CN110699437A - 人sdc2基因甲基化检测试剂盒 - Google Patents
人sdc2基因甲基化检测试剂盒 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110699437A CN110699437A CN201911096347.XA CN201911096347A CN110699437A CN 110699437 A CN110699437 A CN 110699437A CN 201911096347 A CN201911096347 A CN 201911096347A CN 110699437 A CN110699437 A CN 110699437A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- primer
- enzyme digestion
- dna
- sdc2
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6858—Allele-specific amplification
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了一种人SDC2基因甲基化检测试剂盒，该试剂盒包括酶切反应液和荧光PCR反应液，所述酶切反应液和荧光PCR反应液被热熔材料分层包装在同一PCR扩增管内，所述酶切反应液位于PCR扩增管的底部。本发明所述试剂盒利用甲基化敏感限制性内切酶和标记型孪生引物实现了在一管中依次进行酶切反应和荧光PCR反应以检测SDC2基因甲基化状态，具有操作快捷简便、灵敏度高、特异性好、易于自动化的特点。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种人SDC2基因甲基化检测试剂盒。
技术背景
多配体聚糖-2(Syndecan-2，SDC2)是一种跨膜硫酸乙酰肝素蛋白多糖，它能调节许多 对组织发育和体内平衡至关重要的细胞功能，包括细胞增殖、分化、粘附、细胞骨架组织、 迁移、伤口愈合、血管生成等(Mytilinaiou M et al.,IUBMB Life,2017,69,824-833)。编码该 蛋白的SDC2基因包含9个外显子，定位于人类染色体8q22.1。SDC2与多种不同类型的肿瘤 有关，并且其表达的改变在多种肿瘤中被检测到(Mytilinaiou M et al.,IUBMB Life,2017,69, 824-833)。在人结肠腺癌组织样本中，SDC2的mRNA和蛋白质表达相比邻近正常上皮增加， 并且这种上调对于结肠癌细胞的致瘤活性是必需的(Ryu HY etal.,Journal of Biological Chemistry,2009,284,35692-35701)，高SDC表达通过调节结肠癌细胞中的细胞粘附，起到对 结肠癌细胞的增殖和致瘤活性作用(Park H et al.,Journal of Biological Chemistry,2002,277, 29730-29736)，并作为对接受体与基质金属蛋白酶-7(MMP-7)前体相互作用，增强其加工 成活化的MMP-7，活化的MMP-7导致SDC2细胞外脱落(Ryu HY et al.,Journal of Biological Chemistry,2009,284,35692-35701)，脱落的SDC2可以增强血管生成过程，从而促进癌细胞 的生长和转移(Choi S et al.,Oncotarget,2015,6,3874-3886)。
一项针对来自139名结直肠癌患者肿瘤样品的DNA微阵列分析显示，肿瘤组织SDC2甲基化率达97.8％，明显高于相应非肿瘤组织；在131名CRC患者和125名健康受试者中使用血清SDC2甲基化临床检测结直肠癌结果表明87.0％和95.2％的灵敏度和特异性，其中检测 Ⅰ期结直肠癌的灵敏度高达92.3％，表明血清SDC2甲基化作为早期检测结直肠癌的潜力(Oh TJ et al.,The Journal of Molecular Diagnostics,2013,15,498-507)。一项联合分析42个待评估 候选基因作为DNA甲基化生物标志物的研究显示，SDC2在非肿瘤结直肠患者外周血DNA 中具有非常低的甲基化，适合作为基于血液的诊断标记进一步评估(Mitchell SM et al.,BMC cancer,2014,14,54)。
一项在细胞系、398例结直肠组织样本及497例粪便样本中进行的SDC2甲基化分析显 示，与邻近正常上皮相比，96.8％的结直肠癌组织SDC2甲基化水平更高；粪便SDC2甲基化 检测到81.1％的结直肠癌和58.2％的腺瘤，特异性为93.3％，提示粪便甲基化SDC2是用于非 侵入性检测结直肠肿瘤的有价值的生物标志物(Niu F et al.,CancerEpidemiology and Prevention Biomarkers,2017,26,1411-1419)。另一项结直肠癌SDC2甲基化研究发现，在100％ 的原发性肿瘤、90.6％的腺瘤性息肉、94.1％的增生性息肉和0％的正常组织中检测到阳性 SDC2甲基化阳性，并且根据病变严重程度，SDC2甲基化水平明显增加；比较各阶段结直肠 癌或癌前病变和健康受试者显示，粪便SDC2甲基化检测对于检测结直肠癌和小息肉具有 90.0％和33.3％的总体灵敏度，特异性为90.9％；提示粪便SDC2甲基化检测或可用于早期检 测结直肠癌(Oh TJ et al.,Clinical Epigenetics,2017,9,126)。
一项在从患有结直肠肿瘤患者和健康正常个体中收集的总共190个肠道灌洗液(BLF) 样品中进行的SDC2甲基化分析显示，绒毛状腺瘤、高度异型增生和增生性息肉样本SDC2 甲基化阳性率为100％，管状腺瘤样本SDC2甲基化阳性率为88.9％，正常粘膜样本SDC2甲 基化阳性率为0％；BLF DNA样本SDC2甲基化检测结直肠癌和绒毛状腺瘤的灵敏度分别为 80.0％和64.7％，特异性为88.9％；多发性管状腺瘤、单管腺瘤和增生性息肉患者BLF的SDC2 甲基化阳性率分别为62.8％、26.7％和28.6％；表明SDC2甲基化阳性率随着病变严重程度和 腺瘤数量的逐渐增加而增加，SDC2甲基化是癌前病变中的常见事件，BLF的SDC2甲基化 状态具有检测结直肠肿瘤的潜力(Park YS,et al.,Gut and Liver,2018,12,508-515)。
可见，SDC2甲基化检测在临床上具有重要意义。
目前SDC2甲基化检测多采用以亚硫酸氢盐转化法。亚硫酸氢盐可将非甲基化的胞嘧啶 转化为尿嘧啶，后者经PCR扩增转变成胸腺嘧啶而产生T：A配对，但甲基化的胞嘧啶则能 抵抗亚硫酸氢盐的修饰，这样DNA包含的甲基化信息就转化为DNA序列的差异(Klose RJet al.,Trends in Biochemical Sciences,2006,31,89-97)。由此发展了多种甲基化SDC2检测方法， 如亚硫酸氢盐测序法、焦磷酸测序、甲基化特异性PCR和实时甲基化特异性PCR等。但是， 亚硫酸氢盐转化法存在下列缺点：①转化条件较为剧烈，可能会造成DNA降解从而影响后 续检测的灵敏度；②操作繁琐，转化后还需纯化，可能造成DNA损失；③可能出现转化不 完全的情况，从而影响后续检测的准确性；④未甲基化的胞嘧啶占人类基因组中总胞嘧啶的 95％，未甲基化胞嘧啶完全转化为胸腺嘧啶将严重降低序列复杂性，从而降低了序列特异性 并增加后续特异性检测的难度。
