CN114959025A - 一种用于血浆游离dna甲基化检测肠癌的引物探针组合物及其应用和试剂盒 - Google Patents

一种用于血浆游离dna甲基化检测肠癌的引物探针组合物及其应用和试剂盒 Download PDF

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Abstract

一种用于血浆游离DNA甲基化检测肠癌的引物探针组合物及其应用和试剂盒，涉及体外检测技术领域；包括用于检测SDC2、COL4A2、PDX1和NPY基因甲基化的引物对和探针。发明的引物探针组合物，其可实现SDC2、COL4A2、PDX1和NPY基因甲基化特异性扩增检测，上述基因组合的甲基化情况可用作肠癌恶性程度和预后评价的分子生物学标记，实现肠癌的筛查，准确性高。

Description

一种用于血浆游离DNA甲基化检测肠癌的引物探针组合物及 其应用和试剂盒
技术领域
本发明属于体外检测技术领域，具体涉及一种用于血浆游离DNA甲基化检 测肠癌的引物探针组合物及其应用和试剂盒。
背景技术
肠癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，其发病率位居全球恶性肿瘤第三位。 肠癌患者的生存率与肿瘤分期密切相关，早期肠癌术后5年生存率超过90％， 但多数患者就诊时已处于进展期。由于93％的肠癌源于腺瘤，早期多无特异性 症状，而从腺瘤发展到癌需要3～17年，这就为早期筛查提供了时间基础，有 效的早期筛查能够及时发现癌前病变，采取相应的治疗措施，提高患者生存率。
目前肠癌筛查方法主要分为粪便检测和结肠结构性检测两大类。粪便检测 包括粪便潜血检测(fecal occult blood test，FOBT)及粪便DNA检测(stool DNA testing，sDNA)；结肠结构性检测包括乙状结肠镜检查(flexible sigmoidoscopy， FSIG)、结肠镜检查(colonoscopy，CS)、结肠气钡双重造影(double contrast barium enema，DCBE)及CT结肠成像(CT colonoscopy，CTC)。粪便潜血检测FOBT是 一种简单、快速的肠癌筛查方法，用于检测粪便中的微量血红蛋白。FOBT检测 简便、廉价、无创，可用于大规模筛查研究，但其影响因素较多，需在肿瘤形 成后破溃出血的情况下才能检测到阳性结果，而息肉或癌组织的出血常呈间歇 性，不可能被任意粪便标本所包含，因此，其特异性不高，容易出现漏诊。乙 状结肠镜检查(FSIG)是运用内镜技术直接检查远端结肠的方法，操作较简单，肠 道准备要求相对较低，无需术中镇静，可对病变进行活检和治疗，是一种相对 廉价、简便又安全的筛查方法；然而FSIG的检查部位仅限于远端大肠(以脾曲 为界)，如果FSIG发现远端大肠肿瘤后才进行结肠镜检查，将会造成72.0％的 近端大肠肿瘤漏诊。结肠镜检查(CS)是目前肠癌诊断与治疗的金标准，可以对整 个结肠进行完整的观察，并能进行组织活检以及切除发现的息肉。尽管CS具有 疗效好、准确性高等优点，但也有一定的局限性：(1)CS是一种侵入性的检查方 法，发生并发症的风险更高，可能会引起结肠穿孔(0.3％)甚至死亡(1/5000)；(2) 耗时长，在检查前需要充分的肠道准备和镇静处理；(3)价格较贵，如果需要组织活检并切除发现的息肉则花费更多；(4)结肠镜对肠癌的漏诊率为5％。CT结 肠成像(CTC)属于非侵入性检查方法，能以1-2mm的厚度进行断层扫描，进而 在二维和三维图像上检查肠道病变。CTC具有快速、准确及并发症低等优点， 对较大息肉及肠癌的筛查效能接近于CS。但作为一种常规的筛查方法，CTC存 在明显的不足：为了获得令人满意的影像，CTC检查过程中仍需释放2-4rads X 射线到患者腹部，增加患癌的风险；通常会向肠腔内注入空气或二氧化碳以扩 张肠道，患者检查时会有一定的不适；此外，高额的检查费用，不管对个人还 是社会都会带来更重的经济负担。因此，无论是粪便检测还是结肠结构性检测， 其敏感度和特异性偏低，亟需更方便、更准确的肠癌检查方法以提高筛查率。
