CN117343992A - 一种多基因合并荧光通道检测的方法 - Google Patents
一种多基因合并荧光通道检测的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117343992A CN117343992A CN202210760371.4A CN202210760371A CN117343992A CN 117343992 A CN117343992 A CN 117343992A CN 202210760371 A CN202210760371 A CN 202210760371A CN 117343992 A CN117343992 A CN 117343992A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gene
- dna
- seq
- detection
- methylation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 63
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 133
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 claims abstract description 123
- 230000011987 methylation Effects 0.000 claims abstract description 116
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 36
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M Bisulfite Chemical compound OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 25
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims abstract description 19
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 110
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 106
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 78
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 78
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 51
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 46
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 claims description 29
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 claims description 26
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 claims description 25
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 claims description 25
- 238000013461 design Methods 0.000 claims description 22
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 22
- 108700001666 APC Genes Proteins 0.000 claims description 20
- 101000739671 Homo sapiens Semaphorin-6D Proteins 0.000 claims description 20
- 102100037548 Semaphorin-6D Human genes 0.000 claims description 20
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 20
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 20
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 20
- 101001123859 Homo sapiens Sialidase-1 Proteins 0.000 claims description 18
- 102100022650 Homeobox protein Hox-A7 Human genes 0.000 claims description 17
- 101001045116 Homo sapiens Homeobox protein Hox-A7 Proteins 0.000 claims description 17
- 101000919183 Homo sapiens Probable carboxypeptidase X1 Proteins 0.000 claims description 14
- 108091006649 SLC9A3 Proteins 0.000 claims description 14
- 102000046061 Sodium-Hydrogen Exchanger 3 Human genes 0.000 claims description 14
- 102100028760 Sialidase-1 Human genes 0.000 claims description 12
- 108091029430 CpG site Proteins 0.000 claims description 11
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 11
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 11
- 101150087690 ACTB gene Proteins 0.000 claims description 10
- 230000007067 DNA methylation Effects 0.000 claims description 10
- 102100029401 Probable carboxypeptidase X1 Human genes 0.000 claims description 9
- 101150024252 Neu1 gene Proteins 0.000 claims description 8
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 claims description 8
- 102100034540 Adenomatous polyposis coli protein Human genes 0.000 claims description 7
- 101000924577 Homo sapiens Adenomatous polyposis coli protein Proteins 0.000 claims description 7
- 101100168480 Homo sapiens CPXM1 gene Proteins 0.000 claims description 7
- 101150090906 Sema6d gene Proteins 0.000 claims description 7
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims description 7
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 7
- 101150049694 slc9a3 gene Proteins 0.000 claims description 7
- 238000010791 quenching Methods 0.000 claims description 6
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 claims description 6
- 101150013773 Hoxa7 gene Proteins 0.000 claims description 5
- ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N tetramethylrhodamine Chemical compound C=12C=CC(N(C)C)=CC2=[O+]C2=CC(N(C)C)=CC=C2C=1C1=CC=CC=C1C([O-])=O ABZLKHKQJHEPAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 4-[4-[[2,5-dimethoxy-4-[(4-nitrophenyl)diazenyl]phenyl]diazenyl]-n-methylanilino]butanoic acid Chemical compound COC=1C=C(N=NC=2C=CC(=CC=2)N(C)CCCC(O)=O)C(OC)=CC=1N=NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 UDGUGZTYGWUUSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims description 4
- 125000006853 reporter group Chemical group 0.000 claims description 4
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000000112 colonic effect Effects 0.000 claims description 3
- 210000000416 exudates and transudate Anatomy 0.000 claims description 3
- WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 4-[[4-(dimethylamino)phenyl]diazenyl]benzoic acid Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1N=NC1=CC=C(C(O)=O)C=C1 WCKQPPQRFNHPRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N texas red Chemical compound [O-]S(=O)(=O)C1=CC(S(Cl)(=O)=O)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 MPLHNVLQVRSVEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 26