此外，以亚硫酸氢盐转化为基础发展而来的各种甲基化SDC2检测方法也各有不足之处。 例如，亚硫酸氢盐测序法需要大量的克隆测序，过程较为繁琐，费用也较高；焦磷酸测序每 次测序的序列长度有限(Grigg G et al.,Bioessays,2010,16,431-436)；甲基化特异性PCR和 实时甲基化特异性PCR则缺乏有效预防非特异性扩增的机制。
因此，需要提供一种操作快捷简便、检测准确的SDC2基因甲基化检测试剂盒。
发明内容
基于此，本发明提供一种人SDC2基因甲基化检测试剂盒(荧光PCR法)，该试剂盒利用甲基化敏感限制性内切酶和标记型孪生引物实现了在一管中依次进行酶切反应和荧光PCR 反应以检测SDC2基因甲基化状态，具有操作快捷简便、灵敏度高、特异性好、易于自动化 的特点。
为了实现上述目的，本发明的技术方案如下：
人SDC2基因甲基化检测试剂盒，包括酶切反应液和含有引物的荧光PCR反应液，所述 酶切反应液和荧光PCR反应液被热熔材料分层包装在同一PCR扩增管内，所述酶切反应液 位于PCR扩增管的底部。
所述酶切反应液中甲基化敏感限制性内切酶用于消化DNA样本中未发生甲基化的SDC2 基因DNA，优选地，所述甲基化敏感限制性内切酶为HinP1I。
在其中一些实施例中，所述荧光PCR反应液中引物包含针对SDC2基因CpG岛设计的一组标记型孪生引物，包括如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3所示的正引物序列，如SEQ IDNO.2和SEQ ID NO.4所示的负引物序列，正引物序列的5’端标记荧光报告基团，负引物3’端标记荧光淬灭剂。
在其中一些实施例中，还包括内标基因的标记型孪生引物，优选地，其为SEQ ID 5至 SEQ ID 8所示的序列。
在其中一些实施例中，包括针对ACTB基因不包含甲基化敏感限制性内切酶的酶切位点 的区域设计的一组标记型孪生引物作为PCR内参引物，优选地，其如SEQ ID 9至SEQID 12 所示。
所述标记型孪生引物为正引物与负引物杂交而成的双链结构，正引物为用于PCR扩增的 上、下游引物，其5’端标记荧光报告基团如FAM、HEX或ROX，负引物为与正引物互补的 并经修饰的序列，即其3’端标记荧光淬灭剂，这一修饰使负引物不具备延伸能力，在这种结 构的孪生引物中，荧光报告基团和荧光淬灭剂同处一端发生荧光淬灭，形成非荧光的孪生引 物。
所述标记型孪生引物的制备方法为：5’端标记上荧光报告基团的正引物与3’端标记上荧 光淬灭剂的负引物以1：(1～2)的比例混合，在含1.0～2.0mM MgCl2的10mM Tris-HCl中， 于94±1℃反应5分钟，58±1℃反应2分钟杂交而成双链式引物，作为荧光PCR检测的引物。
所述酶切缓冲液为含10mM Tris-HCl(37℃时pH为7.5)、10mM MgCl2、0.1mg/mlBSA 的水溶液；每9μl中含有4-6U的HinP1I酶。
所述热熔材料为熔点为70℃～72℃的全精炼石蜡。
在其中一些实施例中，还包括有阴性质控品和阳性质控品；每个反应所述阴性质控品由 0.1μgBSA和1ng非甲基化人类基因组DNA组成；每个反应所述阳性质控品由0.1μgBSA、 0.9ng非甲基化人类基因组DNA和0.1ng甲基化人类基因组DNA组成。
本发明的另一个目的是提供上述检测试剂盒的使用方法。
所述试剂盒的使用方法，包括如下步骤：
(1)获得待检测DNA样本；
(2)酶切/荧光PCR反应：向酶切反应液中加入1μl待测DNA样本在荧光PCR仪上依次进行酶切反应和荧光PCR反应，其反应条件设置如下：37℃酶切1小时，65℃灭活20分 钟，1个循环；95℃预变性10分钟，1个循环；95℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸 30秒，45个循环；72℃延伸5分钟。
本发明具有至少以下有益效果：
(1)本发明的酶切/荧光PCR体系采用熔点为70℃～72℃的无菌石蜡油混合物将酶切反 应液和荧光PCR反应液隔离开来，酶切反应液位于无菌石蜡油混合物的上层，可在不熔化无 菌石蜡油混合物的情况下实现对待测DNA样本的酶切和内切酶灭活；内切酶灭活完成后直 接进入PCR反应，当温度升至95℃时，隔离酶切反应液和荧光PCR反应液的无菌石蜡油混 合物熔化并上浮到反应体系的上层(石蜡油密度低于反应液)，荧光PCR反应液与上层酶切 产物混合，实现对酶切产物的荧光PCR检测。这种酶切/荧光PCR体系实现了在一管中依次 进行酶切反应和荧光PCR反应，与现有技术相比，操作快捷简便，易于自动化。
(2)本发明甲基化敏感限制性内切酶为根据甲基化SDC2序列优选出的HinP1I，该酶可 识别GCGC序列，实现对非甲基化核酸中含有的GCGC序列的酶切。该酶配合相应的独特设 计标记型孪生引物用于SDC2基因甲基化检测时酶切效果好，保证了检测结果的准确性，减 少了假阳性的发生。
(3)本发明采用标记型孪生引物配制的荧光PCR反应体系进行荧光PCR检测，其优势 在于：①该标记型孪生引物配合甲基化敏感限制性内切酶HinP1I设计，可实现对甲基化SDC2 目的片段的有效扩增。②由于其特殊的双链结构，使得该标记型孪生引物用于SDC2甲基化 荧光PCR检测时有助于防止荧光PCR反应体系中多个引物之间的非特异性结合，可在荧光 PCR反应进入热变性阶段前有效预防非特异性扩增的发生，在整个荧光PCR反应过程中有效 避免非特异性扩增，有助于提高特异性扩增产率。③由于其正引物5’端标记荧光报告基团如 FAM、HEX或ROX，负引物3’端标记荧光淬灭剂，使得该标记型孪生引物用于SDC2甲基 化荧光PCR检测时其扩增本身贡献了荧光信号，无需向荧光PCR反应体系中添加荧光探针 即可实现荧光PCR检测。
(4)本发明试剂盒适用于多种DNA样本类型，可用于组织DNA样本、血浆DNA样本、粪便DNA样本、肠道灌洗液(BLF)DNA样本等。
(5)本发明采用三重荧光PCR反应，能够单管内一次反应检测SDC2基因甲基化、酶切内参和PCR内参，不仅极大地节省了试剂耗材还缩短了检测时间。
(6)进一步地，本发明设计有阴性质控品和阳性质控品，能更好地防止假阳性结果和假 阴性结果的产生，从而确保检测结果准确可靠。同时，酶切内参的设计可有效监测酶切反应 是否完全，PCR内参的设计可确保甲基化检测结果的有效性，从而确保SDC2基因甲基化检 测结果准确可靠。
附图说明
