CN110592224A - 人结直肠癌相关基因特定区域甲基化的引物组及试剂以及试剂盒及其应用 - Google Patents
人结直肠癌相关基因特定区域甲基化的引物组及试剂以及试剂盒及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种利用特异性PCR从粪便、血液或组织中检测人结直肠癌相关基因特定区域甲基化的引物组、试剂、试剂盒及其应用，所述引物组包括针对本研究发现的基因标志物PRDM12、FOXE1、B3GAT2基因特定区域甲基化区域的特异性扩增引物探针序列，所述引物探针组还包含Vimentin、SFRP2‑1、SFRP2‑2基因特定区域甲基化区域的特异性扩增引物探针序列和内参基因ACTB的特异性扩增引物探针组，检测效率高，针对性强。
Description
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种利用特异性PCR从粪便、血液或组织中检测人结直肠癌相关基因特定区域甲基化的引物组、试剂、试剂盒及其应用，适用于检测人类基因组中是否存在结直肠癌及癌前腺瘤相关基因特定区域甲基化情况。
背景技术：
结直肠癌(Colorectal cancer,结直肠癌)又称结直肠癌及进展期腺瘤，是常见的消化系统恶性肿瘤，目前研究结果认为结直肠癌的发生既与遗传因素有关，有明显的家族遗传倾向，又与各种环境因素的作用有关。结直肠粘膜上皮细胞在多种因素的共同作用下，产生遗传和表观遗传的变化，获得恶性增殖、侵袭、浸润和转移的能力，在局部形成肿块，在淋巴结和其他组织器官中形成转移灶。近年来，随着我国人民生活水平提高，饮食结构和习惯改变，预期寿命延长，人口老龄化趋势等的影响，我国结直肠癌的发病率和死亡率呈直线上升的趋势，而且发病年龄提前的趋势。根据发表在《CA:A Cancer Journal forClinicians》杂志上《2015年中国癌症统计数据》显示：结直肠癌在男性肿瘤发病率中排第5位，在女性肿瘤发病率中排第4位；结直肠癌在男性和女性肿瘤死亡率中都排在第5位。尽管目前的手术方式和辅助治疗手段不断改进，结直肠癌患者的术后生存情况有很大改善，但是患者的五年总体生存率依旧不够理想，主要因为结直肠癌患者的生存率与肿瘤分期密切相关，早期结直肠癌患者术后5年生存率超过90％，但大多数患者出现症状或发现疾病时已发展到肿瘤中、晚期。由于93％的结直肠癌源于腺瘤，早期多无特征性症状，而从腺瘤发展到癌症需要3～17年，这就为早期筛查提供了时间基础。因此，对结直肠癌高危人群的筛查，对结直肠癌患者的早发现、早诊断，从而实现结直肠癌患者早治疗，是提高患者总体生存率的重要方面。
目前结直肠癌及进展期腺瘤筛查方法主要分为粪便检测和结肠结构性检测两大类。粪便检测包括粪便潜血检测(fecal occult blood test，FOBT)及粪便DNA检测(stoolDNA testing，sDNA)；结肠结构性检测包括乙状结肠镜检查(flexible sigmoidoscopy，FSIG)、结肠镜检查(colonoscopy，CS)、结肠气钡双重造影(double contrast bariumenema，DCBE)及CT结肠成像(CT colonoscopy，CTC)。粪便潜血检测FOBT是一种简单、快速的结直肠癌及进展期腺瘤筛查方法，用于检测粪便中的微量血红蛋白。FOBT检测简便、廉价、无创，可用于大规模筛查研究，但其影响因素较多，需在肿瘤形成后破溃出血的情况下才能检测到阳性结果，而息肉或癌组织的出血常呈间歇性，不可能被任意粪便标本所包含，因此，其特异性不高，容易出现漏诊。乙状结肠镜检查(FSIG)是运用内镜技术直接检查远端结肠的方法，操作较简单，肠道准备要求相对较低，无需术中镇静，可对病变进行活检和治疗，是一种相对廉价、简便又安全的筛查方法；然而FSIG的检查部位仅限于远端大肠(以脾曲为界)，如果FSIG发现远端大肠肿瘤后才进行结肠镜检查，将会造成72.0％的近端大肠肿瘤漏诊。结肠镜检查(CS)是目前结直肠癌及进展期腺瘤诊断与治疗的金标准，可以对整个结肠进行完整的观察，并能进行组织活检以及切除发现的息肉。尽管CS具有疗效好、准确性高等优点，但也有一定的局限性：(1)CS是一种侵入性的检查方法，发生并发症的风险更高，可能会引起结肠穿孔(0.3％)甚至死亡(1/5000)；(2)耗时长，在检查前需要充分的肠道准备和镇静处理；(3)价格较贵，如果需要组织活检并切除发现的息肉则花费更多；(4)结肠镜对结直肠癌及进展期腺瘤的漏诊率为5％。CT结肠成像(CTC)属于非侵入性检查方法，能以1-2mm的厚度进行断层扫描，进而在二维和三维图像上检查肠道病变。CTC具有快速、准确及并发症低等优点，对较大息肉及结直肠癌及进展期腺瘤的筛查效能接近于CS。但作为一种常规的筛查方法，CTC存在明显的不足：为了获得令人满意的影像，CTC检查过程中仍需释放2-4rads X射线到患者腹部，增加患癌的风险；通常会向肠腔内注入空气或二氧化碳以扩张肠道，患者检查时会有一定的不适；此外，高额的检查费用，不管对个人还是社会都会带来更重的经济负担。
粪便脱落细胞及基因检测(sDNA)是目前结直肠癌及进展期腺瘤筛查的最前沿技术，是一种非侵入性的筛查方法，与正常大肠黏膜相比，结直肠癌及进展期腺瘤细胞更新代谢速度明显增快，脱落细胞随之增加，通过对粪便脱落细胞DNA定量分析，可有效筛查出部分结直肠癌及进展期腺瘤。该法总体包括两类的检测：一类是粪便脱落细胞学的检测：就是将粪便当中脱落的肠道上皮细胞进行常规的病理学检查以期找出其中的肿瘤细胞，从而达到明确肠道肿瘤的诊断。第二类是粪便脱落细胞DNA的检测：因为有研究表明，患者粪便中脱落的肿瘤细胞中的突变基因和肿瘤组织本身的突变基因有很高的一致性。如果能从粪便中脱落的肿瘤细胞中检测出该类基因，那么肠道肿瘤的诊断也可明确，而且该法还具有有很高的特异性，阳性结果基本能确诊病变的存在；不需要改变筛查人群的饮食习惯；不需要限制药物的使用等。
PRDM12基因(PRDI-BF1 and RIZ homology domain-containing protein 12)位于人第9号染色体9q34.12中(chr9:130,664,594-130,682,997,hg38)，属于一个含有PR和SET蛋白结构域的转录调控因子家族(PR/SET domain family)。PRDM12编码蛋白含有N端的PRDI-BF1和RIZ同源结构域(PR)、1个SET结构域、C端的3个C2H2锌指DNA结合域。国内外研究表明，PRDM12是重要的转录调节因子，控制神经分化和形成，与实体肿瘤和血液恶性肿瘤发生相关。目前，国内外还未见PRDM12基因特定区域甲基化程度与肿瘤发生之间关系的研究报道，也未见任何关于定量检测PRDM12甲基化程度的检测试剂盒相关研究报道。
FOXE1基因(Forkhead Box E1)位于人第9号染色体9q22.33中(chr9:97,853,254-97,856,715，hg38)，是叉头转录因子家族的成员(Forkhead family)，含有该家族基因共有的叉头结构域(Forkhead domain)，此结构域由100多个氨基酸构成，可以识别并结合基因组DNA特定序列。既往研究表明，FOXE1是重要转录因子，是甲状腺特异性表达的叉头转录因子，对甲状腺形态发生、分化至关重要，还参与甲状腺激素诱导的转录调控。FOXE1与甲状腺癌、胰腺癌、皮肤鳞状细胞癌的发生直接相关，FOXE1基因高甲基化在皮肤鳞状细胞癌、乳腺癌中也有报道。尽管FOXE1在结直肠癌中的作用尚不清楚，但最新的研究发现，FOXE1基因异常高甲基化造成基因低表达，与结直肠癌转移和患者预后相关，有作为结直肠癌检测的生物标志物(biomarker)的潜质。尽管上述研究中有检测FOXE1基因特定区域甲基化的报道，但是目前国内外未见有定量检测FOXE1基因特定区域甲基化程度的检测试剂盒的报道。
B3GAT2基因(Beta-1,3-Glucuronyltransferase 2)位于人第6号染色体6q13中(chr6:70,856,679-70,957,189，hg38)，属于葡糖醛酸基转移酶家族成员，编码一个跨膜蛋白，功能主要是催化Beta-1,3连接的葡萄糖醛酸转移到多种糖蛋白或糖脂含有的Gal-Beta-1-4GLcNAc或Gal-Beta-1-3GLcNAc残基末端的半乳糖基上。已有研究发现，B3GAT2参与HNK-1糖链表位的合成，与神经系统的细胞识别、黏附、迁移有关,对神经系统生长发育、神经元再生、突触可塑性均有调节作用。目前国内外未见B3GAT2基因与肿瘤发生相关的研究报道，仅有一例研究发现B3GAT2基因特定区域甲基化与巴雷特氏食管(Barrett'sEsophagus)发生有关，有作为此疾病诊断生物学标志物的潜质，而巴雷特氏食管虽然有发展为食道癌的可能，但是癌变几率很低。目前，国内外未见有定量检测B3GAT2基因特定区域甲基化程度的检测试剂盒的报道。