- 230000004907 flux Effects 0.000 abstract description 4
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 abstract description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 32
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 19
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 19
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 15
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical class NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 13
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 11
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 10
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 10
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 10
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 10
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 10
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 9
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 9
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 9
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 8
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 8
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 6
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 6
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical compound CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 5
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 5
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 5
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 5
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 5
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 5
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000001369 bisulfite sequencing Methods 0.000 description 4
- 238000007855 methylation-specific PCR Methods 0.000 description 4
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 description 4
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 4
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 210000004876 tela submucosa Anatomy 0.000 description 4
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 201000011243 gastrointestinal stromal tumor Diseases 0.000 description 3
- 238000012164 methylation sequencing Methods 0.000 description 3
- 125000000714 pyrimidinyl group Chemical group 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 5-methylcytosine Chemical compound CC1=CNC(=O)N=C1N LRSASMSXMSNRBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101100491335 Caenorhabditis elegans mat-2 gene Proteins 0.000 description 2
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 206010051066 Gastrointestinal stromal tumour Diseases 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N Sulfurous acid Chemical compound OS(O)=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004100 adrenal gland Anatomy 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 description 2
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000003935 denaturing gradient gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 2
- 210000000188 diaphragm Anatomy 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 2
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 2
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 2
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 2
- 238000007430 reference method Methods 0.000 description 2
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 2
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- 210000003384 transverse colon Anatomy 0.000 description 2
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 2
- TVZRAEYQIKYCPH-UHFFFAOYSA-N 3-(trimethylsilyl)propane-1-sulfonic acid Chemical compound C[Si](C)(C)CCCS(O)(=O)=O TVZRAEYQIKYCPH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 101000756632 Homo sapiens Actin, cytoplasmic 1 Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 208000018142 Leiomyosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 241001337020 Linevichella vortex Species 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 241000270295 Serpentes Species 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 208000009956 adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N adenyl group Chemical group N1=CN=C2N=CNC2=C1N GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 208000002458 carcinoid tumor Diseases 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 238000007847 digital PCR Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- GRWZHXKQBITJKP-UHFFFAOYSA-L dithionite(2-) Chemical compound [O-]S(=O)S([O-])=O GRWZHXKQBITJKP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 230000005021 gait Effects 0.000 description 1
- 208000010749 gastric carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000011528 liquid biopsy Methods 0.000 description 1
- 238000011880 melting curve analysis Methods 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229940124276 oligodeoxyribonucleotide Drugs 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 238000003793 prenatal diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000012175 pyrosequencing Methods 0.000 description 1
- 239000002096 quantum dot Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012772 sequence design Methods 0.000 description 1
- 208000000649 small cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 206010041823 squamous cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 201000000498 stomach carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
- C12Q1/6851—Quantitative amplification
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
- C12Q1/6886—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material for cancer
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Oncology (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
Abstract
本发明涉及一种多基因合并荧光通道检测的方法。本发明提供了一种多基因合并荧光通道检测的方法,所述方法包含以下步骤:a)提取待测生物样本的基因组DNA和/或细胞游离DNA;b)对步骤a)中所述基因组DNA和/或细胞游离DNA进行亚硫酸氢盐转化;c)对步骤b)中经过亚硫酸氢盐转化的基因组DNA和/或细胞游离DNA进行多基因合并荧光通道的检测。本发明提供的检测方法可以实现有限的荧光通道数对微量或痕量DNA的尽可能多的靶点同步检测,以及实现从大量的非甲基化背景DNA中检测出微量的甲基化靶序列,从而提升了检测的灵敏度;并且所述方法能够实现在有限的荧光通道数检测尽量多的待检位点,提升了检测的效率和通量。
Description
技术领域
本发明属于基因检测领域,具体涉及一种多基因合并荧光通道检测的方法。
背景技术
循环游离DNA(Circulating free DNA)或细胞游离DNA(Cell free DNA,cfDNA)广泛存在于人体的各种体液如血清、血浆、脑脊液、尿液或唾液中,随组织损伤、癌症和炎症反应等发生浓度变化。近年来随着基因诊断技术的发展,cfDNA检测作为液态活检的常见形式,被用于临床孕妇产前诊断、肿瘤早诊、器官移植术后排斥和感染检测等领域。
cfDNA检测在具备巨大潜力的同时,在技术开发和临床应用上面临一系列难题。首先,血液中cfDNA含量一般较低,片段较小,不易提取。其次,由于血浆中存在的靶cfDNA微乎其微,标本的采集、抗凝剂使用和保存的不当都会影响检测的质量,造成假阳性或假阴性的结果。再者,cfDNA因为是片段化DNA,断裂的随机性使检测的靶区域可能不完整,进一步影响靶基因检出。这些都影响了cfDNA的基因检测和各种研究的开展。
下一代测序(Next Generation Sequencing,NGS)技术在近些年发展势头迅猛,应用广泛。甲基化测序方法有多种,按原理分为以下三大类:一、重亚硫酸盐测序(bisulfitesequencing);二、基于限制性内切酶的测序;三、靶向富集甲基化位点测序。其中,重亚硫酸盐测序数据重复性好,但是灵敏度较低,而且费用太高,即使现在测序费用不断降低的前提下也一样让科研工作者很难接受。另外,利用该原理在测序中产生的庞大数据,使得分析任务繁重。基于限制性内切酶的测序可以确定甲基化位点,减少数据量,通量较高,但是酶切的效率低可能使某些甲基化的位点未被切开而导致结果不全面。靶向富集甲基化位点测序更有针对性,测序费用较低,分析数据也相对容易,但是这个方法最大的弊端在于富集结果的不确定性,经常使得结果不可验证。而且,即便是费用低的酶切法(即上文所述基于限制性内切酶的甲基化测序方法),费用也是甲基化特异性PCR(methylation-specific PCR,MSP)检测的数十倍,检测的复杂度的增加和检测周期的延长也可能导致更多的人为误差。
大部分用于肿瘤早期筛查的单个基因检测因为敏感度或特异度偏低,不能满足临床需要。采用多基因联合检测可以有效解决敏感度低的问题,提高肿瘤早期筛查和诊断的准确度(Olkhov-Mitsel,E.,et al.,(2014).“Novel multiplex MethyLight protocolfor detection of DNA methylation in patient tissues and bodily fluids”,Scientific Reports 4:4432.)。多基因联合检测更适合类似cfDNA这样的珍贵临床样本,仅需要少量的模板,就可以实现对多个基因的检测分析。同时,多基因联合检测方案符合卫生经济学,它使用更少量的试剂和检测材料。而且,节省了检测时间,提高了检测通量和效率。
即便如此,现有技术中的多基因联合检测也有一些局限性,作为市场上主流的荧光定量检测平台,ABI 7500实时荧光定量PCR仪支持最多五种荧光染料(包括FAMTM/Green I,/>/JOE,NEDTM/TAMRATM//>ROXTM/Texas/>和/>)的同时检测(其中,ROX作为参比荧光使用),其他平台如QuantstudioTM 12K Flex实时荧光定量PCR系统支持最多六种荧光探针的使用。
限制荧光通道使用的另一个因素是引物和探针的设计。MethyLight是用实时定量PCR(real-time quantitative PCR)检测甲基化的一种方法,它对经过亚硫酸氢盐转化后的DNA进行检测。亚硫酸氢盐将DNA中非甲基化的胞嘧啶(C)转化成尿嘧啶(U),而甲基化的胞嘧啶不被改变,这一过程使DNA的复杂性显著降低,因而设计高特异性的引物探针更具挑战,需要特别关注靶序列和引物探针的CG碱基含量和寡核苷酸长度、引物探针与靶序列的退火温度以及多重体系中引物探针的形成二级结构和二聚体的可能。此外,在多基因联合检测中可能存在大量的非甲基化的DNA,需要从这些大量的背景DNA中检测出微量的甲基化靶序列,对于检测的灵敏度要求严格。而对于点突变的检测,由于野生型DNA与突变型DNA在序列上仅存在一个碱基的差异,所设计的引物和探针需要经过特殊的错配设计才能提高对于突变位点的检测特异性。另外,需要从生物样本中大量的野生型DNA背景下,实现微量的突变型DNA检出,对于检测的灵敏度也有严格的要求。
发明内容
发明要解决的问题
针对现有技术中存在的上述缺陷,为了突破上述局限,经过大量的分析和试验,本发明提供一种多基因合并荧光通道检测的方法,利用该方法可以实现有限的荧光通道数对微量或痕量DNA的尽可能多的靶点同步检测,并且费用低廉,操作便捷、周期短。
用于解决问题的方案
在本发明的第一方面中,提供了一种多基因合并荧光通道检测的方法,所述方法包含以下步骤:
a)提取待测生物样本的基因组DNA和/或细胞游离DNA(cfDNA);
b)对步骤a)中所述基因组DNA和/或细胞游离DNA进行亚硫酸氢盐转化;
c)对步骤b)中经过亚硫酸氢盐转化的基因组DNA和/或细胞游离DNA进行多基因合并荧光通道的检测;
其中,所述步骤c)包含以下步骤:
i)确定检测目标,所述检测目标为待测生物样本中与肿瘤相关的DNA甲基化区域和/或突变位点,并将所述DNA甲基化区域和/或突变位点作为标志物,其中所述标志物的数量为1个以上;
ii)针对步骤i)中所述标志物设计扩增引物和探针;优选的,同时针对内参基因设计扩增引物和探针;
iii)利用步骤ii)中的扩增引物和探针对步骤a)中的基因组DNA和/或细胞游离DNA和/或步骤b)中经过亚硫酸氢盐转化处理的基因组DNA和/或细胞游离DNA进行荧光定量PCR,并且,所述荧光定量PCR中荧光定量通道的数量少于步骤i)中所述标志物的数量。
在一些实施方案中,所述标志物为SLC9A3、CPXM1、HOXA7、NEU1、SEMA6D和APC中的任一种以上的基因,所述内参基因为ACTB基因。
在一些实施方案中,所述步骤ii)中的探针在5’端标记有荧光报告基团,所述荧光报告基团选自由FAM、VIC、NED、CY5、TET、FITC、JOE、HEX、TAMRA、CY3、CY5.5、ROX和Texas Red组成的组中任一种;在一些优选的实施方案中,所述荧光报告基团为FAM、VIC、NED和CY5;
所述步骤ii)中的探针在3’端标记有荧光淬灭基团,所述荧光淬灭基团选自由BHQ1、BHQ2、Dabcyl和TAMRA组成的组中任一种;在一些优选的实施方案中,所述荧光淬灭基团为BHQ1和BHQ2。
在一些实施方案中,其中所述SLC9A3、CPXM1、HOXA7、NEU1、SEMA6D和APC中的任意两种基因在一个荧光定量通道中进行检测;
在一些优选的实施方案中,所述SLC9A3和CPXM1基因在一个荧光定量通道中进行检测,所述HOXA7、NEU1基因在一个荧光定量通道中进行检测,所述SEMA6D和APC基因在一个荧光定量通道中进行检测,并且所述ACTB基因在一个荧光定量通道中进行检测;
在一些更优选的实施方案中,所述SLC9A3和CPXM1基因在FAM荧光定量通道中进行检测,所述HOXA7、NEU1基因在VIC荧光定量通道中进行检测,所述SEMA6D和APC基因在NED荧光定量通道中进行检测,并且所述ACTB基因在CY5荧光定量通道中进行检测。
在一些实施方案中,所述SLC9A3基因的扩增引物和探针的序列分别如SEQ ID NO:1-3所示;所述CPXM1基因的扩增引物和探针的序列分别如SEQ ID NO:4-6所示;所述HOXA7基因的扩增引物和探针的序列分别如SEQ ID NO:7-9所示;所述NEU1基因的扩增引物和探针的序列分别如SEQ ID NO:10-12所示;所述SEMA6D基因的扩增引物和探针的序列分别如SEQ ID NO:13-15所示;所述APC基因的扩增引物和探针的序列分别如SEQ ID NO:16-18所示;所述ACTB基因的扩增引物和探针的序列分别如SEQ ID NO:19-21所示。
在一些实施方案中,对步骤ii)中所述的扩增引物进行变异设计,使其在合并荧光通道检测时,能够保持单通道检测中的检测特异性;
使用上述变异设计的扩增引物,可有效可提升经亚硫酸氢盐转化后的DNA的甲基化检测的特异性,尤其适用于多个基因合并荧光通道检测上可能遇到的特异性降低的情况。
在一些具体的实施方案中,对所述扩增引物进行变异设计的方法为:根据本发明实施例7中的表9所示的非甲基化转化序列、甲基化转化后序列和引物设计改良序列,将扩增引物最靠近3’端的一个CpG位点邻近的碱基进行变异设计。