图1为不同的甲基化敏感限制性内切酶检测SDC2甲基化的荧光PCR曲线图。其中，Aci Ⅰ酶切SDC2基因非甲基化人类基因组DNA中FAM、HEX(曲线12、13)通道无扩增信号， ROX通道升起S型扩增曲线(曲线4)；AciⅠ酶切SDC2基因甲基化人类基因组DNA中三 个荧光通道均有扩增信号，FAM通道Ct值为38.45(曲线8)，HEX通道Ct值为43.19(曲 线10)，ROX通道Ct值为29.08(曲线9)；HinP1I酶切SDC2基因非甲基化人类基因组DNA 中FAM、HEX通道无扩增信号，ROX通道升起S型扩增曲线(曲线2)；HinP1I酶切SDC2 基因甲基化人类基因组DNA；中HEX通道无扩增信号，FAM、ROX通道升起S型扩增曲线， FAM通道曲线6)，ROX通道(曲线1)；HpaⅡ酶切SDC2基因非甲基化人类基因组DNA FAM、 HEX通道无扩增信号(曲线14、15)，ROX通道升起S型扩增曲线(曲线5)；HpaⅡ酶切 SDC2基因甲基化人类基因组DNA中三个荧光通道均有扩增信号，FAM通道Ct值为38.27 (曲线7)，HEX通道Ct值为44.12(曲线11)，ROX通道Ct值为29.55(曲线3)。
图2为标记型孪生引物与传统引物检测SDC2基因甲基化人类基因组DNA的荧光PCR曲线图。其中，使用标记型孪生引物检测结果中HEX通道无扩增信号(曲线5)，FAM、ROX 通道升起S型扩增曲线，FAM通道(曲线3)，ROX通道(曲线1)；使用传统引物检测结果 中HEX通道无扩增信号(曲线6)，FAM、ROX通道升起S型扩增曲线，FAM通道(曲线4)， ROX通道(曲线2)。
图3为标记型孪生引物与传统引物PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳图。M：DNAmarker， 1：SDC2标记型孪生引物PCR扩增产物，2：SDC2传统引物PCR扩增产物，3：酶切内参传统PCR扩增产物，4：PCR内参标记型孪生引物PCR扩增产物，5：PCR内参传统引物PCR 扩增产物，6：酶切内参标记型孪生引物PCR扩增产物。
图4为本发明与基于亚硫酸氢盐转化的SDC2甲基化检测方法的荧光PCR曲线图。其中， 本发明检测SDC2基因非甲基化人类基因组DNA中FAM、HEX通道无扩增信号(曲线7-8)，ROX通道升起S型扩增曲线(曲线1)；本发明检测SDC2基因甲基化人类基因组DNA中 HEX通道无扩增信号(曲线9)，FAM、ROX通道升起S型扩增曲线，FAM通道(曲线5)， ROX通道(曲线2)；基于亚硫酸氢盐转化的SDC2甲基化检测方法检测SDC2基因非甲基化 人类基因组DNA中没有HEX通道，FAM通道无扩增信号(曲线10)，ROX通道升起S型 扩增曲线(曲线3)；基于亚硫酸氢盐转化的SDC2甲基化检测方法检测SDC2基因甲基化人 类基因组DNA中没有HEX通道，FAM、ROX通道升起S型扩增曲线，FAM通道(曲线6)， ROX通道(曲线4)。
图5为本发明检测甲基化DNA比例为1％的1ng DNA样本的荧光PCR曲线图。
图6为本发明阴性质控品的荧光PCR曲线图(曲线1ROX，曲线2、3为FAM和HEX)；
图7为本发明阳性质控品的荧光PCR曲线图(曲线2ROX，曲线1为FAM，曲线3为HEX)。
具体实施方式
除非另外指明，本发明的实践将使用分子生物学、细胞生物学、免疫学和重组DNA的传 统技术，其属于本领域技术范围。参见例如，Sambrook，Fritsch和Maniatis，分子克隆实验 指南，第3版(2002)。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按 照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术 人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目 的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任 意的和所有的组合。
下面将结合实施例对本发明进行进一步说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了 起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明 的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
实施例1：制备所述人SDC2基因甲基化检测试剂盒(荧光PCR法)
人SDC2基因甲基化检测试剂盒(荧光PCR法)，包括酶切/荧光PCR反应体系、阴性质控品和阳性质控品。试剂盒的制备包括以下步骤：
(1)标记型孪生引物的设计及制备：针对SDC2基因的CpG岛、ACTB基因包含甲基 化敏感限制性内切酶的酶切位点的区域和ACTB基因不包含甲基化敏感限制性内切酶的酶切位点的区域分别设计SDC2基因甲基化检测用标记型孪生引物、酶切内参标记型孪生引物和PCR内参标记型孪生引物，具体如SEQ ID 1至SEQ ID 12所示。引物以100μM的母液储存， 根据检测需求制备成正引物浓度为10μM的标记型孪生引物。其制备方法为：将标记型孪生 引物中的正引物与其相应的负引物以1:1.5的比例加入到含1.5mM MgCl2的10mM Tris-HCl中进行杂交获得双链式引物，杂交条件为94℃反应5分钟，58℃反应2分钟。作为荧光PCR 检测的引物，冷冻保存。其中，正引物与含1.5mM MgCl2的10mM Tris-HCl的体积比为1:7.5。
(2)所述试剂盒的标记型孪生引物序列具体如下表所示：
| 引物 | 引物类型 | 序列(5’-3’) | SEQ ID |
| SDC2-F1 | 上游正引物 | FAM-CAAGTGAGAGGGCGCCGCGT | 1 |
| SDC2-F2 | 上游负引物 | ACGCGGCGCCCTCTCACTTG-DABCYL | 2 |
| SDC2-R1 | 下游正引物 | FAM-CTGCCCAGCGCTCGGCGCAG | 3 |
| SDC2-R2 | 下游负引物 | CTGCGCCGAGCGCTGGGCAG-DABCYL | 4 |
| ACTB-F1 | 上游正引物 | HEX-CAGCTCACCATGGATGATG | 5 |
| ACTB-F2 | 上游负引物 | CATCATCCATGGTGAGCTG-DABCYL | 6 |
| ACTB-R1 | 下游正引物 | HEX-GACCCATGCCCACCATCAC | 7 |
| ACTB-R2 | 下游负引物 | GTGATGGTGGGCATGGGTC-DABCYL | 8 |
| ACTB-F3 | 上游正引物 | ROX-GTTGTTACAGGAAGTCCCT | 9 |
| ACTB-F4 | 上游负引物 | AGGGACTTCCTGTAACAAC-DABCYL | 10 |
| ACTB-R3 | 下游正引物 | ROX-AAAGCAATGCTATCACCTC | 11 |
| ACTB-R4 | 下游负引物 | GAGGTGATAGCATTGCTTT-DABCYL | 12 |
(2)荧光PCR反应液的配制：按照本发明的荧光PCR反应液配制方案配制荧光PCR反应液，保存备用。荧光PCR反应液配制方案具体如下：
| 试剂名称 | 每反应(μl) |
| PCR缓冲液 | 10 |
| dNTP(10mM) | 4 |
| 10μM正引物的标记型孪生引物 | 每种加入1μl |
| DNA聚合酶(5U/μl) | 0.4 |
| 无核酸酶的水 | 补水至40μl |
| 总体积 | 40 |
(3)甲基化敏感限制性内切酶的选择：根据甲基化SDC2序列选择甲基化敏感限制性内 切酶。优选地，所述甲基化敏感限制性内切酶为HinP1I。
(4)酶切缓冲液的配制：按照酶切缓冲液的组成进行配制。酶切缓冲液组成如下：10mM Tris-HCl(37℃时pH为7.5)、10mM MgCl2、0.1mg/ml BSA、纯化水。
(5)酶切反应液的配制：按照本发明的酶切反应液配制方案配制酶切反应液，保存备用。 酶切反应液配制方案具体如下：
| 试剂名称 | 每反应(μl) |
| 酶切缓冲液 | 8.5 |
| HinP1I(10U/μl) | 0.5 |
| 总体积 | 9 |
(6)酶切/荧光PCR反应体系的配制：步骤(2)中配制好的荧光PCR反应液混匀离心，取40μl加入到PCR扩增管管底并用熔点为70℃～72℃的全精炼石蜡(厂家：昆仑，型号：70#)封闭，待无菌石蜡油混合物冷却凝固，取步骤(5)中配制好的酶切反应液9μl加入到 无菌石蜡油混合物已经冷凝的PCR扩增管内。酶切/荧光PCR反应体系亦可在PCR八联管中 进行配制。
(7)每个反应的阴性质控品和阳性质控品的配制：以0.1μgBSA和1ng非甲基化人类基 因组DNA配制成阴性质控品；以0.1μg BSA、0.9ng非甲基化人类基因组DNA和0.1ng甲基化人类基因组DNA配制成阳性质控品。
(8)试剂盒的分装与组装：试剂盒规格为24人份/盒，分装与组装方案如下：
所述检测试剂盒的检测全过程包括以下步骤：
(1)酶切/荧光PCR反应：取1μl待测DNA样本加入到酶切/荧光PCR反应体系的酶切反应液(位于已冷凝的无菌石蜡油混合物上层)中，置于荧光PCR仪上依次进行酶切反应和荧光PCR反应，其反应条件设置如下：37℃酶切1小时，65℃灭活20分钟，1个循环；95℃ 预变性10分钟，1个循环；95℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒，45个循环； 72℃延伸5分钟。荧光PCR仪荧光通道选择FAM、HEX和ROX通道。
(2)检测结果的判读：根据荧光PCR仪检测到的荧光信号来判读检测结果。检测反应 体系的FAM、HEX和ROX荧光强度，以HEX来判断酶切反应是否完全，若HEX无扩增信 号，说明酶切反应完全，DNA样本被完全酶切，若HEX有扩增信号，说明酶切反应不完全； 以ROX达到设定的阈值时表示DNA上样量在允许范围内，FAM信号结果可靠；以FAM达 到设定阈值时所需要的Ct值作为阴阳性判定标准，Ct值为0或大于等于45：阴性，Ct值小 于45：阳性。具体的检测结果判断表如下：
实施例2：使用不同的甲基化敏感限制性内切酶检测SDC2甲基化的对比实验
(1)实验目的
本实施例中通过使用不同的甲基化敏感限制性内切酶检测SDC2甲基化以比较不同的甲 基化敏感限制性内切酶的酶切效果。
(2)实验方法
本实施例中根据本实施例1中的试剂盒的制备步骤分别以AciⅠ、HinP1I、HpaⅡ作为甲 基化敏感限制性内切酶分别配制三种酶切/荧光PCR反应体系；使用上述三种酶切/荧光PCR 反应体系分别对浓度相同的3份SDC2基因非甲基化人类基因组DNA和SDC2基因甲基化人 类基因组DNA进行酶切/荧光PCR反应。试剂盒其他组成以及酶切/荧光PCR反应根据实施 例1中的检测步骤进行，DNA上样量为1μl。
(3)实验结果与分析
检测结果如图1和下表所示(N表示非甲基化人类基因组DNA，P表示甲基化人类基因 组DNA)。
从图1及上表检测结果可知，使用HinP1I配制的酶切/荧光PCR反应体系检测DNA样本时酶切内参均无扩增信号(Ct值＞45)，说明HinP1I酶切反应是正常和完全的；PCR内参均有扩增信号(Ct值＜36)(图1中曲线1、2和上表)，说明HinP1I配制的酶切/荧光PCR 反应体系检测结果是有效的；SDC2基因非甲基化人类基因组DNA检测结果皆为SDC2甲基 化阴性，SDC2基因甲基化人类基因组DNA检测结果皆为SDC2甲基化阳性(曲线6和上表)， 则说明HinP1I配制的酶切/荧光PCR反应体系检测结果的准确性。而使用AciⅠ或HpaⅡ配 制的酶切/荧光PCR反应体系检测DNA样本时各有1例SDC2基因甲基化人类基因组DNA 样本酶切内参检测到扩增信号(Ct＜45)(图1和上表)，提示这两种酶用于SDC2甲基 化检测时出现酶切反应不完全的情况。以上说明HinP1I的酶切效果较AciⅠ和HpaⅡ更佳。 与此同时，从图1及上表检测结果可知，使用HinP1I配制的酶切/荧光PCR反应体系检出的 SDC2基因Ct值和PCR内参Ct值均低于AciⅠ或HpaⅡ配制的酶切/荧光PCR反应体系，说 明HinP1I配制的酶切/荧光PCR反应体系的扩增效率更好，检测效果更佳。
实施例3：标记型孪生引物检测效果验证实验
(1)实验目的
本实施例中通过与传统引物检测结果的比较，以验证本发明标记型孪生引物检测效果。
(2)实验方法
本实施例中选择甲基化人类基因组DNA作为待测样本。使用由标记型孪生引物制备的 实施例1所述试剂盒和由传统引物(传统引物为单链引物，其碱基序列与标记型孪生引物上、 下游正引物相同，其5’端不带荧光基团)配合荧光探针建立的酶切/荧光PCR反应体系分别对 3份浓度相同的SDC2基因甲基化人类基因组DNA进行检测。与此同时，使用本发明实施例 1所述SDC2标记型孪生引物、PCR内参标记型孪生引物、SDC2传统引物、PCR内参传统 引物分别对经HinP1I酶切的SDC2基因甲基化人类基因组DNA进行PCR扩增，使用酶切内参标记型孪生引物、酶切内参传统引物对未经酶切的SDC2基因甲基化人类基因组DNA进行PCR扩增，PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。传统引物为单链引物，其碱基序列与标记型孪生引物上、下游正引物相同，其5’端不带荧光基团。
传统引物及荧光探针碱基序列如下：
传统引物配合荧光探针建立的酶切/荧光PCR反应体系如下：
(3)实验结果与分析
检测结果如下表、图2和图3所示。
从图2和上表荧光PCR检测结果可知，图2中使用标记型孪生引物检测结果中HEX通道无扩增信号(曲线5)，FAM、ROX通道升起S型扩增曲线，FAM通道(曲线3)，ROX 通道(曲线1)；使用传统引物检测结果中HEX通道无扩增信号(曲线6)，FAM、ROX通道 升起S型扩增曲线，FAM通道(曲线4)，ROX通道(曲线2)，说明标记型孪生引物的检 测结果与传统引物的检测结果一致，所有SDC2基因甲基化人类基因组DNA样本的检测结果 皆为SDC2甲基化阳性；但是，标记型孪生引物检出的SDC2基因Ct值和PCR内参Ct值均 低于传统引物，说明标记型孪生引物的扩增效率更好，检测效果更佳。从图3琼脂糖凝胶电 泳检测结果可知，SDC2基因的标记型孪生引物和传统引物均可扩增出大小约为172bp的目 的条带，PCR内参的标记型孪生引物和传统引物均可扩增出大小约为108bp的目的条带，酶 切内参的标记型孪生引物和传统引物均可扩增出大小约为154bp的目的条带；但是，标记型 孪生引物扩增出的目的条带较传统引物的更亮，且不存在非特异性扩增，而传统引物有微弱 的非特异性条带，存在非特异性扩增；这说明与传统引物相比，标记型孪生引物的特异性扩 增效率更佳，避免了非特异性扩增的发生。总之，以上结果证明了本发明采用的标记型孪生 引物相比传统引物更具优势。