Vimentin基因位于10号染色体10P13(chr10:17,229,548-17,229,607),属于第Ⅲ型中间丝纤维蛋白基因。是中间丝纤维蛋白家族的一员，在很多方面表现出复杂的基因表达模式。主要表达于胚胎组织和由间叶组织来源的成体细胞。越来越多的研究已经表明，Vimentin的表达并非是间充质起源细胞及向间叶分化的肿瘤细胞的特异性生物标志。已经发现角蛋白和Vimentin在乳腺癌、肝细胞肝癌、前列腺癌、子宫内膜癌、胃癌、食管癌、结肠癌、肺癌等上皮源性恶性肿瘤中的共同表达，而且与癌细胞的侵袭性强和易转移密切相关。另有研究证实，与肿瘤、癌前病变(如腺瘤)产生相关的Vimentin的表达下调可能与其启动子的甲基化密切相关。这提示DNA甲基化可以从基因转录水平下调Vimentin的表达，其对于肿瘤细胞迁移具有促进作用。Chen等研究显示未发生转移的早期结直肠癌及进展期腺瘤组织和晚期结直肠癌及进展期腺瘤的Vimentin基因的甲基化率是相等的，还有研究表明Vimentin基因特定区域甲基化与肿瘤大小和Duke's分期无关，这些都说明Vimentin基因特定区域甲基化检测对结直肠癌及进展期腺瘤早期诊断的重要性。
SFRP2基因位于染色体4q31.3中(chr4:153,789,388-153,789,447),其编码的SFRP2蛋白质含有一特征性半胱氨酸富含区域，许多研究表明，SFRP2基因的超甲基化会引起该基因在多种肿瘤中表达沉默。SFRP2基因包含二个内含子和三个外显子，在SFRP2基因的第一个外显子周围有着高密度的CpG岛，这个CpG岛与肿瘤细胞DNA超甲基化(DNAmethylation)密切相关。近年来，许多研究发现SFRP2基因超甲基化参与了结直肠癌的发生过程。大量研究证明SFRP2甲基化的程度是诊断结直肠癌最灵敏的标记，因此，从粪便脱落细胞中检测SFRP2基因特定区域的甲基化情况，可作为筛查结直肠癌的依据之一。
发明内容：
针对现有技术中存在的缺陷，本发明的第一个目的是提供一种人结直肠癌相关基因特定区域甲基化的引物组，所述的引物组包括PRDM12、FOXE1、B3GAT2、Vimentin、SFRP2-1、SFRP2-2六个特定基因甲基化区域的任意一种基因或任意几种基因组合的甲基化引物组。
进一步，所述PRDM12基因的检测引物组，其特异性引物探针组序列为：
正向引物F：5’-GTTAGATTAGAAGTATAAAATGTG-3’；以下称：引物1；
反向引物R：5’-ATCCCATTCCTCTCCTCC-3’；以下称：引物2；
检测探针P：5’-AGCGCGGTGGAGATTTG-3’；以下称：探针1；
进一步，所述FOXE1基因的检测引物组，其特异性引物探针组序列为：
正向引物F：5’-CGAGTttAAGtttTTGGtAGAGG-3’；以下称：引物3；
反向引物R：5’-CCGATCGACTaAaaCCCGa-3’；以下称：引物4；
检测探针P：5’-tCGAGTTCGGGCGtTGAGG-3’；以下称：探针2；
进一步，所述B3GAT2基因的检测引物组，其特异性引物探针组序列为：
正向引物F：5’-TtCGtCGGGTtTGGCG-3’；以下称：引物5；
反向引物R：5’-CAaaAaaTCGTaCAaCCCCG-3’；以下称：引物6；
检测探针P：5’-tCGCGAGtAAGtTCGGGAG-3’；以下称：探针3；
进一步，所述Vimentin基因的检测引物组，其特异性引物探针组序列为：
正向引物F：5’-GtCGtAGttTtTACGttTCGT-3’；以下称：引物7；
反向引物R：5’-aaCGCACGaCAaAaaAaCG-3’；以下称：引物8；
检测探针P：5’-ttCGGGCGGCGTGTATG-3’；以下称：探针4；
进一步，所述SFRP2-1基因的检测引物组，其特异性引物探针组序列为：
正向引物F：5’-CGGAtTGGGGtAAAAtAAGttC-3’；以下称：引物9；
反向引物R：5’-CTaaCGaaAACGCGCCTA-3’；以下称：引物10；
检测探针P：5’-TAGGCGCGTTttCGttAGTAttTGG-3’；以下称：探针5；
进一步，所述SFRP2-2基因的检测引物组，其特异性引物探针组序列为：
正向引物F：5’-AATGtAGtCGGCGCG-3’；以下称：引物11；
反向引物R：5’-CCTTaTTaaaAaTTCAAaaAaCCCG-3’；以下称：引物12；
检测探针P：5’-AGttAtTTtCGGGCGTGCGGt-3’；以下称：探针6；
进一步，还包括内参ACTB基因的引物组，其检测引物探针组序列为：
正向引物：5’-GTGATGGAGGAGGTTTAGTAAG-3’；以下称：引物13；
反向引物：5’-CAATAAAACCTACTCCTCCCTT-3’；以下称：引物14；
检测探针P：5’-TGTGTTTGTTATTGTGTGTTGGGTGGT-3’；以下称：探针7。
进一步，所述的检测探针5’端的荧光报告基团包括：ALEX-350、FAM、VIC、TET、CALFluor Gold 540、JOE、HEX、CAL Flour Orange 560、TAMRA、Cal Fluor Red 590、ROX、CALFluor 20Red 610、TEXAS RED、CAL Flour Red 635、Quasar 670、Cy3、Cy5、Cy5.5或Quasar705；3’端的淬灭基团包括TAMRA、BHQ1、BHQ2、MGB。
本发明的另一个目的是提供人结直肠癌相关基因特定区域甲基化检测试剂，所述的试剂包括6个PCR体系，分别为CRC PCR Mix-A/B/C/D/E/F；每个体系中包括如上述相应的基因特定区域甲基化情况的特异性引物探针组，内参基因特异性引物探针组，所述的试剂体系A包含PRDM12正向引物F(引物1)、PRDM12反向引物R(引物2)、PRDM12检测探针P(探针1)；所述的试剂体系B包含FOXE1正向引物F(引物3)、FOXE1反向引物R(引物4)、FOXE1检测探针P(探针2)；所述的试剂体系C包含B3GAT2正向引物F(引物5)、B3GAT2反向引物R(引物6)、B3GAT2检测探针P(探针3)；所述的试剂体系D包含Vimentin正向引物F(引物7)、Vimentin反向引物R(引物8)、Vimentin检测探针P(探针4)；所述的试剂体系E包含SFRP2-1正向引物F(引物9)、SFRP2-1反向引物R(引物10)、SFRP2-1检测探针P(探针5)；所述的试剂体系F包含SFRP2-2正向引物F(引物11)、SFRP2-2反向引物R(引物12)、SFRP2-1检测探针P(探针6)。
进一步，所述6个试剂体系CRC PCR Mix(A/B/C/D/E/F)都还包括通用成分有PCRbuffer、dNTPs、MgCl2。
进一步，所述内参基因为人类管家基因ACTB基因，所述内参基因的引物及探针，用于监控每一个样本的质量及其在每一个反应体系中的扩增情况，从而避免假阴性或者部分抑制结果的产生。
进一步，所述的六个PCR反应体系CRC PCR Mix-A/B/C/D/E/F，每个体系终体积都在20～40μl之间，所述的反应体系A/B/C/D/E/F中引物终浓度为：正向引物F均在0.3～0.8μM之间，反向引物R均在0.3～0.8μM之间，探针P浓度均在0.1～0.3μM之间；所述6个反应体系中每个体系的通用成分终浓度为：dNTPs中的dATP、dTTP、dCTP、dGTP都为0.1～0.3mM，MgCl2溶液为1～2mM。
本发明的再一个目的是提供人结直肠癌相关基因特定区域甲基化检测试剂盒，所述的试剂盒包括上述的6个PCR体系中的任意一个或者任意几个的组合，0.5～2U Taq HS热启动酶，还包括阳性对照、阴性对照和空白对照；所述阳性对照为PRDM12、FOXE1、B3GAT2、Vimentin、SFRP2-1、SFRP2-2的甲基化质粒DNA片段和内参ACTB基因的混合物，或者为人全基因组DNA甲基化阳性对照；所述阴性对照为PRDM12、FOXE1、B3GAT2、Vimentin、SFRP2-1、SFRP2-2的非甲基化质粒DNA片段和内参ACTB基因的混合物，或者为人全基因组DNA无甲基化阴性对照；所述空白对照为pH＝8.5±0.1的TE缓冲液或无核酸酶水。
本发明的又一个目的是提供人结直肠癌相关基因特定区域甲基化检测试剂盒的应用，从人的粪便、血液或组织中直接提取DNA，DNA经过亚硫酸氢盐处理转化，以转化后的DNA为模板，通过PCR方法扩增，并通过检测探针上信号累积从而实现人结直肠癌相关PRDM12、FOXE1、B3GAT2、Vimentin、SFRP2-1、SFRP2-2基因特定区域甲基化的实时检测；同时ACTB基因作为内参基因；包括如下PCR具体实验步骤：
步骤一：收集一定数量的结直肠癌患者及进展期腺瘤患者的粪便、血液或组织样本；
步骤二：从待检测人的粪便、血液或组织样本中提取人基因组DNA；
步骤三：提取的人基因组DNA经亚硫酸氢盐处理，转化后，作为PCR反应的模板；
步骤四：从试剂盒中取出29.7μl×(n+1)，PCR Mix和0.3μl×(n+1)Taq HS热启动酶混合液，混匀20s，瞬时离心10s；n＝检测样本数量。
步骤五：按每管30μl分装至PCR管中，再加入待检测的转化后DNA模板10μl，总体积40μl；
步骤六：进行扩增反应。反应程序为：
步骤七：PCR结果判定：在样本的检测过程中，基线的确定为：取3～15个循环的荧光信号；阈值设定：使阀值线超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，且Ct值为Undet；根据所报告的Ct值，即每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数判读样本的阳性或阴性结果。
采用上述技术方案，本发明的有益效果：
1.本发明鉴定了新的基因特定区域甲基化作为人结直肠癌的肿瘤标志物，可用于患者早期筛查和辅助检测。
2、本发明试剂盒选取靶基因适宜的区域并设计了高特异性的引物和探针。3、
3、本发明试剂盒可直接采用粪便提取DNA，因其无创，减少病人的痛苦。
4、本发明首次公开了可用于检测与结直肠癌及进展期腺瘤相关的PRDM12、FOXE1、B3GAT2、Vimentin、SFRP2-1、SFRP2-2基因甲基化的试剂盒及其应用，所述的检测试剂盒包含PRDM12、FOXE1、B3GAT2、Vimentin、SFRP2-1、SFRP2-2基因的甲基化特异性扩增正向引物、反向引物及其荧光探针，PRDM12、FOXE1、B3GAT2、Vimentin、SFRP2-1、SFRP2-2基因甲基化水平导致结直肠癌及进展期腺瘤患者PRDM12、FOXE1、B3GAT2、Vimentin、SFRP2-1、SFRP2-2基因低表达，从而导致结直肠癌及进展期腺瘤细胞具有更强的侵袭能力，因此，PRDM12、FOXE1、B3GAT2、Vimentin、SFRP2-1、SFRP2-2基因甲基化情况能用作结直肠癌及进展期腺瘤恶性程度和预后评价的分子生物学标记。以检测结直肠癌及进展期腺瘤PRDM12、FOXE1、B3GAT2、Vimentin、SFRP2-1、SFRP2-2基因甲基化水平为基础的诊断试剂盒可以方便快捷地在分子水平上实现对结直肠癌及进展期腺瘤的检测，对结直肠癌及进展期腺瘤恶性程度和预后判断，检测效率高，针对性强，具有准确可靠、灵活快速和经济节约的优点，有利于结直肠癌及进展期腺瘤的早期发现和及时治疗。
5、与传统的结肠镜检筛查结直肠癌及进展期腺瘤比较，及常规的粪便隐血试验比较，本试剂盒采用甲基化特异性PCR法通过检测粪便脱落细胞DNA筛查结直肠癌及进展期腺瘤具有以下优势：
1)完全无创，仅需2～5克粪便，无症状人群接受度高；
2)准确性高，在临床前研究中可以检测出绝对多数的结直肠癌及进展期腺瘤和大部分的癌前腺瘤；能检测到96.3％的早期结直肠癌，85.8％的癌前腺瘤(≥1厘米)，特异性为100％；
3)可以同时发现左右两侧结肠的肿瘤，减少检测盲区和漏诊；
4)不仅可以发现结直肠癌及进展期腺瘤，也可以发现癌前腺瘤，为通过摘除癌前腺瘤而预防结直肠癌及进展期腺瘤提供了可能性；
5)操作方便，在获得检测试剂盒后，用户可以居家完成样本的收集工作，之后快递寄出由专业人员进行检测。
6、本方法采用实时荧光PCR法(Real-time PCR)，这种技术是在普通聚合酶链式反应技术上发展起来的，在普通聚合酶链式反应扩增过程中利用荧光染料或者电泳检测进行定量，探针法的应用使得该技术具有更高的精确性、高敏感性和较高通量，且无需在PCR后电泳、杂交等操作，减少了污染和操作误差。
附图说明：
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1为PRDM12甲基化检测结果图；
图2为FOXE1甲基化检测结果图；
图3为B3GAT2甲基化检测结果图；
图4为Vimentin甲基化检测结果图；
图5为SFRP2-1甲基化检测结果图；
图6为SFRP2-2甲基化检测结果图。
具体实施方式：
为了使本发明所要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚、明白，以下结合附图和实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
如图1－图6所示，相关基因甲基化检测结果图(FAM通道)。
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明：
一、研究对象的样本收集：
本研究中，选取上海长海医院手术切除的31例结直肠癌患者标本为研究对象。所有病例诊断依据患者的临床资料、影像学和结肠镜检查等，都得到术后病理诊断确定。手术切除的结直肠癌组织和癌旁组织(距离癌组织≥5cm的正常结直肠粘膜组织)经液氮速冻后，保存于-80度冰箱中。取适量癌组织和癌旁组织提取基因组DNA。
本研究中，收集来自上海长海医院31例结直肠癌患者的粪便和对应病人的粪便作为研究对象。所用病例诊断依据患者的临床资料、影像学、结肠镜检查和术后病理等确定。收集的粪便样本，保存于含有粪便DNA保存液的收集管，置于-20度冰箱中。取适量粪便样本提取基因组DNA。
二、基因组DNA的提取
组织样本采用QIAamp DNA Mini Kit组织全基因组DNA提取试剂盒(Qiagen公司，德国)提取癌组织和癌旁组织的基因组DNA。粪便样本采用QIAamp DNA Stool Mini Kit粪便基因组DNA提取试剂盒。通过NanoDrop2000微量分光光度计(Thermo FisherScientific，美国)检测基因组DNA的浓度和质量，供后续基因特定区域甲基化PCR检测。具体提取步骤根据提取试剂盒操作说明书进行。
三、对照品选择
所述阳性性对照为PRDM12、FOXE1、B3GAT2、Vimentin、SFRP2-1、SFRP2-2甲基化质粒DNA片段和内参ACTB基因的混合物(或者为人全基因组DNA甲基化阳性对照)；所述阴性对照为PRDM12、FOXE1、B3GAT2、Vimentin、SFRP2-1、SFRP2-2非甲基化质粒DNA片段和内参ACTB基因的混合物(或者为人全基因组DNA无甲基化阴性对照)；所述空白对照为TE缓冲液或无核酸酶水。
四、DNA亚硫氢酸盐转化
获取的粪便、血液或组织的基因组DNA，使用ZYMO EZ DNA Methylation Gold Kit(ZYMO公司，美国)的DNA亚硫氢酸盐转化试剂盒，依照说明书操作，经过磺化、水解脱氨、去磺化三个主要步骤，将非甲基化的胞嘧啶(C)转化为尿嘧啶(U)，而甲基化的胞嘧啶(5mC)不能进行转化。待测样本的基因组DNA经亚硫氢酸盐转化后作为甲基化PCR检测的模板。阳性对照和阴性对照为基因工程合成质粒。
五、引物和探针的设计与合成
针对人基因组中PRDM12、FOXE1、B3GAT2、Vimentin、SFRP2-1、SFRP2-2基因特定甲基化位点以及内参基因ACTB(序列参见NCBI数据库公开的人类全基因组序列)，使用PrimerPremier 3.0及BeaconDesigner软件，设计特异性引物及探针。引物和探针由生工生物工程(上海)有限公司合成。
本发明针对结直肠癌及进展期腺瘤相关的PRDM12、FOXE1、B3GAT2、Vimentin、SFRP2-1、SFRP2-2靶基因片段甲基化的核酸序列同时设计并验证了多对引物和探针组合序列，经多次反复优化实验，优选了以下(表1)一组检测PRDM12、FOXE1、B3GAT2、Vimentin、SFRP2-1、SFRP2-2基因片段甲基化的引物探针序列。特异性引物及探针序列如表1所示：
表1检测基因特定区域甲基化的特异性引物探针序列
六、PCR反应体系组成
PCR反应体系包括含有上述特异性引物，分为包括6个反应体系(A/B/C/D/E/F)，其中：
反应体系A包含PRDM12正向引物(引物1)、PRDM12反向引物(引物2)、PRDM12检测探针(探针1)；反应体系B包含FOXE1正向引物(引物3)、FOXE1反向引物(引物4)、FOXE1检测探针(探针2)；反应体系C包含B3GAT2正向引物(引物5)、B3GAT2反向引物(引物6)、B3GAT2检测探针(探针3)；反应体系D包含Vimentin正向引物(引物7)、Vimentin反向引物(引物8)、Vimentin检测探针(探针4)；反应体系E包含SFRP2-1正向引物(引物9)、SFRP2-1反向引物(引物10)、SFRP2-1检测探针(探针5)；反应体系F包含SFRP2-2正向引物(引物11)、SFRP2-2反向引物(引物12)、SFRP2-2检测探针(探针6)。所述PCR反应体系还包括内参基因ACTB正向引物(引物13)、ACTB反向引物(引物14)、ACTB检测探针(探针7)、PCR buffer、dNTPs、Taq HS酶、MgCl2。
在各PCR反应体系总加入转化后的DNA，各成分终浓度如表2所示：
表2反应体系组分表
七、试剂盒的使用，包括以下步骤：
(1)准备待测样品，粪便、血液或组织来源样本均适用于本发明。从粪便、血液或组织样本提取基因组DNA，并经亚硫酸氢盐处理转化后作为模板，用于PCR反应。
(2)从试剂盒中取出PCR反应试剂，平衡至室温，29.7μl×(n+1)，PCR反应液和0.3μl×(n+1)酶混合液，充分混匀20s，瞬时离心；(n＝检测样本数量)，瞬时离心。
(3)按每管30μl分装于PCR管中。
(4)用微量移液器向每个PCR管中再加入10μL模版DNA溶液(转化后的待测样本DNA或转化后的阴性/阳性/空白对照品)，每个反应终体积为40ul。立即盖严管盖，充分混匀，瞬时离心，将PCR管移至实时荧光定量PCR扩增仪上。
(5)在实时荧光定量PCR仪上，设置一个扩增程序，连续完成PCR扩增以及扩增过程中实时荧光信号采集、分析。反应程序设定如表3所示：
表3：
(6)结果的判定：
在样本的检测过程中，基线的确定为：取3～15个循环的荧光信号；阈值设定：使阀值线超过正常阴性对照品扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点，且Ct值为Undet。根据所报告的Ct值(每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数)判读样本的阳性或阴性结果。
结论：(1)31例阳性样本FAM通道对应检测孔均有扩增曲线，检测结果为阳性，与病理诊断结果一致；10例阴性样本只有对照的内参基因ROX通道有扩增曲线，检测靶基因结果在FAM通道均为阴性，与病理诊断结果一致表明本试剂盒的检测结果具有极高的特异性和可靠性。本发明各样本的详细检测结果的Ct值见表3。
由样本的荧光定量PCR检测结果中可以看出，各样本PRDM12、FOXE1、B3GAT2、Vimentin、SFRP2-1、SFRP2-2基因在结直肠癌及进展期腺瘤样本中高度扩增，而正常样本中扩增极少，由此证明本发明试剂盒能快速、准确的检测结直肠癌及进展期腺瘤粪便脱落细胞中突变基因和正常基因。由此看出本发明试剂盒不仅是快速、高效的，而且其结果的判读非常明确、直观，结果可靠、特异的。
表3各样本荧光定量PCR检测结果的Ct值(编号“1-N、1-P、1-F”中1代表样本号，N代表正常组织、P代表癌症或腺瘤组织、F代表粪便样本，以此类推)
上述说明示出并描述了本发明的优选实施例，如前所述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。
Claims (13)
1.人结直肠癌相关基因特定区域甲基化的引物组，其特征在于：所述的引物组包括PRDM12、FOXE1、B3GAT2、Vimentin、SFRP2-1、SFRP2-2六个特定基因甲基化区域的任意一种基因或任意几种基因组合的甲基化引物组。
2.如权利要求1所述的人结直肠癌相关基因特定区域甲基化的引物组，其特征在于：所述PRDM12基因的检测引物组，其特异性引物探针组序列为：
正向引物F：5’-GTTAGATTAGAAGTATAAAATGTG-3’；以下称：引物1；
反向引物R：5’-ATCCCATTCCTCTCCTCC-3’；以下称：引物2；
检测探针P：5’-AGCGCGGTGGAGATTTG-3’；以下称：探针1。
3.如权利要求1所述的人结直肠癌相关基因特定区域甲基化的引物组，其特征在于：所述FOXE1基因的检测引物组，其特异性引物探针组序列为：
正向引物F：5’-CGAGTttAAGtttTTGGtAGAGG-3’；以下称：引物3；
反向引物R：5’-CCGATCGACTaAaaCCCGa-3’；以下称：引物4；
检测探针P：5’-tCGAGTTCGGGCGtTGAGG-3’；以下称：探针2。
4.如权利要求1所述的人结直肠癌相关基因特定区域甲基化的引物组，其特征在于：所述B3GAT2基因的检测引物组，其特异性引物探针组序列为：
正向引物F：5’-TtCGtCGGGTtTGGCG-3’；以下称：引物5；
反向引物R：5’-CAaaAaaTCGTaCAaCCCCG-3’；以下称：引物6；
检测探针P：5’-tCGCGAGtAAGtTCGGGAG-3’；以下称：探针3。
5.如权利要求1所述的人结直肠癌相关基因特定区域甲基化的引物组，其特征在于：所述Vimentin基因的检测引物组，其特异性引物探针组序列为：
正向引物F：5’-GtCGtAGttTtTACGttTCGT-3’；以下称：引物7；
反向引物R：5’-aaCGCACGaCAaAaaAaCG-3’；以下称：引物8；
检测探针P：5’-ttCGGGCGGCGTGTATG-3’；以下称：探针4。
6.如权利要求1所述的人结直肠癌相关基因特定区域甲基化的引物组，其特征在于：所述SFRP2-1基因的检测引物组，其特异性引物探针组序列为：
正向引物F：5’-CGGAtTGGGGtAAAAtAAGttC-3’；以下称：引物9；
反向引物R：5’-CTaaCGaaAACGCGCCTA-3’；以下称：引物10；
检测探针P：5’-TAGGCGCGTTttCGttAGTAttTGG-3’；以下称：探针5。
7.如权利要求1所述的人结直肠癌相关基因特定区域甲基化的引物组，其特征在于：所述SFRP2-2基因的检测引物组，其特异性引物探针组序列为：
正向引物F：5’-AATGtAGtCGGCGCG-3’；以下称：引物11；
反向引物R：5’-CCTTaTTaaaAaTTCAAaaAaCCCG-3’；以下称：引物12；
检测探针P：5’-AGttAtTTtCGGGCGTGCGGt-3’；以下称：探针6。
8.如权利要求1所述的人结直肠癌相关基因特定区域甲基化的引物组，其特征在于：还包括内参ACTB基因的引物组，其检测引物探针组序列为：
正向引物：5’-GTGATGGAGGAGGTTTAGTAAG-3’；以下称：引物13；
反向引物：5’-CAATAAAACCTACTCCTCCCTT-3’；以下称：引物14；
检测探针P：5’-TGTGTTTGTTATTGTGTGTTGGGTGGT-3’；以下称：探针7。
9.如权利要求2-8任意一项所述的人结直肠癌相关基因特定区域甲基化的引物组，其特征在于：所述的检测探针5’端的荧光报告基团包括：ALEX-350、FAM、VIC、TET、CAL FluorGold 540、JOE、HEX、CAL Flour Orange 560、TAMRA、Cal Fluor Red 590、ROX、CAL Fluor20Red 610、TEXAS RED、CAL Flour Red 635、Quasar 670、Cy3、Cy5、Cy5.5或Quasar 705；3’端的淬灭基团包括TAMRA、BHQ1、BHQ2、MGB。
10.人结直肠癌相关基因特定区域甲基化检测试剂，其特征在于：所述的试剂包括6个PCR体系，分别为CRC PCR Mix-A/B/C/D/E/F；每个体系中包括如权利要求2-7任意一项相应的基因特定区域甲基化情况的特异性引物探针组，权利如权利要求8的内参基因特异性引物探针组，还包括通用成分有PCR buffer、dNTPs、MgCl2。
11.如权利要求10所述的人结直肠癌相关基因特定区域甲基化检测试剂，其特征在于：所述的六个PCR反应体系CRC PCR Mix-A/B/C/D/E/F，每个体系终体积都在20～40μl之间，所述的反应体系A/B/C/D/E/F中引物终浓度为：正向引物F均在0.3～0.8μM之间，反向引物R均在0.3～0.8μM之间，探针P浓度均在0.1～0.3μM之间；所述6个反应体系中每个体系的通用成分终浓度为：dNTPs中的dATP、dTTP、dCTP、dGTP都为0.1～0.3mM，MgCl2溶液为1～2mM。
12.人结直肠癌相关基因特定区域甲基化检测试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒包括如权利要求10中的6个PCR体系中的任意一个或者任意几个的组合，0.5～2U Taq HS热启动酶，还包括阳性对照、阴性对照和空白对照；所述阳性对照为PRDM12、FOXE1、B3GAT2、Vimentin、SFRP2-1、SFRP2-2的甲基化质粒DNA片段和内参ACTB基因的混合物，或者为人全基因组DNA甲基化阳性对照；所述阴性对照为PRDM12、FOXE1、B3GAT2、Vimentin、SFRP2-1、SFRP2-2的非甲基化质粒DNA片段和内参ACTB基因的混合物，或者为人全基因组DNA无甲基化阴性对照；所述空白对照为pH＝8.5±0.1的TE缓冲液或无核酸酶水。
13.如权利要求12所述的人结直肠癌相关基因特定区域甲基化检测试剂盒的应用，其特征在于：从人的粪便、血液或组织中直接提取DNA，DNA经过亚硫酸氢盐处理转化，以转化后的DNA为模板，通过PCR方法扩增，并通过检测探针上信号累积从而实现人结直肠癌相关PRDM12、FOXE1、B3GAT2、Vimentin、SFRP2-1、SFRP2-2基因特定区域甲基化的实时检测；同时ACTB基因作为内参基因；包括如下PCR具体实验步骤：
步骤一：收集一定数量的结直肠癌患者及进展期腺瘤患者的粪便、血液或组织样本；
步骤二：从待检测人的粪便、血液或组织样本中提取人基因组DNA；
步骤三：提取的人基因组DNA经亚硫酸氢盐处理，转化后，作为PCR反应的模板；
步骤四：从试剂盒中取出29.7μl×(n+1)，PCR Mix和0.3μl×(n+1)Taq HS热启动酶混合液，混匀20s，瞬时离心10s；n＝检测样本数量
步骤五：按每管30μl分装至PCR管中，再加入待检测的转化后DNA模板10μl，总体积40μl；
步骤六：进行扩增反应。反应程序为：
步骤五：PCR结果判定：在样本的检测过程中，基线的确定为：取3～15个循环的荧光信号；阈值设定：使阀值线超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点，且Ct值为Undet；根据所报告的Ct值，即每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数判读样本的阳性或阴性结果。
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