近年来，以血浆检测为基础的基因甲基化测试为肠癌的早期诊断提供了较 有前景的筛查方法；其通过检测外周血游离DNA基因的甲基化水平可以判定肠 癌的患病风险。但是现有的血浆游离DNA检测方法均采用单一的基因靶点，其 诊断的准确度有限。因此针对多个基因靶点提高筛查肠癌的准确性的研究具有 极大发展前景。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种用于血浆游离 DNA甲基化检测肠癌的引物探针组合物，其可实现多基因的甲基化特异性扩增 检测，提高分析肠癌的准确性。
本发明的目的之二在于提供一种用于血浆游离DNA甲基化检测肠癌的引物 探针组合物的应用。
本发明的目的之三在于提供一种用于血浆游离DNA甲基化检测肠癌的试剂 盒，可实现对肠癌的早期筛查和辅助诊断，敏感度高、特异性强、准确度高。
本发明的目的之一采用如下技术方案实现：
一种用于血浆游离DNA甲基化检测肠癌的引物探针组合物，包括用于检测 SDC2、COL4A2、PDX1和NPY基因甲基化的引物对和探针；
用于检测SDC2基因甲基化的引物对序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2 所示，探针序列如SEQ ID NO:3所示；
用于检测COL4A2基因甲基化的引物对序列如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示，探针序列如SEQ ID NO:6所示；
用于检测PDX1基因甲基化的引物对序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8 所示，探针序列如SEQ ID NO:9所示；
用于检测NPY基因甲基化的引物对序列如SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11 所示，探针序列如SEQ ID NO:12所示。
进一步地，用于检测SDC2、COL4A2、PDX1和NPY基因甲基化的探针的 5’端分别标记有FAM、VIC、ROX和HEX荧光基团中的任一种；其3’端分别标 记有MGB、BHQ淬灭基团的任一种。
本发明的目的之二采用如下技术方案实现：
一种用于血浆游离DNA甲基化检测肠癌的引物探针组合物在制备多基因靶 点检测肠癌试剂中的应用。
本发明的目的之三采用如下技术方案实现：
一种用于血浆游离DNA甲基化检测肠癌的试剂盒，包括裂解液、荧光定量 反应液和亚硫酸氢盐转化剂，所述荧光定量反应液包括所述的用于血浆游离 DNA甲基化检测肠癌的引物探针组合物。
进一步地，所述荧光定量反应液还包括内参基因的引物及探针。
进一步地，所述内参基因为GAPDH，所述内参基因的引物对序列如SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示，探针序列如SEQ ID NO:15所示。
进一步地，所述荧光定量反应液包括第一荧光定量反应液和第二荧光定量 反应液；
所述第一荧光定量反应液包括：用于检测SDC2、COL4A2和PDX1基因甲 基化的引物对和探针及内参基因的引物对和探针；
所述第二荧光定量反应液包括：用于检测NPY基因甲基化的引物对和探针 及内参基因的引物对和探针。
进一步地，所述第一荧光定量反应液中引物对和探针的终浓度为80-100μ M；所述第二荧光定量反应液中引物对和探针的终浓度为40-50μM。
进一步地，所述试剂盒的使用方法包括以下步骤：
1)收集血浆样本，并从所述血浆样本中提取游离DNA；
2)将所述游离DNA用亚硫酸氢盐转化剂进行转化，得到bis-DNA；
3)将所述bis-DNA进行荧光定量PCR扩增反应，检测荧光信号并判定结 果。
进一步地，步骤3)中，PCR扩增的程序为：第一步为温度93-97℃，时间 4-6min，循环1次；第二步为温度93-97℃，时间14-16s后，温度63-65℃，时 间28-32s，循环18-22次；第三步为温度93-97℃，时间9-11s，循环38-42次后， 温度56-60℃，时间30-32s，采集荧光。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
本发明的一种用于血浆游离DNA甲基化检测肠癌的引物探针组合物，其可 实现SDC2、COL4A2、PDX1和NPY基因甲基化特异性扩增检测，上述基因组 合的甲基化情况可用作肠癌恶性程度和预后评价的分子生物学标记，实现肠癌 的筛查，准确性高。
本发明的一种用于血浆游离DNA甲基化检测肠癌的试剂盒，操作简单，无 痛无创，可实现对肠癌的早期筛查和辅助诊断，检测效率高、敏感度高、特异 性强、准确度高。
附图说明
图1是本发明的第一PCR反应体系中正常样本的扩增曲线图。
图2是本发明的第二PCR反应体系中正常样本的扩增曲线图。
图3是本发明的第一PCR反应体系中肠癌样本的扩增曲线图。
图4是本发明的第二PCR反应体系中肠癌样本的扩增曲线图。
图5是本发明的PCR反应体系中ROC图；其中线1为第一PCR反应体系 的ROC曲线，线2为第二PCR反应体系的ROC曲线，线3为总PCR反应体系 的ROC曲线。
具体实施方式
下面，结合附图与具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是， 在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组 合形成新的实施例。
实施例1
一种用于血浆游离DNA甲基化检测肠癌的引物探针组合物，所述引物探针 组合物用于SDC2、COL4A2、PDX1和NPY基因的甲基化检测。
本实施例根据美国国立生物技术信息中心(NCBI)公开的人类全基因组序列SDC2、COL4A2、PDX1和NPY基因序列，设计多组引物及探针。经筛选获得 特异性和灵敏度效果最优的引物序列如下：
用于检测SDC2基因甲基化的引物对，记为：SDC2-Me-PF和SDC2-Me-PR， 序列如SEQID NO:1和SEQ ID NO:2所示；其探针记为：SDC2-Me Probe(FAM)， 序列如SEQ ID NO:3所示；
用于检测COL4A2基因甲基化的引物对，记为：COL4A2-1-Me-PF和 COL4A2-1-Me-PR，序列如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示；其探针记为： COL4A2-1-Me Probe(VIC)，序列如SEQ ID NO:6所示；
用于检测PDX1基因甲基化的引物对，记为：PDX1-Me-PF和PDX1-Me-PR， 序列如SEQID NO:7和SEQ ID NO:8所示；其探针记为：PDX1-Me Probe(ROX)， 序列如SEQ ID NO:9所示；
用于检测NPY基因甲基化的引物对，记为：NPY-Me-PF和NPY-Me-PR， 序列如SEQ IDNO:10和SEQ ID NO:11所示；其探针记为：NPY-Me Probe(HEX)， 序列如SEQ ID NO:12所示。
内参基因为GAPDH，所述内参基因的引物对，记为GAPDH Me-PF和 GAPDH Me-PR，序列如SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示；其探针记为：GAPDH-Me Probe(CY5)，序列如SEQID NO:15所示。
本实施例的引物探针组合物的核苷酸序列具体如表1所示。
表1引物探针组合物序列
Figure BDA0003557185150000071
Figure BDA0003557185150000081
实施例2
一种用于血浆游离DNA甲基化检测肠癌的试剂盒，包括荧光定量反应液、 裂解液、内参基因的引物及探针和亚硫酸氢盐转化剂，所述荧光定量反应液包 括所述的用于血浆游离DNA甲基化检测肠癌的引物探针组合物。
所述荧光定量反应液包括第一荧光定量反应液和第二荧光定量反应液；
所述第一荧光定量反应液包括：用于检测SDC2、COL4A2和PDX1基因甲 基化的引物对和探针及内参基因的引物对和探针；
所述第二荧光定量反应液包括：用于检测NPY基因甲基化的引物对和探针 及内参基因的引物对和探针。
实施例3
一种用于血浆游离DNA甲基化检测肠癌的试剂盒的使用方法，包括以下步 骤：
1、收集血浆样本，并从所述血浆样本中提取游离DNA；
具体为：(1)取200μL血浆样本，加入1mL裂解液，然后振荡1min，然 后用DNA洗涤液洗涤3次后，用DNA洗脱液洗脱，得到游离DNA。
2、将所述游离DNA用亚硫酸氢盐转化剂进行转化，得到bis-DNA；
具体为：(1)将游离DNA全部转移至0.2mL离心管中，添加150μL亚硫 酸氢盐转化剂，摇匀后置于变温器中，设置条件为：
①98℃，9min；
②60℃，60min；
③4℃保持(不超过20h)。
(2)待转化反应完成后，移至吸附柱中，洗涤，离心，收集，得到bis-DNA。
通过轻弹离心管或移液器轻柔吹打操作混匀后短暂离心。
3、将所述bis-DNA进行荧光定量PCR扩增反应，检测荧光信号并判定结 果。
具体为：(1)按照表2和表3分别配制第一PCR反应体系和第二PCR反应 体系。
表2第一PCR反应体系
Figure BDA0003557185150000091
Figure BDA0003557185150000101
表3第二PCR反应体系
成分 浓度(μM) 加入量(μL)
NPY-Me-PF 10 0.65
NPY-Me Probe(HEX) 10 0.12
NPY-Me-PR 10 0.65
GAPDH-Me-PR 5 0.08
GAPDH-Me Probe(CY5) 5 0.08
GAPDH-Me-PF 5 0.08
bis-DNA / 6
2×Epitectmethylight master mix / 9
RNase-Free Water / 1.34
Total Volume / 18
(2)将第一PCR反应体系和第二PCR反应体系分别送入PCR仪器中进行 反应，反应条件如表4所示。
表4PCR反应条件设置
Figure BDA0003557185150000102
Figure BDA0003557185150000111
(3)分别读取第一PCR反应体系和第二PCR反应体系的Ct值。
实施例4
本实施例将正常人血浆样本通过实施例3的第一PCR反应体系和第二PCR 反应体系进行PCR扩增，得到的扩增曲线图如图1和图2所示。
将肠癌患者血浆样本通过实施例3的第一PCR反应体系和第二PCR反应体 系进行PCR扩增，得到的扩增曲线图如图3和图4所示。
参照图1-4，在正常样本中，内参基因GAPDH用含CY5荧光基团的探针标 记，其Ct值随着PCR循环的次数的增加而增加，目的基因(SDC2、COL4A2、 PDX1和NPY基因)的含量几乎不变。而在肠癌样本中，SDC2、COL4A2、 PDX1和NPY基因的Ct值随着PCR循环的次数的增加而增加，且增值速率大 于内参基因，说明本发明的引物探针组合物可实现的SDC2、COL4A2、PDX1 和NPY基因的甲基化特异性扩增检测，上述基因组合的甲基化情况可用作肠癌 恶性程度和预后评价的分子生物学标记，实现肠癌的筛查，准确性高。
参照图5，其为第一PCR反应体系和第二PCR反应体系的PCR结果绘制 的ROC曲线；结果表明，本发明的检测方法具有很好的诊断效果，具有优异的 灵敏度和特异性。
实施例5
取46组正常样本进行荧光定量PCR检测，分别标记为N1～N46；取44组 肠癌样本进行荧光定量PCR检测，分别标记为C1～C44。根据检测的CT值换 算成甲基化数值(EI)，结果如表5所示。
计算方法为：
总EI值＝各目的基因EI值之和；
△CT＝目的基因CT值-内参基因CT值；
CT值与EI值的换算
(1)目的基因CT＝0；EI＝0；
目的基因△CT≤0，EI＝5；
(2)目的基因≤20时，
△CT＝1～5，EI＝3；△CT＝6～10，EI＝2；△CT>10，EI＝1；
(3)目的基因20<CT≤25值，
△CT＝1～10，EI＝2；△CT>10，EI＝1；
(4)目的基因CT>25值，
△CT＝1～10，EI＝1；△CT>10，EI＝0。
表5
Figure BDA0003557185150000121
Figure BDA0003557185150000131
Figure BDA0003557185150000141
本发明EI的cut-off值＝3时，灵敏性为84.09％(37/44)，特异性为86.96％ (40/46)，说明本发明的基因组合的甲基化情况可用作肠癌恶性程度和预后评价 的分子生物学标记；本发明的引物探针组合物可实现的SDC2、COL4A2、PDX1 和NPY基因的甲基化特异性扩增，适用于检测血浆游离DNA甲基化情况，灵 敏度高，特异性强。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的 范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换 均属于本发明所要求保护的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州尔立简生物科技有限公司
<120> 一种用于血浆游离DNA甲基化检测肠癌的引物探针组合物及其应用和试剂盒
<130> 2022
<160> 15
<170> PatentIn version 3.3
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<212> DNA
<213> 人工合成
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atggtttgaa ggtggtaggg 20

Claims (10)

1.一种用于血浆游离DNA甲基化检测肠癌的引物探针组合物，其特征在于，包括用于检测SDC2、COL4A2、PDX1和NPY基因甲基化的引物对和探针；
用于检测SDC2基因甲基化的引物对序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示，探针序列如SEQ ID NO:3所示；
用于检测COL4A2基因甲基化的引物对序列如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示，探针序列如SEQ ID NO:6所示；
用于检测PDX1基因甲基化的引物对序列如SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示，探针序列如SEQ ID NO:9所示；
用于检测NPY基因甲基化的引物对序列如SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示，探针序列如SEQ ID NO:12所示。
2.如权利要求1所述的用于血浆游离DNA甲基化检测肠癌的引物探针组合物，其特征在于：用于检测SDC2、COL4A2、PDX1和NPY基因甲基化的探针的5’端分别标记有FAM、VIC、ROX和HEX荧光基团中的任一种；其3’端分别标记有MGB、BHQ淬灭基团的任一种。
3.一种权利要求1或2所述的用于血浆游离DNA甲基化检测肠癌的引物探针组合物在制备多基因靶点检测肠癌试剂中的应用。
4.一种用于血浆游离DNA甲基化检测肠癌的试剂盒，其特征在于：包括裂解液、荧光定量反应液和亚硫酸氢盐转化剂，所述荧光定量反应液包括权利要求1或2所述的用于血浆游离DNA甲基化检测肠癌的引物探针组合物。
5.如权利要求4所述的用于血浆游离DNA甲基化检测肠癌的试剂盒，其特征在于：所述荧光定量反应液还包括内参基因的引物及探针。
6.如权利要求5所述的用于血浆游离DNA甲基化检测肠癌的试剂盒，其特征在于：所述内参基因为GAPDH，所述内参基因的引物对序列如SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示，探针序列如SEQ ID NO:15所示。
7.如权利要求6所述的用于血浆游离DNA甲基化检测肠癌的试剂盒，其特征在于：所述荧光定量反应液包括第一荧光定量反应液和第二荧光定量反应液；
所述第一荧光定量反应液包括：用于检测SDC2、COL4A2和PDX1基因甲基化的引物对和探针及内参基因的引物对和探针；
所述第二荧光定量反应液包括：用于检测NPY基因甲基化的引物对和探针及内参基因的引物对和探针。
8.如权利要求7所述的用于血浆游离DNA甲基化检测肠癌的试剂盒，其特征在于：所述第一荧光定量反应液中引物对和探针的终浓度为80-100μM；所述第二荧光定量反应液中引物对和探针的终浓度为40-50μM。
9.一种权利要求4-8任一项所述的用于血浆游离DNA甲基化检测肠癌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的使用方法包括以下步骤：
1)收集血浆样本，并从所述血浆样本中提取游离DNA；
2)将所述游离DNA用亚硫酸氢盐转化剂进行转化，得到bis-DNA；
3)将所述bis-DNA进行荧光定量PCR扩增反应，检测荧光信号并判定结果。
10.如权利要求9所述的用于血浆游离DNA甲基化检测肠癌的试剂盒，其特征在于：步骤3)中，PCR扩增的程序为：第一步为温度93-97℃，时间4-6min，循环1次；第二步为温度93-97℃，时间14-16s后，温度63-65℃，时间28-32s，循环18-22次；第三步为温度93-97℃，时间9-11s，循环38-42次后，温度56-60℃，时间30-32s，采集荧光。
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