实施例4：与基于亚硫酸氢盐转化的SDC2甲基化检测方法的比较
(1)实验目的
本实施例中比较本发明与基于亚硫酸氢盐转化的SDC2甲基化检测方法。
(2)实验方法
本实施例中选择SDC2基因非甲基化人类基因组DNA和SDC2基因甲基化人类基因组DNA作为待测样本。取浓度相同的上述样本各3份使用实施例1所述人SDC2基因甲基化检 测试剂盒(荧光PCR法)根据实施例1中的检测步骤进行检测。另取相同浓度的SDC2基因 非甲基化人类基因组DNA和SDC2基因甲基化人类基因组DNA各3份使用商业化的亚硫酸 氢盐转化试剂盒如Qiagen公司的EpiTect Fast Bisulfite Conversion Kits(货号59824)进行亚硫酸氢盐转化，转化后DNA使用针对亚硫酸氢盐转化后SDC2基因序列和ACTB基因序列 设计的引物及荧光探针进行多重荧光PCR检测，其中，引物的设计位置与实施例1所述人 SDC2基因甲基化检测试剂盒(荧光PCR法)中的标记型孪生引物上、下游正引物设计位置 相同。
基于亚硫酸氢盐转化的SDC2甲基化检测方法的引物及荧光探针如下：
基于亚硫酸氢盐转化的SDC2甲基化检测方法的荧光PCR反应体系如下：
(3)实验结果与分析
检测结果如图4和下表所示(N表示SDC2基因非甲基化人类基因组DNA，P表示SDC2基因甲基化人类基因组DNA)。
从图4和上表检测结果可知，本发明与基于亚硫酸氢盐转化的SDC2甲基化检测方法检 测结果一致，所有SDC2基因非甲基化人类基因组DNA检测结果皆为SDC2甲基化阴性，所 有SDC2基因甲基化人类基因组DNA检测结果皆为SDC2甲基化；但是，从检测Ct值来看，本发明检出的Ct值要低于基于亚硫酸氢盐转化的SDC2甲基化检测方法，说明本发明的检测效果更佳。此外，基于亚硫酸氢盐转化的SDC2甲基化检测方法检测过程包括待测DNA样本亚硫酸氢盐转化、纯化、荧光PCR检测，且转化/纯化操作步骤繁琐，而本发明只需向酶切/荧光PCR反应体系加入待测DNA样本即可进行检测，相比之下，本发明操作更为快捷简便，易于自动化。
实施例5：灵敏度分析实验
(1)实验目的
本实施例中通过对不同甲基化DNA比例、不同起始量的DNA样本进行检测，以分析本 发明的灵敏度。
(2)实验方法
本实施例中选择SDC2基因非甲基化人类基因组DNA、SDC2基因甲基化人类基因组DNA配制成甲基化DNA比例分别为0％、1％、2.5％、5％、10％的起始量分别为10ng、5ng、2ng、1ng、0.1ng的DNA样本作为待测样本，使用实施例1所述人SDC2基因甲基化检测试 剂盒(荧光PCR法)根据实施例1中的检测步骤进行检测。
DNA样本的配制方案如下：
(3)实验结果与分析
检测结果如下表所示。
从上表检测结果可知，本发明能在DNA含量低至1ng，甲基化DNA比例低至1％，检测到SDC2基因的甲基化(图5所示)，证明了本发明的检测灵敏度高。
图5中HEX通道无扩增信号(曲线3)，FAM和ROX通道均升起S型扩增曲线，FAM 通道Ct值为43.40(曲线2)，ROX通道Ct值为33.72(曲线1)。
实施例6：特异性分析实验
(1)实验目的
本实施例中通过对来自健康者的DNA样本、经亚硫酸氢盐测序法确定为SDC2甲基化阳 性的DNA样本进行检测，以分析本发明的特异性。
(2)实验方法
本实施例中选择来自健康者的DNA样本、经亚硫酸氢盐测序法确定为SDC2甲基化阳性 的DNA样本各7例作为待测样本，使用实施例1所述人SDC2基因甲基化检测试剂盒(荧光 PCR法)根据实施例1中的检测步骤进行检测。
(3)实验结果与分析
检测结果如下表所示(N1-N7代表健康者的DNA样本，P1-P7代表SDC2甲基化阳性的DNA样本)。
从上表检测结果可知，本发明对7份来自健康者的DNA样本的检测结果皆为SDC2甲基 化阴性，对7例经亚硫酸氢盐测序法确定为SDC2甲基化阳性的DNA样本的检测结果皆为SDC2甲基化阳性，证明了本发明的检测特异性好，阴性符合率为100％，阳性符合率为100％。
实施例7：同类产品比较实验
(1)实验目的
本实施例中通过与甲基化检测“金标准”亚硫酸氢盐测序法的检测结果进行对比，验证 本发明试剂盒的准确性。
(2)实验方法
本实施例中收集DNA样本共100例作为待测样本，取适量分别使用本发明试剂盒和亚 硫酸氢盐测序法进行检测。本发明试剂盒检测过程根据实施例1中的检测步骤进行。亚硫酸 氢盐测序法委托美吉生物完成。
(3)实验结果与分析
检测结果如下表所示。
从上表检测结果可知，本发明试剂盒的检测结果与亚硫酸氢盐测序法检测结果的符合率 为100％，证明了本发明的检测准确性。
实施例8：不同DNA样本类型检测结果对比实验
(1)实验目的
本实施例中通过对不同类型DNA样本的检测，以分析本发明试剂盒适用的样本类型。
(2)实验方法
本实施例中收集10例结直肠癌患者的组织DNA样本、血浆DNA样本、粪便DNA样本、肠道灌洗液(BLF)DNA样本各1份作为待测样本，使用实施例1所述人SDC2基因甲基化 检测试剂盒(荧光PCR法)根据实施例1中的检测步骤进行检测。
(3)实验结果与分析
检测结果如下表所示。
从上表检测结果可知，对于同时提供组织DNA、血浆DNA、粪便DNA和BLF DNA的 10例结直肠癌患者，4种DNA样本检测结果完全相同，符合率为100％，说明本发明试剂盒 适用于多种DNA样本类型，包括组织DNA、血浆DNA、粪便DNA和BLF DNA。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因 此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不 脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因 此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 益善生物技术股份有限公司
<120> 人SDC2基因甲基化检测试剂盒
<160> 27
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
caagtgagag ggcgccgcgt 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acgcggcgcc ctctcacttg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctgcccagcg ctcggcgcag 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctgcgccgag cgctgggcag 20