在一些实施方案中,进行变异设计后的扩增引物包括:NEU1基因的扩增引物SEQID NO:22,SEMA6D基因的扩增引物SEQ ID NO:23和APC基因的扩增引物SEQ ID NO:24。
在一些实施方案中,所述SLC9A3基因的扩增引物和探针的序列分别如SEQ ID NO:1-3所示;所述CPXM1基因的扩增引物和探针的序列分别如SEQ ID NO:4-6所示;所述HOXA7基因的扩增引物和探针的序列分别如SEQ ID NO:7-9所示;所述NEU1基因的扩增引物和探针的序列分别如SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示;所述SEMA6D基因的扩增引物和探针的序列分别如SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15所示;所述APC基因的扩增引物和探针的序列分别如SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:18所示;所述ACTB基因的扩增引物和探针的序列分别如SEQ ID NO:19-21所示。
在一些实施方案中,本发明第一方面提供的多基因合并荧光通道检测的方法能够对微量或痕量的基因组DNA和/或细胞游离DNA中的多个甲基化标志物和/或点突变标志物进行同步检测。
具体来说,通过采用部分或全部靶基因探针一致的荧光基团修饰方式能够实现有限的荧光通道数对微量或痕量DNA的尽可能多的位点同步检测。所述方法针对微量或痕量DNA、包含内参在内的7个靶位点使用四通道合并检测。该方法既适用于两个以上的甲基化区域的荧光通道的合并,也适用于甲基化区域及点突变检测在同一荧光通道进行同时检测,同时还适用于多个点突变检测在同一荧光通道中进行同时检测。
在一些实施方案中,其中所述微量或痕量的基因组DNA和/或细胞游离DNA来源于单细胞DNA或片段化DNA;在一些优选的实施方案中,所述片段化DNA是血浆中的游离DNA。在一些实施方案中,所述微量或痕量DNA的最低甲基化检出量为50pg或以下。
在本发明的第二方面中,提供了一种用于肿瘤诊断的试剂盒,其中,所述试剂盒包含用于检测待测生物样本中的甲基化标志物和/或点突变标志物的甲基化水平和/或突变水平的试剂;
在一些优选的实施方案中,所述肿瘤为胃癌,所述甲基化标志物和/或点突变标志物为选自由SLC9A3、CPXM1、HOXA7、NEU1、SEMA6D和APC基因组成的组中的任一种或其任意组合。
在一些实施方案中,所述试剂盒中的所述试剂包含如本发明在第一方面中涉及的未经过变异设计以及经过变异设计的扩增引物和探针。
在一些实施方案中,所述待测生物样本选自由细胞、组织样品、体液样品和排泄物组成的组中的任一种,或上述生物样本的任意组合;
在一些优选的实施方案中,所述体液样品选自由血浆、唾液和血清组成的组中的任一种或其任意组合,所述排泄物选自由尿液、粪便和结肠流出物组成的组中的任一种或其任意组合;
在一些更优选的实施方案中,所述待测生物样本选自血浆。
发明的效果
本发明提供的多基因合并荧光通道检测的方法,相对于现有技术具有以下有益效果:
(1)本发明通过多基因合并荧光通道检测的方法,实现了利用有限的荧光通道数对微量或痕量DNA的尽可能多的标志物的同步检测,以及能够从大量的非甲基化背景DNA和/或从大量未突变的野生型DNA中检测出微量的甲基化靶序列和/或突变的靶序列,提升了检测的效率和通量,并且提高了检测的灵敏度。
(2)本发明突破了ABI 7500检测平台最多检测除ROX参比荧光外的最多四个荧光通道中四个待检基因位点的限制,通过计算和分析合并检测体系中引物探针间的退火温差、形成二级结构和二聚体的能力等,使这一体系能够实现有限的荧光通道数检测尽量多的待检标志物,进一步提升了检测的效率和通量。
(3)本发明通过调整引物和探针的序列设计,解决了合并通道检测中可能出现的特异性变差的问题,在保持与单通道检测同等特异性的基础上,实现从大量的非甲基化背景DNA和/或从大量未突变的野生型DNA中检测出微量的甲基化靶序列和/或突变的靶序列,提升了检测的灵敏度。
附图说明
图1A示出了23例胃癌及165例非胃癌新鲜冰冻组织样本的甲基化差异热图。
图1B示出了395例胃癌及559例非胃癌的石蜡包埋组织样本的甲基化差异热图。
图2示出了实施例8中所述不同检测方法的ROC曲线。
具体实施方式
为了便于理解本发明,下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现,并不限于本文所描述的实施例。相反地,提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989);寡聚核苷酸合成(M.J.Gait,1984);分子生物学实验指南(F.M.Ausubel等,1987版);PCR:聚合酶链式反应(Mullis等,1994版)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂,均为市售产品。
除非另有定义,本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
定义
为了便于理解本技术,下面定义了一些术语和短语。
在整个说明书和权利要求书中,以下术语具有与本文明确相关的含义,除非上下文另有明确规定。在本发明中使用的短语“在一个实施方案中”不一定指代相同的实施方案,尽管其可能是。此外,在本发明中使用的短语“在另一实施方案中”不一定指代不同的实施方案,尽管其可能是。因此,如下所述,可以容易地组合本发明的各个实施方案,而不脱离本发明的范围或精神。
此外,如本发明所使用的,术语“或”是包含性的“或”符号,并且等同于术语“和/或”,除非上下文另有明确规定。术语“基于”不是排他性的,并且允许基于未描述的其他因素,除非上下文另有明确规定。此外,在整个说明书中,“一个”、“一种”和“所述/该”的含义包括复数指示物。“在......中”中的含义包括“在......中”和“在......上”。
本说明书中,术语“样品模板”是指来源于样品的用于分析“靶”的存在的核酸。相比之下,“背景模板”用于指样品模板以外的核酸,其可能存在或可能不存在于样品中。背景模板通常是无意的。这可能是遗留的结果,或者可能是由于试图从样品中纯化走的核酸污染物的存在。例如,来自生物体的待检测核酸以外的核酸可以作为测试样品的背景存在。
本说明书中,术语“引物”是指在纯化的限制性消化物中天然存在的或合成产生的寡核苷酸,当处于其中诱导与核酸链互补的引物延伸产物合成的条件下(例如,在核苷酸和诱导剂如DNA聚合酶的存在下并且在合适的温度和pH下)时,其能够作为合成的起点。引物优选是单链的,用于扩增的最大效率,但也可以是双链的。如果是双链,则在用于制备延伸产物之前首先处理引物以分离其链。优选地,引物是寡脱氧核糖核苷酸。引物必须足够长以在诱导剂的存在下引发延伸产物的合成。引物的确切长度将取决于许多因素,包括温度、引物来源以及方法的使用。
本说明书中,术语“探针”是指在纯化的限制性消化物中天然存在的或者合成、重组或通过PCR扩增产生的寡核苷酸(例如,核苷酸序列),其能够与另一种感目标寡核苷酸杂交。探针可以是单链或双链的。探针可用于特定基因序列的检测、鉴定和分离(例如,“捕获探针”)。预期在一些实施方案中,本发明中使用的任何探针可以用任何“报道分子”进行标记,使得在任何检测系统中可检测。
本说明书中,术语“胃癌(gastric cancer)”,“胃癌(gastric carcinoma)”和“胃癌(stomach cancer)”涵义相同,是指原发于胃的上皮源性恶性肿瘤。
本说明书中,术语“胃癌”以最广泛的含义使用,并且是指在胃中开始的所有癌症。其包括在胃中开始的以下亚型:腺癌、淋巴瘤、胃肠道间质瘤(gastrointestinal stromaltumor,GIST)、类癌瘤和鳞状细胞癌、小细胞癌和平滑肌肉瘤。其还包括以下阶段(如由括号中对应的TNM分类所限定):0期(Tis,N0,M0)、IA期(T1,N0,M0)、IB期(T1,N1,M0;或T2,N0,M0)、IIA期(T1,N2,M0;T2,N1,M0;或T2,N0,M0)、IIB期(T1,N3,M0;T2,N2,M0;T3,N1,M0;或T4a,N0,M0)、IIIA期(T1,N2,M0;T2,N1,M0;或T2,N0,M0)、IIIB期(T3,N3,M0;T4a,N2,M0;或T4b,N0或N1,M0)、IIIC期(T4a,N3,M0;或T4b,N2或N3,M0)和IV期(任意其他T,N和M)。
本说明书中,TNM(Tumor Node Metastasis)是肿瘤学中对肿瘤的一种分期形式,其中T(Tumor)指肿瘤原发灶的情况,随着肿瘤体积的增加和邻近组织受累范围的增加,依次用T1~T4来表示;N(Node)指区域淋巴结(regional lymph node)受累情况。淋巴结未受累时,用N0表示。随着淋巴结受累程度和范围的增加,依次用N1~N3表示;M(Metastasis)指远处转移(通常是血道转移),没有远处转移者用M0表示,有远处转移者用M1表示。在此基础上,用TNM三个指标的组合划出特定的分期。常用分期符号如下:
通常,TNM分期中T,N,M确定后就可以得出相应的总的分期/阶段,即I期,II期,III期,IV期等。
胃癌的阶段在它的定义内包括但不严格限于如下所述的下列阶段:
I期:在I期中,在胃壁粘膜(最内层)的内层中已经形成癌症。I期根据癌症已经扩散的位置被分成IA期和IB期。
IA期:癌症可能已经扩散到胃壁的粘膜下层(紧挨着粘膜的组织层)中。
IB期:癌症可能已经扩散到胃壁的粘膜下层(紧挨着粘膜的组织层)并且在接近肿瘤的1个或2个淋巴结中被发现;或已经扩散到胃壁的肌肉层。
II期:II期胃癌根据癌症已经扩散的位置被分成IIA期和IIB期。
IIA期:癌症已经扩散到胃壁的浆膜下层(紧挨着浆膜的组织层);或已经扩散到胃壁的肌肉层并且在接近肿瘤的1个或2个淋巴结中被发现;或可能已经扩散到胃壁的粘膜下层(紧挨着粘膜的组织层)并且在接近肿瘤的3个至6个淋巴结中被发现。
IIB期:癌症已经扩散到胃壁的浆膜(最外层);或已经扩散到胃壁的浆膜下层(紧挨着浆膜的组织层)并且在接近肿瘤的1个或2个淋巴结中被发现;或已经扩散到胃壁的肌肉层并且在接近肿瘤的3个至6个淋巴结中被发现;或可能已经扩散到胃壁的粘膜下层(紧挨着粘膜的组织层)并且在接近肿瘤的7个或更多个淋巴结中被发现。
III期:III期胃癌根据癌症已经扩散的位置被分成IIIA期、IIIB期、以及IIIC期。
IIIA期:癌症已经扩散到胃壁的浆膜层(最外层)并且在接近肿瘤的1个或2个淋巴结中被发现;或已经扩散到胃壁的浆膜下层(紧挨着浆膜的组织层)并且在接近肿瘤的3个至6个淋巴结中被发现;或已经扩散到胃壁的肌肉层并且在接近肿瘤的7个或更多个淋巴结中被发现。
IIIB期:癌症已经扩散到邻近器官,如脾、横结肠、肝脏、横隔膜、胰腺、肾脏、肾上腺、或小肠,并且可以在接近肿瘤的1个或2个淋巴结中被发现;或已经扩散到胃壁的浆膜(最外层)并且在接近肿瘤的3个至6个淋巴结中被发现;或扩散到胃壁的浆膜下层(紧挨着浆膜的组织层)并且在接近肿瘤的7个或更多个淋巴结中被发现。
IIIC期:癌症已经扩散到邻近器官,如脾、横结肠、肝脏、横隔膜、胰腺、肾脏、肾上腺、或小肠,并且可以在接近肿瘤的3个或更多个淋巴结中被发现;或已经扩散到胃壁的浆膜(最外层)并且在接近肿瘤的7个或更多个淋巴结中被发现。
IV期:在IV期中,癌症已经扩散到身体的远处部位。
本说明书中,术语“标志物”指的是诸如基因、蛋白、代谢物等,是可测量的分子。与疾病相关的变量测定,可用于诊断疾病,或指示疾病的严重程度。疾病的存在或风险可以从生物标志物这个参数推断出来,而不需要测定疾病本身。
本说明书中,术语“实时荧光定量PCR”表示在DNA扩增反应中,以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应(PCR)循环后产物总量的方法。通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。该PCR技术中,循环阈值(Cycle threshold,Ct值)的含义是:每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。例如,荧光阈值(threshold)的设定方法如下:PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号,荧光阈值的缺省(默认)设置是3~15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。
本说明书中,术语“扩增效率”是评估PCR扩增效率稳定可靠的一种方法,使用一系列稀释样品,采用标准qPCR程序进行扩增获得Ct值,最后根据各样品浓度(本申请中为各样本的甲基化率)及相应的Ct值绘制标准曲线,得到线性方程Ct=-klgX0+b(k为曲线斜率,X0为系列稀释样本的PCR反应投入量,b为截距),扩增效率E=10^(-1/k)-1。
本说明书中,术语“cut off值”表示针对某一个生物标志物的判断样本阴阳性的一个临界Ct值。根据本申请的某些具体实施方式,“cut-off值”(即阳性判断值)是根据一定数量的样本数据,基于统计学处理而得到的,该临界Ct值可以根据所需要的灵敏度或特异性的要求不同而不同。
本说明书中,术语“灵敏度”表示从确诊阳性的样本中检测出阳性的比例,其计算公式为:灵敏度=(检测到的阳性/真阳性)×100%,“真阳性”即采用公认的金标准确诊为阳性。而“特异性”表示一定正常人样本中检测出正常的比例,其计算公式为特异性=(检测到的阴性/真阴性)×100%。
本说明书中,术语“受试者”可以是哺乳动物或所述哺乳动物的细胞、组织、器官或一部分。在本发明中,哺乳动物是指任何种类的哺乳动物,优选人(包括人、人受试者或人患者)。受试者和哺乳动物包括,但不限于,农场动物、运动动物、宠物、灵长类动物、马、狗、猫和啮齿类动物如小鼠和大鼠。
本说明书中,诊断包括受试者疾病状态或病症的检测或鉴定、确定受试者将患给定疾病或病症的可能性、确定患有疾病或病症的受试者将对治疗有反应的可能性、确定患有疾病或病症的受试者的预后(或其可能的进展或消退)以及确定治疗对患有疾病或病症的受试者的效果。
本说明书中,术语“甲基化”是指胞嘧啶(Cytosine,简称为C)位置C5或N4的胞嘧啶甲基化,腺嘌呤(Adenine,简称为A)的N6位点或其他类型的核酸甲基化。体外扩增的DNA通常是非甲基化的,因为通常体外DNA扩增方法不能保留扩增模板的甲基化模式。然而,“非甲基化DNA”或“甲基化DNA”也可以分别指原始模板非甲基化或甲基化的扩增DNA。
因此,如本文所用,术语“甲基化核苷酸”或“甲基化核苷酸碱基”是指在核苷酸碱基上存在甲基部分,其中甲基部分不存在于公认的典型核苷酸碱基中。例如,胞嘧啶在其嘧啶环上不包含甲基部分,但是5-甲基胞嘧啶在其嘧啶环的5位包含甲基部分。因此,胞嘧啶不是甲基化核苷酸,5-甲基胞嘧啶是甲基化核苷酸。在另一个实例中,胸腺嘧啶(Thymine,简称T)在其嘧啶环的5位含有甲基部分;然而,为了本文的目的,当存在于DNA中时,不认为胸腺嘧啶是甲基化核苷酸,因为胸腺嘧啶是DNA的典型核苷酸碱基。
本说明书中,甲基化状态可任选地由术语“甲基化值”表示或指示(例如,表示甲基化频率、分数、比例、百分比等)。术语“甲基化值”可以例如在用甲基化依赖性限制酶限制性消化之后定量存在的完整核酸的量,或者通过比较亚硫酸氢盐反应后的扩增谱,或者通过比较亚硫酸氢盐处理和未处理的核酸的序列来产生。因此,诸如甲基化值的值代表甲基化状态,因此可用作基因座的多个拷贝中甲基化状态的定量指标。共甲基化程度由多于一个甲基化位点的甲基化状态表示或指示,在一段甲基化区域内,当多于一个甲基化位点的甲基化状态均为甲基化时定义为共甲基化。
如本文所用,“甲基化频率”或“甲基化百分比(%)”是指分子或基因座为甲基化的实例数相对于分子或基因座为非甲基化的实例数。例如,在一些实施方案中,甲基化百分比是指甲基化胞嘧啶的百分比,以β值表示,即β=携带甲基化胞嘧啶数量/(携带甲基化胞嘧啶数量+未携带甲基化胞嘧啶的数量)。
本说明书中,术语“亚硫酸氢盐试剂”是指在一些实施方案中包含亚硫酸氢盐(bisulfite)、亚硫酸氢盐(disulfite)、亚硫酸氢盐(hydrogen sulfite)或其组合的试剂,经过亚硫酸氢盐试剂处理的DNA,其未经过甲基化的胞嘧啶核苷酸将转化为尿嘧啶,而甲基化的胞嘧啶及其他碱基维持不变,因此可以区分例如CpG二核苷酸序列中的甲基化和非甲基化胞苷。
本说明书中,术语“甲基化测定”是指用于确定核酸序列内的一个或多个CpG二核苷酸序列的甲基化状态的任何测定。
本发明的对上述甲基化区域的检测,包括如下主要步骤:
(1)采用DNA提取试剂盒,提取待测生物样本的基因组DNA和/或游离DNA;
(2)对所述DNA进行亚硫酸氢盐转化;
(3)对所述经过亚硫酸氢盐转化的DNA进行多个甲基化区域的甲基化检测。
在一些实施方案中,通过本领域中的任何标准手段,包括使用可商购的试剂盒,来分离DNA(例如血浆游离DNA)。
在一些实施方案中,待检测的生物样品为活检或尸检样本。在一些情况下,该生物样品为细胞、组织样品。在一些情况下,该生物样品为体液样品,其包括血浆、唾液、血清中的任一种。在一些情况下,该生物样品为排泄物,其包括尿液、粪便、结肠流出物中的任一种。
如本文所用的术语“AUC”是“曲线下面积”的缩写。具体地,其指接收者操作特征(ROC)曲线下面积。ROC曲线是对于诊断测试的不同可能的块割点而言真阳性比率相对于假阳性比率的曲线图。其表明根据所选的切割点在灵敏性与特异性之间的折衷(灵敏性的任何增加将伴随特异性的下降)。ROC曲线下面积(AUC)是诊断测试的准确度的度量(面积越大越好;最佳为1;随机测试将具有面积为0.5的处于对角线上的ROC曲线;参见:J.P.Egan.(1975)Signal Detection Theory and ROC Analysis,Academic Press,NewYork)。
下面结合具体的实施例对本发明作进一步说明,显然,所描述的实施例仅为本发明的一部分,目的在于对本发明的技术方案进行描述,而不是对本发明的限制。
实施例1肿瘤基因DNA甲基化区域的筛选和确定
大部分用于肿瘤早期筛查的单个基因检测因为敏感度或特异度偏低,不能满足临床需要。
采用多基因联合检测可以有效解决敏感度低的问题,提高肿瘤早期筛查和诊断的准确度。同时,多基因联合检测方案符合卫生经济学,它使用更少量的试剂和检测材料。
我们对23例胃癌及165例非胃癌新鲜冰冻组织样本使用TruSeq Methyl CaptureEPIC Library Prep Kit建库试剂盒根据使用说明书进行DNA甲基化建库及测序,对获得的原始fastq数据进行质控过滤,对于通过NGS分析质控条件的reads使用bismark软件进行基因组比对。比对后有效数据大于50×的样本,进行目标区域CpG位点的贝塔值计算。然后将胃癌和非胃癌样本的目标捕获区域的CpG的贝塔值进行DSS差异分析。根据差异分析的结果,要求FDR<0.05且贝塔值差异大于0.15,获得候选差异CpG位点。再结合候选CpG位点的AUC、灵敏度(Sensitivity)、特异性(Specificity)及临近位置CpG共甲基化情况等,综合筛选到5个共甲基化区域,即5个甲基化标志物,如图1A所示。
使用395例胃癌及559例非胃癌的石蜡包埋组织样本的450K芯片甲基化信息,进行limma(moderated t-test)差异分析。根据差异分析的结果,要求FDR<0.05且贝塔值差异大于0.15,获得候选差异CpG位点。再结合候选CpG位点的AUC、灵敏度(Sensitivity)、特异性(Specificity)及临近位置CpG共甲基化情况等,综合筛选到6个共甲基化区域,即6个甲基化标志物,如图1B所示。
在2个数据库中,有5个甲基化标志物是相同的。因而结合2个数据库的结果,筛选出可以鉴别胃癌的高特异性的6个甲基化标志物,它们分别是:SLC9A3、CPXM1、HOXA7、NEU1、SEMA6D和APC。其中,新鲜冰冻组织样本及石蜡包埋组织样本的甲基化差异热图分别如图1A和1B所示。
实施例2胃癌的甲基化标志物的引物设计
1)针对实施例1中确定的甲基化标志物(即胃癌的标志物),分别设计了如表1所示的引物对(包括正向引物和反向引物)和探针组合:
表1胃癌检测的引物对和探针
2)对应的内参基因引物对和探针的序列如表2所示:
表2内参基因的引物对和探针
本实施例在表1-2中的“基因名-F”表示该基因检测片段的正向引物,“基因名-R”表示该基因检测片段的反向引物,“基因名-P”表示该基因检测片段的探针(括号内为相应修饰基团)。
实施例3单重荧光定量PCR检测标准品评估引物和探针的性能
使用商业化的完全甲基化(亚硫酸氢盐转化后的DNA序列,阳性对照)及非甲基化(亚硫酸氢盐转化后的DNA序列,阴性对照)标准品(购自QIAGEN公司)对实施例1中所述的6个甲基化标志物进行单一甲基化区域的甲基化检测。
具体流程如下:
1、标准曲线的配制
商业化完全甲基化的标准品(在本实施例中作为阳性对照)和非甲基化的标准品(在本实施例中作为阴性对照)使用无核酸酶水均配制成5ng/μL,稀释后的商业化完全甲基化的标准品使用稀释后非甲基化标准品进行再稀释,比例依次为1:0、1:9、1:19、1:39、1:99、1:199、0:1,对应的甲基化率分别为100%、10%、5%、2.5%、1%、0.5%和0%。
2、单重荧光定量PCR检测
采用6个目标基因的甲基化区域的引物对和探针,分别进行单重荧光定量PCR(引物和探针的序列具体参见表1和表2),扩增目标区域的目标序列,通过扩增循环阈值Ct评估检测结果。具体操作如下:
1)配制单个引物(即表1和表2中所述的正向引物或反向引物)浓度为10μM的PCR引物,同时配制相应的10μM的PCR探针;
2)单重荧光定量PCR反应液配置:根据表3配制单重荧光定量PCR反应液。
表3单重荧光定量PCR反应液配置方案
试剂 | 终浓度 | 体积(μL) |
DEPC水 | / | 16.15 |
10×PCR缓冲液 | 1× | 2.50 |
25mM MgCl2 | 2mM | 2.00 |
25mM dNTP混合物 | 0.2mM | 0.20 |
10μM正向引物 | 0.2μM | 0.50 |
10μM反向引物 | 0.2μM | 0.50 |
10μM探针 | 0.1μM | 0.25 |
5U/μl Taq酶 | 2Unit | 0.40 |
ROX(50×) | 1× | 0.50 |
PCR反应液体积[μl] | / | 23.00 |
3)加入DNA样本:将表3所示的23μL单重荧光定量PCR反应液加到PCR反应孔,向其中加入DNA亚硫酸氢盐转化后的DNA(DNA转化前上样量为10ng),PCR反应总体积为25μL。涡旋震荡和离心。每个甲基化区域及内参基因对应的每个标准品浓度检测2个复孔。
4)荧光定量PCR反应程序:95℃5分钟;95℃15秒,60℃40秒,15个循环;95℃15秒,62℃40秒(采集荧光),45个循环。
5)结果处理
记录下荧光定量PCR相应的荧光通道下的扩增循环阈值Ct,按照本发明具体实施方式部分所述的“扩增效率”的评估方法,计算检测结果的最佳线性范围、扩增效率和线性相关系数和Ct值,结果如下表4所示:
表4:单重荧光定量PCR检测结果
基因名 | 最佳线性范围 | 扩增效率 | 线性相关系数 | Ct值(0%甲基化) |
SLC9A3 | 1%~100% | 137.51% | 0.9975 | Undetermined |
CPXM1 | 1%~100% | 88.82% | 0.9957 | Undetermined |
HOXA7 | 0.5%~100% | 108.53% | 0.9801 | Undetermined |
NEU1 | 0.5%~100% | 103.97% | 0.9696 | Undetermined |
SEMA6D | 1%~100% | 68.31% | 0.9952 | Undetermined |
APC | 1%~100% | 93.49% | 0.9876 | 31.52 |
本实施例中表4中所述“Undetermined”表示在该扩增条件下未检测到相应的Ct值。表4中所述“最佳线性范围”是指在以完全非甲基化标准品为背景的情况下,对应百分比质量含量的全甲基化标准品在此范围内呈现良好的线性关系。表4中所述“线性相关系数”用于反应甲基化百分比和Ct值之间的相互关系,其越接近1,表示甲基化百分比和Ct值之间的相关程度就越强。
如上表4结果所示,大部分的引物探针均在较低的甲基化率范围内实现较好的线性扩增。
实施例4合并荧光通道方法检测标准品评估引物和探针的性能
使用商业化的完全甲基化(亚硫酸氢盐转化后的DNA序列,阳性对照)及非甲基化(亚硫酸氢盐转化后的DNA序列,阴性对照)标准品(购自QIAGEN公司)对实施例1中所述的6个甲基化标志物进行合并荧光通道的甲基化检测。
具体流程如下:
1、标准曲线的配制
具体操作同实施例3。
2、合并荧光通道PCR检测
采用6个目标基因的甲基化区域的引物对和探针,分别进行合并荧光通道的甲基化检测(具体的引物和探针序列参见表1和表2),扩增目标区域的目标序列,通过扩增循环阈值Ct评估检测结果。具体操作如下:
1)配制单个引物(即表1和表2中所述的正向引物或反向引物)浓度为10μM的PCR引物,同时配制相应的10μM的PCR探针;
2)合并荧光通道的PCR反应液配置:根据表5配制合并荧光通道的甲基化PCR反应液。相应的,如表1和表2所示,反应体系中检测FAM通道的荧光对应为SLC9A3基因和CPXM1基因同时检测;检测VIC通道的荧光对应为HOXA7基因和NEU1基因同时检测;检测NED通道的荧光对应为SEMA6D基因和APC基因同时检测;检测CY5通道的荧光对应为内参基因ACTB的检测。
表5合并荧光通道的甲基化PCR反应液配置方案
试剂 | 终浓度 | 体积(μL) |
DEPC水 | / | 补至23.00 |
10×PCR缓冲液 | 1× | 2.50 |
25mM MgCl2 | 2mM | 2.00 |
25mM dNTP混合物 | 0.2mM | 0.20 |
10μM每条正向引物 | 0.2μM | 0.50 |
10μM每条反向引物 | 0.2μM | 0.50 |
10μM每条探针 | 0.1μM | 0.25 |
5U/μl Taq酶 | 3Unit | 0.60 |
ROX(50×) | 1× | 0.50 |
PCR反应液体积[μl] | / | 23.00 |
3)加入DNA样本:具体操作同实施例3。
4)荧光定量PCR反应程序:具体操作同实施例3。
5)结果处理
记录下荧光定量PCR相应的荧光通道下的扩增循环阈值Ct,按照本发明具体实施方式部分所述的“扩增效率”的评估方法,计算检测结果的最佳线性范围、扩增效率和线性相关系数和Ct值,结果如下表6所示:
表6合并荧光通道PCR检测结果
基因名 | 最佳线性范围 | 扩增效率 | 线性相关系数 | Ct值(0%甲基化) |
SLC9A3&CPXM1 | 0.5%~100% | 106.80% | 0.9979 | Undetermined |
HOXA7&NEU1 | 0.5%~100% | 101.51% | 0.9918 | 29.00 |
SEMA6D&APC | 0.5%~100% | 87.79% | 0.9973 | 31.97 |
本实施例表6中所述的“Undetermined”表示在该扩增条件下未检测到相应的Ct值。表6中所述“最佳线性范围”是指在以完全非甲基化标准品为背景的情况下,对应百分比质量含量的全甲基化标准品在此范围内呈现良好的线性关系。表6中所述“线性相关系数”用于反映甲基化百分比和Ct值之间的相互关系,其越接近1,表示甲基化百分比和Ct值之间的相关程度就越强。
如上表结果所述,在合并荧光通道检测中,SLC9A3基因和CPXM1基因的最佳线性范围(即检测线性范围的最低甲基化率)从单通道的1%(具体参见表4的第2列中SLC9A3基因以及CPXM1基因对应的结果)减低至0.5%(具体参见表6的第2列中SLC9A3&CPXM1基因对应的结果),有效实现了检测灵敏度的提高。同时,SEMA6D基因和APC基因的最佳线性范围(即检测线性范围的最低甲基化率)也从单通道的1%(具体参见表4的第2列中SEMA6D基因以及APC基因对应的结果)减低至0.5%(具体参见表6的第2列中SEMA6D&APC基因对应的结果),有效实现了检测灵敏度的提高。然而,由于检测灵敏度的提高,HOXA7和NEU1基因及SEMA6D和APC基因合并后在本实施例0%甲基化标准品中有非特异性检出(具体参见表6最后1列,HOXA7&NEU1基因以及SEMA6D&APC基因的Ct值的检测结果)。
实施例5提高检测特异性的改良检测方法及引物设计
针对实施例3(具体参见表4中APC基因的Ct值为31.52)和实施例4中所述的0%甲基化标准品出现非特异性检出的问题(具体参见表6中HOXA7&NEU1基因的Ct值为29.00,表6中SEMA6D&APC基因的Ct值为31.97),在引物设计上引入对经亚硫酸盐转化后甲基化的序列的一个碱基的错配设计。由于该设计对于亚硫酸盐转化后的非甲基化序列会产生两个或两个以上的碱基错配,使其对非甲基化序列的特异性大大增高,而对于甲基化序列的扩增无显著影响,因此可以提高DNA甲基化检测的特异性。具体分别在NEU1、SEMA6D和APC的正向或反向引物的3’端倒数第2位或第3位碱基处引入一个错配碱基。重新设计的引物对(包括正向引物和反向引物)序列和探针序列如表7所示:
表7:重新设计的引物对序列和探针序列
/>
本实施例表7所示引物序列中加字符边框的碱基表示在此处引入相应的一个错配碱基。
本实施例在表7中的“基因名-F”表示该基因检测片段的正向引物,“基因名-R”表示该基因检测片段的反向引物,“基因名-P”表示该基因检测片段的探针(括号内为相应修饰基团)。
实施例6提高检测特异性的改良检测方法及引物设计的技术评估
使用商业化的完全甲基化(亚硫酸氢盐转化后的DNA序列,阳性对照)及非甲基化(亚硫酸氢盐转化后的DNA序列,阴性对照)标准品(购自QIAGEN公司)对上述的6个甲基化标志物进行单一甲基化区以及合并荧光通道的甲基化检测。
具体流程如下:
1、标准曲线的配制
具体操作同实施例3。
2、PCR检测
单一甲基化区域检测的具体操作同实施例3,合并荧光通道的甲基化检测的具体操作同实施例4,扩增目标区域的目标序列,通过扩增循环阈值Ct评估检测结果。具体操作如下:
1)配制单个引物(即表7中所述的正向引物或反向引物)浓度为10μM的PCR引物,同时配制相应的10μM的PCR探针;
2)单重荧光定量PCR反应液及合并荧光通道的PCR反应液的配置:单一甲基化区域的甲基化检测的PCR反应液的配置同实施例3中的表3,合并荧光通道的甲基化检测的PCR反应液的配置同实施例4中的表5。
3)加入DNA样本:具体操作同实施例3。
4)荧光定量PCR反应程序:具体操作同实施例3。
5)结果处理
记录下荧光定量PCR相应的荧光通道下的扩增循环阈值Ct,按照本发明具体实施方式部分所述的“扩增效率”的评估方法,计算检测结果的最佳线性范围、扩增效率和线性相关系数以及Ct值,结果如下表8所示:
表8:单重荧光定量PCR检测及合并荧光通道PCR检测的结果
基因名 | 最佳线性范围 | 扩增效率 | 线性相关系数 | Ct值(0%甲基化) |
NEU1 | 1%~100% | 87.26% | 0.9875 | Undetermined |
SEMA6D | 1%~100% | 101.81% | 0.9878 | Undetermined |
APC | 1%~100% | 93.49% | 0.9876 | Undetermined |
HOXA7&NEU1 | 0.5%~100% | 97.43% | 0.9991 | Undetermined |
SEMA6D&APC | 0.5%~100% | 100.64% | 0.9977 | Undetermined |
本实施例中的表8中所述“Undetermined”表示在该扩增条件下未检测到相应的Ct值。表8中所述“最佳线性范围”是指在以完全非甲基化标准品为背景的情况下,对应百分比质量含量的全甲基化标准品在此范围内呈现良好的线性关系。表8中所述“线性相关系数”用于反应甲基化百分比和Ct值之间的相互关系,其越接近1,表示甲基化百分比和Ct值之间的相关程度就越强。
上表8结果显示,利用如实施例5所述的改良方法设计的引物,在单重荧光定量PCR检测及多个基因合并荧光通道PCR检测中,其检测线性范围的最低甲基化率(即最佳线性范围)均无显著影响,在不影响检测灵敏度的同时,使0%甲基化的标准品无Ct值检出,从而增加了检测的特异性。同时,能够用于检测的DNA最低甲基化检出量为50pg或以下(10ngDNA投入量中可以检测的到低至0.5%甲基化率的样本,即可检测出样本中10ng×0.5%=50pg完全甲基化DNA)。
实施例7提高检测特异性的甲基化引物设计方法
用于甲基化PCR检测的引物设计原则,要求引物的3’端最后3个碱基应至少包含1个CpG位点以增强引物的特异性,结合碱基错配PCR扩增的原理(Li,B.,et al.(2004)."Genotyping with TaqMAMA."Genomics 83(2):311-320.),将引物最靠近3’端的一个CpG位点邻近的碱基根据下表作特异性改良设计。
例如,SEQ ID NO:10(NEU1-F)未经转化的序列为其中相应的非甲基化的胞嘧啶经亚硫酸氢盐转化后的序列为SEQ ID NO:25:(即SEQ ID NO:10中的3’端的第2个C转化为T),而甲基化的胞嘧啶经亚硫酸氢盐转化后的序列仍为SEQ ID NO:10:如下表9所示,对应所做的引物改良序列为(即SEQ ID NO:22)。
根据以上设计原则,非甲基化转化后序列、甲基化转化后序列和引物设计改良序列如表9所示:
表9:非甲基化转化后序列、甲基化转化后序列和引物设计改良序列
非甲基化转化后序列 | 甲基化转化后序列 | 引物设计改良序列 |
AT | AC | TC |
TT | TC | GC |
CT | CC | GC |
CT | GC | CC |
事实上,根据本发明,如上述方法设计的改良引物在实际的甲基化检测中可能存在性能上的差异。在实际应用中,将根据特异性甲基化区域的检测结果选择相应的合适的引物。在本发明的实施例中,列举了优选的引物序列。
在某些实施例中,包括但不限于上述优选的引物序列。
在实际应用中,优选的高特异性引物序列可用于其他多种不同的方法检测DNA甲基化区域的共甲基化,如:甲基化特异性PCR(MSP)、DNA甲基化芯片、靶向DNA甲基化测序、数字PCR定量及荧光定量PCR、甲基化敏感性限制性内切酶(MS-RE)-PCR/Southern法、直接测序法、甲基化敏感性单核苷酸引物延伸(Ms-SnuPE)、结合重亚硫酸盐的限制性内切酶法(COBRA)、甲基化敏感性单链构象分析(MS-SSCA)、甲基化敏感性变性梯度凝胶电泳(MSDGGE)、甲基化特异性变性高效液相色谱(MS-DHPLC)、甲基化特异性微阵列(MSO)、甲基化敏感性解链曲线分析(MS-MCA)甲基化敏感性斑点分析(MS-DBA)、甲基化特异性多连接依赖性探针扩增、重亚硫酸盐测序和/或焦磷酸测序。
实施例8单个通道多基因甲基化检测与多基因合并通道检测的临床诊断性能比较
对经内镜病理或临床诊断确认的58例胃癌及59例非胃癌的临床血浆样本,根据本发明实施例3和实施例4中的检测技术进行多个甲基化区域的甲基化进行检测。测试样本的临床信息统计如下表10所示:
表10:测试样本的临床统计信息
/>
1)外周血处理
对表10中所述临床血浆样本,使用STRECK常温采血管采集,于采集后3天内分离血浆。血浆分离的方法:1,600g,4℃,离心10分钟,小心吸取上层血浆转移至2mL离心管;血浆16,000g,4℃,二次离心10分钟,小心吸取上层血浆转移至新的2mL离心管;分离后的血浆马上提取或-80℃以下冻存一年以内提取。
2)血浆游离DNA提取
血浆游离DNA提取使用LIFE公司商业化试剂盒MagMAXTM Cell-Free DNAIsolation Kit按照说明书要求进行提取,提取的DNA经Qubit 4.0和Agilent 2100生物分析仪质检合格后使用。
3)DNA亚硫酸氢盐转化
DNA亚硫酸氢盐转化试剂盒购于ZYMO RESEARCH公司,按照试剂盒说明书进行。
4)单重荧光定量PCR检测及多基因合并通道PCR检测
采用本发明实施例5所述的引物对和探针,根据本发明实施例3和实施例4的方法分别进行单重荧光定量PCR检测及多基因合并通道PCR检测。
5)结果处理
记录下荧光定量PCR相应的荧光通道下的扩增循环阈值Ct,计算每个样本各通道的靶基因与内参基因的差值ΔCt,以临床样本的内镜病理或临床诊断结果作为标准,根据每个荧光通道(合并或单个SEQ ID)在胃癌组及非胃癌组中的ΔCt值分布,制作ROC曲线,并计算其AUC值及Youden指数下的检测灵敏度及特异性,对比使用单重荧光定量PCR检测单个甲基化区域的AUC、Youden指数cut-off下的灵敏度、特异性、两个甲基化区域合并判读(即表11中所述两基因单重检测合并判读)的AUC、灵敏度及特异性,及多基因合并通道PCR检测中两个甲基化区域(即表11中所述两个基因合并通道检测判读)的AUC、灵敏度及特异性的对比结果如下表11所示,其ROC曲线对比如图2所示:
表11:不同检测方法AUC、灵敏度及特异性的对比结果
上述结果表明,所有甲基化区域在两个基因合并通道的检测中,其诊断性能均优于单个基因的诊断性能,而在与两个基因单重检测合并模型判别对比上,其诊断性能类似,因此可以说明,多基因合并荧光通道的检测方法在不牺牲诊断性能的前提下,可以实现多个基因的并行检测,从而节省成本及样本的投入量、简化检测操作。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 广州市基准医疗有限责任公司
<120> 一种多基因合并荧光通道检测的方法
<160> 25
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttttgcgagg ggattatcgt t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaacgaaacc ctaaaccgca a 21
<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cctaaccaaa ctaccgccct aactatctcc cg 32
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aatcgacgat cctaaaactt aaaacg 26
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
tcggagagga ggagagggtc 20
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aaaatcaacc ccgctcgctc ctcc 24
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
cggagcgaga ttatttgtga gg 22
<210> 8
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
gaaactcgcc gcaacacg 18
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cacataaccg cctccgccaa tctc 24
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gttaatcgga agggtaagtt tcg 23
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
cgcttcccga actctaatta atct 24
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
cccgcccaac cgcacaacct ac 22
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
tttcgattgg aaatgtttta cg 22
<210> 14
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
aaacgtaaca catctcaaca ccgaa 25
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cgcctaacga aaaccctatc caaaacgctt 30
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
cgcactccgc aataaaacac a 21
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
agggtatatt ttcgaggggt acg 23
<210> 18
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
cccgcccaac cgcacaacct ac 22
<210> 19
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
gtgatggagg aggtttagta agtt 24
<210> 20
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
ccaataaaac ctactcctcc cttaa 25
<210> 21
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
accaccaccc aacacacaat aacaaacaca 30
<210> 22
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gttaatcgga agggtaagtt gcg 23
<210> 23
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
tttcgattgg aaatgttttg cg 22
<210> 24
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
agggtatatt ttcgaggggt tcg 23
<210> 25
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
gttaattgga agggtaagtt ttg 23
Claims (13)
1.一种多基因合并荧光通道检测的方法,所述方法包含以下步骤:
a)提取待测生物样本的基因组DNA和/或细胞游离DNA(cfDNA);
b)对步骤a)中所述基因组DNA和/或细胞游离DNA进行亚硫酸氢盐转化;
c)对步骤b)中经过亚硫酸氢盐转化的基因组DNA和/或细胞游离DNA进行多基因合并荧光通道的检测;
其中,所述步骤c)包含以下步骤:
i)确定检测目标,所述检测目标为待测生物样本中与肿瘤相关的DNA甲基化区域和/或突变位点,并将所述DNA甲基化区域和/或突变位点作为标志物,其中所述标志物的数量为1个以上;
ii)针对步骤i)中所述标志物设计扩增引物和探针;优选的,同时针对内参基因设计扩增引物和探针;
iii)利用步骤ii)中的扩增引物和探针对步骤a)中的基因组DNA和/或细胞游离DNA和/或步骤b)中经过亚硫酸氢盐转化处理的基因组DNA和/或细胞游离DNA进行荧光定量PCR,并且,所述荧光定量PCR中荧光定量通道的数量少于步骤i)中所述标志物的数量。
2.根据权利要求1所述的方法,其中,所述标志物为SLC9A3、CPXM1、HOXA7、NEU1、SEMA6D和APC中的任一种以上的基因,所述内参基因为ACTB基因。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中,所述步骤ii)中的探针在5’端标记有荧光报告基团,所述荧光报告基团选自由FAM、VIC、NED、CY5、TET、FITC、JOE、HEX、TAMRA、CY3、CY5.5、ROX和Texas Red组成的组中任一种;优选的,所述荧光报告基团为FAM、VIC、NED和CY5;
所述步骤ii)中的探针在3’端标记有荧光淬灭基团,所述荧光淬灭基团选自由BHQ1、BHQ2、Dabcyl和TAMRA组成的组中任一种;优选的,所述荧光淬灭基团为BHQ1和BHQ2。
4.根据权利要求3所述的方法,其中所述SLC9A3、CPXM1、HOXA7、NEU1、SEMA6D和APC中的任意两种基因在一个荧光定量通道中进行检测;
优选的,所述SLC9A3和CPXM1基因在一个荧光定量通道中进行检测,所述HOXA7、NEU1基因在一个荧光定量通道中进行检测,所述SEMA6D和APC基因在一个荧光定量通道中进行检测,并且所述ACTB基因在一个荧光定量通道中进行检测;
更优选的,所述SLC9A3和CPXM1基因在FAM荧光定量通道中进行检测,所述HOXA7、NEU1基因在VIC荧光定量通道中进行检测,所述SEMA6D和APC基因在NED荧光定量通道中进行检测,并且所述ACTB基因在CY5荧光定量通道中进行检测。
5.根据权利要求2所述的方法,其中,所述SLC9A3基因的扩增引物和探针的序列分别如SEQ ID NO:1-3所示;所述CPXM1基因的扩增引物和探针的序列分别如SEQ ID NO:4-6所示;所述HOXA7基因的扩增引物和探针的序列分别如SEQ ID NO:7-9所示;所述NEU1基因的扩增引物和探针的序列分别如SEQ ID NO:10-12所示;所述SEMA6D基因的扩增引物和探针的序列分别如SEQ ID NO:13-15所示;所述APC基因的扩增引物和探针的序列分别如SEQ ID NO:16-18所示;所述ACTB基因的扩增引物和探针的序列分别如SEQ ID NO:19-21所示。
6.根据权利要求1或2所述的方法,其中,对步骤ii)中所述的扩增引物进行变异设计,使其在合并荧光通道检测时,能够保持单通道检测中的检测特异性;
优选的,对所述扩增引物进行变异设计的方法为:根据表9,将扩增引物最靠近3’端的一个CpG位点邻近的碱基进行变异设计。
7.根据权利要求2或6所述的方法,其中,进行变异设计后的扩增引物包括:NEU1基因的扩增引物SEQ ID NO:22,SEMA6D基因的扩增引物SEQ ID NO:23和APC基因的扩增引物SEQID NO:24。
8.根据权利要求2、6或7任一项所述的方法,其中,所述SLC9A3基因的扩增引物和探针的序列分别如SEQ ID NO:1-3所示;所述CPXM1基因的扩增引物和探针的序列分别如SEQ IDNO:4-6所示;所述HOXA7基因的扩增引物和探针的序列分别如SEQ ID NO:7-9所示;所述NEU1基因的扩增引物和探针的序列分别如SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示;所述SEMA6D基因的扩增引物和探针的序列分别如SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:14和SEQID NO:15所示;所述APC基因的扩增引物和探针的序列分别如SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:18所示;所述ACTB基因的扩增引物和探针的序列分别如SEQ ID NO:19-21所示。
9.根据权利要求1~8任一项所述的方法,其中,所述方法能够对微量或痕量的基因组DNA和/或细胞游离DNA中的多个甲基化标志物和/或点突变标志物进行同步检测。
10.根据权利要求9所述的方法,其中所述微量或痕量的基因组DNA和/或细胞游离DNA来源于单细胞DNA或片段化DNA;优选的,所述片段化DNA是血浆中的游离DNA。
11.一种用于肿瘤诊断的试剂盒,其中,所述试剂盒包含用于检测待测生物样本中的甲基化标志物和/或点突变标志物的甲基化水平和/或突变水平的试剂;优选的,所述肿瘤为胃癌,所述甲基化标志物和/或点突变标志物为选自由SLC9A3、CPXM1、HOXA7、NEU1、SEMA6D和APC基因组成的组中的任一种或其任意组合。
12.根据权利要求11所述的试剂盒,其中所述试剂包含如权利要求5或权利要求6-8任一项中所述的扩增引物和探针。
13.根据权利要求11或12所述的试剂盒,其中所述待测生物样本选自由细胞、组织样品、体液样品和排泄物组成的组中的任一种,或上述生物样本的任意组合;优选的,所述体液样品选自由血浆、唾液和血清组成的组中的任一种或其任意组合,所述排泄物选自由尿液、粪便和结肠流出物组成的组中的任一种或其任意组合;更优选的,所述待测生物样本选自血浆。
Priority Applications (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202210760371.4A CN117343992A (zh) | 2022-06-29 | 2022-06-29 | 一种多基因合并荧光通道检测的方法 |
PCT/CN2023/103215 WO2024002166A1 (zh) | 2022-06-29 | 2023-06-28 | 一种多基因合并荧光通道检测的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202210760371.4A CN117343992A (zh) | 2022-06-29 | 2022-06-29 | 一种多基因合并荧光通道检测的方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN117343992A true CN117343992A (zh) | 2024-01-05 |
Family
ID=89361950
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202210760371.4A Pending CN117343992A (zh) | 2022-06-29 | 2022-06-29 | 一种多基因合并荧光通道检测的方法 |
Country Status (2)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN117343992A (zh) |
WO (1) | WO2024002166A1 (zh) |
Family Cites Families (9)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2012055409A1 (en) * | 2010-10-27 | 2012-05-03 | Quantibact A/S | Capture of methylated rna and/or dna sequences by specific probes |
US20160083792A1 (en) * | 2013-01-25 | 2016-03-24 | Murdoch Childrens Research Institute | An assay for quantitating the extent of methylation of a target site |
CN106399577B (zh) * | 2016-12-15 | 2018-06-15 | 湖南圣湘生物科技有限公司 | 一种用于单通道双靶点核酸检测的实时荧光pcr检测方法 |
CN110079621B (zh) * | 2019-04-29 | 2022-12-20 | 圣湘生物科技股份有限公司 | 用于分枝杆菌菌种鉴定的寡核苷酸组合、方法及试剂盒 |
CN110872631B (zh) * | 2019-12-26 | 2021-08-10 | 广州市基准医疗有限责任公司 | Dna甲基化生物标志物组合、检测方法和试剂盒 |
CN112852935B (zh) * | 2020-01-30 | 2022-03-04 | 上海快灵生物科技有限公司 | 基于双标记寡核苷酸探针熔解曲线的多重检测靶核苷酸序列的方法及其试剂盒 |
CN112280839A (zh) * | 2020-10-16 | 2021-01-29 | 李凯 | 检测靶点数多于荧光通道数的实时pcr技术及其应用 |
CN114277135B (zh) * | 2021-10-25 | 2022-09-20 | 广州市基准医疗有限责任公司 | 胃癌淋巴结转移相关的甲基化生物标记物及其组合和检测试剂盒 |
CN114480661A (zh) * | 2022-04-18 | 2022-05-13 | 北京起源聚禾生物科技有限公司 | 子宫内膜良恶性病变联合标志物、检测引物探针组及试剂盒 |
-
2022
- 2022-06-29 CN CN202210760371.4A patent/CN117343992A/zh active Pending
-
2023
- 2023-06-28 WO PCT/CN2023/103215 patent/WO2024002166A1/zh unknown
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2024002166A1 (zh) | 2024-01-04 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
WO2021128519A1 (zh) | Dna甲基化生物标志物组合、检测方法和试剂盒 | |
US11767565B2 (en) | Use of detection reagent for detecting methylation of genes associated with colorectal cancer, and kit | |
CN114277135B (zh) | 胃癌淋巴结转移相关的甲基化生物标记物及其组合和检测试剂盒 | |
WO2009051842A2 (en) | Detection of cancer by measuring genomic copy number and strand length in cell-free dna | |
CN115896281B (zh) | 甲基化生物标记物、试剂盒及用途 | |
US20110245087A1 (en) | Method for optimizing and validating an assay for determining the presence or absence of a medical condition | |
KR102472257B1 (ko) | LINC01798 유전자의 CpG 메틸화 변화를 이용한 대장암, 직장암 또는 대장 선종 진단용 조성물 및 이의 용도 | |
CN111826446A (zh) | 用于膀胱癌早期筛查与辅助诊断的引物、探针和试剂盒 | |
CN116144782A (zh) | 一种用于肺癌检测的组合标志物及其应用 | |
WO2005021743A1 (ja) | 核酸増幅用プライマー及びこれを用いた大腸癌の検査方法 | |
CN117343992A (zh) | 一种多基因合并荧光通道检测的方法 | |
JP2023516525A (ja) | Dnaメチル化バイオマーカーの組み合わせ、検出方法および試薬キット | |
CN110699437A (zh) | 人sdc2基因甲基化检测试剂盒 | |
CN117344010B (zh) | 用于诊断胃癌的dna甲基化生物标记物、试剂盒及用途 | |
CN115786502B (zh) | 检测目标区域的甲基化水平的试剂在制备膀胱癌的诊断产品中的应用 | |
CN117701720B (zh) | 宫颈癌clip3基因甲基化的检测试剂及试剂盒 | |
CN116356029B (zh) | Txnrd1基因甲基化水平检测在子宫内膜癌诊断和/或筛查中的应用 | |
CN115838798A (zh) | 检测甲基化水平的试剂在制备结直肠癌诊断产品中的应用 | |
CN113755584A (zh) | Dna甲基化生物标志物组合及其应用 | |
CN117778582A (zh) | 用于检测胃癌的核酸组合、试剂盒及应用 | |
CN115838799A (zh) | 检测基因甲基化的试剂在制备诊断结直肠癌的产品中的应用 | |
CN117248021A (zh) | 一种用于尿路上皮癌或癌前病变检测的核酸组合、试剂盒及应用 | |
KR20210125442A (ko) | GLRB 유전자의 CpG 메틸화 변화를 이용한 대장암, 직장암 또는 대장 선종 진단용 조성물 및 이의 용도 | |
CN117431315A (zh) | 大肠癌淋巴结转移检测甲基化生物标记物及检测试剂盒 | |
CN117344011A (zh) | 用于诊断胃癌的甲基化生物标记物、试剂盒及用途 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |