CN102787174B - 胃肠肿瘤发病相关抑癌基因表观突变检测试剂盒及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及胃肠肿瘤发病相关抑癌基因表观突变检测试剂盒及其用途。试剂盒的主要成分包括：（1）胃肠肿瘤发病相关的9种抑癌基因启动子区CpG岛扩增与测序引物25对；（2）PCR扩增用试剂。通过本试剂盒得到的PCR扩增产物，可以通过甲基化特异性PCR（methylationspecificPCR,MSP)、亚硫酸氢盐修饰和限制性内切酶联合分析（combinedbisulphite-restrictionanalysis,COBRA）、或亚硫酸氢盐修饰后测序（bisulfitesequencingPCR,BSP）等方法分析基因CpG岛甲基化状态。本试剂盒具有高效的CpG岛甲基化检出作用。用于胃肠肿瘤发病相关抑癌基因表观突变检测。
Description
技术领域
本发明涉及一种胃肠肿瘤发病相关抑癌基因表观突变检测试剂盒，特别涉及其在中国胃肠肿瘤患病人群的表观突变分析与后果评估。
背景技术
作为现代医学发展的重要标志之一，肿瘤等复杂性疾病的遗传分析和基因诊断正不断走向临床，并逐步成为临床医学的一种常规手段。在人类肿瘤的发展中，基因结构性变异与表观遗传学改变在可遗传的基因表达变异中均起着重要作用。已经知道，抑癌基因的表观遗传学改变，特别是基因启动子区CpG岛的高度甲基化，可以导致基因的转录沉默，从而丢失相应蛋白的表达及功能，引发肿瘤。此机制在肿瘤的形成过程中越来越受到重视。
胃肠肿瘤包括胃癌与结直肠癌，是严重危害人类健康的常见恶性肿瘤，在我国约占恶性肿瘤总发病率的1/4。研究表明一些抑癌基因启动子区CpG岛高甲基化在胃肠肿瘤中频繁出现，并且引起相应蛋白的表达降低或丢失。其中以下9种基因的甲基化与胃肠肿瘤的关系尤其密切，它们分别是：维持DNA稳定的错配修复基因MLH1及MSH2、能抑制IKKβ/NF-κB信号通路的脯氨酸羟化酶家族成员PHD3、衰老抑制基因Klotho、胰岛素样生长因子结合蛋白家族成员IGFBP7、Wnt信号通路竞争性拮抗剂SFRP1、SFRP2及SFRP5，以及可抑制细胞增殖的细胞周期素依赖性激酶抑制因子家族成员P16INK4a。因此有必要开发一种方便快捷的胃肠肿瘤发病相关抑癌基因表观突变检测试剂盒，以用于胃肠肿瘤的遗传诊断。
发明内容
本发明的目的是提供一种胃肠肿瘤发病相关抑癌基因表观突变检测试剂盒及其应用。
本检测试剂盒主要包括以下成分：
(1)胃肠肿瘤发病相关的9种抑癌基因启动子区CpG岛扩增与测序引物25对，各对引物序列见表1；
（2）PCR扩增试剂，如dNTP、Ex Taq Hot Start聚合酶等。
表1CpG岛扩增与测序引物序列
本试剂盒扩增出的PCR产物可以采用以下三种方式进行基因CpG岛甲基化检测：第一种方式是甲基化特异性PCR（methylation specific PCR,MSP)，第二种方式是亚硫酸氢盐修饰和限制性内切酶联合分析（combinedbisulphite-restriction analysis,COBRA）、第三种方式是亚硫酸氢盐修饰后测序（bisulfite sequencing PCR,BSP）。因此，试剂盒中，还可以有亚硫酸氢盐修饰试剂、限制性内切酶或（/和）琼脂糖凝胶。
所说的限制性内切酶是BstUI酶。
本发明所说的试剂盒用于检测胃肠肿瘤发病相关抑癌基因启动子区CpG岛甲基化状态。
本试剂盒的检测基因启动子区CpG岛甲基化步骤包括：
（1）常规提取样本组织DNA。
（2）DNA亚硫酸氢盐修饰：按照CHEMICON公司CpGenomeTM DNA修饰试剂盒说明书操作步骤，经过磺化、水解脱氨和碱性条件下去磺化三个主要步骤，将非甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶。而5-甲基-胞嘧啶不能进行该反应。
（3）基因启动子区CpG岛甲基化分析，可以有三种分析方法：
I.甲基化特异性PCR（MSP)（适用于基因CpG岛甲基化筛查）
实验原理：针对亚硫酸氢盐修饰后的DNA序列差异设计引物。M引物在CpG二联核苷处，设计为CG，只可以扩出甲基化的DNA；U引物在CpG二联核苷处，设计为TG，只可以扩出非甲基化的DNA。用这种特异性扩增的方法来检测DNA中胞嘧啶的甲基化情况。
MSP法的具体步骤为：
A.PCR扩增
引物如表1所示。反应体系为25μl：TaKaRa Ex Taq HS聚合酶0.125μl、10×EX Taq buffer2.5μl、dNTP Mixture（2.5mM each）2.5μl、上游引物（10μM）1μl、下游引物（10μM）1μl、亚硫酸氢盐修饰DNA 1μl、ddH2O 17μl。反应条件：95℃预变性3min；95℃变性30sec，60℃左右（相应退火温度）复性30sec，72℃延伸30sec，40个循环；再72℃延伸10min，4℃保存。
B.将PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，在紫外光下观察实验结果。
II.亚硫酸氢盐修饰和限制性内切酶联合分析（COBRA）（适用于基因CpG岛甲基化筛查）
实验原理：对亚硫酸氢盐修饰过的DNA，设计引物扩增基因启动子区CpG岛片段，扩增片段中含有BstUI的酶切位点CGCG。酶切位点CGCG中的胞嘧啶如果甲基化，经过亚硫酸氢盐修饰后，保持为CGCG，可以被BstUI酶切开，成为两段或多段。酶切位点CGCG中的胞嘧啶如果为非甲基化，经过修饰、扩增后，将转化为TGTG，不能被BstUI酶识别，从而不能被切开。以此辨别扩增区域可能存在的CpG岛高度甲基化。
COBRA法的具体步骤为：
A.PCR扩增
引物如表1所示。反应体系为25μl：TaKaRa Ex Taq HS聚合酶0.125μl、10×EX Taq buffer2.5μl、dNTP Mixture（2.5mM each）2.5μl、上游引物（10μM）1μl、下游引物（10μM）1μl、亚硫酸氢盐修饰DNA1μl、ddH2O 17μl。反应条件：95℃预变性3min；95℃变性30sec，60℃左右（相应退火温度）复性30sec，72℃延伸30sec，40个循环；再72℃延伸10min，4℃保存。
B.酶切
酶切体系及条件：PCR产物25μl、10×NEBuffer 2.5μl、BstUI 0.625μl，60°C，1小时。
C.将酶切产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，在紫外光下观察实验结果。
III.亚硫酸氢盐修饰后测序（Bisulfite sequencing PCR,BSP）（适用于以上9种基因CpG岛甲基化状态确认）
实验原理：对亚硫酸氢盐修饰过的DNA，设计引物扩增基因启动子区CpG岛片段，各CpG二联核苷处胞嘧啶如果甲基化，经过亚硫酸氢盐修饰后，保持为CG；各CpG二联核苷处胞嘧啶如果为非甲基化，经过修饰、扩增后，将转化为TG。扩增产物纯化后直接测序，即可确认CpG岛中各CpG二联核苷处胞嘧啶甲基化状态。
BSP法的具体步骤为：
A.PCR扩增
引物如表1所示。反应体系为25μl：TaKaRa Ex Taq HS聚合酶0.125μl、10×EX Taq buffer2.5μl、dNTP Mixture（2.5mM each）2.5μl、上游引物（10μM）1μl、下游引物（10μM）1μl、亚硫酸氢盐修饰DNA1μl、ddH2O 17μl。反应条件：95℃预变性3min；95℃变性30sec，60℃左右（相应退火温度）复性30sec，72℃延伸30sec，40个循环；再72℃延伸10min，4℃保存。
B.将PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，在紫外光下观察实验结果。
C.目标条带经切胶纯化，采用BigDye Terminator V3.1试剂盒，在ABI 3130基因分析仪（美国ABI公司）上测序鉴定。
本试剂盒具有高效的基因启动子区CpG岛甲基化状态检测作用。实施实例中报道，在192例中国结直肠癌患者中针对PHD3基因启动子区CpG岛分析甲基化状态，采用试剂盒的COBRA与BSP检测方法提出，PHD3基因启动子区CpG岛甲基化率为84/192（43.75%），PHD3基因启动子区CpG岛甲基化对于结直肠癌形成可能具有病因学意义。本试剂盒在胃肠肿瘤患者抑癌基因启动子区CpG岛甲基化状态分析上具有重要作用。
附图说明
图1是PHD3基因启动子区CpG岛COBRA分析图：图示PCR扩增产物及内切酶BstUI酶切后片段。
图2是患者ZY127瘤组织DNA启动子区CpG岛测序图片段：箭头所示CG二联核苷处为杂合的C与T。
图3是Klotho基因启动子区CpG岛MSP分析图：图示分别用M引物及U引物PCR扩增条带，Marker为DNA标记。
图4是患者ZY94瘤组织DNA启动子区CpG岛测序图片段：箭头所示CG二联核苷处为强的C峰，显示为高甲基化的胞嘧啶。
具体实施方式
实施例1：中国结直肠癌患者PHD3基因启动子区CpG岛甲基化状态分析
选择192例中国江苏地区结直肠癌患者，提取瘤组织DNA。按照CHEMICON公司CpGenomeTM DNA修饰试剂盒说明书操作步骤进行DNA的亚硫酸氢盐修饰。修饰后的DNA先行COBRA分析，筛查PHD3基因启动子区CpG岛甲基化状态，具体步骤为：选择表1中第7对引物（F:5'-GGTAGTGGTGGTTTTTTA-3'，R:5'-CATAATATATCCCAAAAACATCTC-3′）扩增PHD3基因启动子区CpG岛片段。反应体系为25μl：TaKaRa Ex Taq HS聚合酶0.125μl、10×EX Taq buffer 2.5μl、dNTP Mixture（2.5mMeach）2.5μl、上游引物（10μM）1μl、下游引物（10μM）1μl、亚硫酸氢盐修饰DNA1μl、ddH2O 17μl。反应条件：95℃预变性3min；95℃变性30sec，55℃复性30sec，72℃延伸30sec，40个循环；再72℃延伸10min。PCR产物用内切酶BstUI酶切，酶切体系及条件为：PCR产物25μl、10×NEBuffer 2.5μl、BstUI 0.625μl，60°C，1小时。将酶切产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，在紫外光下观察条带位置。图1为PHD3基因启动子区CpG岛COBRA分析图，由图1可见，患者ZY104只存在329bp长度的条带，而患者ZY105、ZY106、ZY127及ZY132除了329bp长度的条带，在228bp处、88bP处显示明显条带（理论上在13bP处也存在条带，但是短片段难以分辨出），分析为PCR产物经BstUI内切酶切开的条带，提示后四位患者DNA启动子区CpG岛中CGCG处的胞嘧啶为甲基化的。对于用COBRA法筛查得到的PHD3基因启动子区存在高甲基化的DNA样本，抽样采用BSP确认甲基化的状态，具体步骤为：上述PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，在紫外光下分辨条带。目标条带经切胶纯化，采用BigDye TerminatorV3.1试剂盒，选择表1中第7对引物中的上游引物（F:5'-GGTAGTGGTGGTTTTTTA-3′），在ABI 3130基因分析仪（美国ABI公司）上测序鉴定。
图2为患者ZY127瘤组织DNA启动子区CpG岛测序图片段，具体序列如SEQ ID NO.51所示，图2中箭头所示CG二联核苷处为杂合的C与T，显示为单等位基因甲基化。192例患者瘤组织DNA经COBRA筛查及BSP确认，其中84例显示单等位基因甲基化，这批结直肠癌患者PHD3基因启动子区CpG岛甲基化阳性率为84/192（43.75%）。
实施例2：中国结直肠癌患者Klotho基因启动子区CpG岛甲基化状态分析
选择183例中国江苏地区结直肠癌患者，提取瘤组织DNA。按照CHEMICON公司CpGenomeTM DNA修饰试剂盒说明书操作步骤进行DNA的亚硫酸氢盐修饰。修饰后的DNA先行MSP分析，筛查Klotho基因启动子区CpG岛甲基化状态，具体步骤为：选择表1中第8对引物（Klotho-M,F:5'-ATGAATTTGAGCGTTTACGAAAC-3'，R:5'-ACTCCGCTAACAATAATTACCTACG-3'）及第9对引物（Klotho-U,F:5'-ATGAATTTGAGTGTTTATGAAATGT-3'，R:5'-TCCACTAACAATAATTACCTACAAA-3'），分别扩增Klotho基因启动子区CpG岛片段，用这种甲基化特异性扩增的方法来检测DNA中胞嘧啶的甲基化情况。反应体系为25μl：TaKaRa Ex Taq HS聚合酶0.125μl、10×EXTaq buffer 2.5μl、dNTP Mixture（2.5mM each）2.5μl、上游引物（10μM）1μl、下游引物（10μM）1μl、亚硫酸氢盐修饰DNA 1μl、ddH2O 17μl。反应条件：95℃预变性3min；95℃变性30sec，60℃(M引物)或55℃（U引物）复性30sec，72℃延伸30sec，40个循环；再72℃延伸10min。将PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，在紫外光下观察条带位置。图3为Klotho基因启动子区CpG岛MSP分析图，由图3可见，患者ZY16用M引物扩增出约210bp的条带，提示该患者DNA启动子区CpG岛中存在甲基化的胞嘧啶，而患者ZY13、ZY14及ZY19只用U引物扩出208bp的条带，用M引物未扩出条带，提示这三位患者DNA启动子区CpG岛中胞嘧啶为非甲基化的。对于用MSP法筛查得到的Klotho基因启动子区CpG岛存在高甲基化的DNA样本，抽样采用BSP法确认甲基化的状态，具体步骤为：选择表1中第10对引物（Klotho-BS P，F:5'-GTTTTTTTTAGGGTATTTTT-3'，R:5'-CCCAATAATACAAAATAACCAC-3′）扩增Klotho基因启动子区CpG岛片段，PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，在紫外光下分辨条带。目标条带经切胶纯化，采用BigDyeTerminator V3.1试剂盒，选择表1中第10对引物中的上游引物（F:5'-GTTTTTTTTAGGGTATTTTT-3′），在ABI 3130基因分析仪（美国ABI公司）上测序鉴定。图4为患者ZY94瘤组织DNA启动子区CpG岛测序图片段，具体序列如SEQ ID NO.52所示，图4中箭头所示CG二联核苷处为强的C峰，显示为高甲基化的胞嘧啶。183例患者瘤组织DNA经MSP筛查及BSP确认，其中116例显示单等位基因甲基化，这批结直肠癌患者Klotho基因启动子区CpG岛甲基化阳性率为116/183（63.39%）。
实施例3：中国结直肠癌患者MLH1、MSH2、IGFBP7、SFRP1、SFRP2、SFRP5及P16INK4a基因启动子区CpG岛甲基化状态分析
选择中国江苏地区结直肠癌患者，提取瘤组织DNA。按照CHEMICON公司CpGenomeTMDNA修饰试剂盒说明书操作步骤进行DNA的亚硫酸氢盐修饰。修饰后的DNA先行MSP分析，筛查MLH1、MSH2、IGFBP7、SFRP1、SFRP2、SFRP5及P16INK4a基因启动子区CpG岛甲基化状态，具体步骤为：分别选择表1中第1-2对引物、第4-5对引物、第11-12对引物、第14-15对引物、第17-18对引物、第20-21对引物、第23-24对引物，分别扩增MLH1、MSH2、IGFBP7、SFRP1、SFRP2、SFRP5及P16INK4a基因启动子区CpG岛片段，用这种甲基化特异性扩增的方法来检测DNA中胞嘧啶的甲基化情况。反应体系为25μl：TaKaRa Ex Taq HS聚合酶0.125μl、10×EX Taq buffer 2.5μl、dNTP Mixture（2.5mM each）2.5μl、上游引物（10μM）1μl、下游引物（10μM）1μl、亚硫酸氢盐修饰DNA1μl、ddH2O 17μl。反应条件：95℃预变性3min；95℃变性30sec，60℃左右(相应退火温度）复性30sec，72℃延伸30sec，40个循环；再72℃延伸10min。将PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，在紫外光下观察条带位置。对于用MSP法筛查得到的基因启动子区CpG岛存在高甲基化的DNA样本，抽样采用BSP法确认甲基化的状态，具体步骤为：分别选择表1中第3对引物、第6对引物、第13对引物、第16对引物、第19对引物、第22对引物、第25对引物，扩增MLH1、MSH2、IGFBP7、SFRP1、SFRP2、SFRP5及P16INK4a基因启动子区CpG岛片段，PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，在紫外光下分辨条带。目标条带经切胶纯化，测序鉴定。经以上MSP筛查及BSP鉴定，这批结直肠癌患者MLH1、MSH2、IGFBP7、SFRP1、SFRP2、SFRP5及P16INK4a基因启动子区CpG岛甲基化阳性率分别为0.52%、0.00%、89.84%、38.65%、98.43%、60.29%及10.42%。
SEQUENCE LISTING
<110> 南京大学
<120> 胃肠肿瘤发病相关抑癌基因表观突变检测试剂盒及其用途
<130>
<160> 52
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
attggttgga tatttcgtat ttttc 25
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cctaaaacga ctactacccg ct 22
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<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
attggttgga tattttgtat tttttg 26
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
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ctccctaaaa caactactac ccact 25
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ggtatttttg tttttattgg ttggatat 28
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
caacttaaat accaatcaaa tttctca 27
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
cggagaagtc gattattata gtgc 24
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ctaaatctta aacacctccc gaa 23
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
tggagaagtt gattattata gtgtgt 26
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<213> 人工序列
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cctaaatctt aaacacctcc caaa 24
<210> 11
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gttttggaag ttgattgggt gtggt 25
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cctaaatctt aaacacctcc c 21
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<400> 13
ggtagtggtg gtttttta 18
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<212> DNA
<213> 人工序列
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cataatatat cccaaaaaca tctc 24
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atgaatttga gcgtttacga aac 23
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actccgctaa caataattac ctacg 25
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atgaatttga gtgtttatga aatgt 25
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tccactaaca ataattacct acaaa 25
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<213> 人工序列
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gtttttttta gggtattttt 20
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<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
cccaataata caaaataacc ac 22
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
aaattagagg gtggaagagt cgt 23
<210> 22
<211> 25
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<213> 人工序列
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ctactaacgt cgaaaaataa acgaa 25
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<211> 25
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<400> 23
agaaattaga gggtggaaga gttgt 25
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<213> 人工序列
<400> 24
ctactaacat caaaaaataa acaaa 25
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
ggggagaagg ttattattta ggttagtaa 29
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<400> 26
ccctcccatc taactcctaa aatac 25
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 27
gtattatttg aggttaggag ttcga 25
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 28
ctaaaataca ataacgctat ctccg 25
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 29
gtattatttg aggttaggag tttga 25
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 30
aaaatacaat aacactatct ccact 25
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<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 31
ttagtttggt taatatggtg aaattt 26
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acaaacccat aaaattataa aaacttttt 29
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<211> 22
<212> DNA
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cggattgggg taaaataagt tc 22
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<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 34
aactacgaaa ataaaaaaca cgca 24
<210> 35
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 35
tttggattgg ggtaaaataa gttt 24
<210> 36
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 36
aactacaaaa ataaaaaaca caca 24
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 37
atgtttggta atttagtaga aattt 25
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 38
acaacaaaca aaaaaaccta acc 23
<210> 39
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 39
tagggagttt tggggagaaa c 21
<210> 40
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 40
aaaacgaaaa aacaataaaa acgac 25
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 41
gtagggagtt ttggggagaa at 22
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 42
aaaacaaaaa aacaataaaa acaac 25
<210> 43
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 43
atggggtttg gtattaagtt taatg 25
<210> 44
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 44
actccctacc tccctaaaca tttt 24
<210> 45
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 45
ggggagtagt atggagtttt cg 22
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<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 46
aactattcga tacgttaaac aacgc 25
<210> 47
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 47
gggagtagta tggagttttt gg 22
<210> 48
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 48
actattcaat acattaaaca acacc 25
<210> 49
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 49
tttttagagg atttgaggga tagg 24
<210> 50
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 50
ctacctaatt ccaattcccc taca 24
<210> 51
<211> 329
<212> DNA
<213> 人
<400> 51
ggtagtggtg gttttttatt tttaaaaggy gtttttygat tttttgygty gtattgttyg 60
tygggttagt tyggaaaygg gtygtggagt ttygtattat tttygttggt tttygaaggt 120
agattttttt tttygagagt tgygagaaat ttttttttgt tttygaygtt gtagyggtty 180
gggtatygtg gtagtygtag gtttttgaat ttygggttay gtttttygyg tttyggttty 240
gygttygtgt agatygtttt ttttttggtt gtaygttggg gatttyggat ttygattttg 300
ygggygagat gtttttggga tatattatg 329
<210> 52
<211> 420
<212> DNA
<213> 人
<400> 52
gtttttttta gggtattttt ttygayggtt ttttttgggt ygtgggtagy gtygtttatt 60
agatygaggg yggttggtag tagtayggta agggtgygtt tatttgggat aygtttattt 120
attatttttt ggtattttyg ggagatttty ggaaygttag tttgtygttg ggygtttygt 180
ygtygttgta gttygttaty ggggaygtag ttagygatag ttataataay gtttttygyg 240
atayggaggy gttgygygag ttyggggtta tttattatyg tttttttatt tygtgggygy 300
gagtgttttt taatggtagy gygggygttt ttaatygyga ggggttgygt tattatyggy 360
gtttgttgga gyggttgygg gagttgggyg tgtagttygt ggttattttg tattattggg 420
Claims (3)
1.一种胃肠肿瘤发病相关抑癌基因表观突变检测试剂盒，其特征在于包括以下成分：
（1）抑癌基因启动子区CpG岛扩增与测序引物25对；（2）PCR扩增用试剂；所述的25对引物序列如下：
第1对：MLH1基因MSP分析引物MLH1-M，用于扩增MLH1基因启动子区CpG位点处胞嘧啶甲基化的片段
F: 5'-ATTGGTTGGATATTTCGTATTTTTC-3' R: 5'-CCTAAAACGACTACTACCCGCT-3'
第2对：MLH1基因MSP分析引物MLH1-U，用于扩增MLH1基因启动子区CpG位点处胞嘧啶非甲基化的片段
F: 5'-ATTGGTTGGATATTTTGTATTTTTTG-3'
R: 5'-CTCCCTAAAACAACTACTACCCACT-3'
第3对：MLH1基因BSP分析引物MLH1-BSP，用于扩增MLH1基因启动子区CpG岛并测序鉴定
F: 5'-GGTATTTTTGTTTTTATTGGTTGGATAT-3'
R: 5'-CAACTTAAATACCAATCAAATTTCTCA-3'
第4对：MSH2基因MSP分析引物MSH2-M，用于扩增MSH2基因启动子区CpG位点处胞嘧啶甲基化的片段
F: 5'-CGGAGAAGTCGATTATTATAGTGC-3' R: 5'-CTAAATCTTAAACACCTCCCGAA-3'
第5对：MSH2基因MSP分析引物MSH2-U，用于扩增MSH2基因启动子区CpG位点处胞嘧啶非甲基化的片段
F:5'-TGGAGAAGTTGATTATTATAGTGTGT-3'
R: 5'-CCTAAATCTTAAACACCTCCCAAA-3'
第6对：MSH2基因BSP分析引物MSH2-BSP，用于扩增MSH2基因启动子区CpG岛并测序鉴定
F:5'-GTTTTGGAAGTTGATTGGGTGTGGT-3' R: 5'-CCTAAATCTTAAACACCTCCC-3'
第7对：PHD3基因COBRA或BSP分析引物PHD3-BSP，用于扩增PHD3基因启动子区CpG岛并酶切鉴定或测序鉴定
F: 5'- Ggtagtggtggtttttta-3' R: 5'- CATAATATATCCCAAAAACATCTC-3'
第8对：Klotho基因MSP分析引物Klotho -M，用于扩增Klotho基因启动子区CpG位点处胞嘧啶甲基化的片段
F: 5'-ATGAATTTGAGCGTTTACGAAAC-3' R: 5'-ACTCCGCTAACAATAATTACCTACG-3'
第9对：Klotho基因MSP分析引物Klotho -U，用于扩增Klotho基因启动子区CpG位点处胞嘧啶非甲基化的片段
F: 5'-ATGAATTTGAGTGTTTATGAAATGT-3'
R: 5'-TCCACTAACAATAATTACCTACAAA-3'
第10对：Klotho基因BSP分析引物Klotho -BSP，用于扩增Klotho基因启动子区CpG岛并测序鉴定
F: 5'-GTTTTTTTTAGGGTATTTTT-3' R:5'-CCCAATAATACAAAATAACCAC-3'
第11对：IGFBP7基因MSP分析引物IGFBP7-M，用于扩增IGFBP7基因启动子区CpG位点处胞嘧啶甲基化的片段
F: 5'-AAATTAGAGGGTGGAAGAGTCGT-3' R: 5'-CTACTAACGTCGAAAAATAAACGAA-3'
第12对：IGFBP7基因MSP分析引物IGFBP7-U，用于扩增IGFBP7基因启动子区CpG位点处胞嘧啶非甲基化的片段
F: 5'-AGAAATTAGAGGGTGGAAGAGTTGT-3'
R: 5'-CTACTAACATCAAAAAATAAACAAA-3'
第13对：IGFBP7基因BSP分析引物IGFBP7 -BSP，用于扩增IGFBP7基因启动子区CpG岛并测序鉴定
F: 5'-GGGGAGAAGGTTATTATTTAGGTTAGTAA-3'
R:5'-CCCTCCCATCTAACTCCTAAAATAC-3'
第14对：SFRP1基因MSP分析引物SFRP1-M，用于扩增SFRP1基因启动子区CpG位点处胞嘧啶甲基化的片段
F: 5'-GTATTATTTGAGGTTAGGAGTTCGA-3'
R: 5'-CTAAAATACAATAACGCTATCTCCG-3'
第15对：SFRP1基因MSP分析引物SFRP1-U，用于扩增SFRP1基因启动子区CpG位点处胞嘧啶非甲基化的片段
F: 5'-GTATTATTTGAGGTTAGGAGTTTGA-3'
R: 5'-AAAATACAATAACACTATCTCCACT-3'
第16对：SFRP1基因BSP分析引物SFRP1 -BSP，用于扩增SFRP1基因启动子区CpG岛并测序鉴定
F: 5'-TTAGTTTGGTTAATATGGTGAAATTT-3'
R: 5'-ACAAACCCATAAAATTATAAAAACTTTTT-3'
第17对：SFRP2基因MSP分析引物SFRP2-M，用于扩增SFRP2基因启动子区CpG位点处胞嘧啶甲基化的片段
F: 5'-CGGATTGGGGTAAAATAAGTTC-3' R: 5'-AACTACGAAAATAAAAAACACGCA-3'
第18对：SFRP2基因MSP分析引物SFRP2-U，用于扩增SFRP2基因启动子区CpG位点处胞嘧啶非甲基化的片段
F: 5'-TTTGGATTGGGGTAAAATAAGTTT-3' R: 5'-AACTACAAAAATAAAAAACACACA-3'
第19对：SFRP2基因BSP分析引物SFRP2 -BSP，用于扩增SFRP2基因启动子区CpG岛并测序鉴定
F: 5'-ATGTTTGGTAATTTAGTAGAAATTT-3' R: 5'-ACAACAAACAAAAAAACCTAACC-3'
第20对：SFRP5基因MSP分析引物SFRP5-M，用于扩增SFRP5基因启动子区CpG位点处胞嘧啶甲基化的片段
F: 5'-TAGGGAGTTTTGGGGAGAAAC-3' R: 5'-AAAACGAAAAAACAATAAAAACGAC-3'
第21对：SFRP5基因MSP分析引物SFRP5-U，用于扩增SFRP5基因启动子区CpG位点处胞嘧啶非甲基化的片段
F: 5'-GTAGGGAGTTTTGGGGAGAAAT-3' R: 5'-AAAACAAAAAAACAATAAAAACAAC-3'
第22对：SFRP5基因BSP分析引物SFRP5 -BSP，用于扩增SFRP5基因启动子区CpG岛并测序鉴定
F: 5'-ATGGGGTTTGGTATTAAGTTTAATG-3' R: 5'- ACTCCCTACCTCCCTAAACATTTT-3'
第23对：P16基因MSP分析引物P16-M，用于扩增P16基因启动子区CpG位点处胞嘧啶甲基化的片段
F: 5'- GGGGAGTAGTATGGAGTTTTCG-3' R: 5’-AACTATTCGATACGTTAAACAACGC-3’
第24对：P16基因MSP分析引物P16-U，用于扩增P16基因启动子区CpG位点处胞嘧啶非甲基化的片段
F: 5'-GGGAGTAGTATGGAGTTTTTGG-3' R:5'-ACTATTCAATACATTAAACAACACC-3'
第25对：P16基因BSP分析引物P16-BSP，用于扩增P16基因启动子区CpG岛并测序鉴定
F: 5'-TTTTTAGAGGATTTGAGGGATAGG-3' R:5'-CTACCTAATTCCAATTCCCCTACA-3'。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括亚硫酸氢盐修饰试剂和琼脂糖凝胶。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，还包括限制性内切酶BstUI和琼脂糖凝胶。
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