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cagctcacca tggatgatg 19
<210> 6
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
catcatccat ggtgagctg 19
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gacccatgcc caccatcac 19
<210> 8
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gtgatggtgg gcatgggtc 19
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
gttgttacag gaagtccct 19
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
agggacttcc tgtaacaac 19
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
aaagcaatgc tatcacctc 19
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
gaggtgatag cattgcttt 19
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
caagtgagag ggcgccgcgt 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
ctgcccagcg ctcggcgcag 20
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cagctcacca tggatgatg 19
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gacccatgcc caccatcac 19
<210> 17
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
gttgttacag gaagtccct 19
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
aaagcaatgc tatcacctc 19
<210> 19
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
ccggggcgca gctgcgggcg gcgg 24
<210> 20
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
cgtggggcgc cccaggcacc 20
<210> 21
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gccaccccac ttctctctaa g 21
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
taagtgagag ggcgtcgcgt 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
ctacccaacg ctcgacgcaa 20
<210> 24
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
gttgttatag gaagttttt 19
<210> 25
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
aaaacaatac tatcacctc 19
<210> 26
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
tcggggcgta gttgcgggcg gcgg 24
<210> 27
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
gttattttat ttttttttaa g 21
Claims (10)
1.人SDC2基因甲基化检测试剂盒，其特征在于，包括酶切反应液和含有引物的荧光PCR反应液，所述酶切反应液和荧光PCR反应液被热熔材料分层包装在同一PCR扩增管内，所述酶切反应液位于PCR扩增管的底部。
2.根据权利要求1所述的人SDC2基因甲基化检测试剂盒，其特征在于，所述甲基化敏感限制性内切酶为HinP1I。
3.根据权利要求1所述的人SDC2基因甲基化检测试剂盒，其特征在于，所述酶切反应液中的酶切缓冲液为含10mM Tris-HCl、10mM MgCl2、0.1mg/ml BSA的水溶液。
4.根据权利要求2所述的人SDC2基因甲基化检测试剂盒，其特征在于，每9μl酶切反应液中含有4-6U的HinP1I酶。
5.根据权利要求1-4任一项所述的人SDC2基因甲基化检测试剂盒，其特征在于，所述荧光PCR反应液中引物包括如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.3所示的正引物，如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.4所示的负引物，所述正引物的5’端标记荧光报告基团，所述负引物3’端标记荧光淬灭剂。
6.根据权利要求5述的人SDC2基因甲基化检测试剂盒，其特征在于，还包括内标基因的标记型孪生引物，优选地，其中正引物为SEQ ID 5和SEQ ID 7所示的序列，负引物为SEQ ID6和SEQ ID 8所示的序列。
7.根据权利要求5述的人SDC2基因甲基化检测试剂盒，其特征在于，还包括PCR内参引物，优选地，其中正引物为SEQ ID 9和SEQ ID 11所示的序列，负引物为SEQ ID 10和SEQ ID12所示的序列。
8.根据权利要求5-7任一项所述的人SDC2基因甲基化检测试剂盒，其特征在于，所述正引物与相应的负引物的用量比为1：(1～2)，更优选为1：1.75。
9.根据权利要求1所述的人SDC2基因甲基化检测试剂盒，其特征在于，还包括有阴性质控品和阳性质控品；优选地，所述阴性质控品由BSA和非甲基化人类基因组DNA组成；所述阳性质控品由BSA、非甲基化人类基因组DNA和甲基化人类基因组DNA组成。
10.权利要求1-9任一项所述试剂盒的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)获得待检测DNA样本；
(2)酶切/荧光PCR反应：向酶切反应液中加入1μl待测DNA样本在荧光PCR仪上依次进行酶切反应和荧光PCR反应，其反应条件设置如下：37℃酶切1小时，65℃灭活20分钟，1个循环；95℃预变性10分钟，1个循环；95℃变性30秒，58℃退火30秒，72℃延伸30秒，45个循环；72℃延伸5分钟。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201911096347.XA CN110699437B (zh) | 2019-11-11 | 2019-11-11 | 人sdc2基因甲基化检测试剂盒 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201911096347.XA CN110699437B (zh) | 2019-11-11 | 2019-11-11 | 人sdc2基因甲基化检测试剂盒 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110699437A true CN110699437A (zh) | 2020-01-17 |
| CN110699437B CN110699437B (zh) | 2023-06-20 |
Family
ID=69204876
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201911096347.XA Active CN110699437B (zh) | 2019-11-11 | 2019-11-11 | 人sdc2基因甲基化检测试剂盒 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN110699437B (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2022166734A1 (zh) * | 2021-02-03 | 2022-08-11 | 上海慧众同康生物科技有限公司 | 一种sdc2甲基化检测试剂盒及其应用 |
| CN116970705A (zh) * | 2023-09-13 | 2023-10-31 | 上海奕谱生物科技有限公司 | 用于尿路上皮癌基因甲基化检测的核酸产品、试剂盒及应用 |
Citations (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1278009A (zh) * | 2000-04-30 | 2000-12-27 | 厦门大学 | 用于均相荧光pcr检测的孪生引物 |
| CN103305631A (zh) * | 2013-04-18 | 2013-09-18 | 深圳市生科源技术有限公司 | 小双节rna病毒检测试剂盒及其检测方法 |
| CN104232622A (zh) * | 2014-09-24 | 2014-12-24 | 中国人民解放军疾病预防控制所 | 一种用聚合酶螺旋反应恒温扩增核酸的方法及其应用 |
| CN104673896A (zh) * | 2009-11-05 | 2015-06-03 | 基因特力株式会社 | 用于检测结肠直肠癌的sdc2甲基化 |
| CN105886657A (zh) * | 2010-09-13 | 2016-08-24 | 临床基因组学股份有限公司 | 结直肠癌的外遗传标记以及使用它们的诊断方法 |
| CN107488721A (zh) * | 2017-09-15 | 2017-12-19 | 基因科技（上海）股份有限公司 | 消除pcr产物污染的甲基化扩增方法及其应用 |
| WO2018087129A1 (en) * | 2016-11-08 | 2018-05-17 | Region Nordjylland, Aalborg University Hospital | Colorectal cancer methylation markers |
| CN108103195A (zh) * | 2018-01-22 | 2018-06-01 | 上海酷乐生物科技有限公司 | 一种用于早期结直肠癌的无创多基因甲基化联合检测的引物对和探针、试剂盒及其应用 |
| CN108642180A (zh) * | 2018-05-21 | 2018-10-12 | 上海锐翌生物科技有限公司 | 检测sdc2基因甲基化的方法和试剂盒 |
| WO2018194280A1 (ko) * | 2017-04-17 | 2018-10-25 | (주)지노믹트리 | SDC2(Syndecan 2) 유전자의 메틸화 검출방법 |
| CN110317871A (zh) * | 2019-07-11 | 2019-10-11 | 广州市康立明生物科技有限责任公司 | 一种基因标志物组合及其应用 |
| CN110373470A (zh) * | 2019-08-06 | 2019-10-25 | 阿吉安(福州)基因医学检验实验室有限公司 | 结直肠肿瘤特异性甲基化检测的引物、探针及试剂盒 |
-
2019
- 2019-11-11 CN CN201911096347.XA patent/CN110699437B/zh active Active
Patent Citations (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1278009A (zh) * | 2000-04-30 | 2000-12-27 | 厦门大学 | 用于均相荧光pcr检测的孪生引物 |
| CN104673896A (zh) * | 2009-11-05 | 2015-06-03 | 基因特力株式会社 | 用于检测结肠直肠癌的sdc2甲基化 |
| CN105886657A (zh) * | 2010-09-13 | 2016-08-24 | 临床基因组学股份有限公司 | 结直肠癌的外遗传标记以及使用它们的诊断方法 |
| CN103305631A (zh) * | 2013-04-18 | 2013-09-18 | 深圳市生科源技术有限公司 | 小双节rna病毒检测试剂盒及其检测方法 |
| CN104232622A (zh) * | 2014-09-24 | 2014-12-24 | 中国人民解放军疾病预防控制所 | 一种用聚合酶螺旋反应恒温扩增核酸的方法及其应用 |
| WO2018087129A1 (en) * | 2016-11-08 | 2018-05-17 | Region Nordjylland, Aalborg University Hospital | Colorectal cancer methylation markers |
| WO2018194280A1 (ko) * | 2017-04-17 | 2018-10-25 | (주)지노믹트리 | SDC2(Syndecan 2) 유전자의 메틸화 검출방법 |
| CN107488721A (zh) * | 2017-09-15 | 2017-12-19 | 基因科技（上海）股份有限公司 | 消除pcr产物污染的甲基化扩增方法及其应用 |
| CN108103195A (zh) * | 2018-01-22 | 2018-06-01 | 上海酷乐生物科技有限公司 | 一种用于早期结直肠癌的无创多基因甲基化联合检测的引物对和探针、试剂盒及其应用 |
| CN108642180A (zh) * | 2018-05-21 | 2018-10-12 | 上海锐翌生物科技有限公司 | 检测sdc2基因甲基化的方法和试剂盒 |
| CN110317871A (zh) * | 2019-07-11 | 2019-10-11 | 广州市康立明生物科技有限责任公司 | 一种基因标志物组合及其应用 |
| CN110373470A (zh) * | 2019-08-06 | 2019-10-25 | 阿吉安(福州)基因医学检验实验室有限公司 | 结直肠肿瘤特异性甲基化检测的引物、探针及试剂盒 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| GABRIEL BEIKIRCHER ET AL.: "Multiplexed and Sensitive DNA Methylation Testing Using Methylation-Sensitive Restriction Enzymes "MSRE-qPCR"", 《METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY》 * |
| 薛猛等: "结直肠癌基因DNA甲基化标志物筛查的价值", 《世界华人消化杂志》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2022166734A1 (zh) * | 2021-02-03 | 2022-08-11 | 上海慧众同康生物科技有限公司 | 一种sdc2甲基化检测试剂盒及其应用 |
| CN116970705A (zh) * | 2023-09-13 | 2023-10-31 | 上海奕谱生物科技有限公司 | 用于尿路上皮癌基因甲基化检测的核酸产品、试剂盒及应用 |
| CN116970705B (zh) * | 2023-09-13 | 2024-05-28 | 上海奕谱生物科技有限公司 | 用于尿路上皮癌基因甲基化检测的核酸产品、试剂盒及应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN110699437B (zh) | 2023-06-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108977543B (zh) | 一种基于联合检测sdc2和sfrp2基因甲基化水平的结直肠癌早期诊断试剂 | |
| CN113755603B (zh) | 子宫内膜癌早期筛查诊断用标志物、引物探针及试剂盒 | |
| KR102223014B1 (ko) | 전암병변의 검출방법 | |
| WO2022022386A1 (zh) | 早期结直肠癌和腺瘤的dna甲基化标志物、检测其的方法及其应用 | |
| CN102947468B (zh) | 大肠肿瘤的检测方法 | |
| US20140255418A1 (en) | Composite biomarkers for non-invasive screening, diagnosis and prognosis of colorectal cancer | |
| CN110484621B (zh) | 一种肝癌早期预警的方法 | |
| CN108642180A (zh) | 检测sdc2基因甲基化的方法和试剂盒 | |
| CN112538529A (zh) | 血液中结直肠癌的分子标记物及其检测试剂盒和方法 | |
| CN110699437A (zh) | 人sdc2基因甲基化检测试剂盒 | |
| CN111826446A (zh) | 用于膀胱癌早期筛查与辅助诊断的引物、探针和试剂盒 | |
| US11535897B2 (en) | Composite epigenetic biomarkers for accurate screening, diagnosis and prognosis of colorectal cancer | |
| CN110592224A (zh) | 人结直肠癌相关基因特定区域甲基化的引物组及试剂以及试剂盒及其应用 | |
| KR101374822B1 (ko) | 자궁경부암 진단용 메틸화 마커 | |
| WO2024002165A1 (zh) | 用于诊断胃癌的dna甲基化生物标记物、试剂盒及用途 | |
| JP2022522979A (ja) | スクリーニング方法 | |
| KR101145406B1 (ko) | 장암 진단을 위한 장암 특이적 메틸화 마커 유전자의 메틸화 검출방법 | |
| CN116064786B (zh) | 一种用于检测胃癌的组合物，试剂盒及其用途 | |
| CN117343992A (zh) | 一种多基因合并荧光通道检测的方法 | |
| CN117344011A (zh) | 用于诊断胃癌的甲基化生物标记物、试剂盒及用途 | |
| CN116064786A (zh) | 一种用于检测胃癌的组合物，试剂盒及其用途 | |
| CN117535415A (zh) | 一种用于乳腺癌检测的核酸组合物和试剂盒 | |
| CN117721207A (zh) | 用于检测宫颈癌和/或宫颈高级别病变的组合物及其用途 | |
| CN110846418A (zh) | 结直肠癌Septin9基因甲基化检测的引物组、探针组、试剂盒及用途 | |
| KR101136505B1 (ko) | 장암 진단을 위한 장암 특이적 메틸화 마커 유전자의 메틸화 검출방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB02 | Change of applicant information | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: No. 29, Helix 3 Road, Guangzhou International Biological Island, Huangpu District, Guangzhou City, Guangdong Province, 510663 Applicant after: SUREXAM BIO-TECH Co.,Ltd. Address before: 5 / F, area C, Guangzhou innovation base, No. 80, guanyue Road, Science City, Guangzhou, Guangdong Province Applicant before: SUREXAM BIO-TECH Co.,Ltd. |
|
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |