素、家族遗传因素及年龄等。
结直肠癌一旦出现梗阻，即排便困难或者出现出血，到医院做检查时，往往提示已经是中晚期，此时患者无论采取什么样的治疗手段，治疗效果相对较差且花费巨大。大量临床数据表明，结直肠癌发现越早，期别就越低，治疗效果也越好，生存率就越高。如能做癌前病变阶段发现，结直肠癌早期筛查、及时干预不仅可以提高病人的生存率而且也可减轻医保负担，降低社会成本。
目前结直肠癌筛查方法主要有四种：1)结肠镜检查，是CRC早期筛查的传统方法。然而由于其有侵入性，饮食限制，以及检查前肠道清洁准备等因素导致它在中国的筛查依从性低；2)大便潜血试验(FOBT)，该方法虽然无创，但它对晚期肿瘤(27.1％)和侵袭性癌(65.8％)的敏感性较低；3)大便隐血免疫化学检测(FIT)，该方法无创，对结直肠癌的敏感性和特异性分别为79％(95％CI，68％～86％)和94％(95％CI，92％～95％)，但对进展期腺瘤的敏感性不足，一般仅20％～30％；4)血浆Septin9甲基化基因检测，该方法无创、方便，但它对I期CRC敏感性只有45％，对癌前息肉检测的敏感性极低(5％～15％)，说明该标记物识别癌前病变的能力差。由于该方法对早期CRC敏感性太低，目前多个权威指南均不再推荐该方法。以上四种方法均存在局限性。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺陷，本发明所要解决的技术问题是：提供一种高敏感性、高特异性的SFRP2基因和SDC2基因甲基化检测的试剂盒。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：结直肠肿瘤特异性甲基化检测的引物和探针，包括：
SDC2基因的正向引物、反向引物和探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.3所示；
SFRP2基因的正向引物、反向引物和探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6所示；
ACTB内参基因的正向引物、反向引物和探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7、SEQID NO.8和SEQ ID NO.9所示。
本发明提供的另一种技术方案为：结直肠肿瘤特异性甲基化检测的试剂盒，包括上述的引物和探针。
本发明的有益效果在于：本发明提供的结直肠肿瘤特异性甲基化检测的引物、探针及试剂盒，在检测过程中，使用粪便为样本，取样无创便捷，样本易获得，选用ACTB作为内参基因，通过对引物、探针序列的优化，提高了检测体系的灵敏度和特异性，同时使得ACTB基因能分别与SFRP2基因和SDC2基因一管同时检测，以此达到从样本采样到最终PCR扩增，监控检测全过程，充分保证了实验结果的有效性和准确性。对于癌前病变和早期结直肠癌的早期发现具有重要意义，可增加肠镜检出率，避免受试者不必要的肠镜复查，节省医疗资源。
附图说明
图1所示为本发明具体实施方式的实施例2的SDC2扩增曲线图；
图2所示为本发明具体实施方式的实施例2的SFRP2扩增曲线图；
图3所示为本发明具体实施方式的实施例2的ACTB扩增曲线图。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。
本发明最关键的构思在于：设计适合国人的引物和探针，选用ACTB作为内参基因，并和SFRP2基因和SDC2基因一管同时检测。
请参照图1至图3所示，本发明的结直肠肿瘤特异性甲基化检测的引物和探针，包括：
SDC2基因的正向引物、反向引物和探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.3所示(见表1)；
SFRP2基因的正向引物、反向引物和探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.5和SEQ ID NO.6所示(见表1)；
ACTB内参基因的正向引物、反向引物和探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.7、SEQID NO.8和SEQ ID NO.9所示(见表1)。
结直肠肿瘤特异性甲基化检测的试剂盒，包括权上述的引物和探针。
表1
从上述描述可知，本发明的有益效果在于：本发明提供的用于人的结直肠肿瘤特异性甲基化检测的引物、探针及试剂盒，在检测过程中，使用粪便为样本，取样无创便捷，样本易获得，引物和探针具有特异性和灵敏度高的优点，选用ACTB作为内参基因，通过对引物、探针序列的优化，提高了检测体系的灵敏度和特异性，同时使得ACTB基因能分别和SFRP2基因和SDC2基因一管同时检测，以此达到从样本采样到最终PCR扩增，监控检测全过程，充分保证了实验结果的有效性和准确性。对于癌前病变和早期结直肠癌的早期发现具有重要意义，可增加肠镜检出率，避免受试者不必要的肠镜复查，节省医疗资源。
进一步的，所述SDC2基因的探针、SFRP2基因的探针和ACTB内参基因的探针的5’端均标记有荧光报告基团，3’端均标记有淬灭基团。
进一步的，所述荧光报告基团为：FAM、CY5或VIC；所述淬灭基团为：BHQ1或BHQ3。
进一步的，上述结直肠肿瘤特异性甲基化检测的试剂盒，还包括SDC2/ACTB反应液和SFRP2/ACTB反应液；
所述SDC2/ACTB反应液由SDC2基因的正向引物、反向引物、探针和ACTB内参基因的正向引物、反向引物、探针混合组成；
所述SFRP2/ACTB反应液由SFRP2基因的正向引物、反向引物、探针和ACTB内参基因的正向引物、反向引物、探针混合组成。
从上述描述可知，本申请提供的引物和探针，SDC2和ACTB的引物和探针或SFRP2和ACTB的引物和探针，可混合于一管同时检测，引物之间互不干扰，检测结果准确。
进一步的，上述结直肠肿瘤特异性甲基化检测的试剂盒，还包括：qPCR反应液、阴性对照、阳性对照和PCR级去离子水；
所述阴性对照为：SDC2基因，SFRP2基因均呈现结直肠肿瘤和癌前病变特异性甲基化阴性的基因组序列或合成基因序列；
所述阳性对照为SDC2基因，SFRP2基因均呈现结直肠肿瘤和癌前病变特异性甲基化阳性的基因组序列或合成基因序列。
进一步的，所述qPCR反应液包括dNTP混合溶液、Mg2+溶液、DNA聚合酶和PCRbuffer。
进一步的，所述dNTP混合溶液为dATP、dGTP、dCTP和dTTP的等摩尔混合液。
实施例1：
用于人的结直肠肿瘤特异性甲基化检测的试剂盒，具体包括以下成分：
dNTP混合溶液、Mg2+溶液、DNA聚合酶、PCR buffer、PCR级去离子水、SDC2/ACTB反应液、SFRP2/ACTB反应液、阴性对照、阳性对照和空白对照；
所述SDC2/ACTB反应液由SDC2基因的正向引物、反向引物、探针和ACTB内参基因的正向引物、反向引物、探针混合组成；
所述SFRP2/ACTB反应液由SFRP2基因的正向引物、反向引物、探针和ACTB内参基因的正向引物、反向引物、探针混合组成；
所述阴性对照为：SDC2基因，SFRP2基因均呈现结直肠肿瘤和癌前病变特异性甲基化阴性的基因组序列或合成基因序列；
所述阳性对照为SDC2基因，SFRP2基因均呈现结直肠肿瘤和癌前病变特异性甲基化阳性的基因组序列或合成基因序列；
所述空白对照为纯水；
所述SDC2基因的正向引物、反向引物和探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.3所示；
所述SFRP2基因的正向引物、反向引物和探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.4、SEQID NO.5和SEQ ID NO.6所示；
所述ACTB内参基因的正向引物、反向引物和探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示。
实施例2：
1、样本选择
临床收集1例肠镜及病理检查确诊为肠癌的患者的粪便样本，20例肠镜检查确诊为正常的患者的粪便样本。
2、粪便样本的DNA提取
对所得粪便样本进行DNA提取，使用阿吉安(福州)基因医学检验实验室有限公司的粪便DNA提取试剂盒，具体步骤如下：
1)将所有样本分别充分溶解后，分别摇动粪便标本采集保存管至混合均匀，用去尖的1mL枪头转移1mL样本至15mL离心管中，并管子上做好标记；
2)每管加入1.5mL裂解液，旋紧管盖，漩涡振荡混匀后，置70℃干浴10min，期间不连续轻柔颠倒混匀3次，冷却至室温；
3)离心管置于15mL离心机上，最高转速离心10min，轻轻吸取上层清液2ml(部分样本可能有少量漂浮物或悬浮物，尽量避免吸到)至新的15mL离心管，并在管子上做好标记；
4)每管加入50ul抑制物去除液，旋紧管盖，轻柔颠倒混合均匀，室温1min然后每管加入1ml无水乙醇，旋紧管盖，轻柔颠倒混合均匀，每管加入20ul磁珠溶液，轻柔颠倒混匀，室温10min，期间留意管底，若有磁珠沉淀，则轻柔颠倒离心管，使磁珠悬浮；
5)离心管依次置磁力架，转动离心管一圈后，吸弃废液，去磁力(切忌所有离心管同时置磁力架后依次吸弃废液，磁珠不宜较长时间被磁力吸附)；
6)每管加入1mL洗A，通过用移液器吸打磁珠，使磁珠成分散状，将液体与磁珠一起转移至1.5ml离心管，离心管依次置磁力架，即吸弃废液，去磁力；
7)每管加入1mL洗B，通过用移液器吸打磁珠，使磁珠成分散状，离心管依次置磁力架，即吸弃废液，去磁力；
8)重复步骤7；
9)离心管瞬时离心后置磁力架，用10ulTip尽量吸尽废液,离心管开盖置50℃金属浴90秒后，每管加入100μl洗脱液，轻弹管底，充分混匀后，置50℃金属浴5min；；
10)离心管冷却至室温后置于磁力架上，静置约20秒至磁珠完全聚集管壁，转移上层溶液至新的1.5mL离心管，做好标记备用；
11)经Qubit检测样品浓度，合格的基因组DNA总量：需达到1μg以上。
3、DNA亚硫酸盐转化
将上述提取获得的DNA，使用Zymo Research试剂盒进行亚硫酸盐转化，获得亚硫酸盐转化后的DNA，具体步骤如下：
1)上述提取好的DNA样本20μl，加入CT Conversion Reagent(现配现用)130μl，涡旋混匀；
2)转化反应条件：98℃，10min；64℃，2.5h；Zymo-Spin IC吸附柱中加入600μl M-Binding Buffer，然后再将转化后的样本加入吸附柱中，颠倒数次混匀；10000rpm离心30s，弃去下层溶液；
3)向吸附柱中加入100μl M-Wash Buffer，10000rpm离心30s，弃去下层溶液；
4)向吸附柱中200μl M-Desulphonation Buffer，室温放置15-20min，10000rpm离心30s，弃去下层溶液；
5)向吸附柱内加入200μl M-Wash Buffer，10000rpm离心30s，弃去下层溶液；重复上述步骤一次；
6)将吸附柱转移到新的收集管，加60μl M-Elution Buffer，10000rpm离心1min。获得亚硫酸盐转化后的DNA，用于后续检测。
4、甲基化定量PCR
利用实施例1的试剂盒中的成分对上述亚硫酸盐转化后的DNA进行甲基化定量PCR，具体步骤如下：
1)从-20℃冰箱中取出qPCR反应液、SDC2/ACTB反应液、SFRP2/ACTB反应液，4℃充分融化，瞬时离心；
2)按照每孔每个样本8μlqPCR反应液分装至PCR反应管中；按照每孔每个样本2μlSDC2/ACTB反应液或SFRP2/ACTB反应液分别分装至对应PCR反应管中，轻盖反应管；
3)PCR管转移至样本准备区，剩余试剂放回-20℃冰箱冷冻避光保存；
4)将bis-DNA依次取15μl加入已经装有SDC2/ACTB反应液的反应管和SFRP2/ACTB反应液的反应管中，即每个待测样本分别用这两种反应液进行检测，盖紧PCR反应管，混匀后，瞬时离心使溶液至管底，避免出现气泡；
5)开机，进行PCR仪器性能自检；取在样本制备区准备好的PCR反应管，放在仪器样品槽相应位置，并记录放置顺序；
6)设置仪器扩增相关参数，并开始进行PCR扩增，具体扩增相关参数见表2所示；
表2
5、结果判读(参考图1-图3所示)
1)结果分析
反应结束后，调整基线10-22循环，根据扩增曲线，划定合适荧光阈值，ACTB阈值设定原则以阈值线处于阳性对照的指数扩增期的初始阶段拐点处为准；SDC2和SFRP2阈值设定原则以阈值线超过阴性对照的最高点，且处于阳性对照的指数扩增期的初始阶段拐点处为准；然后得到不同通道Ct值。
2)样本结果判读
内参ACTB：所有样本检测VIC通道Ct值≤36，扩增曲线有明显指数增长期。
若样本ACTB基因不能满足以上要求，视为无效。
SDC2甲基化基因：样本检测FAM通道Ct值≤42，扩增曲线有明显指数增长期，则判阳性，否则为阴性。
SFRP2甲基化基因：样本检测CY5通道Ct值≤42，扩增曲线有明显指数增长期，则判阳性，否则为阴性。
检测结果分别如图1-3所示；
检测20例粪便样本，具体结果如表3所示。
表3
样本编号 性别 年龄 SDC2 SFRP2
CRC-01 男 56 阴性 阴性
CRC-02 男 63 阴性 阴性
CRC-03 女 74 阴性 阴性
CRC-04 女 50 阴性 阴性
CRC-05 男 70 阴性 阴性
CRC-06 女 47 阴性 阴性
CRC-07 男 57 阴性 阴性
CRC-08 男 74 阴性 阴性
CRC-09 男 83 阳性 阳性
CRC-10 男 52 阴性 阴性
CRC-11 男 47 阴性 阴性
CRC-12 女 53 阴性 阴性
CRC-13 男 56 阴性 阴性
CRC-14 女 67 阴性 阴性
CRC-15 女 59 阳性 阳性
CRC-16 女 56 阴性 阴性
CRC-17 女 71 阴性 阴性
CRC-18 男 57 阴性 阴性
CRC-19 女 60 阴性 阴性
CRC-20 男 68 阴性 阴性
相较于传统的肠镜检查，使用本申请提供的引物、探针或试剂盒，能够大幅提高检查的准确性，检出效果稳定。
对比例1：
选择市售的相关试剂盒与本申请的试剂盒进行对比，结果如表4所示。
表4
请补充上述对比的结论：从表4中可以看出，以HCT116人结直肠癌细胞系DNA作为明确定量的样本，SDC2和SFRP2的检出本申请比市售产品更稳定，同时Ct值有4-10个的提前，因此本申请的灵敏度明显由于市售产品试剂盒。
综上所述，本发明提供的用于人的结直肠肿瘤特异性甲基化检测的引物、探针及试剂盒，在检测过程中，使用粪便为样本，取样无创便捷，样本易获得，引物和探针针对国人设计，具有特异性和灵敏度高的优点，选用ACTB作为内参基因，并和SFRP2基因和SDC2基因一管同时检测，可以监控实验结果的有效性，检测结果更加准确，对于癌前病变和早期结直肠癌的早期发现具有重要意义，可增加肠镜检出率，避免受试者不必要的肠镜复查，节省医疗资源。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
序列表
<110> 阿吉安（福州）基因医学检验实验室有限公司
<120> 结直肠肿瘤特异性甲基化检测的引物、探针及试剂盒
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
tttttagtcg tttaggggag ttc 23
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cgtagtcgcg gagttagtgg 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
ttcgaagcgg agggagtcg 19
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
gggagtatat cgataggttg ttgaac 26
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
taaaaaacta cgtccctaat aaccg 25
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
acgaagttcg tcgaggcggt 20
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ttaggtatta gggcgtgatg gt 22
<210> 8
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
cgataccgta ctcgataaaa tacttc 26
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tagaaggatt tttatgtggg cgacg 25

Claims (7)

1.结直肠肿瘤特异性甲基化检测的引物和探针，其特征在于，包括：
SDC2基因的正向引物、反向引物和探针，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQID NO.2和SEQID NO.3所示；
SFRP2基因的正向引物、反向引物和探针，其核苷酸序列如SEQID NO.4、SEQID NO.5和SEQID NO.6所示；
ACTB内参基因的正向引物、反向引物和探针，其核苷酸序列如SEQID NO.7、SEQID NO.8和SEQID NO.9所示。
2.根据权利要求1所述的结直肠肿瘤特异性甲基化检测的引物和探针，其特征在于，所述SDC2基因的探针、SFRP2基因的探针和ACTB内参基因的探针的5’端均标记有荧光报告基团，3’端均标记有淬灭基团。
3.根据权利要求1所述的结直肠肿瘤特异性甲基化检测的引物和探针，其特征在于，所述荧光报告基团为：FAM、CY5或VIC；所述淬灭基团为：BHQ1或BHQ3。
4.结直肠肿瘤特异性甲基化检测的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物和探针。
5.根据权利要求4所述的结直肠肿瘤特异性甲基化检测的试剂盒，其特征在于，还包括SDC2/ACTB反应液和SFRP2/ACTB反应液；
所述SDC2/ACTB反应液由SDC2基因的正向引物、反向引物、探针和ACTB内参基因的正向引物、反向引物、探针混合组成；
所述SFRP2/ACTB反应液由SFRP2基因的正向引物、反向引物、探针和ACTB内参基因的正向引物、反向引物、探针混合组成。
6.根据权利要求4所述的结直肠肿瘤特异性甲基化检测的试剂盒，其特征在于，还包括：qPCR反应液、阴性对照、阳性对照和PCR级去离子水；
所述阴性对照为：SDC2基因，SFRP2基因均呈现结直肠肿瘤和癌前病变特异性甲基化阴性的基因组序列或合成基因序列；
所述阳性对照为SDC2基因，SFRP2基因均呈现结直肠肿瘤和癌前病变特异性甲基化阳性的基因组序列或合成基因序列。
7.根据权利要求6所述的结直肠肿瘤特异性甲基化检测的试剂盒，其特征在于，所述qPCR反应液包括dNTP混合溶液、Mg2+溶液、DNA聚合酶和PCR buffer。
CN201910719918.4A 2019-08-06 2019-08-06 结直肠肿瘤特异性甲基化检测的引物、探针及试剂盒 Pending CN110373470A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910719918.4A CN110373470A (zh) 2019-08-06 2019-08-06 结直肠肿瘤特异性甲基化检测的引物、探针及试剂盒

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910719918.4A CN110373470A (zh) 2019-08-06 2019-08-06 结直肠肿瘤特异性甲基化检测的引物、探针及试剂盒

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110373470A true CN110373470A (zh) 2019-10-25

Family

ID=68258155

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910719918.4A Pending CN110373470A (zh) 2019-08-06 2019-08-06 结直肠肿瘤特异性甲基化检测的引物、探针及试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110373470A (zh)

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110699437A (zh) * 2019-11-11 2020-01-17 益善生物技术股份有限公司 人sdc2基因甲基化检测试剂盒
CN110923300A (zh) * 2019-11-18 2020-03-27 人和未来生物科技（长沙）有限公司 一种基因甲基化的检测方法和应用
CN111534590A (zh) * 2020-04-30 2020-08-14 福建西陇生物技术有限公司 一种结直肠癌多基因甲基化联合检测试剂盒及其应用
CN114292911A (zh) * 2021-12-06 2022-04-08 上海锐翌生物科技有限公司 用于肠癌早筛的组合物、试剂盒及其应用
CN114672565A (zh) * 2022-04-01 2022-06-28 山东鲁抗好丽友生物技术开发有限公司 一种用于检测结直肠癌的双探针组合物及其应用
CN116732171A (zh) * 2022-12-13 2023-09-12 重庆伯豪诊断技术有限公司 筛查结直肠癌甲基化双位点的引物探针组合及其试剂盒

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108103195A (zh) * 2018-01-22 2018-06-01 上海酷乐生物科技有限公司 一种用于早期结直肠癌的无创多基因甲基化联合检测的引物对和探针、试剂盒及其应用
CN108866196A (zh) * 2018-08-21 2018-11-23 杭州和壹基因科技有限公司 一种用于人结直肠肿瘤特异性甲基化检测的引物和探针、试剂盒及其应用
CN108977543A (zh) * 2018-08-06 2018-12-11 上海锐翌生物科技有限公司 一种基于联合检测sdc2和sfrp2基因甲基化水平的结直肠癌早期诊断试剂
CN109097471A (zh) * 2018-08-21 2018-12-28 杭州和壹基因科技有限公司 一种用于结直肠癌及癌前病变检测的试剂盒及其使用方法
US20190010557A1 (en) * 2015-12-31 2019-01-10 Creative Biosciences (Guangzhou) Co., Ltd. Molecular detection/diagnosis reagent for tumor
CN109811056A (zh) * 2019-02-28 2019-05-28 苏州唯善生物科技有限公司 用于结直肠癌及其癌前病变早期诊断、检测或筛查的引物探针组和试剂盒

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20190010557A1 (en) * 2015-12-31 2019-01-10 Creative Biosciences (Guangzhou) Co., Ltd. Molecular detection/diagnosis reagent for tumor
CN108103195A (zh) * 2018-01-22 2018-06-01 上海酷乐生物科技有限公司 一种用于早期结直肠癌的无创多基因甲基化联合检测的引物对和探针、试剂盒及其应用
CN108977543A (zh) * 2018-08-06 2018-12-11 上海锐翌生物科技有限公司 一种基于联合检测sdc2和sfrp2基因甲基化水平的结直肠癌早期诊断试剂
CN108866196A (zh) * 2018-08-21 2018-11-23 杭州和壹基因科技有限公司 一种用于人结直肠肿瘤特异性甲基化检测的引物和探针、试剂盒及其应用
CN109097471A (zh) * 2018-08-21 2018-12-28 杭州和壹基因科技有限公司 一种用于结直肠癌及癌前病变检测的试剂盒及其使用方法
CN109811056A (zh) * 2019-02-28 2019-05-28 苏州唯善生物科技有限公司 用于结直肠癌及其癌前病变早期诊断、检测或筛查的引物探针组和试剂盒

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
唐炳华，等: "《分子生物学》", 31 July 2017 *
李自刚，等: "《生物检测技术》", 31 August 2016 *
柏愚,等: "联合检测2和2甲基化在结直肠癌筛查中的价值", 《中华消化内镜杂志》 *
陈超，等: "《新技术与精准医学》", 31 December 2017 *

Cited By (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110699437A (zh) * 2019-11-11 2020-01-17 益善生物技术股份有限公司 人sdc2基因甲基化检测试剂盒
CN110699437B (zh) * 2019-11-11 2023-06-20 益善生物技术股份有限公司 人sdc2基因甲基化检测试剂盒
CN110923300A (zh) * 2019-11-18 2020-03-27 人和未来生物科技（长沙）有限公司 一种基因甲基化的检测方法和应用
CN111534590A (zh) * 2020-04-30 2020-08-14 福建西陇生物技术有限公司 一种结直肠癌多基因甲基化联合检测试剂盒及其应用
CN114292911A (zh) * 2021-12-06 2022-04-08 上海锐翌生物科技有限公司 用于肠癌早筛的组合物、试剂盒及其应用
CN114672565A (zh) * 2022-04-01 2022-06-28 山东鲁抗好丽友生物技术开发有限公司 一种用于检测结直肠癌的双探针组合物及其应用
CN114672565B (zh) * 2022-04-01 2023-01-20 山东鲁抗好丽友生物技术开发有限公司 一种用于检测结直肠癌的双探针组合物及其应用
CN116732171A (zh) * 2022-12-13 2023-09-12 重庆伯豪诊断技术有限公司 筛查结直肠癌甲基化双位点的引物探针组合及其试剂盒
CN116732171B (zh) * 2022-12-13 2024-02-27 重庆伯豪诊断技术有限公司 筛查结直肠癌甲基化双位点的引物探针组合及其试剂盒

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2017114150A1 (zh) 一种肿瘤分子检测/诊断试剂
CN110373470A (zh) 结直肠肿瘤特异性甲基化检测的引物、探针及试剂盒
WO2017124854A1 (zh) 一组用于肠癌早期诊断的ndrg4基因甲基化检测引物和探针及其试剂盒
CN109207592A (zh) 用于结直肠癌检测的试剂盒及其应用
TWI730429B (zh) Hoxa7甲基化檢測試劑
CN107904313A (zh) 用于胃癌相关基因Reprimo、RNF180甲基化检测的引物对、试剂盒及方法
CN111778332A (zh) 一种用于腺瘤及结直肠癌早期诊断的标志物组合及试剂盒
CN113106163B (zh) 一种用于结直肠癌早期诊断的生物标志物组合物及应用
CN114774540A (zh) 包括外泌体miR-106b-3p、miR-330-5p等在肺癌诊断中的应用
CN109609634A (zh) 一种与子宫内膜癌辅助诊断相关的循环miRNA标志物及其应用
CN109536612A (zh) 一种与鼻咽癌辅助诊断相关的血浆miRNA标志物及其应用
CN114507739A (zh) 用于检测人粪便样本中结直肠癌基因甲基化水平的引物和探针
CN111808961B (zh) 一种用于检测肝癌的生物标志物组及其应用
CN107904310A (zh) 用于大肠癌诊断的尿液microRNA生物标志物、试剂盒及其应用
CN113186293A (zh) 一种用于检测肺癌相关基因甲基化的核酸组合物、试剂盒和检测方法
CN114214421B (zh) 外泌体miR-3615、ARPC5等在肺癌诊断中的应用
CN109022586A (zh) 一种与宫颈癌辅助诊断相关的血浆miRNA标志物及其应用
JP7299765B2 (ja) マイクロｒｎａ測定方法およびキット
CN114507740B (zh) 用于胃肠癌诊断的生物标志物、核酸产品和试剂盒
WO2024001602A1 (zh) 一种用于检测胃癌的组合物，试剂盒及其用途
CN211546555U (zh) 前列腺癌早期诊断试剂盒
WO2024036785A1 (zh) 胃癌早期筛查的dna甲基化标志物组合及试剂盒
CN107236792A (zh) 用于检测肠癌的标记物及其应用
CN115627293A (zh) 结直肠癌甲基化基因标志物及其应用
CN110846418A (zh) 结直肠癌Septin9基因甲基化检测的引物组、探针组、试剂盒及用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination