CN101680025A - 选定基因中的表观遗传变化和癌症 - Google Patents

Abstract

检测样品中癌症易感性或发病的方法，其包括检测选自以下的至少一种基因的表观遗传变化：NDRG4/NDRG2亚家族基因、GATA4、OSMR、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3，其中所述表观遗传变化的检出指示癌症的易感性或发病。还描述了基于本发明方法对患者进行选择来确定合适的癌症治疗方案的药物遗传学方法和治疗癌症患者的方法。本发明还涉及收集、处理和分析样品(尤其是体液样品)的改进方法。上述方法可用于诊断、分期或以其它方式表征多种疾病。本发明还涉及鉴定、诊断、分期或表征癌症的方法，尤其是胃肠道癌(例如结直肠癌、胃癌和食道癌)。此外，本发明的方法涉及分离和分析来自粪便样品和血源样品的人DNA组分。

Description

选定基因中的表观遗传变化和癌症

技术领域

本发明涉及用于鉴定和诊断癌症的方法和试剂盒，其包括检测多种基因中任一种或多种的表观遗传变化(例如甲基化状态变化)或表达水平变化或其组合。还描述了基于本发明方法对患者进行选择来确定合适的癌症治疗方案的药物遗传学方法和治疗癌症患者的方法。本发明还涉及收集、处理和分析样品(尤其是体液样品)的改进方法。更特别地，本发明涉及用于鉴定体液样品中表观遗传变化的方法。上述方法可用于诊断、分期或以其它方式表征多种疾病。本发明还涉及鉴定、诊断、分期或以其它方式表征癌症的方法，尤其是胃肠道癌(例如结直肠癌、胃癌和食道癌)。此外，本发明的方法涉及分离和分析来自粪便样品和血源样品的人DNA组分。

背景技术

大多数癌症在其最早期阶段并没有临床症状。对患者的诊断通常包括介入性操作，其往往缺乏灵敏度和准确性。高度可靠、非介入性的筛选方法将会使患者筛查、诊断和预后评估更加容易。

肿瘤标志物是通常由恶性肿瘤产生的生物学物质。理想的肿瘤标志物应当具有肿瘤特异性，提供肿瘤负荷的指示，以及应当能产生足够的量以便检测出最低限度的疾病。大多数在临床实践中使用的肿瘤标志物是可通过生化测定检测的肿瘤抗原、酶、激素、受体和生长因子。对DNA改变的检测(例如突变、缺失和表观遗传修饰(Baylin等，2000))提供了另一种鉴定癌症的手段/工具。

可以将表观遗传修饰描述为基因表达潜能的稳定改变，其发生在发育和细胞增殖过程中，并通过不改变基因的一级核苷酸序列的机制来介导。现在一般认为，遗传和表观遗传变化均可导致基因沉默和细胞功能障碍。这两种过程的协同作用推动了肿瘤的发展和恶化。已发现的导致基因表达改变的三种相关机制是：DNA甲基化、组蛋白密码变化和RNA干扰。

DNA过度甲基化是一种表观遗传修饰，其通过向DNA的特定胞嘧啶添加甲基(CH₃)而使基因活性受到控制。特别地，甲基化发生在CpG二核苷酸(CpG岛)的胞嘧啶上，所述CpG二核苷酸集中分布在人类基因的启动子区域和内含子中(P.A.Jones等，2002；P.W.Laird等，2003)。甲基化与基因沉默有关。发现DNA过度甲基化存在于多种癌症中，包括肺癌、乳腺癌、卵巢癌、肾癌、宫颈癌、前列腺癌和结直肠癌。癌细胞DNA的甲基化模式明显不同于正常细胞。因此，对癌细胞中适当选择的基因进行甲基化模式检测可区分癌细胞与正常细胞，从而提供早期检出癌症的方法。

DNA肿瘤标志物，尤其是DNA甲基化标志物，提供了与其它生化标志物相比而言的一些优势。一个重要的优势是DNA改变常发生在明显的恶性变化之前，从而可用于癌症的早期诊断。因为DNA比蛋白质要稳定得多，其可通过强大的基于扩增的技术进行扩增以提高灵敏度，所以这可用于需要灵敏检测的情形中，例如当肿瘤DNA极少时或被过多的正常DNA稀释时(Sidransky等，1997)。体液为癌症检测提供了一种成本较低且早期非介入性的方式。在本文中，研究范围还包括基于粪便的癌症测试。

人结直肠癌为研究DNA癌症标志物是否可用作基于粪便的最佳诊断筛查测试提供了很好的模型。基于粪便的结直肠癌测试的核心问题是鉴定特异且灵敏的肿瘤标志物。

N-Myc下游调节基因(N-Myc downstream-regulated gene，NDRG)家族包含4个成员：NDRG1(NDRG家族成员1)、NDRG2(NDRG家族成员2)、NDRG3(NDRG家族成员3)和NDRG4(NDRG家族成员4)。人NDRG1和NDRG3属于一个亚家族，NDRG2和NDRG4属于另一个亚家族。在氨基酸(aa)水平，这4个成员具有53-65％的同一性。这四种蛋白质均含有如人溶酶体酸性脂酶中的α/β水解酶折叠，但是一般认为它们在不同的组织中发挥不同的具体功能。

NDRG1编码一种被认为参与应激应答、激素应答、细胞生长和细胞分化的细胞质蛋白。NDRG1已被证明在细胞分化过程中上调，在胚胎细胞中被N-myc和c-myc抑制，并且在几种肿瘤细胞中被抑制(Qu X等，2002；Guan等，2000)。

NDRG3被认为在精子发生中发挥作用，因为它在睾丸、前列腺和卵巢中高表达(Zhao W等，2001)。还有研究指出它参与脑癌发生(QuX等，2002)。

NDRG2编码一种似乎参与神经突长出和胶质母细胞瘤癌变的细胞质蛋白(Deng Y等，2003)。在阿尔茨海默症患者的脑中，其RNA和蛋白质水平均发生上调(Mitchelmore C等，2004)，也有人指出其在脑癌(Qu X等，2002)、胰腺癌和肝癌(Hu XL等，2004)发生中具有重要作用。

细胞质蛋白NDRG4参与血管平滑肌细胞中有丝分裂信号的调节(Nishimoto S等)。NDRG4基因含有17个外显子，并且已描述了该基因的几种选择性剪接转录物变体。NDRG4也可能参与脑癌的发生(QuX等，2002)。

已证明在多种肿瘤中NDRG家族基因的表达受到抑制(Qu X等，2002)，而DNA启动子过度甲基化的参与情况仅限于在脑肿瘤中NDRG2甲基化的报道(Lusis等，2005)。

最初，基于粪便的DNA测定研究了将特异性点突变标志物用于检测结直肠癌。之后，粪便样品中DNA的完整性被证明是有用的标志物(Boynton等，2003)。最后，通过使用特异性点突变标志物、微卫星不稳定性标志物和DNA完整性标志物，基于DNA改变的粪便测试逐渐发展为多靶标DNA测定。最近，已发现将粪便DNA测试靶向表观遗传改变的可能性(Müller等，2004；Chen等，2005)，并已将其并入多靶标DNA测定中。相比于健康对象的对照样品，已发现结肠癌患者的粪便DNA中具有甲基化状态变化可追踪的基因(Belshaw等，2004；Petko等，2005；Lenhard等，2005；Müller等，2004；Chen等，2005和Lueng等，2004)。

可能影响选定标志物灵敏度的因素是取样处理步骤以及DNA分离和提取步骤。结直肠癌研究人员所面临的一个挑战是粪便样品中存在多种DNA。从粪便样品回收的大多数DNA是细菌来源的，其中仅有极少部分是人类DNA成分。来自结肠粘膜脱落细胞的人DNA仅占粪便回收总DNA的0.1-0.01％。此外，所回收的人DNA是高度异质性的。正常细胞连同仅仅少量的肿瘤细胞(约占脱落细胞的1％)脱落进入结肠腔。因此，目标DNA仅占从粪便分离的总DNA中很小的比例。所以，随着对合适DNA标志物的探寻，已开发了从粪便样品中提取DNA和富集人DNA组分的改进技术，用于更为灵敏的癌症检测。

最初的DNA分离技术通常从10g-4g粪便中回收DNA，更为便利地是使用结合有链亲和素的磁珠来纯化人DNA组分(Dong等，2001；Ahlquist等，2000)。从粪便中回收人靶标DNA的其它改进方法包括利用电泳来分离靶标DNA序列，其采用了固定在丙烯酰胺凝胶中的寡核苷酸捕获探针(Whitney等，2004)。后来，当发现DNA完整性是合适的标志物时，在样品处理过程中防止降解也十分重要。在收集粪便样品后尽可能快地将其冷冻也改善了结果。或者，在接下来的运输前向粪便样品中加入稳定缓冲液(Olson等，2005)。最近的一项改进方案涉及使用MBD柱从高粪便细菌DNA背景下提取甲基化的人DNA(Zou等，2007)。然而，尽管有这些进步，目前针对粪便样品的癌症检测工具仍不能令人满意。

癌在其早期阶段可通过凋亡、坏死或局部血管发生而将其细胞或游离DNA释放到血液中，这便构成了基于血液来检测癌症的基础。已证明了可使用血清和血浆中的DNA甲基化标志物来检测结直肠癌(Grady等2001；Leung等，2005；Nakayama等，2007)。然而，由于从血浆和血清样品收集的总DNA中存在的甲基化DNA水平有限，因此阻碍了将血清和血浆用于癌症检测(Zou等，2002，Clin Cancer Res，188-91)。另一个缺点是由亚硫酸氢盐处理(许多监测DNA甲基化技术所需的处理步骤)导致的甲基化DNA发生部分降解。

已描述了使用血液和体液对早期结直肠癌或前期癌进行检测的方法和组合物。

WO 2006/113770描述了将样品集中和浓缩以便使每个反应输入的DNA最大化的方法。对45ml血液的初步处理得到平均的DNA回收率为3.86ng/ml血浆。对于使用特异性实时测定来检测Septin 9基因是否发生甲基化以检测结直肠癌，这种方法显示出57％的灵敏度和96％的特异性。亚硫酸氢盐处理主要用于大量处理并实现了最大转化。

Lofton-Day等(AACR general meeting April 2007，Los Angeles，USA)提出了检测结直肠癌的改进方法，并使用同样的标志物(Septin 9)获得了70％的灵敏度和90％的特异性。所提议的方法针对每种测试样品使用了4次取血(40ml血)，两次离心回收血浆，并需要进行4次PCR扩增反应。四次反应中有三次使用了相当于每次PCR反应2毫升血浆的DNA输入。第四次反应采用了上述输入DNA的1/10稀释。因此，还需要进行重复试验(至少4次)并使用某种算法来确定最终结果。如果在使用相当于2毫升血浆的输入DNA的三次反应中有两次或者在稀释后测量中Septin 9测定呈阳性，则认为该样品呈阳性。通过使用稀释样品来改善灵敏度表明在该方法中存在抑制剂，Nakayama等(2007，Anticancer Res.27(3B)：1459-63)也描述了这一现象。

还描述了对较少量血液的处理方法(US 20070141582，Hong-ZhiZou等和Satoru Yamaguchi等)，但是所有这些方法均会降低甲基化修饰DNA检测的水平。

因此，目前基于血液的筛查方法缺乏灵敏度。

发明内容

如权利要求所述，本发明是基于发现在人类癌细胞(特别是结肠癌细胞)中NDRG4/2亚家族基因经历了CpG岛启动子甲基化相关的基因沉默。NDRG家族基因(如NDRG4和/或NDRG2)的过度甲基化，特别是发生在启动子区域的过度甲基化，导致其表达丧失。重要的是，在NDRG4/2亚家族基因启动子处存在异常的甲基化具有预后价值。NDRG4/2功能的表观遗传缺失可通过使用DNA去甲基化试剂来恢复，从而提供了一种治疗方法。这些发现强调了NDRG4/2亚家族基因表观遗传沉默作为癌症发生中一个关键步骤的意义，并可能对患者治疗具有重要的临床影响。

本发明还基于以下发现：特定基因和基因组合的甲基化状态与胃肠道癌(例如结直肠癌)的发病或易感性(predisposition)存在联系。使用这些基因检测胃肠道癌(例如结直肠癌)，特别是分别通过适当的组织或粪便样品或适当的血液样品(或其衍生物)检测，已显示出得到高灵敏度和特异性的结果。本发明还提供用于从粪便样品分离出更多量DNA的方法，从而提高了检测粪便样品中结直肠癌的灵敏度。

本发明还提供了用于测定血源样品中目标基因甲基化状态的方法，其只需要少量的血液样品即可产生具有特异性和灵敏度的结果。因为仅需从被测试对象获取较少的血液样品，所以这是有利的。

因此，在第一个方面，本发明提供了一种检测样品中癌症易感性或发病的方法，其包括检测选自以下的至少一种基因的表观遗传变化：NDRG4/NDRG2亚家族基因(尤其是NDRG4)、GATA4、OSMR、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3，其中表观遗传变化的检出指示癌症的易感性或发病。

本发明的所有方面和实施方案的基因亚组分别包括NDRG4/NDRG2亚家族基因(尤其是NDRG4)、GATA4、OSMR、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC和MGMT，以及TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3。每个亚组可能特别适用于体液样品，例如本文讨论的粪便和血浆样品。

“表观遗传变化”是指由表观遗传机制引起的基因的修饰，例如甲基化状态或组蛋白乙酰化的改变。通常，表观遗传变化会导致基因表达水平的改变，这种改变可以作为表观遗传变化的指示来进行检测(可酌情针对RNA或蛋白质水平)。通常，表观遗传变化导致基因的沉默或下调，即本文提及的“表观遗传沉默”。本发明方法中最常研究的表观遗传变化涉及测定基因的甲基化状态，其中甲基化水平的提高通常与相应的癌症有关(因为它可能导致基因表达下调)。

在一个相关的方面，本发明提供了一种诊断癌症或癌症易感性的方法，其包括检测NDRG4/NDRG2亚家族基因的表观遗传沉默，其中所述基因的表观遗传沉默指示癌症或癌症易感性。

在本领域中已对NDRG家族基因进行了表征(参见，例如，Qu X等，2002以及其中引用的参考文献)，其表观遗传沉默可以用DNA甲基化状态或由甲基化状态决定的表达水平来评估。

在一个实施方案中，本发明提供了一种诊断癌症或癌症易感性的方法，其包括检测NDRG4/NDRG2亚家族基因的表观遗传沉默，其中通过测定NDRG4/2家族基因的甲基化状态来检测NDRG2/NDRG4家族基因的表观遗传沉默，其中所述基因的甲基化指示癌症或癌症易感性。

由于NDRG4/NDRG2亚家族基因的甲基化表明其自身基因表达水平的下降，因此本发明还提供了一种诊断癌症或癌症易感性的方法，其包括检测NDRG4/NDRG2亚家族基因的表观遗传沉默，其中通过测量所述基因的表达水平来测定NDRG2/NDRG4家族基因的表观遗传沉默，其中所述基因表达下降指示癌症或癌症易感性。

在一个相关的方面，本发明提供了对癌症或癌症易感性预后的方法，其包括检测NDRG4/NDRG2亚家族基因的表观遗传沉默，其中所述基因的表观遗传沉默指示癌症的发生或癌症易感性。优选地，通过测定NDRG2/NDRG4家族基因的甲基化状态和/或测量其表达水平来检测表观遗传沉默。

本发明还提供了检测样品中癌症(尤其是胃肠道癌，例如结直肠癌)易感性或发病的方法，其包括检测选自以下的至少一种基因的表观遗传变化：GATA4、OSMR、NDRG4、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC和MGMT，和/或TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3，其中表观遗传变化的检出指示癌症(尤其是胃肠道癌，例如结直肠癌)的易感性或发病。这些基因亚组可特别适用于使用粪便测试样品(以及在某些实施方案中的血浆)的情况。

在一个相关的方面，本发明还提供了检测样品(尤其是血液样品或其衍生物)中癌症(尤其是胃肠道癌，例如结直肠癌)易感性或发病的方法，其包括检测选自以下的至少一种基因的表观遗传变化：GATA4、OSMR、NDRG4、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3(连同任何其适当的亚组或组合)，其中表观遗传变化的检出指示癌症(尤其是胃肠道癌，例如结直肠癌)的易感性或发病。

“NDRG2/NDRG4亚家族基因”是指来自NDRG4和NDRG2所属亚家族的任何基因，并根据本发明所有方面包括NDRG2和NDRG4。请注意，“NDRG1、NDRG2、NDRG3和NDRG4”是人类基因组组织批准的NDRG家族基因的标准命名，以确保每个名称都是唯一的。这些基因的登录号可在www.gene.ucl.ac.uk/nomenclature查询。

NDRG家族基因不仅包含可在公共数据库中查询到的条目所表示的特定序列，而且还包含这些序列的转录物变体。编码蛋白的变体形式可包含翻译后修饰，可由剪接信使形成，等等。NDRG4具有登录号分别为NM_020465和NM_022910的转录物变体。NDRG2具有多个转录物变体，其登录号分别为NM_201535、NM_201536、NM_201537、NM_201538、NM_201539、NM_201540、NM_2015401和NM_016250。变体序列可与数据库条目或序列表中的序列有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。用于确定同一性百分比的计算机程序是本领域已有的，其包括可从美国国立生物技术信息中心(NationalCenter for Biotechnology Information)获得的基本局部比对搜索工具(Basic Local Alignment Search Tool，BLAST5)。

GATA4是由人类基因组组织基因命名委员会(HUGO GeneNomenclature Committee)批准的基因名称。该基因位于8号染色体上(定位于p23.1-p22)，其基因序列在登录号为AK097060、NM_002052和ENSG00000136574中列出。该基因编码GATA结合蛋白4。

OSMR是由人类基因组组织基因命名委员会批准的基因名称。该基因位于5号染色体上(定位于p13.2)，其基因序列在登录号为U60805、NM_003999和ENSG00000145623中列出。该基因编码制瘤素(oncostatin)M受体。

NDRG4是由人类基因组组织基因命名委员会批准的基因名称。该基因位于16号染色体上(定位于q21-q22.3)，其基因序列在登录号为AB044947和ENSG00000103034中列出。该基因编码NDRG家族成员4。

GATA5是由人类基因组组织基因命名委员会批准的基因名称。该基因位于20号染色体上，其基因序列在登录号为ENSG00000130700中列出。该基因编码GATA结合蛋白5。

SFRP1是由人类基因组组织基因命名委员会批准的基因名称。该基因位于8号染色体上(定位于p11.21)，其基因序列在登录号为AF017987、NM_003012和ENSG00000104332中列出。该基因编码分泌型卷曲相关蛋白1。

ADAM23是由人类基因组组织基因命名委员会批准的基因名称。该基因位于2号染色体上(定位于q33)，其基因序列在登录号为AB009672和ENSG00000114948中列出。该基因编码ADAM金属肽酶结构域23。

JPH3是由人类基因组组织基因命名委员会批准的基因名称。该基因位于16号染色体上(定位于q24.3)，其基因序列在登录号为AB042636和ENSG00000154118中列出。该基因编码连接蛋白3(junctophilin 3)。

SFRP2是由人类基因组组织基因命名委员会批准的基因名称。该基因位于4号染色体上(定位于q31.3)，其基因序列在登录号为AF017986和ENSG00000145423中列出。该基因编码分泌型卷曲相关蛋白2。

APC是由人类基因组组织基因命名委员会批准的基因名称。该基因位于5号染色体上(定位于q21-q22)，其基因序列在登录号为M74088和ENSG00000134982中列出。该基因编码腺瘤性结肠息肉病蛋白(adenomatosis polyposis coli)。

MGMT基因编码O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(O6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT)，它是一种在鸟嘌呤O6位迅速逆转烷基化(例如甲基化)的细胞DNA修复蛋白，从而中和烷基化试剂(如替莫唑胺(TMZ)和卡莫司汀(1-3))的细胞毒效应。MGMT是由人类基因组组织基因命名委员会批准的基因名称。该基因位于10号染色体上(定位于10q26)，其基因序列在登录号为M29971、NM_002412和ENSG00000170430中列出。

BNIP3是由人类基因组组织基因命名委员会批准的基因名称。该基因位于10号染色体上(定位于10q26.3)，其基因序列在登录号为U15174和ENSG00000176171中列出。该基因编码BCL2/腺病毒E1B 19kDa相互作用蛋白3。

FOXE1是由人类基因组组织基因命名委员会批准的基因名称。该基因位于9号染色体上(定位于9q22)，其基因序列在登录号为U89995和ENSG00000178919中列出。该基因编码叉头(forkhead)盒E1蛋白(甲状腺转录因子2)。

JAM3是由人类基因组组织基因命名委员会批准的基因名称。该基因位于11号染色体上(定位于11q25)，其基因序列在登录号为AF356518、NM_032801和ENSG00000166086中列出。该基因编码连接粘附分子3。

PHACTR3是由人类基因组组织基因命名委员会批准的基因名称。该基因位于20号染色体上(定位于20q13.32)，其基因序列在登录号为AJ311122、NM_080672和ENSG00000087495中列出。该基因编码磷酸酶和肌动蛋白调节因子3。

TFPI2是由人类基因组组织基因命名委员会批准的基因名称。该基因位于7号染色体上(定位于7q22)，其基因序列在登录号为L27624和ENSG00000105825中列出。该基因编码组织因子途径抑制因子2。

SOX17是由人类基因组组织基因命名委员会批准的基因名称。该基因位于8号染色体上(定位于8q11.23)，其基因序列在登录号为AB073988和ENSG00000164736中列出。该基因编码SRY(性别决定区域Y)盒蛋白17。

SYNE1是由人类基因组组织基因命名委员会批准的基因名称。该基因位于6号染色体上(定位于6q25)，其基因序列在登录号为AB018339和ENSG00000131018中列出。该基因编码含血影蛋白重复的核被膜蛋白1。

当然，视情况而定，技术人员会理解，也可根据本发明的方法检测每个所述基因序列的功能相关变体。例如，可根据本发明的方法测定多种剪接变体的甲基化状态。变体序列优选地与数据库条目中的核苷酸序列有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性。用于确定核苷酸序列同一性百分比的计算机程序是本领域已有的，其包括可从美国国立生物技术信息中心获得的基本局部比对搜索工具(BLAST)。

本发明的方法一般是离体或在体外对测试样品(特别是经分离的测试样品)进行操作的方法。所述方法可用于诊断任何合适类型的癌症。所述癌症包括胃肠道赘生物/肿瘤(例如在一个实施方案中的胃肠道癌)，或基本由其组成或者由其组成。在一些具体的实施方案中，本发明的方法被应用于结直肠癌、胃癌和/或食道癌。在一些更具体的实施方案中，所述方法用于诊断结直肠癌，尤其是诊断遗传性非息肉型结肠癌和/或散发性结直肠癌。或者，所述方法的目的是诊断胃癌。优选地，所述方法用于诊断结直肠癌和/或胃癌。所述方法可用于检测癌瘤或腺瘤，特别是晚期腺瘤。本方法可用于诊断弥漫型和肠型胃癌，尤其是当测定NDRG4的甲基化状态时。在一个实施方案中，所述方法还可包括获取样品的步骤。

在一个具体的实施方案中，所述方法用于诊断食道腺癌。特别地，本文首次揭示NDRG4基因(启动子)的甲基化状态与这一特定癌症类型的发病具有高灵敏度和特异性的关联。在此基础上，食道腺癌可与食道鳞状细胞癌相区分。

所述“测试样品”可以是任何组织样品或体液。优选地，所述测试样品从人类对象获取。在一些具体的实施方案中，所述样品取自胃肠道。所述样品可以是结直肠组织样品，或结肠、直肠、食道、胃或阑尾组织样品，或基于粪便或血液的样品。对于粪便样品来说，所述方法优选地用于检测胃肠道癌(例如本文所讨论的结直肠癌)，但也可用于鉴定具有潜在危险性的腺瘤。可有不同的标志物和标志物组合适用于特定的样品类型，例如本文所详细讨论的组织样品、血源样品或粪便样品。

因此，例如在一个实施方案中，本发明的方法涉及检测表观遗传变化，特别是在粪便测试样品中测定(至少是)NDRG4基因的甲基化状态，其中表观遗传变化(特别是NDRG4基因(启动子)的(过度)甲基化)的检出指示胃肠道赘生物/癌，特别是结直肠癌，例如胃肠道的腺瘤和癌、胃癌和其它腺癌(如食道腺癌)和/或弥漫型和肠型胃癌。

所述对象可以是疑似发生肿瘤的病例。更具体地，所述患者可以被怀疑患有癌症，例如本文所讨论的胃肠道癌(特别是结直肠癌)。然而，本发明的范围内包含任何其它合适的测试样品，在所述测试样品中可通过测定本发明所述的合适基因(例如NDRG4/NDRG2亚家族基因)的表观遗传沉默来指示癌症的存在。本文介绍了提供灵敏且特异之诊断的优选基因组合和亚组，所述诊断包括基于合适的样品(例如本文所讨论的组织、粪便和血浆样品)对胃肠道癌(如结直肠癌)进行早期检测。因此，在一些使用组织样品的实施方案中，本发明的方法可包括检测一组基因(其包含OSMR、GATA4和ADAM23，或OSMR、GATA4和GATA5)的表观遗传变化，或基本由其组成或由其组成，其中在所述组合的至少一种基因中检出表观遗传变化指示胃肠道癌(例如结直肠癌)的易感性或发病。例如，所述组织样品可包括结肠和/或直肠和/或阑尾样品，或基本由其组成或由其组成。

可用于本发明方法的其它含DNA的样品包括用于诊断、预后或个体化医疗用途的样品。例如，这些样品可取自手术样品(如活组织检查或细针抽吸)、石蜡包埋组织、冷冻的肿瘤组织样品、新鲜的肿瘤组织样品或者新鲜或冷冻的体液。非限制性的实例包括全血或其部分/组分、骨髓、脑脊液、腹腔液、胸腔液、淋巴液、血清、血浆、尿液、乳糜、精液、痰、乳头吸取液、唾液、拭子标本、结肠清洗标本和刷拭标本。所述组织和体液可以使用任何合适的方法收集，许多这样的方法是本领域所熟知的。可以对石蜡包埋标本直接进行评估或对组织切片进行评估。组织样品一般取自怀疑发生肿瘤的组织。

在一个具体实施方案中，测试样品是血液样品。可使用任何血样或其衍生物。所述血样或其衍生物可包括全血或其任何合适的含DNA的部分/组分，或者主要由其组成。在一些具体实施方案中，所述血样或其衍生物包括血清或血浆，或者基本由其组成或由其组成。所述血样可通过使用任何合适的方法收集，许多这样的方法是本领域所熟知的。在一个实施方案中，本发明的方法还包括获取血样的步骤。任何适当的血样均可用于本发明的方法中，只要它包含足够的DNA即可。在一个具体实施方案中，在所述方法中使用的血样或其衍生物的体积大约为5至15ml，例如10ml。

血样或其衍生物在获得之后可以在用于本发明方法之前进行储存。例如可将它们在合适的温度(例如大约-80℃)冷冻。

优选地，血样或其衍生物包括血浆或血清样品，或者基本由其组成或由其组成。血浆可通过任何适当的手段/工具取自全血。在一个实施方案中，血浆样品通过离心全血获得。离心可在本领域技术人员确定的任何合适的速度、任何合适的时间长度以及任何合适的条件下进行。例如，离心可在约1000～3000g之间进行。例如，离心时间可为约1、2、3、4或5分钟到10、11、12、13、14或15分钟之间。离心可在低温(例如在约0到5℃之间，例如4℃)下进行以保持样品的完整。可采用多步离心以获得血浆样品。在一个具体实施方案中，采用两步离心获得血浆样品。

在一些使用血液(特别是血浆或血清样品)的实施方案中，所述至少一种基因可选自OSMR、SFRP1、NDRG4、GATA5、ADAM23、JPH3、SFRP2和APC。如下所示，这些基因为诊断血浆样品中结直肠癌提供了灵敏且特异的方法。本文中合适的基因组合包含OSMR、NDRG4、GATA5和ADAM23，或者主要由其组成或由其组成。基于血浆或血清的方法可使用的其它基因包括TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3。

本文所定义的“诊断”包括筛查疾病或疾病预兆，鉴定疾病或疾病预兆，监测疾病的分期、状态和进展，检查治疗后疾病的复发以及监测具体治疗的成功性。本发明的方法也可具有预后价值，这也包含在“诊断”这一术语的定义中。例如，本发明方法的预后价值可用作多种胃肠道癌(例如结直肠癌)的潜在易感性标志物，或作为从腺瘤发展到癌症的标志物。因此，依据患者的可鉴别症状，可以在所述疾病有机会显现出来之前就可鉴定出有患病风险的患者。

本发明的方法可利用纯化的或未纯化的含DNA样品来进行。然而，在一些具体的实施方案中，DNA从样品中分离/提取/纯化出来。可使用任何合适的DNA分离技术。纯化技术的实例可参见标准教科书，例如Molecular Cloning-A Laboratory Manual，第三版，Sambrook和Russell(尤其参见其中的附录8和第5章)。在一个实施方案中，纯化涉及DNA的醇沉淀。优选的醇包括乙醇和异丙醇。合适的纯化技术还包括基于盐的沉淀方法。因此，在一个具体实施方案中，DNA纯化技术包括使用高浓度的盐来沉淀杂质。例如，所述盐可包括醋酸钾和/或醋酸铵，或者基本由其组成或由其组成。所述方法还可包含去除已沉淀的杂质、随后通过醇沉淀回收DNA的步骤。

在一个替代实施方案中，所述DNA纯化技术基于使用有机溶剂，从而将杂质从细胞裂解物中提取出。因此，在一个实施方案中，所述方法包括使用酚、氯仿和异戊醇来提取DNA。采用适当的条件以确保杂质被隔离到有机相，而DNA仍保留在水相中。

在这些纯化技术的一些具体实施方案中，利用醇沉淀(例如乙醇或异丙醇沉淀)来回收所提取的DNA。

根据本发明的一些具体实施方案，从天然来源扩增DNA(使用PCR)常常受到一起纯化出的杂质的抑制，已有多种从环境样品中提取DNA的方法并提供了用于从粪便样品或血源样品分离DNA的替代方法。例如，QIAGEN的QIAamp粪便DNA小量试剂盒(QIAamp DNA StoolMini Kit)利用InhibitEX吸附样品中破坏DNA的物质和PCR抑制剂。其它(特别是针对粪便样品)应用的实例包括Wizard基因组DNA纯化试剂盒(Wizard Genomic DNA Purification Kit，Promega)、easyMAG^TM(Biomerieux)和Macherey Nagel制造的核酸纯化试剂盒。

在测试样品是血源样品的一些具体实施方案中，可通过酚氯仿抽提来分离DNA，这是因为已显示出该方法提供特别高效的从样品回收DNA的方案。

例如，当使用血源测试样品时，可使用ChargeSwitch操作步骤。

用于从血样中分离DNA的合适的方法和试剂盒是可购得的。下表中列出了可用于本发明方法中的实例。

表1.用于从血样中分离DNA的试剂盒和方法

从Qiagen购得的QIAamp血液DNA大量试剂盒(QIAamp DNABlood Maxi kit)和Invitrogen的GeneCatcher gDNA试剂盒均使用血浆或血清作为原料。

因此，如表1所示，DNA分离可使用例如基于硅胶膜、异丙醇或磁珠的方法。

视情况，本发明的方法还可包括对样品中经分离/提取/纯化的DNA进行定量。可使用任何合适的方法对样品中的DNA进行定量。例如，对核酸进行定量可基于使用分光光度计、荧光计或紫外透射仪。合适技术的实例可参见标准教科书中的描述，例如Molecular Cloning-ALaboratory Manual，第三版，Sambrook和Russell(尤其参见其中的附录8)。在一个实施方案中，可使用试剂盒(例如Molecular Probes，Invitrogen的

dsDNA定量试剂盒来对DNA进行定量。

本文所定义的“癌症”包括赘生物。赘生物是指异常的新生生长，因而其含义与肿瘤相同，其可以是良性的或恶性的。与本发明有关的特定癌症类型在上文有所论述，其包括选自胃肠道赘生物的癌症。具体实例包括结直肠癌、食道癌、胃癌(stomach cancer)和胃癌(gastric cancer)。

“结直肠癌”，也称为结肠癌或肠癌，其包含结肠、直肠和阑尾中的癌性生长。本文所详述的特异性标志物和标志物组合可特别适用于其某些癌症类型。

与本发明一些具体(但非所有)实施方案相关的其它癌症类型可包括前列腺癌、乳腺癌、卵巢癌和甲状腺癌。

本文所定义的“表观遗传沉默”包括任何导致基因表达减少的DNA改变，其介导机制不同于基因一级核苷酸序列改变的机制。在某些情况下，表观遗传修饰可以是稳定的可遗传性状。已发现多种导致基因表达变化的相关机制，包括DNA甲基化、可导致染色质重塑的组蛋白变化(例如组蛋白乙酰化的变化)和RNA干扰。在许多情况下，DNA过度甲基化错误地关闭了关键基因使癌症得以发生和发展。

在可观察到异常的新生生长/癌症之前，所述至少一种基因(选自NDRG2/NDRG4亚家族基因(尤其是NDRG4)、GATA4、OSMR、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3(采用包括本文所述之组合在内的所有排列组合))的表观遗传沉默或表观遗传变化(例如甲基化)即可自我显现出来。对象可进行例行筛查，而不一定被怀疑患有某种疾病(例如结肠肿瘤)。在上述对象的腺瘤中检测一种或多种基因的表观遗传沉默可指示腺瘤发展到癌的过程并因此指示肿瘤易感性。在这种情况下，可建议进行预防性治疗，包括切除晚期腺瘤。这些方法可有利地涉及检测NDRG4基因的甲基化，尤其是使用如本文所述的第1组引物。

“晚期腺瘤”是指观察到至少一种与结直肠癌有关的基因发生表观遗传沉默的腺瘤，优选地检出本发明所述的一种或多种基因(例如NDRG4等)的表观遗传沉默(例如甲基化)。

在所检测的至少一种基因(选自NDRG2/NDRG4亚家族基因(尤其是NDRG4)、GATA4、OSMR、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3(采用包括本文所述之组合在内的所有排列组合))中最优选的表观遗传变化包括甲基化，或者基本由其组成或由其组成。特别地，检测一种或多种基因的异常甲基化(可称为过度甲基化)。通常，测定合适的CpG岛中的甲基化状态，所述CpG岛常存在于基因的启动子区域。术语“甲基化”、“甲基化情况”或“甲基化状态”是指在DNA序列中的一个或多个CpG二核苷酸上存在或不存在5-甲基胞嘧啶(“5-mCyt”)。CpG二核苷酸通常集中在人类基因的启动子区域和外显子中。

可根据DNA甲基化状态或根据通过基因甲基化状态确定的表达水平来评估基因表达的减少。一种检测表观遗传沉默的方法是测定在正常细胞中表达的基因在肿瘤细胞中表达减少或不表达。因此，本发明提供了一种诊断癌症或癌症易感性的方法，其包括检测NDRG4/NDRG2亚家族基因的表观遗传沉默，其中NDRG2/NDRG4家族基因的表观遗传沉默通过测量所述基因的表达水平来确定，其中所述基因表达的减少指示癌症或癌症易感性。本发明还提供了一种检测样品中癌症(尤其是胃肠道癌，例如结直肠癌)易感性或发病的方法，其包括检测选自以下的至少一种基因的表观遗传变化：GATA4、OSMR、NDRG4(或NDRG4/NDRG2亚家族另一成员)、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC和MGMT，和/或TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3，其中表观遗传变化的检测是通过测量所述至少一种基因的表达水平来确定的，其中所述至少一种基因表达的低水平、降低水平或缺乏指示癌症(尤其是胃肠道癌，例如结直肠癌)的易感性或发病。

在使用血液(特别是血浆或血清)样品的实施方案中，所述至少一种基因可选自OSMR、SFRP1、NDRG4、GATA5、ADAM23、JPH3、SFRP2和APC，和/或选自TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3。这些基因也用于使用粪便测试样品的方案。TFPI2可以是一种尤其有用的标志物。当使用血浆样品时，特定的基因(例如选自TPFI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1和SOX17的基因)可能最为有用。对于粪便样品来说，基因例如GATA4、OSMR、NDRG4、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC和MGMT以及选自TFPI2、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3的基因可能是适用的。如下所示，这些基因为诊断血浆样品中结直肠癌提供了灵敏且特异的方法。本文中合适的组合包含OSMR、NDRG4、GATA5和ADAM23，或者基本由其组成或由其组成。更多组合在下文讨论。可使用所述基因组合来诊断早期结直肠癌，尤其是0-II期结直肠癌。

在使用组织样品的一些实施方案中，所述方法优选地包括检测基因组合(包含OSMR、GATA4和ADAM23，或OSMR、GATA4和GATA5)的表观遗传变化，或者基本由其组成或由其组成，其中在所述基因组合的至少一种基因中检出表观遗传变化指示胃肠道癌(例如结直肠癌)的易感性或发病。所述组织样品可包括例如结肠和/或直肠和/或阑尾样品，或者基本由其组成或由其组成。

如本文所述(该描述经必要修改也适用于此处)，在一些具体实施方案中，在样品中观察到选自以下的至少一种基因的蛋白表达完全丧失：NDRG2/NDRG4亚家族基因(尤其是NDRG4)、GATA4、OSMR、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3(采用包括本文所述之组合在内的所有排列组合)，得以诊断出癌症(特别是胃肠道癌，例如结直肠癌)或癌症(特别是胃肠道癌，例如结直肠癌)的易感性，或者根据本发明的其它方法确定最佳治疗方案。然而，由于相应的一种或多种基因的甲基化造成的至少一种选自以下之基因的表达部分丧失也可以是相关的：NDRG2/NDRG4亚家族基因(尤其是NDRG4)、GATA4、OSMR、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3(采用包括本文所述之组合在内的所有排列组合)。

必要时，可测量选自以下之至少一种基因的表达水平的降低以确定其在该样品中是否具有统计学显著性：NDRG2/NDRG4亚家族基因(尤其是NDRG4)、GATA4、OSMR、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3(采用包括本文所述之组合在内的所有排列组合)。这有助于为本发明的方法提供可靠的测试。可使用测定选自以下之至少一种基因的表达水平是否显著降低的任何方法：NDRG2/NDRG4亚家族基因(尤其是NDRG4)、GATA4、OSMR、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3(采用包括本文所述之组合在内的所有排列组合)。此类方法是本领域熟知且常规使用的。例如，可以进行统计分析。一个实例涉及方差检验分析。当确定相对表达或活性是否具有统计学显著性时，该方法中使用的典型P值可以为P值＜0.05或0.01或0.001。例如，如果至少有10％的减少，则表达的变化可被视为是显著的。通过使所述变化为例如至少15％、20％、25％、30％、35％、40％或50％来使所述测试可具有更多选择性，从而被认为是统计学显著的。

在本发明方法的一个具体实施方案中，参照对照样品来测定选自以下之至少一种基因的表达水平或活性的降低：NDRG2/NDRG4亚家族基因(尤其是NDRG4)、GATA4、OSMR、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3(采用包括本文所述之组合在内的所有排列组合)。优选地，所述对照样品取自该患者的正常(即非瘤)组织，其中对应的一种或多种基因的表达是正常的。作为补充或作为替代地，还可使用如下的对照样品，已知其中缺乏选自以下的至少一种基因的表达：NDRG2/NDRG4亚家族基因(尤其是NDRG4)、GATA4、OSMR、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3(采用包括本文所述之组合在内的所有排列组合)。

还可包括其它合适的对照以确保测试正常进行，例如在测试样品和对照样品中测量适当参照基因的表达水平或活性。适用于本发明的参照基因包括β-肌动蛋白、3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、核糖体RNA基因(例如18S核糖体RNA)和RNA聚合酶II基因(Radonic A.等，Biochem Biophys Res Commun.2004年1月23日；313(4)：856-62)。在一些具体实施方案中，所述参照基因是β-肌动蛋白。

可以在RNA水平或在蛋白质水平测量核酸的表达。可将测试样品中的细胞裂解，进而测定该裂解物中、或者从该裂解物纯化或半纯化的RNA中的mRNA水平。或者，可使用采用未经裂解的组织或细胞悬液的方法。用于在RNA水平上测定选自以下之至少一种基因的表达的合适方法是本领域熟知的且在本文已有描述：NDRG2/NDRG4亚家族基因(尤其是NDRG4)、GATA4、OSMR、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3(采用包括本文所述之组合在内的所有排列组合)。

可采用将核酸探针与选自以下之至少一种基因的相应转录物杂交的方法来测量各mRNA的存在和/或水平：NDRG2/NDRG4亚家族基因(尤其是NDRG4)、GATA4、OSMR、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3(采用包括本文所述之组合在内的所有排列组合)。此类方法是本领域所熟知的，其包括利用核酸探针阵列(微阵列技术)和Northern印迹。基因组技术的进步已允许同时分析数以千计的基因，尽管许多技术仍是基于同样的特异性探针-靶标杂交的构思。或者可选择基于测序的方法。这些方法起初使用表达序列标签(EST)，而现在包括基于短标签的方法，例如基因表达系列分析(SAGE)和大规模平行信号测序(massively parallel signaturesequencing，MPSS)。差异显示技术提供了另一分析基因表达的手段/工具；该系列的技术是基于限制性酶切产生的cDNA片段的随机扩增，两种组织之间的差异条带可鉴别出目标cDNA。

在一些实施方案中，使用逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)来测定选自以下的至少一种基因的基因表达水平：NDRG2/NDRG4亚家族基因(尤其是NDRG4)、GATA4、OSMR、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3(采用包括本文所述之组合在内的所有排列组合)。RT-PCR是本领域熟知的技术，其依靠逆转录酶将mRNA逆转录形成cDNA，然后通过标准PCR反应对所述cDNA进行扩增。进行RT-PCR的操作方法和试剂盒是本领域熟知的，且可从商家购得。

在一个实施方案中，提供了针对NDRG4基因的RT-PCR中可用的引物。这些引物包含以下序列，或者基本由其组成或由其组成：

SEQ ID NO：15’-cctgaggagaagccgctg-3’(正向)

SEQ ID NO：25’-atgtcatgttccttccagtctgt-3’(反向)

SEQ ID NO：35’-GGCCTTCTGCATGTAGTGATCCG-3’(正向)

SEQ ID NO：45’-GGTGATCTCCTGCATGTCCTCG-3’(反向)

本文定义的这些引物的变体(其定义已作必要修改)也包含在本发明的范围内。

所述RT-PCR可以非定量的方式进行。终点RT-PCR通过三种不同方式(相对的、竞争性的和比较的)来测量表达水平的变化。这些传统的方法是本领域所熟知的。作为替代，以实时和/或定量的方式来进行RT-PCR。实时定量RT-PCR已在文献中充分描述(参见Gibson等描述的该技术的早期实例)，并且可存在多种相关技术。实例包括使用水解探针(Taqman)、发夹探针(Molecular Beacons)、FRET探针对(LightCycler(Roche))、整合有发夹探针的引物(Scorpion)、发夹引物(Plexor和Amplifluor)、DzyNA和寡核苷酸阻断系统。所有这些系统均可购得并被充分表征，并且可允许多重分析(即，在一个样品中测定多种基因的表达)。

TAQMAN是最早可应用的实时PCR技术之一，其利用PCR反应中结合于上游和下游引物结合位点之间的探针来实现。TAQMAN探针包含5’荧光团和3’猝灭剂部分。因而，当探针结合到其DNA结合位点时，由于猝灭剂接近荧光团，所述探针不发荧光。在扩增过程中，如果探针与被扩增的DNA链结合，则合适的聚合酶(例如Taq)的5’-3’外切核酸酶活性使该探针酶解。这种探针水解导致荧光团的易位。荧光团的释放意味着其不再接近于猝灭剂部分，从而使得荧光团发出荧光。可以测量由此产生的荧光，其与进行扩增的靶序列的数量成正比。有时这些探针一般被称为“水解探针”。

在分子信标系统中，探针也被设计成结合在引物结合位点之间。然而，这里的探针是发夹形的探针。当其未与靶序列结合时，探针中的发夹意味着探针一端连接的荧光团与另一端连接的猝灭剂非常接近，因而发生内部猝灭。只有当PCR扩增过程中合成了探针所对应的靶序列，才使探针打开折叠并结合到对应的序列上。探针的环状部分作为探针本身，而茎是由互补的臂序列(各自的末端连有荧基团和猝灭剂部分)形成。当使用所述信标探针检测其靶标时，其经历了使茎分开的构象变化，这使得荧光团和猝灭剂分隔开。这导致向猝灭剂的能量转移中断从而恢复发荧光。

在变性步骤期间，所述分子信标呈现随机卷曲的构型并发出荧光。随着温度降低，使引物得以退火，茎杂交物迅速形成从而阻止发出荧光。然而，在退火温度下，分子信标还与扩增子结合，进行构象再组织(conformational reorganisation)，从而产生荧光。当温度提高以使引物延伸时，所述分子信标从其靶标上解离，并不干扰聚合反应。新的杂交发生在每个循环的退火步骤中，所产生荧光的强度指示所积累扩增子的量。

Scorpion引物是基于与分子信标同样的原则。然而，此时所述探针结合于扩增引物并形成其组成部分。该探针在其5’端具有阻断基团以防止通过探针序列进行扩增。使用这种引物经过一轮扩增之后，生成了该探针的靶序列，并且该探针与其结合。因此，“Scorpion”的名称源于这样的事实，即探针作为扩增产物的一部分与其靶序列内部杂交，因而形成尾巴型结构。探针-靶标的结合在动力学上优于链内二级结构。Scorpion引物首次描述于文献“Detection of PCR products usingself-probing amplicons and fluoresence”(Nature Biotechnology.17，804-807页(1999))，随后得到了许多以此为基础的变体。

与Scorpion引物的方式类似，Amplifluor引物依赖于将分子信标型探针整合到引物上。同样，该探针的发夹结构形成扩增引物本身的一部分。然而，与Scorpion型引物不同的是，所述探针的5’端没有用以防止其扩增并形成扩增产物一部分的阻断物。因此，该引物结合到模板链并指导合成互补链。所以，在第一轮扩增反应中所述引物成为扩增产物的一部分。当合成互补链时，扩增反应经过发夹结构而进行。这样就使荧基团和猝灭分子分隔开，从而随着扩增的进行产生荧光。

DzyNA引物整合了含有10-23个核苷酸的脱氧核酶(DNAzyme)的互补/反义序列。在扩增过程中，所产生的扩增子包含脱氧核酶的活性(有义)拷贝，所述脱氧核酶切割反应混合物中含有的报告底物。在PCR/扩增过程中积累的扩增子可以通过由整合到所述报告底物内脱氧核酶切割位点两端的荧光团和猝灭剂染料分子分隔开而产生的荧光变化进行实时监测。所述脱氧核酶和报告底物序列可以是通用的，因此可适于与靶向不同基因或转录物的引物组一起使用(Todd等，ClinicalChemistry 46：5，625-630(2000))。

Plexor^TM qPCR和qRT-PCR系统利用两种经修饰核苷酸之间的特异性相互作用来实现定量PCR分析。其中一个PCR引物在邻接于5’末端iso-dC残基处含有荧光标记。另一个PCR引物未作标记。反应混合物包含脱氧核苷酸和用猝灭剂dabcyl修饰的iso-dGTP。Dabcyl-iso-dGTP优选地整合到与iso-dC残基互补的位置。Dabcyl-iso-dGTP在该位置的整合导致互补链上荧光染料的猝灭和荧光强度降低，这容许在扩增过程中进行定量。对于多重反应来说，针对每个靶序列使用带有不同荧光团的引物对。

本发明使用的实时定量技术一般产生可持续监测的荧光读数。荧光信号由特异性针对双链DNA的染料(例如SYBR Green)产生，或由荧光标记的序列特异性寡核苷酸引物或探针产生。可使用不同的荧光团标记每种引物或探针以进行特异性检测。这些实时定量技术是有优势的，因为它们使反应在“单管”中进行。这意味着不需要为了取得结果而进行下游分析，从而更加迅速地得到结果。此外，使反应在“单管”环境中进行降低了交叉污染的风险，并使本发明的方法得到定量结果。这对本发明用于临床可能尤其重要。

应当指出的是，虽然PCR(包括建立于基础技术上的变型方法(如巢式PCR))是一种优选的扩增方法，等效的方法也可涵盖在本发明的范围内。实例包括但不限于等温扩增技术，例如NASBA、3SR、TMA和三重扩增(triamplification)，所有这些都是本领域熟知且市售的。其它合适的扩增方法包括但不限于连接酶链式反应(LCR)(Barringer等，1990)、MLPA、选择性扩增靶多核苷酸序列(美国专利No.6,410,276)、共有序列引物聚合酶链式反应(美国专利No.4,437,975)、入侵者技术(invader technology)(Third Wave Technologies，Madison，WI)、链置换技术、任意引物聚合酶链式反应(WO90/06995)和缺口置换扩增(WO2004/067726)。

检测至少一种基因(选自NDRG2/NDRG4亚家族基因(尤其是NDRG4)、GATA4、OSMR、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3(采用包括本文所述之组合在内的所有排列组合))在蛋白质水平上的表达的合适方法也是本领域技术人员熟知的。实例包括Western印迹、免疫组化染色和免疫定位、免疫荧光、酶联免疫吸附测定(ELISA)、免疫沉淀测定、补体结合测定、凝集反应、放射免疫测定、流式细胞术、质谱分析法和平衡透析法。这些方法通常依赖于特异性鉴定适当基因产物的试剂。可使用任何合适的试剂，例如凝集素、受体、核酸、抗体等。所述试剂优选为抗体，可包括单克隆或多克隆抗体。还可使用抗体的片段和衍生物，其包括但不限于保留了基因产物结合功能的Fab片段、ScFv、单结构域抗体、纳米抗体(nano-antibody)、重链抗体、适配体(aptamer)等。根据本发明，可采用任何检测方法。可通过一系列方法(包括例如SDS-PAGE和氨基酸测序)基于电荷、极性、氨基酸序列等来鉴定蛋白质。所述试剂的性质不限，但其必须能够特异地鉴定适当的基因产物。

当然，在癌症(尤其是胃肠道癌，例如结直肠癌)阳性诊断的情形中，所述相关蛋白质水平将会降低，或可能完全没有。在一个实施方案中，如果所述蛋白质特异性试剂与野生型或全长蛋白结合的话，将会得到阴性结果。在这种情况下，使用适当的对照可确保不会误诊，例如因试剂降解或非特异性造成的误诊。因此，可以使用同样的试剂对如下样品进行测试，已知所述样品在蛋白质水平表达至少一种基因(选自NDRG2/NDRG4亚家族基因(尤其是NDRG4)、GATA4、OSMR、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3(采用包括本文所述之组合在内的所有排列组合))。在此对照样品中的阳性结果加上所测试样品中的阴性结果提供了可信的癌症诊断，并排除了任何对试剂质量的疑虑。

测量基因表达本身可能不一定表示沉默是表观遗传的，因为沉默的机制可以是基因性质的，例如由体细胞突变引起。因此，在一个实施方案中，本发明的方法整合了适当的再次表达测定(re-expression assy)，其用于逆转表观遗传沉默。使用去甲基化试剂(例如DNA-甲基转移酶(DMT)抑制剂)适当地处理样品可以逆转相关基因的表观遗传沉默。合适的试剂包括但不限于：DAC(5’-氮杂脱氧胞苷(5’-deazacytidine))、TSA或任何其它影响细胞系中所存在表观遗传机制的处理。本文讨论的合适试剂是就发明的药理遗传学和治疗方面而论的，其讨论已经必要修改。通常，在使用这些试剂处理后表达被再次激活或逆转，表明沉默是表观遗传的。

如在实验部分中所讨论的，表观遗传沉默导致NDRG4/NDRG2亚家族基因表达降低已显示存在于一系列胃肠道癌(例如结直肠癌和胃癌)中。因此，在一个实施方案中，本发明提供了诊断结直肠癌和/或胃癌或本文定义的其它胃肠道癌的方法，或诊断结直肠癌和/或胃癌或本文定义的其它胃肠道癌易感性的方法，其包括检测NDRG4/NDRG2亚家族基因的表观遗传沉默，其中NDRG2/NDRG4家族基因的表观遗传沉默通过测量所述基因的表达水平来确定，其中基因表达的降低指示结直肠癌和/或胃癌或本文定义的其它胃肠道癌，或结直肠癌和/或胃癌或本文定义的其它胃肠道癌的易感性，或腺瘤向癌的发展。优选地，所述基因是NDRG2，或NDRG4，或NDRG2和NDRG4的组合。

如在实验部分举例说明，导致所述至少一种基因(选自GATA4、OSMR、NDRG4、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3)表达降低的表观遗传沉默已显示与胃肠道癌(特别是结直肠癌)的发病存在灵敏且特异的联系。因此，在另一实施方案中，本发明提供了一种诊断胃肠道癌(特别是结直肠癌)或胃肠道癌(特别是结直肠癌)易感性的方法，其包括检测至少一种基因(选自GATA4、OSMR、NDRG4、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3)的表观遗传沉默，其中所述至少一种基因(选自GATA4、OSMR、NDRG4、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3)的表观遗传沉默通过测量所述基因的表达水平来确定，其中所述基因表达减少指示胃肠道癌(特别是结直肠癌)，或胃肠道癌(特别是结直肠癌)的易感性，或腺瘤向癌的发展。当使用粪便试验样品时，这些标志物可被有效采用。

正如实验部分讨论的，在特定组织和体液(例如粪便和血源样品)中，导致所述至少一种基因(选自GATA4、OSMR、NDRG4、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC和MGMT)表达降低的表观遗传沉默已显示与结直肠癌的发病存在灵敏且特异的联系。因此，在一个具体实施方案中，本发明提供了一种诊断胃肠道癌(特别是结直肠癌)或胃肠道癌(特别是结直肠癌)易感性的方法，其包括检测组织、粪便或血液(血浆或血清)样品或其衍生物中至少一种基因(选自GATA4、OSMR、NDRG4、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC和MGMT)的表观遗传沉默，其中所述至少一种基因(选自GATA4、OSMR、NDRG4、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC和MGMT)的表观遗传沉默通过测量所述基因的表达水平来确定，其中所述基因表达减少指示胃肠道癌(特别是结直肠癌)，或胃肠道癌(特别是结直肠癌)的易感性，或腺瘤向癌的发展。如上所述，当使用血浆或血清样品时，所述至少一种基因可选自OSMR、SFRP1、NDRG4、GATA5、ADAM23、JPH3、SFRP2和APC。

在一些替代性和补充性的实施方案中，尤其是在使用体液样品(如粪便和血浆)的情况下，所述至少一种基因可选自TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3。基因组合可选自本文所期望和所讨论的本发明的这些基因和其它基因。本文首次提出了粪便和血浆样中这些基因的甲基化与结直肠癌有关。在血浆和粪便样品中提供良好的灵敏度和特异性水平的特别有用的标志物包括TFPI2、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3。TFPI2可以尤其有用。当测试血浆样品时，某些基因例如选自TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1和SOX17的基因可被证明是最有用的。该讨论酌情适用于本发明的所有方面。

需要指出，还可测定额外基因的表达以作为本发明方法的补充。事实上，任何如本文定义的参与癌症(特别是胃肠道癌，例如结直肠癌、胃癌和/或食道癌)确定的基因均可与本发明方法中所述至少一种基因(选自NDRG2/NDRG4亚家族基因(尤其是NDRG4)、GATA4、OSMR、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3(采用包括本文所述之组合在内的所有排列组合))联合使用。在某些实施方案中，所述至少一种基因(选自NDRG2/NDRG4亚家族基因(尤其是NDRG4)、GATA4、OSMR、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3(采用包括本文所述之组合在内的所有排列组合))的表达水平与参与癌症确定的至少一种其它基因联合分析。在一个实施方案中，所述至少一种基因(选自NDRG2/NDRG4亚家族基因(尤其是NDRG4)、GATA4、OSMR、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3(采用包括本文所述之组合在内的所有排列组合))与参与癌症确定的至少两种其它基因联合使用。在另一个实施方案中，所述至少一种基因(选自NDRG2/NDRG4亚家族基因(尤其是NDRG4)、GATA4、OSMR、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3(采用包括本文所述之组合在内的所有排列组合))与参与癌症确定的至少三种、四种、五种或六种其它的基因联合使用。参与癌症(结直肠癌)确定的其它基因可选自CHFR、p16、波形蛋白(Vimentin)、p14、RASSF1a、RAB32、SEPTIN-9、RASSF2A、TMEFF2、NGFR和SMARCA3。

因为所述至少一种基因(选自NDRG2/NDRG4亚家族基因(尤其是NDRG4)、GATA4、OSMR、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPT2、BNTP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3(采用包括本文所述之组合在内的所有排列组合))的表观遗传沉默以所述基因甲基化的方式自我显现，本发明的方法优选包括检测基因的甲基化。因此，本发明提供了一种诊断癌症(特别是胃肠道癌，如结直肠癌)或癌症易感性的方法，其包括检测至少一种基因(选自NDRG2/NDRG4亚家族基因(尤其是NDRG4)、GATA4、OSMR、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3(采用包括本文所述之组合在内的所有排列组合))的表观遗传沉默，其中所述至少一种基因的表观遗传沉默通过测定至少一种基因的甲基化状态来检测，其中所述至少一种基因的甲基化指示如上定义的癌症(尤其是胃肠道癌，例如结直肠癌)或其易感性。

在使用血液(特别是血浆或血清样品)的一些实施方案中，所述至少一种基因可选自OSMR、SFRP1、NDRG4、GATA5、ADAM23、JPH3、SFRP2和APC。如下所示，这些基因提供了灵敏且特异的在血浆样品中诊断结直肠癌的方法。本文中合适的基因组合包含OSMR、NDRG4、GATA5和ADAM23，或者基本由其组成或由其组成。这可用于诊断早期结直肠癌，特别是0-II期结直肠癌。作为补充或者作为替代地，所述至少一种基因可选自TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3，例如选自TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1和SOX17，特别是TFPI2。

在使用组织样品的一些实施方案中，所述方法可包括检测基因组合(包含OSMR、GATA4和ADAM23，或者OSMR、GATA4和GATA5)的表观遗传变化，或者基本由其组成或由其组成，其中在所述组合中检出至少一种基因表观遗传变化指示结直肠癌的易感性或发病。所述组织样品可包括结肠和/或直肠和/或阑尾样品，或者基本由其组成或由其组成。

在使用粪便样品的一些实施方案中，所述至少一种基因可选自GATA4、OSMR、NDRG4、GATA5、SERP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC和MGMT。作为补充或者作为替代地，所述至少一种基因可选自TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3，例如选自TFPI2、FOXE1、SYNE1、SOZ17、PHACTR3和JAM3，特别是TFPI2。选自上述基因的两种、三种、四种、五种或六种等基因组合也在本发明范围中。

易甲基化的CpG二核苷酸通常集中在人类基因的启动子区域、外显子和内含子中。可评价启动子、外显子和内含子区域的甲基化。在一个实施方案中，测定所述至少一种基因(选自NDRG2/NDRG4亚家族基因(尤其是NDRG4)、GATA4、OSMR、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3(采用包括本文所述之组合在内的所有排列组合))启动子区域的甲基化状态。“启动子”是典型地从转录起始位点向上游延伸约1Kb、500bp或150bp～300bp的区域。通常，分析所述至少一种基因(选自NDRG2/NDRG4亚家族基因(尤其是NDRG4)、GATA4、OSMR、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3(采用包括本文所述之组合在内的所有排列组合))转录起始位点周围或附近的CpG岛并测定其甲基化状态。或者，可酌情测定所述至少一种基因(选自NDRG2/NDRG4亚家族基因(尤其是NDRG4)、GATA4、OSMR、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3(采用包括本文所述之组合在内的所有排列组合))的外显子和/或内含子区域的甲基化状态。

在本发明方法的一个实施方案中，分析NDRG4基因启动子区域的甲基化状态。在另一实施方案中，分析NDRG2基因启动子区域的甲基化状态。或者，同时分析NDRG2和NDRG4的启动子区域。

在一个实施方案中，分析NDRG4/NDRG2亚家族基因的区域，其包含如SEQ ID NO：524所示的NDRG4核苷酸序列(图3a)和/或如SEQ ID NO：525所示的NDRG2核苷酸序列(图3b)，或者基本由其组成或由其组成，以确定其甲基化状态。

本领域已知多种可用于本发明中的甲基化检测方法。这些测定依赖于两种不同的方法：基于亚硫酸氢盐转换的方法和不基于亚硫酸氢盐的方法。不基于亚硫酸氢盐分析DNA甲基化的方法依赖于甲基化敏感的酶无法限制性切割甲基化胞嘧啶。所述亚硫酸氢盐转换依赖于使用亚硫酸氢钠处理DNA样品，其可将未甲基化的胞嘧啶转换为尿嘧啶，而甲基化胞嘧啶则保持不变(Furuichi等，1970)。这种转换导致DNA原始序列的改变。DNA甲基化分析已通过使用多种技术而成功实现，包括：测序、甲基化特异性PCR(MS-PCR)、解链曲线甲基化特异性PCR(McMS-PCR)、使用或不使用MLPA的亚硫酸氢盐处理、QAMA(Zeschnigk等，2004)、MSRE-PCR(Melnikov等，2005)、MethyLight(Eads等，2000)、ConLight-MSP(Rand等，2002)、亚硫酸氢盐转换特异性甲基化特异性PCR(BS-MSP)(Sasaki等，2003)、COBRA(其依赖于使用限制性酶以揭示在亚硫酸氢盐处理的PCR产物DNA中甲基化依赖的序列差异)、甲基化敏感的单核苷酸引物延伸构象(MS-SNuPE)、甲基化敏感的单链构象分析(MS-SSCA)、结合亚硫酸氢盐限制性分析的解链曲线(McCOBRA)(Akey等，2002)、PyroMethA、HeavyMethyl(Cottrell等，2004)、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)、MassARRAY、甲基化等位基因的定量分析(QAMA)、酶促局部甲基化测定(ERMA)、QBSUPT、MethylQuant、定量PCR测序和基于寡核苷酸的微阵列系统、焦磷酸测序、Meth-DOP-PCR。一些有用技术的综述参见Nucleic acids research，1998，第26卷，No.10，2255-2264；Nature Reviews，2003，第3卷，253-266；Oral Oncology，2006，第42卷，5-13，其通过引用以整体并入本文中。可根据本发明酌情使用任意这些技术。

另一些识别甲基化CpG二核苷酸的方法利用MeCP2蛋白的甲基结合结构域(MBD)的选择性结合甲基化DNA序列的能力(Cross等，1994；Shiraishi等，1999)。或者，所述MBD可从MBP、MBP2、MBP4或poly-MBD获得(Jorgensen等，2006)。在一个方法中，将限制性核酸外切酶消化的基因组DNA加样于表达的His标签甲基-CpG结合结构域(其固定于固体基质)上，用于制备型柱层析以分离高度甲基化的DNA序列。这种甲基化DNA的富集步骤可作为本发明方法的补充。用于检测甲基化CpG岛的另一些方法是本领域所熟知的，包括甲基化CpG岛复原测定(methylated-CpG island recovery assay，MIRA)。需要时，任意这些方法均可用于本发明。

在一些具体的实施方案中，所述至少一种基因(选自NDRG2/NDRG4亚家族基因(尤其是NDRG4)、GATA4、OSMR、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3(采用包括本文所述之组合在内的所有排列组合))(或其部分，尤其是如本文讨论的CpG岛)的甲基化状态通过利用甲基化特异性PCR(MSP)或等效的扩增技术来测定。所述MSP技术对本领域技术人员来说是熟悉的。在所述MSP方法中，可使用设计成可区分甲基化与未甲基化DNA的引物对来扩增DNA，其利用由亚硫酸氢钠处理导致的序列变化(Herman等，1996；以及WO 97/46705)。

MSP技术的一个具体实例是实时定量MSP(QMSP)，其允许甲基化DNA的可靠的实时定量。这些方法通常是基于对扩增过程的连续光学监测并使用荧光标记的试剂，可对掺入产物中的荧光标记试剂进行定量，其量指示该序列在模板中的拷贝数。一种这样的试剂是称为SYBRGreen I的荧光染料，其优先结合双链DNA，通过结合双链DNA使其荧光显著增强。或者，可使用经标记的引物和/或经标记的探针。如本文更详细描述地，它们代表公知且市售的实时扩增技术的具体应用，例如水解探针发夹探针(MOLECULAR

)、发夹引物

整合有发夹探针的引物

寡核苷酸阻断物(例如HeavyMethyl技术)和掺入脱氧核酶之互补序列的引物

两种经修饰核苷酸之间的特异性相互作用(Plexor^TM)等。通常，这些实时方法与聚合酶链式反应(PCR)一起使用。在描述于例如WO02/072880中的Heavymethyl中，引发是甲基化特异性的，但是不能延伸的寡核苷酸阻断物而非引物本身提供了这种特异性。所述阻断物以甲基化特异性的方式结合经亚硫酸氢盐处理的DNA，它们的结合位点与引物结合位点重叠。当阻断物结合后，所述引物不能结合并因此不产生扩增子。在本发明的方法中，Heavymethyl可以与实时或终点检测联合使用。

因此，在一些具体的实施方案中，所述至少一种基因(选自NDRG2/NDRG4亚家族基因(尤其是NDRG4)、GATA4、OSMR、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3(采用包括本文所述之组合在内的所有排列组合))的甲基化状态通过甲基化特异性PCR/扩增(优选实时甲基化特异性PCR/扩增)来测定。在一些具体的实施方案中，所述实时PCR/扩增包括使用发夹引物(Amplifluor)/发夹探针(Molecular Beacons)/水解探针(Taqman)/FRET探针对(Lightcycler)/整合发夹探针的引物(Scorpion)/整合脱氧核酶(其切割反应混合物中的报告底物)之互补序列的引物

/荧光染料(SYBR Green等)/寡核苷酸阻断物/两种经修饰核苷酸之间的特异性相互作用(Plexor)。引物和/或探针可用于研究所述至少一种基因的甲基化状态。

实时PCR检测反应过程中扩增子的积累。然而，并非必须使用实时方法。许多应用不需要定量，而实时PCR主要用作方便地显示及储存结果的工具，同时避免了PCR之后的处理。所进行的分析可仅用于了解样品中是否存在靶DNA。终点检验在扩增反应完成后进行。这种方法可用于医学诊断实验室中以检测患者的癌症易感性或发病。在大多数此类情况下，对DNA模板定量不是非常重要。可以仅仅将扩增产物在合适的凝胶(例如琼脂糖凝胶)中电泳以确定是否存在预期大小的产物。这可涉及使用例如溴化乙锭(ethidium bromide)染色以及在紫外线透射仪下使DNA条带显像。或者，可测量荧光或能量转移来测定甲基化DNA的存在。终点PCR荧光检测技术可以使用与广泛用于实时PCR中的相同的方法：TaqMan测定、分子信标、Scorpion、Amplifluor等。例如，《基因》检测器允许在PCR管中直接测量荧光。

在实时方法的一些实施方案中，定量可以采用绝对基础，或者可以相对于组成型甲基化DNA标准，或者可以相对于未甲基化的DNA标准。甲基化状态可通过使用所研究标志物的信号与参照基因的信号之间的比值来测定(其中参照基因(例如β-肌动蛋白)中的甲基化状态是已知的)，或者通过使用所述甲基化标志物和甲基化及非甲基化标志物的总和之间的比值来测定。或者，可测定甲基化标志物基因的绝对拷贝数。本发明合适的参照基因包括β-肌动蛋白、3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)、核糖体RNA基因(例如18S核糖体RNA)和RNA聚合酶II基因(Radonic A.等，Biochem Biophys Res Commun.2004年1月23日；313(4)：856-62)。在一个特别优选的实施方案中，所述参照基因是β-肌动蛋白。

在一个实施方案中，将每个临床样品测量两次，并计算二者的C_t值(扩增曲线与阈值交叉时的循环数，所述阈值由相关软件自动设置)和拷贝数。使用(针对每个基因的)全部两个拷贝数的平均值对结果进行分类。为了对每个样品的最后结果定量，使用了两条标准曲线，一条针对参照基因(例如β-肌动蛋白或非甲基化标志物)，一条针对甲基化的标志物。所有临床样品的结果(当甲基化基因(m-Gene)可检测时)表示为“甲基化基因拷贝数”/“参照基因拷贝数”或者“甲基化基因拷贝数”/“未甲基化基因(u-Gene)拷贝数+甲基化基因拷贝数”比值的1000倍，然后据此分类(甲基化、非甲基化或无效)(u＝未甲基化；m＝甲基化)。

在一个实施方案中，提供了用于在NDRG4基因启动子区域进行MSP的引物。这些引物包含以下序列，或者基本由其组成或由其组成：

表2

SEQIDNO.	NDRG4	引物	有义引物	SEQIDNO.	反义引物	退火温度	PCR循环数
								5	引物组1	Flank	GGTTYGTTYGGGATTAGTTTTAGG	6	CRAACAACCAAAAACCCCTC	56	35
7	引物组1	U	GATTAGTTTTAGGTTTGGTATTGTTTTGT	8	AAAACCAAACTAAAAACAATACACCA	66	25
								9	引物组1	M	TTTAGGTTCGGTATCGTTTCGC	10	CGAACTAAAAACGATACGCCG	66	25
11	引物组2	Flank	ATYGGGGTGTTTTTTAGGTTT	12	ATACCRAACCTAAAACTAATCCC	56	35
								13	引物组2	U	GGGTGTTTTTTAGGTTTCGCGTCGC	14	CCTAAAACTAATCCCAAACAAACCA	66	30
15	引物组2	M	TTTTTTAGGTTTCGCGTCGC	16	AAACTAATCCCGAACGAACCG	66	30

其中“Flank”＝侧翼引物

“U”＝未甲基化NDRG4的特异性引物

“M”＝甲基化NDRG4的特异性引物

引物组1特别适用于预测腺瘤的进展。引物组2可提供略微更灵敏的结果，尽管这两组引物均是明显适用的。

在另一实施方案中，提供了适用于在NDRG4基因(的启动子区域)进行定量MSP的引物和探针。这些引物和探针包含以下序列，或者基本由其组成或由其组成：

SEQ ID NO：17 5′-GTATTTTAGTCGCGTAGAAGGC-3′(正向引物)

SEQ ID NO：18 5′-AATTTAACGAATATAAACGCTCGAC-3′(反向引物)以及

SEQ ID NO：19 5′-FAM-CGACATGCCCGAACGAACCGCGATCCCTGCATGTCG-3’-DABCYL(分子信标探针)

这些引物和探针的更多特征总结在实验部分中。

在另一实施方案中，提供了适用于在NDRG2基因启动子区域进行MSP的引物。这些引物包含以下序列，或者基本由其组成或由其组成：

侧翼引物：

SEQ ID NO：20 5′-YGTTTTTTATTTATAGYGGTTTTT-3′(上游侧翼)

SEQ ID NO：21 5′-TCCTAATACCTCTCCTCTCTTTACTAC-3′(下游侧翼)

未甲基化NDRG2的特异性引物：

SEQ ID NO：22 5′-TTTTATTTATAGTGGTTTTTTGTATTTTTT-3′(有义)

SEQ ID NO：23 5′-TGTCCTCTCTTTACTAGATCCCAACA-3′(反义)

甲基化NDRG2的特异性引物：

SEQ ID NO：24 5′-TTTATAGCGGTTTTTCGTATTTTTC-3′(有义)

SEQ ID NO：25 5′-CCTCTCTTTACTACGTCCCGACG-3′(反义)。

在一个实施方案中，提供了用于测定至少一种基因(选自GATA4、OSMR、NDRG4、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC和MGMT)甲基化状态的引物和/或探针(在所述至少一种基因(选自GATA4、OSMR、NDRG4、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC和MGMT)的启动子区域上进行)。这些引物和/或探针包含以下序列，或者基本由其组成或由其组成：

表3.引物序列和分子信标(探针)序列

SEQIDNO.
				26	β-肌动蛋白	正向引物	5′-TAGGGAGTATATAGGTTGGGGAAGTT-3′
27		反向引物	5′-AACACACAATAACAAACACAAATTCAC-3′
				28		分子信标	5′-FAM-CGACTGCGTGTGGGGTGGTGATGGAGGAGGTTTAGGCAGTCG-3′-DABCYL
29	GATA4	正向引物	5′-AGGTTAGTTAGCGTTTTAGGGTC-3′
				30		反向引物	5′-ACGACGACGAAACCTCTCG-3′
31		分子信标	5′-FAM-CGACATGCCTCGCGACTCGAATCCCCGACCCAGCATGTCG-3′-DABCYL
				32	GATA5	正向引物	5′-AGTTCGTTTTTAGGTTAGTTTTCGGC-3′
33		反向引物	5′-CCAATACAACTAAACGAACGAACCG-3′
				34		分子信标	5′-FAM-CGACATGCGTAGGGAGGTAGAGGGTTCGGGATTCGTAGCATGTCG-3′-DABCYL
35	SFRP1	正向引物	5′-TGTAGTTTTCGGAGTTAGTGTCGCGC-3
				36		反向引物	5′-CCTACGATCGAAAACGACGCGAACG-3′
37		分子信标	5′-FAM-CGACATGCTCGGGAGTCGGGGCGTATTTAGTTCGTAGCGGCATGTCG-3′-DABCYL
				38	SFRP2	正向引物	5′-GGGTCGGAGTTTTTCGGAGTTGCGC-3′
39		反向引物	5′-CCGCTCTCTTCGCTAAATACGACTCG-3′
				40		分子信标	5′-FAM-CGACATGCGGTGTTTCGTTTTTTCGCGTTTTAGTCGTCGGGCATGTCG-3′-DABCYL
17	NDRG4	正向引物	5′-GTATTTTAGTCGCGTAGAAGGC-3′
				18		反向引物	5′-AATTTAACGAATATAAACGCTCGAC-3′
19		分子信标	5′-FAM-CGACATGCCCGAACGAACCGCGATCCCTGCATGTCG-3′-DABCYL
				41	APC	正向引物	5′-GAACCAAAACGCTCCCCAT-3′
42		反向引物	5′-TTATATGTCGGTTACGTGCGTTTATAT-3′
				43		分子信标	5′-FAM-CGTCTGCCCCGTCGAAAACCCGCCGATTAACGCAGACG-3′-DABCYL
44	ADAM23	正向引物	5′-GAAGGACGAGAAGTAGGCG-3′
				45		反向引物	5′-CTAACGAACTACAACCTTACCGA-3′
46		分子信标	5′-FAM-CGACATGCCCCCGACCCGCACGCCGCCCTGCATGTCG-3′-DABCYL
				47	OSMR(3)	正向引物	5′-TTTGGTCGGGGTAGGAGTAGC-3′
48		反向引物	5′-CGAACTTTACGAACGAACGAAC-3′
				49		分子信标	5′-FAM-CGACATGCCCGTACCCCGCGCGCAGCATGTCG-3′-DABCYL
47	OSMR(4)	正向引物	5′-TTTGGTCGGGGTAGGAGTAGC-3′
				50		反向引物	5′-AAAAACTTAAAAACCGAAAACTCG-3′
49		分子信标	5′-FAM-CGACATGCCCGTACCCCGCGCGCAGCATGTCG-3′-DABCYL
				51	JPH3	正向引物	5′-TTAGATTTCGTAAACGGTGAAAAC-3′
52		反向引物	5′-TCTCCTCCGAAAAACGCTC-3′
				53		分子信标	5′-FAM-CGTCTGCAACCGCCGACGACCGCGACGCAGACG-3′-DABCYL
54	MGMT	正向引物	5′-TTTCGACGTTCGTAGGTTTTCGC-3′
				55		反向引物	5′-GCACTCTTCCGAAAACGAAACG-3′
56		分子信标	5′-FAM-CGTCTCGCGTGCGTATCGTTTGCGATTTGGTGAGTGTTTGGGGCGAGACG-3′-DABCYL

在一些具体的实施方案中，本发明的方法采用或依赖或利用引物和/或探针(其选自包含下面表4所示核苷酸序列的引物和探针)以测定至少一种基因的甲基化状态。下表列出针对某些优选基因的特异性引物和探针组合，所述基因的甲基化状态可根据本发明的方法测定。

表4.引物序列和分子信标(探针)序列

SEQIDNO
				26	β-肌动蛋白	正向引物	5′-TAGGGAGTATATAGGTTGGGGAAGTT-3′
27		反向引物	5′-AACACACAATAACAAACACAAATTCAC-3′
				28		分子信标	5′-FAM-CGACTGCGTGTGGGGTGGTGATGGAGGAGGTTTAGGCAGTCG-3′-DABCYL
29	GATA4	正向引物	5′-AGGTTAGTTAGCGTTTTAGGGTC-3′
				30		反向引物	5′-ACGACGACGAAACCTCTCG-3′
31		分子信标	5′-FAM-CGACATGCCTCGCGACTCGAATCCCCGACCCAGCATGTCG-3′-DABCYL
				32	GATA5	正向引物	5′-AGTTCGTTTTTAGGTTAGTTTTCGGC-3′
33		反向引物	5′-CCAATACAACTAAACGAACGAACCG-3′
				34		分子信标	5′-FAM-CGACATGCGTAGGGAGGTAGAGGGTTCGGGATTCGTAGCATGTCG-3′-DABCYL
35	SFRP1	正向引物	5′-TGTAGTTTTCGGAGTTAGTGTCGCGC-3
				36		反向引物	5′-CCTACGATCGAAAACGACGCGAACG-3′
37		分子信标	5′-FAM-CGACATGCTCGGGAGTCGGGGCGTATTTAGTTCGTAGCGGCATGTCG-3′-DABCYL
				38	SFRP2	正向引物	5′-GGGTCGGAGTTTTTCGGAGTTGCGC-3′
39		反向引物	5′-CCGCTCTCTTCGCTAAATACGACTCG-3′
				40		分子信标	5′-FAM-GGACATGGGGTGTTTCGTTTTTTCGGGTTTTAGTCGTCGGGCATGTCG-3′-DABCYL
17	NDRG4	正向引物	5′-GTATTTTAGTCGCGTAGAAGGC-3′
				18		反向引物	5′-AATTTAACGAATATAAACGCTCGAC-3′
19		分子信标	5′-FAM-CGACATGCCCGAACGAACCGCGATCCCTGCATGTCG-3′-DABCYL
				41	APC	正向引物	5′-GAACCAAAACGCTCCCCAT-3′
42		反向引物	5′-TTATATGTCGGTTACGTGCGTTTATAT-3′
				43		分子信标	5′-FAM-CGTCTGCCCCGTCGAAAACCCGCCGATTAACGCAGACG-3′-DABCYL
44	ADAM23	正向引物	5′-GAAGGACGAGAAGTAGGCG-3′

45		反向引物	5′-CTAACGAACTACAACCTTACCGA-3′
				46		分子信标	5′-FAM-CGACATGCCCCCGACCCGCACGCCGCCCTGCATGTCG-3′-DABCYL
47	OSMR(3)	正向引物	5′-TTTGGTCGGGGTAGGAGTAGC-3′
				48		反向引物	5′-CGAACTTTACGAACGAACGAAC-3′
49		分子信标	5′-FAM-CGACATGCCCGTACCCCGCGCGCAGCATGTCG-3′-DABCYL
				47	OSMR(4)	正向引物	5′-TTTGGTCGGGGTAGGAGTAGC-3′
50		反向引物	5′-AAAAACTTAAAAACCGAAAACTCG-3′
				49		分子信标	5′-FAM-CGACATGCCCGTACCCCGCGCGCAGCATGTCG-3′-DABCYL
51	JPH3	正向引物	5′-TTAGATTTCGTAAACGGTGAAAAC-3′
				52		反向引物	5′-TCTCCTCCGAAAAACGCTC-3′
53		分子信标	5′-FAM-CGTCTGCAACCGCCGACGACCGCGACGCAGACG-3′-DABCYL
				54	MGMT	正向引物	5′-TTTCGACGTTCGTAGGTTTTCGC-3′
55		反向引物	5′-GCACTCTTCCGAAAACGAAACG-3′
				56		分子信标	5′-FAM-CGTCTCGCGTGCGTATCGTTTGCGATTTGGTGAGTGTTTGGGGCGAGACG-3′-DABCYL

在另一具体实施方案中，本发明的方法采用或依赖或利用引物和/或探针(选自包含下面表5所示的核苷酸序列的引物)以测定NDRG4的甲基化状态。下表列出用于测定该基因甲基化状态的特异性引物和探针组合，可根据该表选择所述引物对和相应探针。

表5.用于测定NDRG4甲基化状态的引物对和探针，并显示预计的扩增产物长度

在另一具体实施方案中，本发明的方法采用或依赖或利用引物(选自包含下面表6和表7所示的核苷酸序列的引物)以测定GATA5的甲基化状态。该表列出用于测定该基因甲基化状态的特异性引物组合，可根据该表选择所述引物对。表6还列出了可有利于(定量)检测GATA5甲基化状态的特异性探针，表7整合了Amplifluour序列，其使得所述引物成为发夹引物，从而有利于定量检测(如本文所详细讨论地)。

表6.用于测定GATA5甲基化状态的引物对和探针，并显示预计的扩增产物长度

表7.附加的测定设计：用于测定GATA5甲基化状态的引物和amplifluor序列，并显示预计的扩增产物长度。

在另一具体实施方案中，本发明的方法采用或依赖或利用引物(选自包含下面表8和表9所示的核苷酸序列的引物)以测定OSMR的甲基化状态。该表列出用于测定该基因甲基化状态的特异性引物组合，可根据该表选择所述引物对。表8还列出了可有利于(定量)检测OSMR甲基化状态的特异性探针，表9整合了Amplifluour序列，其使得所述引物成为发夹引物，从而有利于定量检测(如本文所详细讨论地)。

表8.用于测定OSMR甲基化状态的引物对和探针(分子信标)，并显示预计的扩增产物长度。

表9.附加的测定设计：用于测定OSMR甲基化状态的引物和amplifluor序列，并显示预计的扩增产物长度。

在另一具体实施方案中，本发明的方法采用或依赖或利用引物(选自包含下面表10所示的核苷酸序列的引物)以测定ADAM23的甲基化状态。下表列出用于测定该基因甲基化状态的特异性引物组合，可根据该表选择所述引物对。表6还列出了可有利于(定量)检测ADAM23甲基化状态的特异性探针。

表10.用于测定ADAM23甲基化状态的引物对和探针(分子信标)，并显示预计的扩增产物长度。

在另一具体实施方案中，本发明的方法采用或依赖或利用引物(选自包含下面表11所示的核苷酸序列的引物)以测定JPH3的甲基化状态。该表列出了用于测定该基因甲基化状态的特异性引物组合，可根据该表选择所述引物对。表11还列出了可有利于(定量)检测JPH3甲基化状态的特异性探针。

表11.用于测定JPH3甲基化状态的引物对和探针(分子信标)，并显示预计的扩增产物长度。

在一些具体的实施方案中，本发明的方法采用或依赖或利用引物和/或探针(选自包含下面表12所示的核苷酸序列的引物和探针)以测定至少一种基因的甲基化状态。该表列出了针对某些优选基因的特异性引物和探针组合，所述基因的甲基化状态可根据本发明的方法测定。

表12.引物序列和分子信标(探针)序列

在另一具体的实施方案中，本发明的方法采用或依赖或利用引物(选自包含下面表13所示的核苷酸序列的引物和分子信标)以测定BNIP3的甲基化状态。该表列出了用于测定该基因甲基化状态的特异性引物组合，可根据该表选择所述引物对。

表13.附加的测定设计：用于测定BNIP3甲基化状态的引物和探针序列，并显示预计的扩增产物长度。

在另一具体的实施方案中，本发明的方法采用或依赖或利用引物(选自包含下面表14所示的核苷酸序列的引物和分子信标)以测定FOXE1的甲基化状态。该表列出了用于测定该基因甲基化状态的特异性引物组合，可根据该表选择所述引物对。

表14.附加的测定设计：用于测定FOXE1甲基化状态的引物和探针序列，并显示预计的扩增产物长度。

在另一具体的实施方案中，本发明的方法采用或依赖或利用引物(选自包含下面表15所示的核苷酸序列的引物和分子信标)以测定JAM3的甲基化状态。该表列出了用于测定该基因甲基化状态的特异性引物组合，可根据该表选择所述引物对。

表15.附加的测定设计：用于测定JAM3甲基化状态的引物和探针序列，并显示预计的扩增产物长度。

在另一具体的实施方案中，本发明的方法采用或依赖或利用引物(选自包含下面表16所示的核苷酸序列的引物和分子信标)以测定PHACTR3的甲基化状态。该表列出了用于测定该基因甲基化状态的特异性引物组合，可根据该表选择所述引物对。

表16.附加的测定设计：用于测定PHACTR3甲基化状态的引物和探针序列，并显示预计的扩增产物长度。

在另一具体的实施方案中，本发明的方法采用或依赖或利用引物(选自包含下面表17所示的核苷酸序列的引物和分子信标)以测定TFPI2的甲基化状态。该表列出了用于测定该基因甲基化状态的特异性引物组合，可根据该表选择所述引物对。

表17.附加的测定设计：用于测定TFPI2甲基化状态的引物和探针序列，并显示预计的扩增产物长度。

在另一具体的实施方案中，本发明的方法采用或依赖或利用引物(选自包含下面表18所示的核苷酸序列的引物和分子信标)以测定SOX17的甲基化状态。该表列出了用于测定该基因甲基化状态的特异性引物组合，可根据该表选择所述引物对。

表18.附加的测定设计：用于测定SOX17甲基化状态的引物和探针序列，并显示预计的扩增产物长度。

每种及所有这些引物和探针构成本发明的各个方面。特别地，本发明涉及选自本文公开之引物对的引物对，其包含在所述表格中(其中可能包含超出所列基本序列以外的额外序列)。这些引物的更多特点归纳于如下的详细说明(实验部分)中。值得注意的是，这些序列的变体可用于本发明。特别地，可依需要加入额外的序列特异性侧翼序列，例如为了改善结合特异性。变体序列优选地与表2、3、4、5或6任一表中列出的引物和/或探针的核苷酸序列具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的核苷酸序列同一性。所述引物和探针(包括发夹)结构可酌情掺入合成的核苷酸类似物，或者可以是基于例如RNA或PNA的，或是其混合物。类似地，可酌情使用替代性的荧光供体和受体部分/FRET对。除了用荧光供体和受体部分进行标记，所述引物还可包含经修饰的寡核苷酸以及其它附加基团和标签，只要其在本发明方法中作为引物的功能不受影响即可。类似地，可酌情使用替代性的荧光供体和受体部分/FRET对。FRET中常用的分子包括5-羧基荧光素(FAM)、2’7’-二甲氧基-4’5’-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、罗丹明、6-羧基罗丹明(R6G)、N，N，N’，N’-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)、6-羧基-X-罗丹明(ROX)、4-(4’-二甲基氨基苯偶氮基)苯甲酸(DABCYL)和5-(2’-氨乙基)-氨基萘-1-磺酸(EDANS)。荧光团是供体还是受体是由其激发和发射光谱来决定的，并且荧光团是成对的。举例来说，最有效激发FAM的光的波长为488nm，并发出500至650nm范围的光，且最大发射波长为525nm。FAM是与JOE、TAMRA和ROX(所有这些的最大激发波长为514nm)一起使用时的合适的供体荧光团。

因此，在一个实施方案中，所述供体部分和所述受体部分选自5-羧基荧光素(FAM)、2’7’-二甲氧基-4’5’-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、罗丹明、6-羧基罗丹明(R6G)、N，N，N’-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)、6-羧基-X-罗丹明(ROX)、5-(2’-氨乙基)-氨基萘-1-磺酸(EDANS)、2-氨基苯甲酰胺、香豆素，铽螯合衍生物、孔雀石绿、活性红4、DABCYL、四甲基罗丹明、芘丁酸、曙红硝基酪氨酸、乙锭和得克萨斯红。在另一实施方案中，所述供体部分选自荧光素、5-羧基荧光素(FAM)、罗丹明、5-(2’-氨乙基)-氨基萘-1-磺酸(EDANS)、2-氨基苯甲酰胺、香豆素、铽螯合衍生物、孔雀石绿和活性红4，所述受体部分选自DABCYL、罗丹明、四甲基罗丹明、芘丁酸、曙红硝基酪氨酸、乙啶和得克萨斯红。

在一个具体的实施方案中，所述供体部分是荧光素或其衍生物，所述受体部分是DABCYL。在一些具体实施方案中，所述荧光素衍生物包括6-羧基荧光素，或者基本由其组成或由其组成。

对于本发明的所有方面和实施方案来说，所述引物(特别是茎环/发夹结构)和/或探针(视检测采用的形式而定)可以在引物或探针的化学合成过程中用供体和受体部分标记，或者可使用任何合适的方法在合成后连接上标记。本领域中有许多这样的方法，并被充分描述。

值得注意的是，可酌情用不同的探针(或引物)类型来替换所具体示例的探针类型(例如表7和表9中采用的发夹探针类型)。可视情况使用本文所讨论的等效物。

在另一实施方案中，使用了亚硫酸氢盐测序来测定所述至少一种基因(选自NDRG2/NDRG4亚家族基因(尤其是NDRG4)、GATA4、OSMR、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3(采用包括本文所述之组合在内的所有排列组合))的甲基化状态。引物可设计成用于对所述至少一种基因(选自NDRG2/NDRG4亚家族基因(尤其是NDRG4)、GATA4、OSMR、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3(采用包括本文所述之组合在内的所有排列组合))中重要的CpG岛进行测序。因此，引物可以设计成有义和反义两个方向，从而指导跨越相关基因之启动子区域的测序。

在一个对NDRG4和/或NDRG2基因测序的实施方案中，亚硫酸氢盐测序可通过使用包含以下序列、基本由其组成或由其组成的测序引物来进行，所述引物可独立或联合使用以测序全部两条链：

NDRG4引物

SEQ ID NO：570 5′-gatyggggtgttttttaggttt-3′(正向)

其中“Y”代表嘧啶核苷酸

SEQ ID NO：6 5′-craacaaccaaaaacccctc-3′(反向)

其中“r”代表嘌呤核苷酸。

NDRG2引物

SEQ ID NO：522 5′-tttgttggttattttttttttattttt-3′(正向)

SEQ ID NO：523 5′-cccccaaactcaataataaaaac-3′(反向)

这些测序引物构成本发明的另一个方面，适当的变体也包含在本发明的范围内(该讨论经必要修改适用于此处)。

还可酌情使用除PCR(其中包括实时PCR和变型方法，例如巢式PCR)以外的其它核酸扩增技术，以检测所述至少一种基因(选自NDRG2/NDRG4亚家族基因(尤其是NDRG4)、GATA4、OSMR、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3(采用包括本文所述之组合在内的所有排列组合))的甲基化状态。此类扩增技术是本领域所熟知的，包括例如NASBA(Compton，1991)、3SR(Fahy等，1991)和转录介导的扩增(TMA)等方法。其它合适的扩增方法包括连接酶链式反应(LCR)(Barringer等，1990)、选择性扩增靶标多核苷酸序列(美国专利No.6,410,276)、共有序列引物聚合酶链式反应(美国专利No.4,437,975)、任意引物聚合酶链式反应(WO 90/06995)、入侵者技术、链置换技术和缺口置换扩增(WO 2004/067726)。该列表并不旨在穷尽所有；只要能够特异性扩增适当的核酸产物，可使用任何核酸扩增技术。因此，这些扩增技术可与例如MSP和/或亚硫酸氢盐测序技术结合。

反映原始基因组DNA的CpG二核苷酸处之甲基化状态的序列变化提供了两种引物设计方法。这两类引物可单独或组合用于本发明的方法中。首先，引物可被设计成其本身不包含任何潜在的DNA甲基化位点。不同甲基化位点的序列变化位于两个引物之间。这些引物用于例如亚硫酸氢盐基因组测序、COBRA和Ms-SnuPE。此外，引物可设计成特异性地与所转换序列的甲基化或未甲基化形式退火。如果有足够的与靶标互补的区域(例如，12、15、18或20个核苷酸)，则引物还可以包含其它不干扰杂交、但可用于其它操作的核苷酸残基。这些其它残基的实例可以是限制性核酸内切酶切割位点、配体结合位点、因子结合位点、连接子或重复序列。所述寡核苷酸引物可以特异性地针对经修饰的甲基化残基或者可以并非如此。

区分经修饰和未修饰DNA的一种方法是使用寡核苷酸引物进行杂交，所述引物特异性地结合一种形式或另一种形式的DNA。杂交后可以进行扩增反应，并检测扩增产物。存在扩增产物表明样品与引物杂交。引物的特异性指示所述DNA是否已被修饰，从而表明所述DNA是否已被甲基化。

另一种用来区分经修饰和未修饰DNA的方法是利用还可针对某些产物的寡核苷酸探针。这种探针可直接与经修饰DNA杂交或者与经修饰DNA的扩增产物杂交。寡核苷酸探针可使用本领域已知的任何检测系统进行标记。这些标记包括但不限于荧光部分、放射性同位素标记部分、生物发光部分、发光部分、化学发光部分、酶、底物、受体或配体。

在MSP技术中，通过使用特异性针对甲基化状态待评价的基因序列的引物来实现扩增。为了提供针对核酸分子的特异性，可选择对应于合适的序列区域的引物结合位点。技术人员会理解，所述核酸分子还可包含除了检测该基因甲基化状态所需的引物结合位点以外的序列，例如RNA聚合酶结合位点或者启动子序列可以是等温扩增(例如NASBA、3SR和TMA)技术所需的。

TMA(Gen-Probe Inc.)是使用两种酶(即RNA聚合酶和逆转录酶)来驱动反应的RNA转录扩增系统。TMA反应是等温的，可以扩增DNA或RNA来产生RNA扩增终产物。TMA可与Gen-Probe公司的杂交保护测定(Hybridization Protection Assay，HPA)检测技术结合使用，以允许在单个管中检测产物。这种单管检测是实施本发明的优选方法。

尽管本发明所述基因(尤其是启动子)在正常组织中表现为未甲基化，并因此在癌症诊断以及在选择合适的治疗方案及确定成功治疗的可能性或对某些抗癌药剂治疗之抗性的可能性时，检测这些基因的甲基化(或者无甲基化)可容易地观察到显著变化，但是当测定甲基化状态时，仍可优选包含适当的对照，以确定用于评价该参数的所选方法工作正常且可靠。举例来说，适当的对照可包括测定已知被甲基化之基因的甲基化状态。该实验作为阳性对照以确保不会得到假阴性结果(即，尽管所述至少一种基因(选自NDRG2/NDRG4亚家族基因(尤其是NDRG4)、GATA4、OSMR、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3(采用包括本文所述之组合在内的所有排列组合)事实上已被甲基化，却得出未甲基化的结论)。所述基因可以是已知在所研究样品中被甲基化的基因，或者其可被人为地甲基化(例如通过使用合适的甲基转移酶(如SssI甲基转移酶)来实现)。在一个具体实施方案中，可以用SssI甲基转移酶处理正常淋巴细胞后评价NDRG4/NDRG2亚家族基因(优选NDRG4和/或NDRG2基因)来作为阳性对照。

作为补充或者作为替代地，本发明的方法可采用合适的阴性对照。在本文中，合适的对照可包括对已知未甲基化基因的甲基化状态进行评估或在不存在DNA的条件下进行扩增(例如仅使用水作为样品)。前述实验作为阴性对照以确保不会得到假阳性结果(即，尽管所述至少一种基因(选自NDRG2/NDRG4亚家族基因(尤其是NDRG4)、GATA4、OSMR、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3(采用包括本文所述之组合在内的所有排列组合，例如在一个具体实施方案中选自OSMR、SFRP1、NDRG4、GATA5、ADAM23、JPH3、SFRP2和APC的至少一种基因)事实上未被甲基化，却得到甲基化的结论)。所述基因可以是所研究样品中已知未被甲基化的基因，或者它可以被人为地去甲基化，例如通过使用合适的DNA甲基转移酶抑制剂(如以下详细讨论的)来实现。在一个具体实施方案中，由于本文首次证明了NDRG4和/或NDRG2基因在正常组织中不被甲基化，因此可以在正常淋巴细胞中评估NDRG4/NDRG2亚家族基因(优选NDRG4和/或NDRG2基因)作为阴性对照。

本发明方法对释放到所收集液体(尤其是粪便)中的极少量异常甲基化DNA的应用可在测试任何特定基因的甲基化之前需要产生和扩增DNA文库。有关全基因组扩增和用于该扩增的合适文库产生的方法(例如Methylplex和Enzyplex技术，Rubicon Genomics)已描述于例如US2003/0143599、WO2004/081225和WO2004/081183中。此外，WO2005/090507描述了需要亚硫酸氢盐转换或不基于亚硫酸氢盐应用的文库产生/扩增方法。亚硫酸氢盐处理可以发生在文库构建之前或之后，并可需要使用耐受亚硫酸氢盐转换的接头。Meth-DOP-PCR(DiVinci等，2006)是一种改良的与MSP结合使用的简并寡核苷酸引物PCR扩增(DOP-PCR)，其提供了另一种用于在少量DNA中特异性检测甲基化的合适方法。改善的患者护理管理可能需要这些现有方法和技术来补充本发明的方法。

如实验部分中所讨论地，已显示NDRG4/NDRG2亚家族基因甲基化导致表观遗传沉默存在于多种胃肠道癌(例如结直肠癌和/或胃癌、胃癌和食道癌，特别是食道癌)中。因此，在一些具体的实施方案中，本发明提供了一种诊断胃肠道癌(例如结直肠癌和/或胃癌和/或食道癌)或胃肠道癌(例如结直肠癌和/或胃癌和/或食道癌)易感性的方法，其包括检测NDRG4/NDRG2亚家族基因的甲基化状态，其中所述基因的甲基化指示胃肠道癌(例如结直肠癌和/或胃癌和/或食道癌)或胃肠道癌(例如结直肠癌和/或胃癌和/或食道癌)易感性。优选地，所述基因是NDRG2，或NDRG4，或NDRG2和NDRG4的组合。

可测定任意至少一种基因(选自NDRG2/NDRG4亚家族基因(尤其是NDRG4)、GATA4、OSMR、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3(采用包括本文所述之组合在内的所有排列组合，例如选自GATA4、OSMR、NDRG4、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC和MGMT的至少一种基因)的表观遗传变化(特别是甲基化状态)，从而诊断胃肠道癌(例如结直肠癌和/或胃癌和/或食道癌)或其易感性。在一些具体的实施方案中，所述至少一种基因可选自GATA4、OSMR、NDRG4和SFRP2(特别在使用粪便样品的情况下)。检测这些基因中的表观遗传变化(特别是甲基化)得到一种特别灵敏且特异的诊断方法。在使用血浆或血清样品的另一实施方案中，所述至少一种基因可选自OSMR、SFRP1、NDRG4、GATA5、ADAM23、JPH3、SFRP2和APC，特别地选自OSMR、NDRG4、GATA5和ADAM23(特别在使用血浆或血清样品的情况下)。检测这些基因中的表观遗传变化(特别是甲基化)得到一种特别灵敏且特异的诊断方法。

作为补充或作为替代地，所述至少一种基因可选自TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3，例如选自TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1和SOX17，特别是TFPI2。

在使用组织样品的一些实施方案中，所述方法可包括检测基因组合(包含OSMR、GATA4和ADAM23，或OSMR、GATA4和GATA5)的表观遗传变化，或者基本由其组成或由其组成，其中在该组合的至少一种基因中检出表观遗传变化指示结直肠癌的易感性或发病。如上文所述，组织样品可包括例如结肠和/或直肠和/或阑尾样品，或者基本由其组成或由其组成。

在采用粪便样品的一些实施方案中，所述至少一种基因可选自GATA4、OSMR、NDRG4、GATA5、SERP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC和MGMT。作为补充或作为替代地，所述至少一种基因可选自TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3，例如选自TFPI2、FOXE1、SYNE1、SOZ17、PHACTR3和JAM3，特别是TFPI2。

此外，为了提高本发明方法的灵敏度，所述方法可包括检测基因组合(包含至少两种、三种、四种、五种或六种基因)的表观遗传变化，其中在所述组合的至少一种基因中检出表观遗传变化指示癌症(特别是本文定义的胃肠道癌，例如结直肠癌)的易感性或发病。所述基因组合可包含两种、三种、四种、五种或六种基因，或者基本由其组成或由其组成。

已发现某些基因组合可提供用于检测胃肠道癌(例如结直肠癌和/或胃癌和/或食道癌)或其(特别是结直肠癌)易感性的特别灵敏的方法。因此，在一个实施方案中，所述基因组合包含GATA4和OSMR、GATA4和NDRG4、GATA4和SFRP2、OSMR和NDRG4、OSMR和SFRP2、NDRG4和SFRP2、APC和SFRP2、APC和OSMR、APC和GATA4、APC和NDRG4、MGMT和OSMR、MGMT和GATA4、MGMT和NDRG4、MGMT和SFRP2、MGMT和APC、SFRP1和MGMT、SFRP1和OSMR、SFRP1和GATA4、SFRP1和NDRG4、SFRP1和SFRP2、SFRP1和APC、GATA5和SFRP1、GATA5和MGMT、GATA5和OSMR、GATA5和GATA4、GATA5和NDRG4、GATA5和SFRP2或GATA5和APC，或者基本由其组成或由其组成。包含其它基因(例如ADAM23和/或JPH3)的适当组合也包括在本发明范围内。这些实施方案特别适用于粪便测试样品。

另一些有用的基因组合包含SFRP1、SFRP2和APC，或SFRP2、OSMR和APC，或者基本由其组成或由其组成。另一些基因组合包含GATA4、OSMR和NDRG4，GATA4、OSMR和SFRP2，GATA4、NDRG4和SFRP2或OSMR、NDRG4和SFRP2，或者基本由其组成或由其组成。一个具体的四基因组合由GATA4、OSMR、NDRG4和SFRP2组成。一个具体的至少六基因的组合包含NDRG4、OSMR、SFRP1、ADAM23、GATA5和MGMT，或者基本由其组成或由其组成。在一些实施方案中，这些组合可适用于粪便测试样品。

在另一具体实施方案中，所述基因组合包含OSMR、GATA4和ADAM23或OSMR、GATA4和GATA5，或者基本由其组成或由其组成。该实施方案特别适用于组织样品，例如可以是本文讨论的结肠、直肠或阑尾样品。

在一些使用血源样品(尤其是血浆或血清样品)的实施方案中，所述基因组合包含OSMR、NDRG4、GATA5和ADAM23，或者基本由其组成或由其组成。

因此，本发明提供了一种检测血液样品或其衍生物(例如血浆或血清样品，优选血浆样品)中早期结直肠癌(特别是0-II期结直肠癌)易感性或发病的方法，其包括检测选自OSMR、NDRG4、GATA5和ADAM23的至少一种基因的表观遗传变化，其中检出表观遗传变化指示早期结直肠癌(特别是0-II期结直肠癌)的易感性或发病。该方法可适用于由这四种基因组成的基因组合。

值得注意的是，对于每种基因来说，可能在同一基因的多个位置检测出表观遗传变化(特别是基因的甲基化)。因此，例如，基因可包含多于一个CpG岛，或者可酌情研究同一CpG岛内的多个位点。如下面详细说明(实验部分)所示，例如，可以评估OSMR的两个独立的位置，二者均提供了有用的诊断相关结果。本文中将各自的靶标指定为OSMR3和OSMR4。在一个实施方案中，所述基因组合包含OSMR3和OSMR4，或者基本由其组成或由其组成。与所有其它基因一样，当本文提及OSMR时，均是参考表观遗传变化的研究，特别是与结直肠癌相关的甲基化。因此，可酌情对本发明所述基因组合的同一基因内多个位点进行评估。在同一基因内研究多个位点的引物列于上面的表格中，特别参见表2至表18(尤其是表5至表11和表13至表18)。

如本文更详细讨论地，可以在单个反应中检测基因组合中每个基因的表观遗传变化。已有许多允许多重分析的合适技术，并可用于本发明。大多数依靠使用具有可区分发射光谱的合适的荧光分子。本领域技术人员可容易地从多种可用荧光团中进行选择以确定哪些可用于多重分析。

在一个实施方案中，通用猝灭剂与合适的荧光团供体一起使用，每种均具有可区分的最大发射波长。一种特别有用的猝灭剂是DABCYL。可以将如下每一种荧光团与合适的猝灭剂(如DABCYL)一起用于多重分析：香豆素(最大发射波长475nm)、EDANS(491nm)、荧光素(515nm)、萤光黄(523nm)、BODIPY(525nm)、曙红(543nm)、四甲基罗丹明(575nm)和得克萨斯红(615nm)(Tyagi等，NatureBiotechnology，第16卷，1998年1月；49-53)。

值得注意的是，还可以测定另一些基因的甲基化状态以作为本发明方法的补充。尚未发现某种基因在每种类似肿瘤中均出现表观遗传沉默。基于此，可能是有利的是靶向多种DNA改变以实现更高的肿瘤检出率。因此，在本发明方法的一个实施方案中，分析了所述至少一种基因(选自NDRG2/NDRG4亚家族基因(尤其是NDRG4)、GATA4、OSMR、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3(采用包括本文所述之组合在内的所有排列组合))的甲基化状态连同至少一种参与癌症确定之其它基因的甲基化状态。所述至少一种基因(选自NDRG2/NDRG4亚家族基因(尤其是NDRG4)、GATA4、OSMR、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3(采用包括本文所述之组合在内的所有排列组合))可与至少两种参与癌症确定的其它基因结合使用。所述至少一种基因(选自NDRG2/NDRG4亚家族基因(尤其是NDRG4)、GATA4、OSMR、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3(采用包括本文所述之组合在内的所有排列组合))与至少三种、四种、五种或六种参与癌症确定的其它基因结合使用。对于结直肠癌来说，所述参与癌症确定的其它基因可选自SFRP1、SFRP2、GATA-4、GATA-5、CHFR、APC(2)、MGMT、p16、波形蛋白、p14、RASSF1a、RAB32、SEPTIN-9、RASSF2A、TMEFF2、NGFR或SMARCA3。然而，在本发明的方法中，任何参与结直肠癌确定的基因可与所述至少一种基因(选自NDRG2/NDRG4亚家族基因(尤其是NDRG4)、GATA4、OSMR、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3(采用包括本文所述之组合在内的所有排列组合))结合使用。

在癌发生过程早期甲基化的基因不仅适用于筛查目的，而且也是早期癌症检测以及监测癌症进展或结果的有意义的靶标。在另一个方面，本发明提供了一种癌症预后分析(针对癌症的预后)的方法，其包括检测所述至少一种基因(选自NDRG2/NDRG4亚家族基因(尤其是NDRG4)、GATA4、OSMR、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3(采用包括本文所述之组合在内的所有排列组合))的表观遗传沉默，其中所述基因的表观遗传沉默指示癌症的发生。优选地，表观遗传沉默通过测定所述至少一种基因(选自NDRG2/NDRG4亚家族基因(尤其是NDRG4)、GATA4、OSMR、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3(采用包括本文所述之组合在内的所有排列组合))的甲基化状态和/或测量其表达水平来进行检测。在一个实施方案中，患者患有晚期腺瘤或处于发生AJCC I、II、III或IV期癌症的风险中。在另一实施方案中，结果是患者在手术切除(例如无疗效的或有疗效的手术切除)后存活。

早期检出一种或多种基因的表观遗传沉默可为已具有与恶性肿瘤相关的分子特征但尚未出现与恶性肿瘤相关的所有病理或临床特征的患者的更确定的后续发展提供了合理的解释。在癌症最早期(这时癌症是局部性的且容易治疗)对其进行鉴定可改善患者的临床结果。具有预后价值的方法应当允许特异性检出肿瘤，而不会检出(良性)腺瘤，因而提供一种区分良性腺瘤与晚期腺瘤的诊断。如详细说明(实验部分)所示，与来自未患有结直肠癌之患者的腺瘤相比，在伴有结直肠癌的腺瘤中观察到至少一种基因(选自NDRG2/NDRG4亚家族基因(尤其是NDRG4)、GATA4、OSMR、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3(采用包括本文所述之组合在内的所有排列组合))的更高频率的基因启动子过度甲基化。这种预后价值涵盖在诊断的定义中。

在一个相关的方面，本发明提供了一种确定样品中癌症(特别是胃肠道癌，例如结直肠癌)组织病理学阶段的方法，其包括检测至少一种基因(选自NDRG2/NDRG4亚家族基因(尤其是NDRG4)、GATA4、OSMR、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3(采用包括本文所述之组合在内的所有排列组合))的表观遗传变化，其中表观遗传变化的检出指示癌症(例如结直肠癌)的组织病理学阶段。酌情将本发明方法的所有实施方案并入此处，为简洁起见此处不再赘述。表观遗传变化通常引起基因沉默。优选地，表观遗传沉默通过测定所述至少一种基因(选自NDRG2/NDRG4亚家族基因(尤其是NDRG4)、GATA4、OSMR、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3(采用包括本文所述之组合在内的所有排列组合))的甲基化状态和/或测量其表达水平来检测，所述一种或多种基因的甲基化状态和/或表达水平与癌症组织病理学阶段有关。在此方法中，样品是从患有或怀疑患有任何本发明相关癌症(例如结直肠癌)的患者获得的。测定所述至少一种基因(选自NDRG2/NDRG4亚家族基因(尤其是NDRG4)、GATA4、OSMR、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3(采用包括本文所述之组合在内的所有排列组合))的甲基化水平、所述至少一种基因(选自NDRG2/NDRG4亚家族基因(尤其是NDRG4)、GATA4、OSMR、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3(采用包括本文所述之组合在内的所有排列组合))的表达水平或其组合，并与癌症的组织病理学阶段建立关联。癌症的“分期(阶段)”是对癌症扩散程度的一种描述(通常为I至IV)。所述“分期(阶段)”常常考虑肿瘤大小、穿透深度、是否侵入邻接器官、淋巴结是否转移以及转移数目以及是否扩散到远处器官。对癌症进行分期是重要的，因为在诊断中进行分期可很好地预测存活，而且常根据不同分期来改变治疗。如上所述，对用于测定所述至少一种基因(选自NDRG2/NDRG4亚家族基因(尤其是NDRG4)、GATA4、OSMR、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3(采用包括本文所述之组合在内的所有排列组合))的表观遗传沉默的合适方法的描述适用于本发明的这些方面(已经必要修改)，为简洁起见此处不再赘述。

在一个具体的实施方案中，本发明提供了一种确定组织或血液样品或其衍生物(例如血浆或血清样品)中胃肠道癌(例如结直肠癌和/或胃癌和/或食道癌)组织病理学阶段或向易感性的方法。对于这些特定的测试样品来说最合适的基因和基因组合(例如选自OSMR、SFRP1、NDRG4、GATA5、ADAM23、JPH3、SFRP2和APC的至少一种基因)在上文已有描述，为简洁起见此处不再赘述。

在另一具体实施方案中，本发明提供了一种用于预测或监测腺瘤(向癌)(特别是胃肠道癌，例如结直肠癌)发展的方法，其包括在合适的测试样品中测定NDRG2/NDRG4亚家族基因(特别是NDRG4基因)的甲基化状态，其中甲基化水平升高或增加指示(与甲基化水平较低的情形相比)腺瘤更有可能发展成为癌。该实施方案尤其适用于NDRG4基因中用上表2所列的引物组1扩增的区域。因此，在一个实施方案中，这些方法采用引物组1来测定NDRG4基因的甲基化状态。正如下文所讨论地，引物对1可区分向癌发展的腺瘤与不向癌发展的腺瘤。这对于癌症筛查非常重要。测试样品可以是以上广泛讨论的任何合适的样品。然而，所述样品一般是合适的组织样品，特别是腺瘤样品。

在一个相关的实施方案中，检测NDRG4基因转录起始位点甲基化水平的提高也可用于监测癌症(特别是胃肠道癌，例如结直肠癌(CRC))的进展。如本文所示，基于所取得的结果，可预计从启动子5′更上游区域至转录起始位点甲基化的蔓延与癌症发展(例如从腺瘤到癌)相关。因此，本发明提供了一种用于预测和监测胃肠道癌(例如CRC)发展的方法，其包括在合适的测试样品中测定NDRG2/NDRG4亚家族基因的甲基化状态，其中朝向转录起始位点的甲基化水平升高或增加指示与甲基化水平较低的情形相比更易发展成癌症。所述转录起始位点和启动子序列从公开的基因序列信息获知。在这些方法中，可酌情使用本文定义的引物组1和2。引物组1用于测定NDRG4基因的甲基化状态，其比引物组2更接近转录起始位点。因此，在这些方法中比较上述结果可能是有用的。

如本文所述，用于诊断、预后分析或个体化医疗护理的本发明方法优选用于胃肠道癌(例如结直肠癌和/或胃癌和/或食道癌)方面。目前存在多种技术可用于结直肠癌检测。这些技术包括：

-粪便隐血测试(愈创木脂(Guaiac)和免疫化学)

-结肠镜检查和/或乙状结肠镜检查

-双重对比钡灌肠后X射线检查或CT-结肠造影

-粪便DNA测试(PreGen-

)

更精确地筛查、对高风险患者的监视以及改善患者护理管理可有利地采用这些已有方法和技术，以作为本发明方法的补充。

粪便DNA测试是一种用于结直肠癌筛查的新兴技术。前恶性腺瘤和癌症的DNA标志物从它们的细胞上脱落，这些标志物在消化过程中未被降解并在粪便中保持稳定。捕获以及随后进行的扩增(例如使用聚合酶链式反应)使所述DNA扩增至测定可检测的水平。已提示，粪便DNA完整性测定成为检测结直肠癌的有用工具。粪便中高分子量DNA片段的存在与结直肠癌有关，可能与疾病相关的细胞增殖和凋亡调节差异有关。通过粪便DNA检测结直肠癌还可基于对结直肠赘生物特征性的癌基因突变进行鉴定，所述癌基因突变在粪便中脱落的上皮细胞中可检测到。虽然肿瘤出血是间断性的，而上皮脱落却是持续的，因此使基于粪便的DNA测试(也称为粪便DNA[f-DNA]测试)比其它方法可以更灵敏。市售的基于粪便的结直肠癌DNA测试包括PreGen-Plus^TM(EXACT Sciences Corporation，Marlborough，MA01752USA)，该测试通过单个测试鉴定23个已知与CRC相关的不同微卫星(MSI)突变(包括BAT-26中的突变)的存在。此外，该测试中还包含与CRC相关的其它基因中的21个其它点突变，所述基因包括：腺瘤性结肠息肉病(APC)、K-ras和分子大小为53,000道尔顿的蛋白质(p53蛋白)。该测试也设计用于检测长DNA片段，其与称为“非凋亡结肠细胞”的细胞(其常见于CRC中)特别相关。

因此，关注癌基因突变和/或DNA完整性的粪便样品分子筛查可作为本发明方法的补充。在一些具体的实施方案中，本发明的方法与检测DNA完整性或至少一种癌基因DNA突变或二者的组合(检测样品中的DNA完整性和至少一种癌基因的DNA突变)结合使用，以检测结直肠癌的易感性或发病。该方法可利用粪便样品进行。在一个实施方案中，所述方法也可包括获得和/或处理样品的步骤。

测试可用作诊断，或与治疗方案结合。可通过使用DNA去甲基化剂和/或DNA甲基转移酶抑制剂来拯救(rescue)所述至少一种基因(选自NDRG2/NDRG4亚家族基因(尤其是NDRG4)、GATA4、OSMR、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3(采用包括本文所述之组合在内的所有排列组合))的表观遗传功能丧失。可使用该测试来确定向患者施用何种治疗或预防方案，以及监测治疗方案的疗效。

因此，本发明还提供了一种用于预测使用DNA去甲基化剂和/或DNA甲基转移酶抑制剂和/或HDAC抑制剂治疗本文所述之癌症(特别是胃肠道癌，例如结直肠癌和/或胃癌和/或食道癌)的成功可能性的方法，其包括检测至少一种基因(选自NDRG2/NDRG4亚家族基因(尤其是NDRG4)、GATA4、OSMR、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3(采用包括本文所述之组合在内的所有排列组合))的表观遗传变化，其中，与检测不到表观遗传变化的情形相比，检出表观遗传变化指示使用所述方案治疗的成功可能性更高。或者，所述方法包括测量所述至少一种基因(选自NDRG2/NDRG4亚家族基因(尤其是NDRG4)、GATA4、OSMR、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3(采用包括本文所述之组合在内的所有排列组合))的表达水平，其中，与所述至少一种基因(选自NDRG2/NDRG4亚家族基因(尤其是NDRG4)、GATA4、OSMR、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3(采用包括本文所述之组合在内的所有排列组合))表达水平更高的情形相比，表达水平降低表明使用所述方案治疗的成功可能性更高。为免遭质疑，特此声明，对于用于测定至少一种基因(选自NDRG2/NDRG4亚家族基因(尤其是NDRG4)、GATA4、OSMR、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3(采用包括本文所述之组合在内的所有排列组合))表观遗传沉默的适当方法的描述适用于本发明的这些方面(已经必要修改)，为简洁起见在此不再赘述。

对应地，本发明提供了一种用于预测使用DNA去甲基化剂和/或DNA甲基转移酶抑制剂和/或HDAC抑制剂治疗结直肠癌时产生抗性可能性的方法，其包括检测至少一种基因(选自NDRG2/NDRG4亚家族基因(尤其是NDRG4)、GATA4、OSMR、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3(采用包括本文所述之组合在内的所有排列组合))的表观遗传变化，其中，与检测不到表观遗传修饰的情形相比，检出表观遗传变化指示使用该方案治疗的抗性可能性更低。

或者，所述方法包括测量所述至少一种基因(选自NDRG2/NDRG4亚家族基因(尤其是NDRG4)、GATA4、OSMR、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3(采用包括本文所述之组合在内的所有排列组合))的表达水平，其中与所述至少一种基因(选自NDRG2/NDRG4亚家族基因(尤其是NDRG4)、GATA4、OSMR、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3(采用包括本文所述之组合在内的所有排列组合))表达水平降低的情形相比，表达水平升高指示治疗抗性的可能性更高。

因此，待治疗患者群的选择可基于其相关的至少一种基因(选自NDRG2/NDRG4亚家族基因(尤其是NDRG4)、GATA4、OSMR、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3(采用包括本文所述之组合在内的所有排列组合，例如当使用组织或体液(特别是基于粪便或血液的样品，尤其是血浆样品)时所述至少一种基因选自GATA4、OSMR、NDRG4和SFRP2或选自OSMR、NDRG4、GATA5和ADAM23))的甲基化状态，所述甲基化状态导致相应基因的基因表达下调。这便得到更为专一和个体化的医疗形式，并且由于使用最可能起效的药物治疗患者而提高了成功率。对于用于测定至少一种基因(选自GATA4、OSMR、NDRG4、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3(采用包括本文所述之组合在内的所有排列组合))表观遗传沉默的适当方法的描述适用于本发明的这些方面(已经必要修改)，为简洁起见此处不再赘述。

在某些方面，在腺瘤中至少一种基因(选自NDRG2/NDRG4亚家族基因(尤其是NDRG4)、GATA4、OSMR、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3(采用包括本文所述之组合在内的所有排列组合))的表观遗传功能丧失可鉴别对治疗的需求。可测定患病(例如结肠肿瘤)的患者中至少一种基因(选自NDRG2/NDRG4亚家族基因(尤其是NDRG4)、GATA4、OSMR、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3(采用包括本文所述之组合在内的所有排列组合))的甲基化。或者，所述患者可正在进行例行筛查，而不一定被怀疑患有某种疾病(例如结肠肿瘤)。检测腺瘤中至少一种基因(选自NDRG2/NDRG4亚家族基因(尤其是NDRG4)、GATA4、OSMR、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3(采用包括本文所述之组合在内的所有排列组合))的甲基化可用于提高结肠肿瘤检测的灵敏度和/或特异性，因为这样的晚期腺瘤可指示腺瘤可能发展成癌。在这种情况下，可建议进行预防性治疗，包括切除腺瘤。

因此，本发明提供了一种通过取自对象的腺瘤来预测合适治疗方案的方法，其包括测定腺瘤中至少一种基因(选自NDRG2/NDRG4亚家族基因(尤其是NDRG4)、GATA4、OSMR、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3(采用包括本文所述之组合在内的所有排列组合))的甲基化状态，其中如果所述至少一种基因(选自NDRG2/NDRG4亚家族基因(尤其是NDRG4)、GATA4、OSMR、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3(采用包括本文所述之组合在内的所有排列组合))发生了甲基化(尤其是过度甲基化)，则鉴定为该腺瘤需要治疗。优选地，所述治疗包括切除腺瘤。

对应地，本发明提供了一种通过取自对象的腺瘤来预测合适治疗方案的方法，其包括测定腺瘤中至少一种基因(选自NDRG2/NDRG4亚家族基因(尤其是NDRG4)、GATA4、OSMR、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3(采用包括本文所述之组合在内的所有排列组合))的甲基化状态，其中如果所述至少一种基因(选自NDRG2/NDRG4亚家族基因(尤其是NDRG4)、GATA4、OSMR、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3(采用包括本文所述之组合在内的所有排列组合))未发生甲基化或甲基化程度较低，则确定不需要切除腺瘤。对于用于测定至少一种基因(选自NDRG2/NDRG4亚家族基因(尤其是NDRG4)、GATA4、OSMR、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3(采用包括本文所述之组合在内的所有排列组合))表观遗传沉默的适当方法的描述适用于本发明的这些方面(已经必要修改)，为简洁起见此处不再赘述。在某些实施方案中，所述腺瘤通常为结肠来源的。

本发明还提供了一种针对癌症或癌症易感性来选择合适治疗方案的方法，其包括测定取自对象的样品中NDRG4/2家族基因的表观遗传沉默，其中如果所述基因发生表观遗传沉默(特别是过度甲基化或表达降低)，则可选用DNA去甲基化剂和/或DNA甲基转移酶抑制剂和/或HDAC抑制剂来进行治疗。

对应地，本发明提供了一种针对癌症或癌症易感性来选择合适治疗方案的方法，其包括测定取自对象的样品中NDRG4/2家族基因的甲基化状态和/或表达水平，其中如果所述基因未被甲基化或较高表达，则不宜使用DNA去甲基化剂和/或DNA甲基转移酶抑制剂和/或HDAC抑制剂进行治疗。因此，应寻找替代治疗方案。

在一个相关的方面，本发明还提供了一种针对癌症(尤其是胃肠道癌，例如本文定义的结直肠癌)选择合适的治疗方案的方法，其包括检测至少一种基因(选自NDRG2/NDRG4亚家族基因(尤其是NDRG4)、GATA4、OSMR、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3(采用包括本文所述之组合在内的所有排列组合))的表观遗传变化，其中检出所述表观遗传变化则选择DNA去甲基化剂和/或DNA甲基转移酶抑制剂和/或HDAC抑制剂用于治疗，其中如果未检出所述表观遗传改变则不选用DNA去甲基化剂和/或DNA甲基转移酶抑制剂和/或HDAC抑制剂进行治疗。针对未检出表观遗传变化(例如，通过基因表达检测或任何其它合适的方法)的情形，应寻找替代治疗方案。对于用于测定所述至少一种基因(选自NDRG2/NDRG4亚家族基因(尤其是NDRG4)、GATA4、OSMR、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3(采用包括本文所述之组合在内的所有排列组合))表观遗传沉默的适当方法的描述适用于本发明的这些方面(已经必要修改)，为简洁起见此处不再赘述。在使用血液(特别是血浆或血清样品)的实施方案中，所述至少一种基因可选自OSMR、SFRP1、NDRG4、GATA5、ADAM23、JPH3、SFRP2和APC。在这种情况下，合适的基因组合包含OSMR、NDRG4、GATA5和ADAM23，或者基本由其组成或由其组成。作为补充或作为替代地，所述至少一种基因可选自TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3，例如选自TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1和SOX17(特别是TFPI2)。

在采用粪便样品的实施方案中，所述至少一种基因可选自GATA4、OSMR、NDRG4、GATA5、SERP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC和MGMT。作为补充或作为替代地，所述至少一种基因可选自TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3，例如选自TFPI2、FOXE1、SYNE1、SOZ17、PHACTR3和JAM3(特别是TFPI2)。本文定义的合适的基因组合也涵盖在内，例如包含OSMR、NDRG4、GATA4和SFRP2、基本由其组成或由其组成的基因组合。

在使用组织样品的实施方案中，所述方法可包括检测基因组合(包含OSMR、GATA4和ADAM23或OSMR、GATA4和GATA5)的表观遗传变化，或者基本由其组成或由其组成。所述组织样品可包含结肠和/或直肠和/或阑尾样品，或者基本由其组成或由其组成。

在另一个方面，本发明提供了一种治疗患者癌症(特别是结直肠癌)的方法，其包括施用DNA去甲基化剂和/或HDAC抑制剂和/或DNA甲基转移酶抑制剂，其中所述患者是基于本发明的方法被选择进行治疗的。因此，对于用于测定所述至少一种基因(选自NDRG2/NDRG4亚家族基因(尤其是NDRG4)、GATA4、OSMR、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3(采用包括本文所述之组合在内的所有排列组合))表观遗传沉默的适当方法的描述适用于本发明的这些方面(已经必要修改)，为简洁起见此处不再赘述。因此，在使用血液(特别是血浆或血清样品)的实施方案中，所述至少一种基因可选自OSMR、SFRP1、NDRG4、GATA5、ADAM23、JPH3、SFRP2和APC。在这种情况下，合适的基因组合包含OSMR、NDRG4、GATA5和ADAM23，或者基本由其组成或由其组成。

作为补充或作为替代地，所述至少一种基因可选自TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3，例如选自TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1和SOX17(特别是TFPI2)。

在采用粪便样品的实施方案中，所述至少一种基因可选自GATA4、OSMR、NDRG4、GATA5、SERP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC和MGMT。作为补充或可选地，所述至少一种基因可选自TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3，例如选自TFPI2、FOXE1、SYNE1、SOZ17、PHACTR3和JAM3(特别是TFPI2)。本文定义的合适的基因组合也涵盖在内，例如包含OSMR、NDRG4、GATA4和SFRP2、基本由其组成或由其组成的基因组合。

在使用组织样品的实施方案中，所述方法可包括检测基因组合(包含OSMR、GATA4和ADAM23，或OSMR、GATA4和GATA5)的表观遗传变化，或者基本由其组成或由其组成。所述组织样品可包含结肠和/或直肠和/或阑尾样品，或者基本由其组成或由其组成。

因此，对于所述至少一种基因(选自NDRG2/NDRG4亚家族基因(尤其是NDRG4)、GATA4、OSMR、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3(采用包括本文所述之组合在内的所有排列组合))发生甲基化(其导致基因表达降低)的患者群体，建议进行此类治疗。该方法在下文中被称为本发明的“治疗方法”方面。

在一个相关的方面，本发明还提供DNA去甲基化剂和/或DNA甲基转移酶抑制剂和/或HDAC抑制剂(在制备用于)治疗患者癌症(特别是胃肠道癌，例如结直肠癌和/或胃癌和/或食道癌)(的药物)中的用途，其中所述患者是基于本发明的方法被选择进行治疗的。同样地，本发明还提供了用于治疗患者癌症(特别是胃肠道癌，例如结直肠癌和/或胃癌和/或食道癌)的DNA去甲基化剂和/或DNA甲基转移酶抑制剂和/或HDAC抑制剂，其中所述患者是基于本发明的方法被选择进行治疗的。

对于本发明所有相关方法(药物遗传学方法、治疗方案方法和治疗方法)，所述DNA去甲基化剂可以是能够上调至少一种基因(选自NDRG2/NDRG4亚家族基因(尤其是NDRG4)、GATA4、OSMR、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3(采用包括本文所述之组合在内的所有排列组合，例如至少一种基因选自GATA4、OSMR、NDRG4、GATA5和ADAM23))转录的任何试剂。优选的DNA去甲基化剂包括DNA甲基转移酶抑制剂，或者基本由其组成或由其组成。所述DNA甲基转移酶抑制剂可以是适于治疗癌症的任何合适的DNA甲基转移酶抑制剂，所述癌症中至少一种基因(选自NDRG2/NDRG4亚家族基因(尤其是NDRG4)、GATA4、OSMR、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3(采用包括本文所述之组合在内的所有排列组合，例如至少一种基因选自OSMR、NDRG4、GATA5和ADAM23))存在甲基化。正如以下实验部分所示，所述至少一种基因(选自NDRG2/NDRG4亚家族基因(尤其是NDRG4)、GATA4、OSMR、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3(采用包括本文所述之组合在内的所有排列组合，例如至少一种基因选自OSMR、NDRG4、GATA5和ADAM23))的甲基化与结直肠癌相关，因此预计阻止这种甲基化可有助于治疗胃肠道癌(例如结直肠癌和/或胃癌和/或食道癌)。

在一个实施方案中，所述DNA甲基转移酶抑制剂可以是降低DNMT基因表达的试剂，例如合适的反义分子或介导RNAi的siRNA分子。设计合适的siRNA分子在本领域技术人员的能力范围之内，并且可通过商业渠道订购合适的分子(参见例如www.ambion.com)。在一些实施方案中，所述DNA甲基转移酶基因是(人类)DNMT1。

或者，所述试剂可以是DNMT的直接抑制剂。实例包括经修饰的核苷酸(例如硫代磷酸酯修饰的寡核苷酸(Villar-Garea，A.和Esteller，M.DNA demethylating agents and chromatin-remodelling drugs：which，how and why？Current Drug Metabolism，2003，4，11-31中的图6))和核苷以及核苷酸(例如胞苷类似物)。合适的胞苷类似物的实例包括5-氮杂胞苷、5-氮杂-2’-脱氧胞苷、5-氟-2’-脱氧胞苷、假异胞苷、5，6-二氢-5-氮杂胞苷、1-β-D-阿拉伯呋喃基-5-氮杂胞嘧啶(也称为fazabarine)(参见Villar-Garea，A.和Esteller，M.DNA demethylating agents andchromatin-remodelling drugs：which，how and why？Current DrugMetabolism，2003，4，11-31中的图4)。

在另一实施方案中，所述DNA甲基转移酶抑制剂包括地西他滨(Decitabine)。该药物的详细说明可在例如www.supergen.com上查阅。

另外的DNMT抑制剂包括S-腺苷甲硫氨酸(SAM)相关化合物，例如乙基基团供体(如L-乙硫氨酸)和非烷基化剂(如S-腺苷高半胱氨酸(SAH)、西奈芬净(sinefungin)、(S)-6-甲基-6-脱氨西奈芬净、6-脱氨西奈芬净、N4-腺苷-N4-甲基-2，4-二氨基丁酸、5’-甲硫基-5’-脱氧腺苷(MTA)和5’-氨基-5’-脱氧腺苷(Villar-Garea，A.和Esteller，M.DNAdemethylating agents and chromatin-remodelling drugs：which，howand why？Current Drug Metabolism，2003，4，11-31)。

可改变DNA甲基化并因此可用于本发明组合物的另一些试剂包括有机卤代化合物(如氯仿等)、普鲁卡因胺(procianamide)、嵌入试剂(如丝裂霉素C、4-氨基联苯等)、砷和硒的无机盐以及抗生素(如卡那霉素、潮霉素和头孢噻肟(cefotaxim))(Villar-Garea，A.和Esteller，M.DNA demethylating agents and chromatin-remodelling drugs：which，how and why？Current Drug Metabolism，2003，4，11-31)。

本发明中有用的DNMT抑制剂包含5-氮杂胞苷和/或zebulaine，或者基本由其组成或由其组成。

如上所述，研究结直肠癌的研究人员所面临的一个挑战是粪便样品中存在的DNA的多样性。目的DNA只占从粪便分离出的总DNA的很小比例。所以，随着对合适的DNA标志物的开发，需要从粪便样品分离DNA和富集人类DNA组分的改进技术用于更灵敏的癌症检测。

大多数提高粪便样品的癌症检测灵敏度的技术关注的是提高从总DNA中回收人类靶DNA的效率。本发明人通过增加检测反应中使用的DNA量已成功地提高了利用粪便样品检测结直肠癌的灵敏度。增加检测反应中的DNA量意味着与DNA共同纯化出的物质的增加。杂质量的增加可能会导致PCR抑制，因此，之前并未对增加检测反应中的DNA量来提高利用粪便样品检测癌症之灵敏度进行过研究。

因此，在另一个方面，本发明提供了一种处理粪便样品以分离和制备DNA用于通过粪便样品检测结直肠癌易感性或发病的方法，其包括：

(a)从粪便样品中分离DNA；

(b)用试剂处理所需的至少2.5μg经分离DNA(每个扩增反应)，所述试剂选择性修饰样品所含DNA中未甲基化的胞嘧啶残基以产生可检测的经修饰残基，但该试剂不修饰甲基化的胞嘧啶残基；

(c)扩增经处理的分离DNA。

因此本发明人发现，针对所需的每个下游扩增反应，通过包含用所述试剂处理至少2.5μg经分离DNA的步骤，即可实现利用粪便样品的改进的检测方法。所需的每个扩增反应的DNA量特别地表示为允许利用同一样品进行多组平行反应。例如，测试和对照样品可以平行处理。此外，当对至少一种基因(选自NDRG2/NDRG4亚家族基因(尤其是NDRG4)、GATA4、OSMR、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3(采用包括本文所述之组合在内的所有排列组合))的表观遗传变化(优选甲基化)的检测不在同一反应中进行时(例如通过使用合适的荧光团来进行)，可利用分别的反应来评价基因组合中的每个基因。因此，需要时，可将单个起始样品分成多个子样品。这通过使样品之间变异最小化来提高结果的精确性。每个扩增反应中经分离DNA的量至少为约2.5μg、3μg、4μg、5μg、7.5μg、10μg等以提高灵敏度，最优选为约2.5μg。

在一个实施方案中，所述方法还优选地包括在从样品中分离DNA之前向粪便样品加入匀浆缓冲液。任何合适的缓冲液均可使用。有用的缓冲液是可购得的，例如从Amresco购得。

所述选择性修饰样品所含DNA中未甲基化胞嘧啶残基以产生可检测的经修饰残基、但不修饰甲基化的胞嘧啶残基的试剂包含亚硫酸氢盐试剂，或者基本由其组成或由其组成。本文讨论了合适的试剂(其讨论已经必要修改)。在一些具体的实施方案中，所述亚硫酸氢盐试剂包含亚硫酸氢钠，或者基本由其组成或由其组成。

在一个具体的实施方案中，在用试剂处理经分离DNA步骤和扩增经处理的分离DNA步骤之间，将经处理的分离DNA浓缩。任何合适的DNA浓缩方法均可使用。例如，可利用DNA结合试剂以从样品中浓缩DNA。DNA结合试剂可选自DNA结合缓冲液、DNA结合滤器、DNA结合柱等，并可能需要使用离心步骤。合适的试剂盒是可购得的，例如可从Zymo Research获得ZYMO纯化和浓缩试剂盒(ZYMO Clean andConcentrator Kit)。

为了实现从粪便样品回收所需的DNA，粪便样品的重量可至少为约4g。所述粪便样品的重量可以为约2g到10g之间，最优选为4g左右。

因此，本发明的方法可包括以下步骤：

-获取和处理来自待测对象的粪便样品，其中优选地获取(至少)4g左右的粪便。

-加入匀浆缓冲液，优选地在排便后直接加入(所述对象可自行加入)。所述缓冲液可以任何合适的比例(例如以1∶7)加入。

-从所述粪便样品分离DNA。如上所述，可使用任何合适的DNA分离技术。这可包括(两轮)低速离心。分离可需要核糖核酸酶A和蛋白酶K处理，随后进行DNA提取(例如通过酚/氯仿提取来实现)。如本文讨论地，也可使用其它DNA纯化技术。

-对所获得的DNA进行亚硫酸氢盐转换，例如对至少18～32μg DNA进行亚硫酸氢盐转换，或对即将进行的每个PCR反应中至少2.5μgDNA进行亚硫酸氢盐转换(基于前面讨论的多重分析的原因，加入量表示为每个PCR反应的量)。

-将来自至少18～32μg未处理DNA的经亚硫酸氢盐处理的DNA的量进行浓缩。

-扩增经亚硫酸氢盐转换之DNA的量。待扩增的量可相当于10～2.5μg未转换DNA(这相当于使用4种标志物的组合到使用一种标志物的量)。

所述用于处理粪便样品方法的灵敏度可通过结合已知的从粪便样品分离DNA的方法而得到进一步提高。例如，可使用结合有链亲合素蛋白的磁珠从粪便样品中纯化人DNA组分(Dong等，2001；Ahlquist等，2000)。在另一实施方案中，可利用电泳驱动的靶DNA序列分离从粪便样品中纯化人DNA，其采用了固定于丙烯酰胺凝胶中的寡核苷酸捕获探针(Whitney等，2004)。在又一实施方案中(其可作为先前实施方案的替代方案，或与先前实施方案结合使用)，在收集后可尽快将粪便样品冷冻，以保持DNA的完整性。如上文所讨论地，DNA的完整性在诊断结直肠癌方面也可能是有益的测试。作为补充或作为替代地，在运输样品前，可向粪便样品中加入稳定缓冲液(Olson等，2005)。在又一补充实施方案中，可使用含甲基结合结构域(MBD)的蛋白质从粪便样品中富集甲基化的人DNA，从而特异性地提高对样品中甲基化DNA标志物的检测灵敏度(Zou等，Clin Chem.2007年9月；53(9)：1646-51)。

在一些具体的方面，本发明的处理粪便样品的方法与本发明的其它方法结合，从而提供改进的结直肠癌诊断、组织病理学分析、药物遗传学分析等。相应地，本发明方法的所有实施方案已经必要修改。因此，本发明的方法可针对扩增的经处理DNA来进行，以提供与例如结直肠癌相关的特别灵敏的方法。

在又一个方面，本发明提供了一种测定血液样品(特别是血浆或血清样品)中所述至少一种基因甲基化状态的方法，其包括：

(a)从血浆或血清样品中分离DNA；

(b)用试剂处理经分离的DNA，所述试剂选择性地修饰样品所含DNA中未甲基化的胞嘧啶残基以产生可检测的经修饰残基，但该试剂不修饰甲基化的胞嘧啶残基；

(c)扩增经处理的分离DNA以测定所述至少一种基因的甲基化状态，其特征在于每个扩增反应使用相当于0.07～0.72ml血浆或血清样品的DNA。

因此，所述方法利用小体积的扩增反应，但仍保持高的检测灵敏度和特异性。因而，如本文讨论地，在一个实施方案中，可优选使用单一的血样来测定基因组合的甲基化状态。每个扩增反应的体积可以为相当于约0.07ml到约0.72ml血浆或血清(如下面讨论地，优选血浆)的DNA。在一些具体的实施方案中，每个扩增反应使用相当于约0.07、0.10、0.15到0.50、0.60、0.70ml之间(例如介于0.07到0.15、0.16、0.17、0.18或0.19ml之间)的血浆或血清的DNA。在一个具体的实施方案中，所进行的每个扩增反应使用了相当于所选基本相同体积的血浆或血清样品的DNA。因此，当基于取自对象的单一血液样品进行多个扩增时，每个扩增将使用相当于0.07～0.72ml血浆或血清样品的DNA。

视情况，所述血浆或血清样品可来自全血或含有其部分/组分的任何合适的血浆或血清。在一些具体的实施方案中，所述血浆或血清样品包含血浆，或者基本由其组成或由其组成。所述血浆或血清所来源的血液样品可使用任何适当的方法收集。许多这样的方法是本领域所熟知的。在一个实施方案中，本发明的方法还包括从全血中获取血液样品和/或血浆或血清样品的步骤。本发明的方法可使用任何适当的血液样品，只要它含有足够的(游离漂浮的)DNA即可。在一个具体的实施方案中，所述方法中使用的血液样品或其衍生物的体积约为5～15ml，例如10ml。

一旦获得血液样品或其衍生物(特别是血浆或血清样品)之后，可将其在用于本发明的方法前进行储存。可将它们冷冻，例如，在适当温度下。适当的温度可介于0℃、-1℃、-2℃、-3℃、-4℃到-20℃、-30℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃、-80℃、-90℃等之间，例如约-80℃。取决于其形式，它们还可以储存在其它温度下，例如在4℃或在室温下。在一个具体的实施方案中，使血浆或血清干燥以允许在非冷冻温度下储存。所述干燥可包括例如冻干，然而也可采用其它脱水技术。当血浆或血清储存在高于冷冻温度时，特别是高于-80℃，可向该样品加入抗微生物剂(例如抗生素)以防止腐败。

在一个实施方案中，向血液样品或其衍生物(尤其是血清或血浆)中添加稳定剂。当样品未被冷冻时，这一点尤为必要。在一个样品为血清的具体实施方案中，采用了例如选自EDTA和/或柠檬酸和/或肝素的稳定剂。在另一个样品为血浆的实施方案中，可使用例如选自柠檬酸和/或肝素的稳定剂。

优选地，所述血浆或血清样品包含血浆样品，或者基本由其组成或由其组成。可通过任何适当的手段/工具从全血获取血浆。在一个实施方案中，所述血浆样品通过对全血离心而获得。如本领域技术人员可确定地，离心可以任何适当的速度、任何适当的时间以及在任何适当的条件下进行。例如，离心可在约1000～3000g之间进行。例如，离心可在约1、2、3、4或5到10、11、12、13、14或15分钟之间进行。离心可在低温下进行，例如在约0～5℃之间(例如4℃)进行，以保持所述样品的完整。可采用多步离心以获得血浆样品。在一个具体的实施方案中，采用两步离心以获得血浆样品。

已显示，可通过在分离DNA之前排除血浆(或血清)体积小于约1～3ml(特别是约2ml，例如1.5～2.5ml)的样品来提高本发明方法的灵敏度。因此，所述方法可包括在分离DNA之前测定从血液样品获取的血浆(或血清)体积。如果从血液样品获取的血浆(或血清)体积小于约1～3ml(特别是约2ml，例如1.5～2.5ml)，则将该样品从接下来的评估中排除。

如本文所述，所述方法可用于测定所述至少一种基因的甲基化状态。“测定甲基化状态”是指测定所述至少一种基因的DNA序列中一个或多个(功能相关的)CpG二核苷酸处是否存在5-甲基胞嘧啶(“5-mCyt”)。特别地，可检测所述至少一种基因的异常甲基化，所述异常甲基化可以指“过度甲基化”。通常，测定所述至少一种基因中一个或多个CpG岛的甲基化状态。这些CpG岛常存在于基因的启动子区域。因此，CpG二核苷酸通常集中在人类基因的启动子区域和外显子中，这些CpG残基的甲基化状态对于所述至少一种基因的表达具有重要功能。由于易被甲基化的CpG二核苷酸通常集中在人类基因的启动子区域、外显子和内含子中，可评估启动子、外显子和内含子区域以测定所述至少一种基因的甲基化状态。“启动子”是通常从转录起始位点向上游延伸约1Kb、500bp或150bp到300bp之间的区域。所述CpG岛可围绕或位于所述至少一种基因之转录起始位点的周围。

本发明的方法包括从血浆或血清样品中分离/提取/纯化DNA。如本文所讨论地(其讨论已经必要修改)，任何合适的DNA分离技术均可使用。同样，在本文中也讨论并示例了市售的从血液样品分离DNA的合适方法和试剂盒，其讨论已经必要修改(参见表1)。因此，如可从表中得出地，可使用例如基于硅胶膜、异丙醇或磁珠的方法来进行DNA分离。

视情况，本发明的方法还可包括对从样品中分离/提取/纯化的DNA进行定量。可使用任何合适的方法实现对样品中DNA的定量。例如，核酸定量可基于分光光度计、荧光计或紫外透射仪的使用。合适技术的实例描述于标准教科书中，例如Molecular Cloning-A LaboratoryManual(第三版)，Sambrook和Russell(尤其参见其中的附录8)。在一个实施方案中，可使用试剂盒(例如可以从Molecular Probes，Invitrogen购得的

dsDNA定量试剂盒)进行DNA定量。

本发明这方面(以及本发明涉及某些类型甲基化检测的其它方面)的方法依赖于下述试剂，其选择性地修饰样品所含DNA中的未甲基化胞嘧啶残基以产生可检测的经修饰残基，但该试剂不修饰甲基化的胞嘧啶残基。任何合适的试剂均可用于本发明的方法中。实例包括亚硫酸氢盐、重亚硫酸盐(hydrogen sulphite)和焦亚硫酸盐(disulphite)试剂及其适当的混合物。在本发明的一个实施方案中，所述试剂包含亚硫酸氢盐试剂，或者基本由其组成或由其组成。特别地，所述试剂可包含亚硫酸氢钠，或者基本由其组成或由其组成。

在一个具体的实施方案中，在用所述试剂处理过经分离DNA之后，优选地在使用所述试剂处理经分离DNA与扩增经处理的分离DNA之间对经处理的分离DNA进行浓缩。任何合适的DNA浓缩方法均可使用。例如，可利用DNA结合试剂以从样品中浓缩DNA。DNA结合试剂可选自DNA结合缓冲液、DNA结合滤器、DNA结合柱等，并可能需要使用离心步骤。合适的试剂盒是可购得的，例如可从Zymo Research购得的ZYMO纯化和浓缩试剂盒(ZYMO Clean and ConcentratorKit)。

在一个具体的实施方案中，待测定甲基化状态的所述至少一种基因选自OSMR、SFRP1、NDRG4、GATA5、ADAM23、JPH3、SFRP2和APC。正如本文所详细讨论地，在血浆或血清样品中这些基因的甲基化状态与癌症(特别是结直肠癌)的发病有关。本文提供了这些基因的详细信息，其讨论已经必要修改。

在一个具体的实施方案中，所述至少一种基因选自OSMR、NDRG4、GATA5和ADAM23，这是因为已证明使用血液来源样品(特别是血浆样品)时这四种基因与结直肠癌发病特别相关。

此外，这些基因已被证明与早期结直肠癌相关。因此，本发明提供了一种测定血液样品(特别是血浆或血清样品)中所述至少一种基因(选自OSMR、NDRG4、GATA5和ADAM23)甲基化状态的方法，其包括：

(a)从血浆或血清样品中分离DNA；

(b)用试剂处理经分离的DNA，所述试剂选择性地修饰样品所含DNA中未甲基化的胞嘧啶残基，以产生可检测的经修饰残基，但该试剂不修饰甲基化的胞嘧啶残基；

(c)扩增经处理的分离DNA以测定所述至少一种基因的甲基化状态，其特征在于每个扩增反应使用相当于0.07～0.72ml血浆或血清样品的DNA。

可使用该方法来诊断早期结直肠癌，特别是0-II期结直肠癌。它也可用于结直肠癌分期——一个或多个甲基化基因的检出指示早期癌症。相应的方法和试剂盒也包括在内。这些方法可额外地或作为替代地适用于测定所述至少一种基因(选自TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3，例如选自TFPI2、BNIP3、FOXE1、STNE1和SOX17，特别是TFPI2)的甲基化状态。

此外，为了提高本发明方法的灵敏度，所述方法可包括测定基因组合(包含至少两种、三种、四种、五种或六种(所述)基因)的甲基化状态。因此，在一个实施方案中，所述至少一种基因构成了包含至少两种、三种、四种、五种或六种基因的基因组合的一部分，其中每种基因的甲基化状态均需测定。所述基因组合可包含两种、三种、四种、五种或六种基因，或者基本由其组成或由其组成。本文还讨论了涉及本发明其它方面的合适基因组合。该讨论和实施方案已经必要修改。

在一些具体的实施方案中，所述基因组合包含OSMR、NDRG4、GATA5和ADAM23，或者基本由其组成或由其组成。该基因组合可用于诊断早期结直肠癌(例如0-II期结直肠癌)。

值得注意的是，对于每个基因来说，有可能在同一基因的多个位点处测定该基因的甲基化状态(如本文讨论地)。因此，例如，一个基因可包含多于一个CpG岛，或者可以视情况研究同一CpG岛内的多个位点。

如本文更详细讨论地，可以在单一反应中测定基因组合中每个基因的表观遗传变化。已有许多合适的允许多重分析的技术，并可用于本发明中。大多数依赖于使用具有可区分发射光谱的适当的荧光分子。本领域技术人员可容易地从多种可用荧光团中进行选择以确定哪些可用于多重分析。

在一个实施方案中，通用猝灭剂与合适的荧光团供体一起使用，每种均具有可区分的最大发射波长。一种合适的猝灭剂是DABCYL。可以将如下每一种荧光团与合适的猝灭剂(如DABCYL)一起用于多重分析：香豆素(最大发射波长475nm)、EDANS(491nm)、荧光素(515nm)、萤光黄(523nm)、BODIPY(525nm)、曙红(543nm)、四甲基罗丹明(575nm)和得克萨斯红(615nm)(Tyagi等，NatureBiotechnology，第16卷，1998年1月；49-53)。

如上所述，还可测定另一些基因的甲基化状态以作为本发明方法的补充。其他参与结直肠癌确定的基因可选自CHFR、MGMT、p16、波形蛋白、p14、RASSF1a、RAB32、SEPTIN-9、RASSF2A、ALX4和SMARCA3。

本发明方法的最后一步包括扩增经处理的分离DNA，以测定所述至少一种基因的甲基化状态。如上所述，这种扩增使用相当于0.07～0.72ml血浆或血清样品的DNA(每个扩增反应)。任何合适的扩增技术均可使用。在一个具体的实施方案中，所述扩增步骤包括聚合酶链式反应(PCR)，或者基本由其组成或由其组成。应当指出的是，虽然PCR(包括建立于基础技术上的变型方法(如巢式PCR))是一种优选的扩增方法，等效的方法也可涵盖在本发明的范围内。实例包括但不限于等温扩增技术，例如NASBA、3SR、TMA和三重扩增，所有这些都是本领域熟知且市售的。其它合适的扩增方法包括但不限于连接酶链式反应(LCR)(Barringer等，1990年)、MLPA、选择性扩增靶多核苷酸序列(美国专利No.6,410,276)、共有序列引物聚合酶链式反应(美国专利No.4,437,975)、入侵者技术(Third Wave Technologies，Madison，WI)、链置换技术、任意引物聚合酶链式反应(WO90/06995)和缺口置换扩增(WO2004/067726)。

本领域已知多种用于测定所述至少一种基因的甲基化状态并可用于本发明中的基于扩增的测定。本文详细介绍了这些测定(包括技术，例如甲基化特异性PCR)，其说明已经必要修改，为简洁起见此处不再赘述。

在一些具体的实施方案中，本发明的方法采用或依赖或利用引物和/或探针(其选自包含上面相关表格(例如表2至表18，特别是表4至表10)中列出的核苷酸序列的引物和探针)以测定所述至少一种基因的甲基化状态。所述表格列出了针对某些优选基因的特异性引物和探针组合，所述基因的甲基化状态可根据本发明的方法来测定。

反映原始基因组DNA的CpG二核苷酸处之甲基化状态的序列变化提供了两种引物设计方法。如本文详细讨论地，这两类引物可用于本发明的方法中，其讨论已经必要修改。如本文所述，还可使用合适的探针。

当测定甲基化状态时，包含适当的对照可以是有益的，以便确保用来评估该参数的所选方法工作正常且可靠。本文详细讨论了合适的(阳性和阴性)对照，其讨论已经必要修改。

如可由本文的讨论和实例得出地，所述至少一种基因的甲基化状态可与针对特定基因的疾病和特定疾病的发病有关。因此，为了检测任何与基因甲基化相关之疾病的易感性或发病，可使用本发明的方法。在一个具体的实施方案中，所述疾病包含细胞增殖性病症，然而原则上任何疾病(只要在适当的血浆或血清样品中可检测到基因甲基化)均可根据这些方法进行诊断。所述细胞增殖紊乱可包括例如癌症，或者基本由其组成或由其组成。特别地，所述癌症可包括胃肠道癌(例如结直肠癌和/或胃癌和/或食道癌，特别是例如结直肠癌)，或者基本由其组成或由其组成。更多的胃肠道癌于上文讨论，每一种均可以适用于本办法。如本文所讨论的，所述方法可以特别适用于结直肠癌的早期阶段(例如0-II期结直肠癌)。

本发明还提供了可用于实施本发明方法的试剂盒。所述试剂盒可包含与本发明上述各种方法(和用途)所提及有关的任何特征、方面和实施方案。

因此，提供试剂盒用于：

(a)预测使用DNA损伤剂和/或DNA甲基转移酶抑制剂和/或HDAC抑制剂成功治疗癌症(如本文所定义地，特别是胃肠道癌，如结直肠癌和/或胃癌和/或食道癌)的可能性和/或对癌症(特别是胃肠道癌，如结直肠癌和/或胃癌和/或食道癌)治疗的抗性可能性，和/或

(b)为癌症(特别是胃肠道癌，例如结直肠癌和/或胃癌和/或食道癌)选择合适的治疗方案，和/或

(c)诊断癌症(特别是胃肠道癌，例如结直肠癌和/或胃癌和/或食道癌)或其易感性，和/或

(d)确定样品中癌症(特别是胃肠道癌，例如结直肠癌和/或胃癌和/或食道癌)的组织病理学阶段或其易感性，其包含含有用于检测至少一种基因(选自NDRG2/NDRG4亚家族基因(尤其是NDRG4)、GATA4、OSMR、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3(采用包括本文所述(特别是与本发明方法有关的)之组合在内的所有排列组合))甲基化状态的引物组的运载手段/工具。例如，在一个具体的实施方案中，所述试剂盒包含含有用于检测至少一种基因(选自OSMR、SFRP1、NDRG4、GATA5、ADAM23、JPH3、SFRP2和APC)甲基化状态的引物组的运载手段/工具。可使用本发明的试剂盒来评估任何NDRG2/NDRG4家族的基因。更详细的家族成员信息参见上文。

因此，所述试剂盒可包含用于测定NDRG2/NDRG4家族基因(优选NDRG4和/或NDRG2基因)是否甲基化的合适的引物。这些引物可包含本发明所述各种方法详细讨论的任何引物，所述方法可用于测定NDRG2/NDRG4家族基因(优选NDRG4和/或NDRG2基因)的甲基化状态。因此，所述试剂盒中的引物可包含用于扩增甲基化或未甲基化DNA(在亚硫酸氢盐处理后)的引物，或者基本由其组成或由其组成。在一个实施方案中，所述试剂盒中的引物包含可扩增亚硫酸氢盐处理后之甲基化和/或未甲基化DNA的引物(或者基本由其组成或由其组成)，其DNA包含SEQ ID NO：524和/或SEQ ID NO：525示出的核苷酸序列(或者基本由其组成或由其组成)。

作为补充或作为替代地，所述试剂盒可采用亚硫酸氢盐测序以确定NDRG2/NDRG4家族基因(特别是NDRG4和/或NDRG2基因)的甲基化状态。因此，所述试剂盒可包含用于对NDRG2/NDRG4家族基因(特别是NDRG4和/或NDRG2基因)中重要的CpG岛进行测序的引物。因此，可将引物设计成跨越所述基因启动子区域的指导测序有义方向和反义方向的两条引物。在一个实施方案中，所述试剂盒中的引物包含可对亚硫酸氢盐处理后的DNA进行测序的引物(或者基本由其组成或由其组成)，其DNA包含SEQ ID NO：524和/或SEQ ID NO：525示出的核苷酸序列(或者基本由其组成或由其组成)。本文更加详细地讨论了合适的引物。

类似地，本发明提供了通过样品检测胃肠道癌(例如结直肠癌和/或胃癌和/或食道癌，特别是结直肠癌)易感性或发病的试剂盒，其包含：

(a)用于检测至少一种基因(选自NDRG2/NDRG4亚家族基因(尤其是NDRG4)、GATA4、OSMR、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC和MGMT)和/或选自TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3的至少一种基因(采用包括本文所述之组合在内的所有排列组合))表观遗传变化的手段/工具；

(b)处理粪便样品的方法。

如上文更详细讨论地，所述至少一种基因可选自GATA4、OSMR、NDRG4和SFRP2，因为这些基因提供了针对结直肠癌的特别灵敏的指示。所述至少一种基因可选自TFPI2、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3，特别是TFPI2。

所述试剂盒可包含用于检测基因组合(包含至少两种、三种、四种、五种或六种所述基因)之表观遗传变化的手段/工具，其中在所述基因组合的至少一种基因中检出表观遗传变化指示结直肠癌的易感性或发病，或者用于如上所述的一种另外的应用。在一个实施方案中，所述基因组合包含两种、三种、四种、五种或六种基因。

在一些具体实施方案中，所述基因组合包含GATA4和OSMR、GATA4和NDRG4、GATA4和SFRP2、OSMR和NDRG4、OSMR和SFRP2或NDRG4和SFRP2，或者基本由其组成或由其组成。在一个更具体的实施方案中，所述基因组合包含GATA4、OSMR和NDRG4，GATA4、OSMR和SFRP2，GATA4、NDRG4和SFRP2或者OSMR、NDRG4和SFRP2，或者基本由其组成或由其组成。另外的基因组合包含GATA4、OSMR、NDRG4和SFRP2，或者基本由其组成或由其组成。

一种可作为替代的基因组合包含NDRG4、OSMR、SFRP1、ADAM23、GATA5和MGMT，或者基本由其组成或由其组成。本领域技术人员应理解，如本发明方法所讨论地，可视情况形成其它的排列组合。

在一个实施方案中，所述用于处理粪便样品的手段/工具包含用于收集粪便样品的可密封的容器。作为补充或作为替代地，所述试剂盒中用于处理粪便样品的手段/工具包含匀浆缓冲液。所述用于处理粪便样品的手段/工具还可以或作为替代地包含用于提取/分离/浓缩/纯化DNA的试剂。合适的试剂是本领域所熟知的，其包含用于沉淀DNA的醇(例如乙醇和异丙醇)，或者基本由其组成或由其组成。基于盐的沉淀可能需要高浓度的盐来沉淀杂质。所述盐可包含例如醋酸钾和/或醋酸铵，或者基本由其组成或由其组成。所述试剂盒中还可包含有机溶剂以从细胞裂解物中抽提杂质。因此，在一个实施方案中，用于处理粪便样品的手段/工具包含用于提取DNA的苯酚、氯仿和异戊醇，或者基本由其组成或由其组成。视情况，合适的试剂组合也涵盖在内。

如本文讨论地(已经必要修改)，可通过增加样品DNA的量来提高检测灵敏度。因此，在一个实施方案中，用于处理粪便样品的手段/工具包含用于指导样品DNA扩增的引物，或者基本由其组成或由其组成。可使用任何扩增所述至少一种基因(选自GATA4、OSMR、NDRG4、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3)的合适的引物。所述引物可以不对甲基化和未甲基化的DNA进行区分(即引物结合位点位于CpG岛以外)，从而在测定样品中是否存在甲基化形式的单个基因或多个基因之前提供了DNA量的一般的增加。

类似地，本发明提供了一种检测胃肠道癌(例如结直肠癌和/或胃癌和/或食道癌，特别是结直肠癌)易感性或发病的试剂盒，其包含：

(a)用于检测至少一种基因(选自OSMR、SFRP1、NDRG4、GATA5、ADAM23、JPH3、SFRP2和APC和/或选自TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3)的表观遗传变化的手段/工具；

(b)处理血液样品或其衍生物的手段/工具。

如上文更详细讨论地，所述至少一种基因可选自OSMR、NDRG4、GATA5和ADAM23，因为这些基因提供了针对血液样品或其衍生物(特别是血浆)中结直肠癌的特别灵敏的指示。所述至少一种基因可选自TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1和SOX17，特别是TFPI2。

所述试剂盒可包含用于检测基因组合(包含至少两种、三种、四种、五种或六种所述基因)之表观遗传变化的手段/工具，其中在所述基因组合的至少一种基因中检出表观遗传变化指示结直肠癌的易感性或发病，或者用于如上所述的一种另外的应用。在一个实施方案中，所述基因组合包含两种、三种、四种、五种或六种基因。

在一个实施方案中，所述基因组合包含OSMR、NDRG4、GATA5和ADAM23，或者基本由其组成或由其组成。该试剂盒可用于诊断早期结直肠癌(特别是0-II期结直肠癌)。

在一个实施方案中，用于处理血液样品或其衍生物的手段/工具包含收集血液样品的可密封容器，或者基本由其组成或由其组成。用于处理血液样品或其衍生物的手段/工具可进一步地或作为替代地包含用于提取/分离/浓缩/纯化DNA的试剂，或者主要由其组成或由其组成。合适的试剂是本领域所熟知的，其包含用于沉淀DNA的醇(如乙醇、异丙醇)，或者基本由其组成或由其组成。基于盐的沉淀可能需要高浓度的盐来沉淀杂质。所述盐可包含例如醋酸钾和/或醋酸铵，或者基本由其组成或由其组成。试剂盒中还可包含有机溶剂以从细胞裂解物中抽提杂质。因此，在一个实施方案中，用于处理血液样品或其衍生物的手段/工具包含用于提取DNA的苯酚、氯仿和异戊醇，或者基本由其组成或由其组成。视情况，合适的试剂组合也涵盖在内。用于处理血液样品或其衍生物的手段/工具包含用于分离DNA的异丙醇、磁珠或基于硅胶的膜，或者基本由其组成或由其组成。用于处理血液样品或其衍生物的手段/工具包含如表1所示的试剂盒，或者基本由其组成或由其组成。

用于处理血液样品或其衍生物(特别是血浆或血清样品)的手段/工具可包含一种或多种稳定剂，或者基本由其组成或由其组成。在一个实施方案中，将试剂盒包含的稳定剂添加到血液样品或其衍生物中。当样品未被冷冻时，这一点尤为必要。在样品为血清的一个具体实施方案中，包含了例如选自EDTA和/或柠檬酸和/或肝素的稳定剂。在样品为血浆的另一实施方案中，可包含例如选自柠檬酸和/或肝素的稳定剂。本发明的试剂盒还可包含抗微生物剂(例如抗生素)以防止(血清和血浆样品)腐败。

类似地，本发明提供了一种通过样品检测胃肠道癌(例如结直肠癌和/或胃癌和/或食道癌，特别是结直肠癌)易感性或发病的试剂盒，其包含：

(a)用于检测至少一种基因(选自GATA4、OSMR、NDRG4、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC和MGMT)表观遗传变化的手段/工具；

(b)用于处理组织样品(特别是结肠、直肠或阑尾样品)的手段/工具。

所述试剂盒可包含用于检测基因组合(包含至少两种、三种、四种、五种或六种所述基因)表观遗传变化的手段/工具，其中在所述基因组合的至少一种基因中检出表观遗传变化指示胃肠道癌(例如结直肠癌和/或胃癌和/或食道癌，特别是结直肠癌)的易感性或发病，或者用于如上面所述的一种另外的应用。在一个实施方案中，所述基因组合包含两种、三种、四种、五种或六种基因。

在一些具体的实施方案中，所述基因组合包含OSMR、GATA4和ADAM23或者OSMR、GATA4和GATA5，或者基本由其组成或由其组成。

如结合本发明方法所讨论地，这些试剂盒还可用于预测使用DNA损伤剂和/或DNA甲基转移酶抑制剂和/或HDAC抑制剂成功治疗胃肠道癌(例如结直肠癌和/或胃癌和/或食道癌，特别是结直肠癌)的可能性和/或对胃肠道癌(例如结直肠癌和/或胃癌和/或食道癌，特别是结直肠癌)治疗的抗性可能性，和/或选择合适的胃肠道癌(例如结直肠癌和/或胃癌和/或食道癌，特别是结直肠癌)治疗方案，和/或通过样品确定胃肠道癌(例如结直肠癌和/或胃癌和/或食道癌，特别是结直肠癌)的组织病理学阶段(其讨论已经必要修改)。

在适用于本发明所有相关试剂盒的另一实施方案中，用于检测所述基因组合之表观遗传变化的手段/工具能使检测在单一反应中进行。通过例如使用具有可区分发射光谱的合适的荧光团使多重分析成为可能。因为可将不同发射光谱的荧光染料连接到不同的探针上，所以本文所述的TaqMan探针、分子信标、Scorpions等允许在同一样品中进行多个标志物的测量(多重PCR)。因此，本发明的试剂盒包含经适当标记的探针和引物。

在一个特别优选的实施方案中，使用本发明试剂盒检测的表观遗传变化是甲基化。用于甲基化检测的许多合适的试剂是本领域所熟知的，且在本文已作讨论(其讨论已经必要修改)。特别地，可使用本发明的试剂盒检测基因启动子区域的过度甲基化。因此，用于检测甲基化的手段/工具可包含甲基化特异性PCR引物。取决于所述试剂盒以及所涉及的单个基因或多个基因，合适的引物可酌情选自包含表2至表18任一中列出的核苷酸序列(或基本由其组成或由其组成)的引物。

所述试剂盒还可包含用于以实时或终点方式实施甲基化特异性PCR的手段/工具。所述用于以实时或终点方式实施甲基化特异性PCR/扩增的手段/工具可包含例如发夹引物(Amplifluor)、发夹探针(Molecular Beacons)、水解探针(Taqman)、FRET探针对(Lightcycler)、整合有发夹探针的引物(Scorpion)、荧光染料(SYBRGreen等)、DzyNA引物或寡核苷酸阻断剂。针对各基因，合适的探针可酌情选自包含表2至表18列出的核苷酸序列(或者基本由其组成或由其组成)的探针。本发明涵盖所有适当的组合。用于检测合适参照基因(例如β-肌动蛋白)的引物和探针列于某些所述表格(表3和表4)中。

终点PCR荧光检测技术可使用广泛应用于实时PCR中的同样的方法——TaqMan测定、分子信标、Scorpion等。因此，在一些实施方案中，本发明的试剂盒可包含用于进行终点甲基化特异性PCR的手段/工具。所述用于进行终点甲基化特异性PCR/扩增的手段/工具可包含如针对实时PCR/扩增中所述的引物和/或探针。

在一些实时和终点检测的实施方案中，用于检测扩增产物的探针可仅用于实时监测扩增反应的过程，和/或它们本身还可用于测定所述至少一种基因(选自NDRG2/NDRG4亚家族基因(尤其是NDRG4)、GATA4、OSMR、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3(采用包括本文所述之组合在内的所有排列组合))的甲基化状态。因此，所述探针可设计成与所述引物几乎相同的形式，以利用在合适试剂(例如亚硫酸氢钠)处理后取决于适当胞嘧啶残基(存在于CpG二核苷酸中)甲基化状态的序列差异。

所述探针可包含如上文讨论的用于实时检测扩增产物的任何合适探针类型。然而，值得注意的是，就使用AMPLIFLUOR和SCORPION的实施方案而言，所述探针是所使用引物的组成部分。所述探针通常用荧光进行标记，但也可酌情使用其它类型的标记(如质量标记或放射性同位素标记)。这些探针也适用于终点检测。

本发明的试剂盒可以是用于MSP(特别是采用实时或终点检测的MSP)的试剂盒。

本发明的试剂盒可包含DNA定量试剂，例如可购自MolecularProbes(Invitrogen)的

dsDNA定量试剂盒中的DNA定量试剂。

作为补充或作为替代地，本发明的试剂盒可包含选择性修饰样品所含DNA中未甲基化胞嘧啶残基的试剂(或者基本由其组成或由其组成)以产生可检测的经修饰残基，但该试剂不修饰甲基化的胞嘧啶残基。所述试剂优选地包含亚硫酸氢盐试剂，或者基本由其组成或由其组成。所述亚硫酸氢盐试剂最优选地包含亚硫酸氢钠，或者基本由其组成或由其组成。该试剂能将未甲基化的胞嘧啶残基转换为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶则保持不变。可利用这种残基差异在后续过程中区分甲基化和未甲基化的核酸，所述过程例如使用可区分胞嘧啶和尿嘧啶之引物的PCR(胞嘧啶与鸟嘌呤配对，而尿嘧啶与腺嘌呤配对)。取决于所使用的试剂盒，可包含试剂作为用于处理粪便样品的手段/工具或处理血液样品或其衍生物的手段/工具。

如本发明方法所讨论地，可使用适当对照以作为所述方法的质量控制对照。因此，在一个实施方案中，本发明的试剂盒还包含一种或多种甲基化状态已知的对照核酸分子，或者基本由其组成或由其组成。这些(一种或多种)对照核酸分子可包含已知被甲基化或经处理被甲基化的分子，和/或已知未甲基化或经处理使之未甲基化的分子。一个合适的内部参照基因的实例是β-肌动蛋白，其通常是未甲基化的，但可通过处理使其甲基化。

此外，本发明的试剂盒还可包含用于扩增对照核酸的引物，或者基本由其组成或由其组成。在一些具体实施方案中，这些引物可与用于监测测试样品中甲基化的引物相同。因此，所述对照核酸可包含至少一种基因(选自NDRG2/NDRG4亚家族基因(尤其是NDRG4)、GATA4、OSMR、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3(采用包括本文所述之组合在内的所有排列组合))，例如取自已知未甲基化的正常组织。所述对照核酸可额外地包含甲基化形式的至少一种基因(选自NDRG2/NDRG4亚家族基因(尤其是NDRG4)、GATA4、OSMR、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3(采用包括本文所述之组合在内的所有排列组合))，例如通过甲基转移酶(例如SssI甲基转移酶)使之甲基化。

用于测定对照核酸分子甲基化状态的合适探针和/或寡核苷酸阻断剂也可包含在本发明的试剂盒中。所述探针可包含任何用于实时检测扩增产物的合适探针类型。上述讨论已经必要修改。

本发明的试剂盒可额外地包含用于实施本发明方法的缓冲液和其它试剂。因此，所提供的有关本发明方法的讨论涉及测定至少一种基因(选自NDRG2/NDRG4亚家族基因(尤其是NDRG4)、GATA4、OSMR、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3(采用包括本文所述之组合在内的所有排列组合))的甲基化状态，该讨论在此处已经必要修改。

在一些具体实施方案中，本发明的试剂盒还包含核酸扩增缓冲液，或者基本由其组成或由其组成。合适的试剂可选自(NH₄)₂SO₄、Tris(pH8.8)、MgCl₂、β-巯基乙醇和dNTP储液。试剂可以任何合适的浓度提供。

所述试剂盒还可额外地包含催化核酸扩增的酶，或者基本由其组成或由其组成。因此，所述试剂盒还可额外地包含用于核酸扩增的合适聚合酶，或者基本由其组成或由其组成。实例包括来自家族A和家族B类型的聚合酶，例如Taq(例如市售的Jumpstart DNA Taq聚合酶)、Pfu、Vent等。

所述试剂盒的各组分可单独包装在分别的隔室中，或者可以例如视情况保存在一起。

所述试剂盒还可以包含合适的使用说明，其可以例如印在单独的纸页上或整合进试剂盒的包装上。

在一个具体方面，本发明的方法和试剂盒可联合本发明的另一些方法和试剂盒，以提供更好的胃肠道癌(例如结直肠癌和/或胃癌和/或食道癌，特别是结直肠癌)诊断、组织病理学分析、药物遗传学分析等。因此，本发明方法和试剂盒的所有实施方案已经必要修改地应用于本发 明的各个方面。

本发明将通过以下非限制性实例进行描述。

附图说明

图1.

a.NDRG4：对结直肠癌组织(T)、正常结肠粘膜(N)、甲基化的结直肠癌细胞系(HCT116)和未甲基化细胞系SW480进行亚硫酸氢盐测序。白色和黑色方块分别代表NDRG4中甲基化和未甲基化的CpG二核苷酸。每一行代表一个克隆。CpG的位置是相对于转录起始位点而言的。MSP引物的位置分别位于20～23和31～34位。

b.NDRG2：对结肠癌细胞系(RKO和LS174T)进行亚硫酸氢盐测序。白色和黑色方块分别代表NDRG2B中甲基化和未甲基化的CpG二核苷酸。

图2.使用DAC和TSA处理后，相比于未经处理细胞系的NDRG4的相对表达。使用亲环素(cyclophilin)作为表达归一化的参照基因。

图3.a.甲基化的NDRG4序列(SEQ ID NO：524)(NM_020465：相对于转录起始位点(TSS)而言的-1000～+1000)。亚硫酸氢盐测序引物以中灰色表示；用于巢式MSP的侧翼引物以下划线表示；甲基化的MSP引物以浅灰色表示；未甲基化引物以深灰色和浅灰色表示。

图3.b.甲基化的NDRG2序列(SEQ ID NO：525)。亚硫酸氢盐测序引物以中灰色表示；用于巢式MSP的侧翼引物以下划线表示；甲基化的MSP引物以浅灰色表示；未甲基化引物以深灰色和浅灰色表示。

图4.不同标志物的灵敏度(特异性为100％)。X轴＝实时QMSP中的阳性％；Y轴＝不同的标志物。病例：n＝65例癌症；对照：n＝33例组织学正常的切除物。

图5显示了用于确定临床样品中与结直肠癌相关的目的基因甲基化状态的决策树(实时MSP)。

图6显示了针对34个结肠癌组织样品、16个结肠腺瘤组织样品和63个癌症样品(乳腺癌(20)、肺癌(21)和膀胱癌(22))进行9种不同基因的实时MSP的结果。显示了针对每种基因的灵敏度，其中所设置的分析截取值提供100％的特异性(基于非癌对照)。

图7显示了针对34个结肠癌组织样品、16个结肠腺瘤组织样品和59个取自非结直肠癌患者的样品进行10种不同基因的实时MSP的结果。显示了针对每种基因的灵敏度，其中所设置的分析截取值提供100％的特异性(基于非癌对照)，除JPH3获得95％的特异性以外。

图8显示了针对血浆训练组1的8种不同基因和血浆训练组2的5种不同基因进行实时MSP的结果。血浆训练组1包含34个无疑似结果的样品、25个患有除结肠癌外其它癌症患者的样品和42个覆盖各阶段CRC患者的样品(其中81％处于该疾病的I-III期)。血浆训练组2检测了64个无疑似结果的样品、49个腺瘤样品，25个患有除结肠癌外其它癌症患者的样品和78个覆盖各阶段CRC患者的样品(其中76％处于该疾病的I-III期)。

图9是NDRG4研究的总览，显示了所研究的患者群体。

图10.NDRG4启动子区域的示意图。显示了相对于转录起始位点(TSS，以弯曲的箭头指示)而言-556～+869处的密集的CpG岛。图中指示CpG二核苷酸的位置(用“|”表示)、NDRG4的ORF(如灰色矩形所示)以及通过甲基化特异性PCR(MSP)、定量MSP(qMSP)和亚硫酸氢盐(BS)测序引物鉴定的过度甲基化片段区域。

图11a.使用引物对2检测8种不同CRC细胞系中DNA甲基化的甲基化特异性PCR(MSP)的结果。

图11b.两种CRC细胞系(即HCT116和SW480)的亚硫酸氢盐测序。对6个不同的克隆进行了测序。每行代表一个经过亚硫酸氢钠修饰DNA后进行测序的独立克隆的等位基因。每个框代表一个CpG二核苷酸(黑色框：甲基化的CpG位点，白色框：未甲基化的CpG位点)。

图11c.使用甲基化抑制剂5-氮杂-2’-脱氧胞苷(DAC)处理后，结肠癌细胞系(RKO和HCT116)中NDRG4的表达。

图12a.对3个癌症病例(T)和与其对应的正常非恶性粘膜组织(N)的亚硫酸氢盐测序。对6种不同的克隆进行测序。

图12b.针对三个不同人的结肠癌组织(标记为T)和对应的正常结肠组织样品(标记为N)，利用实时PCR测量的NDRG4转录物表达水平。对于每个患者来说，将正常结肠组织中NDRG4的表达水平设定为1。所述实验进行3次。

图12c.NDRG4表达的定位。在正常粘膜和结肠肿瘤中对NDRG4进行免疫组化染色显示，在癌细胞中没有染色，而在正常上皮细胞的细胞核中有明显的染色。

实验部分

1)NDRG实验

细胞培养

将结肠癌细胞系LS174T、HCT116、HT29、RKO、CaCo2、Colo205、SW48和SW480用于MSP、亚硫酸氢盐测序和实时(重表达)RT-PCR方法(1MM DAC和300nM TSA)。

研究群体

从马斯特里赫特大学医院病理学系的档案中回顾性收集50岁以上结直肠癌患者和对照的经福尔马林固定、石蜡包埋的结肠粘膜组织。得到了马斯特里赫特大学和马斯特里赫特大学医院的医学伦理委员会(MEC)的批准。如果存在的话，还在这些病例中收集正常组织和腺瘤组织。对照组由取自因非特异性腹症接受内窥镜检查之患者的组织学正常活检材料和取自在5-10年内未发展成结直肠癌之患者的腺瘤活检材料组成。如果结直肠癌患者和对照被诊断出除非黑素瘤皮肤癌以外的另外的癌症，则将其排除在外。

甲基化特异性PCR

通过使用亚硫酸氢钠对基因组DNA进行亚硫酸氢盐处理并随后进行MSP来测定基因启动子CpG岛中的DNA甲基化。简言之，使用EZ DNA甲基化试剂盒(Zymo Research)对基因组DNA进行亚硫酸氢盐修饰。通过首先使用扩增亚硫酸氢盐修饰的DNA但不区分甲基化或未甲基化DNA的侧翼PCR引物从而有利于对取自福尔马林固定、石蜡包埋的组织的DNA进行MSP分析。使用这种PCR产物作为MSP反应的模板。所有PCR均采用以下对照：未甲基化的DNA(来自正常淋巴细胞的DNA)、甲基化的DNA(使用SssI甲基转移酶(New EnglandBiolabs)体外处理的正常淋巴细胞DNA)以及无DNA对照。将10μl的每种MSP反应产物直接加样至2％琼脂糖上，并在紫外线照射下显像。表19中列出了引物序列和PCR条件。

另外，通过QMSP测定DNA甲基化。

表19.NDRG4和NDRG2b的MSP引物

＊相对于转录起始位点而言的位置

亚硫酸氢盐基因组测序

使用Wizard基因组DNA纯化试剂盒(Wizard Genomic DNAPurification kit，Promega，Leiden，the Netherlands)对基因组DNA进行分离。使用EZ DNA甲基化试剂盒(EZ DNA methylation kit，ZymoResearch)对基因组DNA进行亚硫酸氢盐修饰。使用TA克隆试剂盒(Invitrogen，Breda，the Netherlands)对PCR产物进行亚克隆，挑选单克隆并测序。表20中列出了引物序列和PCR条件。

表20.NDRG4和NDRG2b的亚硫酸氢盐测序引物

实时RT-PCR

使用Rneasy Mini试剂盒(Qiagen)来分离总RNA，使用IscriptcDNA合成试剂盒(Bio-Rad)来合成cDNA。使用SYBR Green PCRMaster Mix(Applied Biosystems，Nieuwekerk a/d IJssel，theNetherlands)进行定量实时逆转录PCR。表21中列出了引物和PCR条件。

表21.NDRG4实时RT-PCR引物

NDRG4的表达分析

通过实时逆转录PCR(RT-PCR)来测定NDRG4基因的表达。结果发现，NDRG4基因在正常结肠细胞系中表达良好，而在结肠癌细胞系中不表达。仅仅如此并不能表明该沉默是表观遗传性的，所以将RKO和HCT116细胞系用试剂DAC(5’-氮杂脱氧胞苷)和TSA处理。在用DAC和TSA处理后，将NDRG4的相对表达与未经处理的细胞系进行比较。将亲环素用作表达归一化的参照基因。图2显示了所述处理导致NDRG4表达的再活化，这为该基因在结肠癌细胞中发生表观遗传沉默提供了证据。

NDRG4和NDRG2的CpG岛甲基化状态分析

已发现NDRG4表达沉默在DAC和TSA处理后发生逆转，进一步研究了转录失活与推测的表观遗传异常之间的关联。通过对亚硫酸氢盐修饰的基因组DNA进行PCR分析来确定NDRG CpG岛的甲基化状态，其使用所阐述的方法诱导未甲基化胞嘧啶(而非甲基化胞嘧啶)化学转换为尿嘧啶。表V显示，通过MSP分析，在癌细胞系LS174T、HCT116、HT29、RKO、CaCO2和SW48中观察到NDRG4 CpG岛的甲基化，而未甲基化细胞系SW480中则不存在。

类似地，通过使用不同的引物组(a到d)进行MSP分析，在大多数癌细胞系中观察到NDRG2 CpG岛的甲基化。在包含LS174T、HCT116、HT29、RKO、CaCO2和SW48的所有癌细胞系中，使用表19的引物组b观察到了NDRG2 CpG岛的甲基化。

表22.结肠癌细胞系的甲基化状态(通过MSP分析)

在表明癌细胞系中NDRG4的表观遗传功能丧失之后，我们在癌症患者中评估了NDRG4 CpG岛启动子过度甲基化的程度。正如所预期地，非癌症患者的正常粘膜中不存在NDRG4 CpG岛启动子的过度甲基化。如表23所示，NDRG4 CpG岛启动子的过度甲基化在各类肿瘤中以不同频率存在。在所研究的88个癌组织中有76％发生了NDRG4甲基化，在所研究的57个并发结直肠癌的腺瘤中有57％发生了NDRG4甲基化。在来自于未患结直肠癌患者的腺瘤(低级发育异常型非进行性腺瘤)中，NDRG4甲基化明显较低(14％)，表明这种NDRG4甲基化对结直肠癌发生具有预后价值。

表23.结直肠组织中NDRG4甲基化的程度

	甲基化(％)
		肿瘤组织邻接的形态学正常粘膜	2.5(n＝82)
取自还患有结直肠癌患者的腺瘤	57(n＝57)
		癌组织	76(n＝88)
取自未患癌症患者的正常粘膜	0(n＝27)
		取自未发生结直肠癌患者的腺瘤(低级发育异常型非进行性腺瘤)	14(n＝51)

与其它标志物甲基化比较的NDRG4甲基化

对来自于切除的肿瘤和组织学正常的切除物的样品进行13种基因的过度甲基化检测。图4中显示了代表性的结果。在SFRP1、SFRP2、NDRG4、GATA4和GATA5中得到了最高的甲基化。针对100％的特异性，所有结果均显示大于40％的灵敏度。我们使用了多种基于其检测结直肠癌能力而选择的甲基化标志物对NDRG4甲基化标志物提高癌症检测灵敏度的能力进行测试。所述另一些基因选自SFRP1、SFRP2、GATA-4、GATA-5、CHFR、APC(2)、MGMT、p16、波形蛋白、p14、RASSF1a和RAB32。在第一种情况下，分析了NDRG4补充SFRP1的能力。在SFRP1未能过度甲基化的结肠癌样品(n＝18)中有30％显示出NDRG4的过度甲基(n＝6)。类似地，未能通过SFRP2、GATA4或GATA5甲基化分析的方式检出的癌样品显示出NDRG4的过度甲基化。事实上，NDRG4与图4中任何甲基化标志物的组合均改善了对癌症的诊断。

对另一些癌症类型(甲基化的癌症)进行NDRG-4 MSP

对某些基因显示出过度甲基化的另一些癌症类型进行NDRG-4甲基化评估。这些癌症类型包括黑素瘤、肾透明细胞癌、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌和胃癌。结果如下：

黑素瘤：8个样品中有0个样品的NDRG4发生甲基化

肾透明细胞癌：10个样品中只有1个样品的NDRG4发生甲基化

卵巢癌：20个样品中有0个样品的NDRG4发生甲基化

前列腺癌：10个样品中有0个样品的NDRG4发生甲基化

乳腺癌：0/7的小叶癌和0/9的导管癌NDRG4发生了甲基化

与这些结果相反地，在所测试的所有6个胃癌中，均观察到NDRG4发生了甲基化。这似乎表明，NDRG4是一种类型特异性的癌症甲基化标志物，优选地用来检测结肠癌和/或胃癌。

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2)针对粪便DNA的实验

实施例1

与粪便DNA相关的实验材料与方法

样品的收集和处理

标准化多中心筛选试验(荷兰)开创于2006年。在该试验中，通过结肠镜检查、FOBT(粪便隐血测试)以及使用粪便和血液中DNA的实时MSP对年龄在50岁或以上的非症状患者进行筛查。此外，使用了从多个中心(德国和荷兰)预先收集的粪便样品。在这些试验中，就诊于胃肠病门诊并最终确诊为CRC的具有症状的患者提供了用于进行实时MSP的粪便样品。在所进行的试验中，可用于本研究的粪便样品为147例。主要使用了3类粪便样品：67例无疑似结果的样品，58例腺瘤和22例覆盖CRC各阶段患者的样品(其中90％处于疾病早期)。

在特定的桶里排便后，患者向样品中加入250ml粪便匀浆缓冲液(Amresco，Solon，Ohio，USA)。样品被运往实验室并在排便72小时内做进一步处理。以1∶7的比例加入匀浆缓冲液，并将样品匀浆且等分成每份32ml。

从粪便提取DNA

在20℃，将一等份样品(32ml包含相当于4g的粪便)以2540rcf离心5分钟。保留上清，并进行第二次离心(在4℃以16500rcf离心10分钟)。将第二步离心后获得的22ml上清液与5μl RNA酶A一起在37℃孵育60分钟。接着用醋酸钠(pH 5.2)-异丙醇沉淀总DNA，并用70％乙醇清洗。用4ml 1×TE溶液中(pH 7.4)重悬DNA。加入400μl 10×缓冲液(240mM EDTA(pH＝8.0)、750mM NaC)、400μl 10％SDS和20μl蛋白酶K(20mg/ml)，在48℃连续震荡(225RPM)孵育过夜。离心(在室温以3000 RCF离心30秒)后，加入5ml的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1，体积/体积；Invitrogen)，并在室温下以225 RPM震荡孵育10分钟，再以3000RCF离心5分钟。将水相转移到含有5ml苯酚∶氯仿∶异戊醇的新管中。再将样品在室温下以225RPM震荡孵育10分钟，并在室温下以3000RCF离心5分钟。将水相转移到新管中，加入500μl 7.5M醋酸铵、5μl糖原和10ml冰冷的100％乙醇(-20℃)沉淀DNA，再在-20℃孵育至少1小时，并在4℃以15000 RCF离心30分钟。用3.5ml新鲜制备的70％乙醇清洗沉淀，并在空气中干燥。最后将沉淀重悬于2ml LoTE(pH 8.0)中，并储存于-80℃备用。DNA的平均产量为462μg(范围从46～2127μg；SD 420)。

DNA修饰

对得到的32μg DNA应用扩大规模的DNA修饰步骤。根据制造商的说明，使用EZ-96 DNA甲基化试剂盒(Zymo Research)，利用移液机器人(Tecan)对每份2μg的16等份DNA(采用96孔形式)进行亚硫酸氢盐修饰。大体上，将45μl的等分样品与5μl的M-稀释缓冲液混合，并在37℃以1100rpm震荡孵育15分钟。然后加入100μl稀释的CT转换试剂，将样品于70℃在暗处以1100rpm震荡孵育3小时。转换后，通过在冰上放置10分钟并加入400μl的M-结合缓冲液使样品脱盐。将样品加样于收集管中的Zymo-Spin I柱上，离心后用200μl的M-清洗缓冲液进行清洗。向柱中加入200μl M-去磺化缓冲液，并在室温下孵育15分钟。将所述柱离心后，用200μl的M-清洗缓冲液清洗样品两次。最后，用50μl的1mM Tris-HCl(pH8.0)将DNA从柱中冲洗出来，储存在-80℃备用。

DNA浓缩

使用ZYMO纯化和浓缩试剂盒(Zymo Research)对经亚硫酸氢盐处理的DNA进行浓缩。向每等份的DNA中加入100μl DNA结合缓冲液。将相当于～6μg的DNA(在亚硫酸氢盐处理前进行量化)移至收集管中的Zymo-Spin^TM柱内。(每个样品用亚硫酸氢盐处理之DNA的16个孔被分到5个Zymo-Spin^TM柱中。)将所述管以≥10,000rpm离心30秒，并用200μl清洗缓冲液清洗两次。通过加入6μl的1mM Tris-HCl(pH 8.0)、孵育1分钟并以≥10,000rpm离心30秒从柱中洗脱DNA。将同一样品的柱洗脱物合并。所得到的经化学处理的DNA将用作实时MSP的模板。

DNA扩增

利用7900HT快速实时PCR系统(Applied Biosystems)进行实时MSP。将2.4μl经修饰的DNA(相当于2.5μg未转换的DNA)加至含有缓冲液(16.6mM(NH4)2SO4、67mM Tris(pH 8.8)、6.7mMMgCl2、10mM β-巯基乙醇)、dNTP(5mM)、正向引物(6ng)、反向引物(18ng)、分子信标(0.16μM)、BSA(0.1μg)和Jumpstart DNATaq聚合酶(0.4单位；Sigma Aldrich)的PCR混合物(总体积12μl)中。针对每种基因所使用的引物序列和分子信标序列总结在表1中。使用的循环程序如下：95℃5分钟，随后是45个循环的95℃30秒，57℃(对于APC为51℃)30秒以及72℃30秒，然后是72℃5分钟。包含了标准曲线(2×10⁶～20拷贝)以通过将Ct值与标准曲线参校来确定未知样品的拷贝数。

结果

结肠组织样品的标志物鉴定和验证。

组织和粪便的测定有效率：使用实时MSP对230个FFPE和147个粪便样品进行处理。99％的FFPE和粪便样品的实时MSP测定产生了有效的结果。

结肠组织中标志物的选择：基于再次表达，利用Base5甲基化模式平台对代表了145个基因启动子的224个不同的基因测定进行了测试(数据未显示，详细内容参见参考文献1)。使用实时MSP，利用从65个结直肠癌患者(所有阶段)预先收集的肿瘤和74个远端切除物(组织病理学正常)验证了评价29个基因启动子的37个甲基化差异最大的基因序列。几种标志物在所述组织样品中可靠地检出了CRC(数据未显示)。这些结果又被一个包含39个组织对照(非癌性)、34个癌和16个腺瘤的独立的测试组得以证实。所测试标志物的若干组合以高特异性和灵敏度可靠地检出了CRC。

使用表24中列举的引物组和信标探针对10个检测效果最佳的标志物(GATA5、GATA4、SFRP1、SFRP2、APC、MGMT、NDRG4、OSMR、JPH3和ADAM23)进行了验证。除了结肠测试基因以外，还测量了独立的参照基因β-肌动蛋白(ACT)。计算了结肠测试基因和ACT之间的比率，即为该测定的测试结果。根据图5所示的决策树，所述样品被分为甲基化、非甲基化或无效。

表25显示了10种标志物各自的检测效果。取决于所用的截取值，各标志物获得不同的灵敏度。针对标志物100％的特异性，灵敏度(％)分别为：GATA5为56～66，GATA4为78～82，SFRP1为84～92，SFRP2为72～84，APC为40～46，MGMT为44，NDRG4为64～66，OSMR为88，JPH3为82以及ADAM23为50。

表24.引物序列和分子信标序列

SEQIDNO：
				26	β-肌动蛋白	正向引物	5′-TAGGGAGTATATAGGTTGGGGAAGTT-3′
27		反向引物	5′-AACACACAATAACAAACACAAATTCAC-3′
				28		分子信标	5′-FAM-CGACTGCGTGTGGGGTGGTGATGGAGGAGGTTTAGGCAGTCG-3′-DABCYL
29	GATA4	正向引物	5′-AGGTTAGTTAGCGTTTTAGGGTC-3′
				30		反向引物	5′-ACGACGACGAAACCTCTCG-3′
31		分子信标	5′-FAM-CGACATGCCTCGCGACTCGAATCCCCGACCCAGCATGTCG-3′-DABCYL
				32	GATA5	正向引物	5′-AGTTCGTTTTTAGGTTAGTTTTCGGC-3′
33		反向引物	5′-CCAATACAACTAAACGAACGAACCG-3′
				34		分子信标	5′-FAM-CGACATGCGTAGGGAGGTAGAGGGTTCGGGATTCGTAGCATGTCG-3′-DABCYL
35	SFRP1	正向引物	5′-TGTAGTTTTCGGAGTTAGTGTCGCGC-3
				36		反向引物	5′-CCTACGATCGAAAACGACGCGAACG-3′
37		分子信标	5′-FAM-CGACATGCTCGGGAGTCGGGGCGTATTTAGTTCGTAGCGGCATGTCG-3′-DABCYL
				38	SFRP2	正向引物	5′-GGGTCGGAGTTTTTCGGAGTTGCGC-3′
39		反向引物	5′-CCGCTCTCTTCGCTAAATACGACTCG-3′
				40		分子信标	5′-FAM-CGACATGCGGTGTTTCGTTTTTTCGCGTTTTAGTCGTCGGGCATGTCG-3′-DABCYL
17	NDRG4	正向引物	5′-GTATTTTAGTCGCGTAGAAGGC-3′
				18		反向引物	5′-AATTTAACGAATATAAACGCTCGAC-3′
19		分子信标	5′-FAM-CGACATGCCCGAACGAACCGCGATCCCTGCATGTCG-3′-DABCYL
				41	APC	正向引物	5′-GAACCAAAACGCTCCCCAT-3′
42		反向引物	5′-TTATATGTCGGTTACGTGCGTTTATAT-3′
				43		分子信标	5′-FAM-CGTCTGCCCCGTCGAAAACCCGCCGATTAACGCAGACG-3′-DABCYL
44	ADAM23	正向引物	5′-GAAGGACGAGAAGTAGGCG-3′
				45		反向引物	5′-CTAACGAACTACAACCTTACCGA-3′
46		分子信标	5′-FAM-CGACATGCCCCCGACCCGCACGCCGCCCTGCATGTCG-3′-DABCYL
				47	OSMR(3)	正向引物	5′-TTTGGTCGGGGTAGGAGTAGC-3′
48		反向引物	5′-CGAACTTTACGAACGAACGAAC-3′
				49		分子信标	5′-FAM-CGACATGCCCGTACCCCGCGCGCAGCATGTCG-3′-DABCYL
47	OSMR(4)	正向引物	5′-TTTGGTCGGGGTAGGAGTAGC-3′
				50		反向引物	5′-AAAAACTTAAAAACCGAAAACTCG-3′
49		分子信标	5′-FAM-CGACATGCCCGTACCCCGCGCGCAGCATGTCG-3′-DABCYL
				51	JPH3	正向引物	5′-TTAGATTTCGTAAACGGTGAAAAC-3′
52		反向引物	5′-TCTCCTCCGAAAAACGCTC-3′
				53		分子信标	5′-FAM-CGTCTGCAACCGCCGACGACCGCGACGCAGACG-3′-DABCYL
54	MGMT	正向引物	5′-TTTCGACGTTCGTAGGTTTTCGC-3′
				55		反向引物	5′-GCACTCTTCCGAAAACGAAACG-3′
56		分子信标	5′-FAM-CGTCTCGCGTGCGTATCGTTTGCGATTTGGTGAGTGTTTGGGGCGAGACG-3′-DABCYL

表25.各标志物对腺瘤和癌结直肠组织样品的检测效果

基因＊	病例(腺瘤+癌)	对照	＊＊临界比值	灵敏度(％)	特异性(％)
						GATA5	50	39	12(5)	56(66)	100
GATA4	50	39	17(12)	78(82)	100
						SFRP1	50	39	47(25)	84(92)	100
SFRP2	50	39	28(9)	72(84)	100
						APC	50	39	16(5)	40(46)	100
MGMT	50	39	18	44	100
						NDRG4	50	39	7(1)	64(66)	100
OSMR(3)	50	39	47	88	100
						JPH3	50	39	55(75)	82(82)	95(100)
ADAM23	50	39	2	50	100

＊(3)反映了用于评估OSMR基因甲基化的引物组合

＊＊在评估了两组截取比值时，第二组及其对应的灵敏度示于括号中。

标志物的互补性

测试了不同标志物的互补性。所测试标志物的几种组合以高特异性和灵敏度可靠地检出了CRC。表26总结了该结果。针对100％的特异性，两种标志物之组合的灵敏度(％)为90～98。对于3种标志物的组合(SFRP1+SFRP2+APC和SFRP2+OSMR+APC)获得了100％的灵敏度。

表26.标志物对腺瘤和癌结直肠组织样品的互补性

＊基因	＊＊灵敏度	特异性
			NDRG4+OSMR(4)	90％	100％
SFRP2+APC	92％	100％
			APC+OSMR(3)	92％	100％
MGMT+OSMR(3)	92％	100％
			OSMR(3)+OSMR(4)	92％	100％
SFRP1+APC	94％	100％
			SFRP1+GATA-4	94％	100％
SFRP1+NDRG4	94％	100％
			SFRP1+OSMR(3)	94％	100％
SFRP1+OSMR(4)	94％	100％
			GATA-4+OSMR(4)	94％	100％
NDRG4+OSMR(3)	94％	100％
			GATA-5+SFRP1	96％	100％
GATA-5+OSMR(3)	96％	100％
			SFRP2+OSMR(4)	96％	100％
GATA-4+OSMR(3)	96％	100％
			SFRP1+SFRP2	98％	100％
SFRP2+OSMR(3)	98％	100％
			SFRP1+SFRP2+APC	100％	100％
SFRP2+OSMR(3)+APC	100％	100％

＊(3)和(4)反映了用于评估OSMR基因甲基化的引物组合

＊＊对应于第二种截取值组的灵敏度示于表25的括号间。

标志物对腺瘤和癌组织样品的检测效果

对于早期癌症检测来说重要的是标志物对早期癌症的检测效果。因此，将测试组的50个癌症病例进一步分为2个诊断组：癌和腺瘤。表27和28中总结了结果。对结直肠癌检测的灵敏度介于35％～88％，而对腺瘤检测的灵敏度则介于31％～88％，其中二者的对应特异性均为100％。这些结果表明，所选择的这组基因对结直肠癌具有高度特异性，其中包含了一些对早期检测具有前景的标志物。

表27.标志物对癌样品的检测效果

基因＊	癌	对照	临界比值	灵敏度	特异性
						GATA5	34	39	12	53	100
GATA4	34	39	17	74	100
						SFRP1	34	39	47	82	100
SFRP2	34	39	28	68	100
						APC	34	39	16	35	100
MGMT	34	39	18	35	100
						NDRG4	34	39	7	62	100
OSMR(3)	34	39	47	88	100
						JPH3	34	39	55	82	100
ADAM23	34	39	2	59	100

＊(3)反映了用于评估OSMR基因甲基化的引物组合

表28.标志物对腺瘤样品的检测效果

基因＊	腺瘤	对照	临界比值	灵敏度	特异性
						GATA5	16	39	12	63	100
GATA4	16	39	17	88	100
						SFRP1	16	39	47	88	100
SFRP2	16	39	28	81	100
						APC	16	39	16	50	100
MGMT	16	39	18	63	100
						NDRG4	16	39	7	69	100
OSMR(3)	16	39	47	88	100
						JPH3	16	39	55	81	100
ADAM23	16	39	2	31	100

＊(3)反映了用于评估OSMR基因甲基化的引物组合

标志物在粪便样品中的检测效果

选择了组织中9个检测效果最好的甲基化标志物(GATA4、GATA5、SFRP1、SFRP2、NDRG4、APC、ADAM23、OSMR3及JPH3)用于在粪便样品中进行评估。还对β-肌动蛋白拷贝数进行定量，以作为样品质量和DNA产量的对照。

利用7900HT快速实时PCR系统(Applied Biosystems)，通过实时MSP对所有可用粪便样品中这些基因的甲基化拷贝进行定量。

表29中显示了在来自腺瘤和结直肠癌的粪便样品中9个基因(肌动蛋白、SFRP2、GATA5、GATA4、APC、SFRP1、NDRG4、OSMR3和ADAM23)各自的检测效果。除了SFRP2，大多数基因均得到100％的特异性。在结直肠癌患者粪便样品中检测效果最好的基因为：GATA4(灵敏度为73％)、SFRP1(灵敏度为67％)、OSMR3(灵敏度为67％)和NDRG4(灵敏度为60％)，上述基因对应的特异性均为100％。

表29.标志物在粪便样品中的检测效果

	样品数	Act	SFRP2	GATA5	GATA4	APC	SFRP1	NDRG4	OSMR(3)	Adam23
											临界值(拷贝数)		200	1	1	4	1	1	0	10	1
腺瘤灵敏度	13	15％	38％	0％	15％	8％	8％	15％	8％	0％
											CRC灵敏度	15	67％	67％	27％	73％	47％	67％	60％	67％	40％
特异性	19	95％	84％	100％	100％	100％	100％	100％	100％	100％

标志物组合在粪便样品中的检测效果

发现了4个候选的甲基化标志物在粪便样品中得到最佳的灵敏度和特异性：GATA4、SFRP2、NDRG4、OSMR。还对β-肌动蛋白拷贝数进行定量，以作为样品质量和DNA产量的对照。研究了这4种甲基化标志物组合的检测效果。利用7900HT快速实时PCR系统(AppliedBiosystems)，通过实时MSP对所有可用粪便样品中这些基因的甲基化拷贝进行定量。表30显示了结果，并列出了所使用的截取值(拷贝数)。例如，对于最灵敏的标志物组合SFRP2+GATA4+NDRG4+OSMR，各标志物的截取值分别为SFRP2＝2；GATA4＝4；NDRG4＝0.1和OSMR＝10。这种组合具有95％的特异性，对CRC具有87％的灵敏度，对腺瘤具有46％的灵敏度。优选的2个标志物组合NDRG4+GATA4具有100％的特异性，对CRC具有73％的灵敏度，对腺瘤具有33％的灵敏度。

表30.标志物组合的检测效果

＊组合中未使用标志物用(-)表示

针对不同的UICC分期，评价了最灵敏的标志物组合SFRP2+GATA4+NDRG4+OSMR的检测效果。结果总结于表31中。

表31.标志物组合SFRP2+GATA4+NDRG4+OSMR针对不同UICC分期的检测效果

UICC分期	阴性	阳性	总数
				？		1	1
I	1	4	5
				II		4	4
III	1	3	4
				IV		1	1
样品总数	2	13	15

实施例2

基于再次表达，利用Base5甲基化模式平台对代表了145个基因启动子的224个不同的基因测定进行了测试(数据未显示，详细内容参见参考文献2)。使用实时MSP，利用从65个结直肠癌患者(所有阶段)预先收集的肿瘤和74个远端切除物(组织病理学正常)验证了评价29个基因启动子的37个甲基化差异最大的基因序列。几种标志物在所述组织样品中可靠地检出了CRC(数据未显示)。这些结果又被一个包含59个取自非CRC癌症患者的样品(覆盖I-III期的20个乳腺癌、21个肺癌和22个膀胱癌样品)、39个非癌性对照样品、34个癌和16个腺瘤的独立测试组得以证实。检测了非结直肠癌组织样品后，我们得到了59个结果，这是因为有4个是无效的。当所设置的分析截取值为100％的特异性时(基于39个非癌对照)，9个检测效果最好的标志物的各个检测效果示于图2中。最具组织特异性的标志物包括：NDRG4、OSMR、SFRP1、ADAM23、GATA5和MGMT。

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3)针对血浆DNA的实验

与血浆DNA相关的实验材料与方法

样品的收集和处理

血浆样品取自德国、荷兰和比利时的多个中心。

使用EDTA Vacutainer^TM管每个对象采集10ml血液。本研究中包含了基于结肠镜检查的无疑似结果、患腺瘤或癌的个体。抽血后4小时内，通过以1500g离心15分钟(4℃)将血浆组分与细胞组分分离。将血浆移至新管中并再次离心(1500g，15分钟，4℃)，然后将上清液转移到新管中并储存于-80℃备用。利用干冰运输该样品。

本研究中包含了来自于患有I-IV期结直肠癌患者的血浆样品和属于下列组的不同对照。表32和33概述了所收集的样品集合。

-结直肠癌组：病理学证实患有I-IV期结直肠癌的患者(根据UICC的分期分组)

-腺瘤

-非癌对照：未患癌症的患者

-癌症对照：患有非结直肠癌的癌症患者

表32：血浆训练组1

表33.血浆训练组2

从血浆样品分离DNA

利用15ml的Heavy Phase lock Geltube(PLG管)(Eppendorf，货号#0032005.152)使用规模扩大的酚-氯仿DNA分离方法或者使用来自Invitrogen的

gDNA 1ml血清试剂盒(货号#CS11040)从血浆样品(1.2～6ml)分离DNA。

酚-氯仿方法

将血浆样品解冻，向每种血浆样品加入1/10体积的10×缓冲液(240mM EDTA(pH 8.0)，750mM NaCl)、1/10体积的10％SDS以及向每1ml样品中加入5μl的蛋白酶K(母液为20mg/ml)(例如向3ml样品中加入15μl)。将上述混合物在48℃连续震荡(200 RPM)孵育过夜。

随后，将PLG管以2500 RCF离心3分钟，加入样品混合物和体积大致相同的酚/氯仿(Invitrogen，货号#15593049)。在室温下该溶液短暂涡旋震荡，使用试管摇床混合10分钟，并以2500 RCF离心5分钟。如果回收的样品体积≤4毫升，则加入相同体积的酚/氯仿。再次用酚/氯仿处理上层水相。

向上层水相加入5μl糖原、1/10体积的7.5M醋酸铵和2～2.5倍体积冰冷(-20℃)的100％乙醇，使DNA沉淀。将试管轻轻倒转并在-20℃孵育至少1小时，然后以17000 RCF离心30分钟(4℃)。小心吸去乙醇。用新鲜制备的2ml 70％乙醇清洗沉淀，轻轻涡旋震荡，在4℃以17000 RCF离心15分钟。在小心除去剩余的乙醇后，将沉淀在空气中干燥并重悬于45μl的LoTE(pH 8.0)中。将所分离的DNA储存于-80℃备用。这种方法可使DNA的平均回收率达到

gDNA 1ml血清试剂盒

将血浆样品解冻，根据制造商的说明，使用

gDNA1ml血清试剂盒分离DNA，例外的是，使用来自Promega的

大体积磁性分离装置(货号#V3471)使该方法规模扩大以用于更大的样品体积。结果示于表41中。

DNA修饰

利用移液机器人(Tecan Freedom EVOII，Roma，Liha，Mca，Te-Vacs)，采用来自Zymo Research的EZ-96 DNA甲基化试剂盒(货号#D5003)对上述方法中分离得到的全部DNA进行亚硫酸氢钠处理(BT)。简言之，将45μl的血浆DNA样品与5μl的M-稀释缓冲液(试剂盒中提供)混合，在37℃以1100RPM震荡孵育15分钟。然后，将该混合物与100μl稀释的CT转换试剂(试剂盒中提供)一起在70℃震荡孵育3小时(避光)。随后，根据制造商的说明，对经修饰的DNA进行脱盐和去磺化，并根据所用的浓缩方法用40μl或20μl的1mMTris-HCl(pH8.0)溶液洗脱。经洗脱的材料储存于-80℃备用。

DNA扩增

利用7900HT快速实时PCR仪(来自Applied Biosystems)进行实时MSP。

将2.4μl经修饰的DNA加至PCR混合物(总体积12μl)中，所述PCR混合物含有自制缓冲溶液(终浓度为：16.6mM(NH₄)₂SO₄、67mM Tris(pH 8.8)、6.7mM MgCl₂、10mM β-巯基乙醇)、dNTP(5mM；Amersham Biosciences，货号#27-2035-02)、甲基化特异性正向引物(6ng)、甲基化特异性反向引物(18ng)、分子信标(0.16μM)和JumpstartDNA Taq聚合酶(0.4单位；Sigma，货号#D9307)。

循环条件示于表34中。

包含了标准曲线(9.6×10⁵～9.6拷贝)以通过将Ct值与标准曲线参校来确定未知样品的拷贝数。

表34.循环模式

1	活化	95℃	5分钟
				2	变性	95℃	30秒
3	退火和数据收集	57℃(对于APC为51℃)	30秒
				4	延伸	72℃	30秒
5	循环	重复步骤2至4，45次

结果

在组织和血浆样品中鉴定和验证的标志物。

组织和血浆的测定有效率：

使用实时MSP对293个FFPE和317个血浆样品进行处理(表35)。98％的FFPE样品和100％的血浆样品的实时MSP测定产生了有效的结果。

表35.通过实时MSP评估样品的总结

标志物的鉴定

使用结肠癌细胞系的再次表达模式来鉴定候选基因，并使用Base5甲基化模式平台测试了组织中最有前景的标志物(代表了145个基因启动子的224个不同的基因测定)(数据未显示，详细内容参见Straub，J.等)。将启动子序列与基因表达建立关联以鉴定表观遗传沉默的基因。将用于表观遗传靶基因再次表达分析的成熟的药理揭示策略(5-氮杂-2’-脱氧胞苷(DAC)和曲古菌素A(TSA))与专用的高级生物信息学工具结合以鉴定启动子易被甲基化的基因。

在结肠组织中选择标志物

使用37个实时甲基化特异性PCR(实时MSP)测定对再次表达所鉴定的候选标志物进行筛选。这些测定用来评估从各处临床收集来的293个福尔马林固定、石蜡包埋(formalin-fixed paraffin-embedded，FFPE)的组织样品中29个基因启动子的甲基化状态。样品包括99个各阶段癌症样品、16个腺瘤样品、63个取自非CRC癌症患者的样品(20个乳腺癌[I-III期]、22个膀胱癌[I-III期]、21个肺癌[I期和II期])、39个取自无癌症表征之患者的样品以及76个来自于CRC患者的远端切除物(组织病理学正常)。这些样品被分成训练测试组和独立测试组，用来选择最好的能够区分癌和非癌样品的基因甲基化测定。所述训练组包含预先收集的来自65个结直肠癌患者(所有阶段)的肿瘤和74个远端切除物。使用检测效果最好的10个基因针对独立测试组对结果进行了验证，所述独立测试组包含59个取自非CRC癌症患者的样品、39个非癌对照样品和50个癌症病例(34个癌症和16个腺瘤)。10个检测效果最好的组织标志物OSMR、SFRP1、GATA4、SFRP2、NDRG4、ADAM23、GATA5、MGMT、APC和JPH3各自的检测效果示于图7中，其中所设置的分析截取值给出100％的特异性，只有JPH3是例外(特异性为95％，其基于所述39个非癌对照样品)。对应的引物和分子信标序列总结于表3(上文中)。除了结肠测试基因，还测量了独立的参照基因β-肌动蛋白(ACT)。计算了结肠测试基因和ACT之间的比率，即该测定的测试结果。根据图5所示的决策树，这些样品被分为甲基化、非甲基化或无效。

标志物的互补性

测试了不同标志物的互补性。几种标志物的组合以高特异性和灵敏度可靠地检出CRC。最佳的两种标志物组合总结于表36中。对于100％的特异性，灵敏度为94～100％。

表36.使用实时MSP时，两个标志物组合可靠地检出CRC和腺瘤的检测效果(组织测试组：34个癌、16个腺瘤、39个对照)

血浆中的标志物测试

利用8个在组织中检测效果最好的标志物(OSMR、SFRP1、NDRG4、GATA5、ADAM23、JPH3、SFRP2和APC)对来自多个中心的101个可用的血浆样品(血浆训练组1：表32)进行评估。这些血浆样品包含34个无疑似结果的样品、25个取自非结肠癌患者的样品和42个取自覆盖结肠癌各阶段之患者的样品，其中有81％为I-III期的疾病。

根据规模扩大的酚-氯仿方法来分离DNA；随后如上所述对全部DNA样品进行修饰。将血浆训练组1洗脱至40μl的BT洗脱体积，其中2.4μl用于实时MSP，该2.4μl经洗脱DNA对应相当于进入分离步骤的0.07～0.36ml的原血浆样品(＝相当于每个PCR 0.07～0.36血浆的DNA)。

图8显示了所述8个基因测定在血浆样品中的各自检测效果(灵敏度百分比)，其灵敏度值为14～33％。表37显示了对应的特异性值。得到的特异性值为97～100％。

利用预先从多个中心收集的另外的独立样品组(血浆训练组2：表33)对在训练组1中检测效果最好的5种标志物进行进一步地研究。将基因测定数由8个减少至5个，使每个样品进行更少的检测，并向每个PCR反应中加入相当于更大等份血浆的DNA。通过用20μl而非40μl的BT洗脱体积进行洗脱，样品组2中的经修饰DNA更加浓缩。利用实时MSP对从样品组2中洗脱的2.4μl DNA进一步处理，根据DNA分离之前的血浆体积，其对应相当于每个PCR反应0.16～0.72ml血浆的DNA。

所述训练组2的血浆样品包含64个无疑似结果的样品、49个腺瘤样品、25个取自非结直肠癌的癌症患者的样品和78个取自覆盖各阶段结直肠癌患者的样品(其中76％为疾病的I-III期)。5个基因测定各自的检测效果(灵敏度％)示于图8，对应的特异性值示于表37。特异性值为96～99％，灵敏度为23～47％。

发现4个候选的甲基化标志物在血浆样品中具有最好的灵敏度和特异性：OSMR、NDRG4、GATA5和ADAM23；上述血浆组合的检测效果示于表38。该4个甲基化基因的组合的检测效果(I-III期结直肠癌)表明：当优化灵敏度时，其具有73％的灵敏度和92％的特异性；而当优化特异性时，其具有64％的灵敏度和98％的特异性。当将DNA分离前体积小于2ml的样品排除时，灵敏度可进一步提高(从64％至68％)。结果列示于表39。

表37.各基因测定的检测效果(展示了针对两个血浆训练组的特异性(％)以及针对血浆训练组2中腺瘤的灵敏度(％))

	OSMR	SFRP1	NDRG4	GATA5	ADAM23	JPH3	SFRP2	APC
									特异性％(全部59个对照)，血浆组1	100	98	100	97	98	97	97	97
特异性％(全部89个对照)，血浆组2：每个实时MSP测定增加了等同于DNA的血桨	99	96	99	99	97	N/A	N/A	N/A
									灵敏度％，腺瘤血浆组2：每个实时MSP测定增加了等同于DNA的血浆	2	2	0	6	2	N/A	N/A	N/A

表38.使用实时MSP的血浆标志物组合的检测效果(不依赖于DNA分离前回收的血浆体积)

表39.利用DNA分离前的至少2ml血浆，使用实时MSP的血浆标志物组合的检测效果

来自血浆样品的DNA平均回收率

根据酚-氯仿方法从结直肠癌患者分离血浆DNA(两步离心后收集得到)，并使用Molecular Probes的PicoGreen dsDNA定量试剂盒进行定量。血浆DNA的平均回收产率为117ng/ml血浆，其范围是41～384ng/ml(数据来自25位患者)。

表40.血浆样品的DNA平均回收产率

样品	ng/ml血浆
		1	41
2	66
		3	264
4	163
		5	54
6	121
		7	87
8	107
		9	53
10	121
		11	88
12	201
		13	53
14	47
		15	384
16	87
		17	115
18	107
		19	70
20	72
		21	122
22	146
		23	71
24	195
		25	94

使用血浆样品时酚/氯仿方法与

的比较

该实验用于显示使用本发明的方法从血浆分离DNA。根据上文所述的扩大规模的酚/氯仿和

分离方法，对体积为2.5～6ml的血浆进行处理。研究了来自卵巢、前列腺和结肠血液样品的血浆。目的是分离DNA(根据这两种方法)，并进一步通过亚硫酸氢盐处理和β-肌动蛋白实时MSP来平行处理样品，从而确定样品量和DNA产量。这两种分离方法对应的β-肌动蛋白拷贝数总结于表16中。

表41.酚/氯仿分离方法与

分离方法中的β-肌动蛋白拷贝数

样品编号	样品来源	血浆体积(ml)	β-肌动蛋白拷贝数酚	β-肌动蛋白拷贝数ChargeSwitch
					1	卵巢癌	6.0	4349	863
2	卵巢癌	6.0	2710	466
					3	卵巢癌	6.0	3922	967
4	卵巢癌	6.0	758	490
					5	卵巢癌	6.0	4201	423
6	卵巢癌	6.0	2644	139
					7	卵巢癌	6.0	1472	187
8	前列腺癌	2.6	145	7
					9	结肠癌	2.5	317	52
10	阳性对照细胞系	N/A	8702	1314

血浆训练组2的更新的结果

从临床获得关于血浆训练组2的更正信息。对于血浆训练组2来说，癌症病例保持不变，出现了一个新的“未知”分类，对照数为52(而不是之前的64)以及腺瘤为39例(而不是之前的49例)。这使得样品重新分类，如表42中所示。因为更正信息划分出多种未知癌症病例(对照)作为早期癌症，所以可以得出有关早期癌症检测的另一些结论。如表43所示，所述血浆组合允许非常灵敏地(70％)检测早期样品。通过排除血浆体积小于2ml的样品可以得到改善的检测(表44)。

表42.利用实时MSP测试的样品和可评价率的总结

表43.使用血浆组2时四基因标志物组合的检测效果特征

表44.使用血浆组2的4基因标志物组合的检测特性

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Hong-Zhi Zou，Bao-Ming Yu2，Zhi-Wei Wang，Ji-Yuan Sun，HuiCang，Fei Gao，Dong Hue Li，Ren Zhao，Guo-Guang Feng andJing Yi.Detection of aberrant p16methylation in the serumof colorectal cancer patients.

Clin Cancer Res.Vol.8，188-191，January 2002.

4)N-Myc下游调节基因4(NDRG4)启动子甲基化是结直肠癌的灵敏 且特异性的生物标志物

摘要

背景和目的：N-Myc下游调节基因4(NDRG4)是NDRG家族4个成员之一，其参与细胞分化和神经突形成。本文中，我们阐明了NDRG4启动子甲基化在结直肠癌(CRC)中的作用。

方法：使用甲基化特异性PCR(MSP)和亚硫酸氢盐测序，在CRC细胞系以及一系列充分表征的正常结肠粘膜、结直肠腺瘤、癌和其它肿瘤中分析了NDRG4启动子的甲基化。另外，使用定量MSP分析CRC患者粪便DNA和对照中NDRG4启动子的甲基化。通过对NDRG4编码外显子及其侧翼内含子区域直接测序来对NDRG4基因座进行杂合性丢失(loss of heterozygosity，LOH)作图和突变分析。分别利用RT-PCR和免疫组化对NDRG4的mRNA和蛋白表达进行研究。

结果：在7/8 CRC细胞系中观察到NDRG4启动子的甲基化。结在CRC组织中NDRG4启动子甲基化程度为86％(71/83)，而在正常结肠粘膜中为4％(2/48)。另一独立系列的CRC也证实了NDRG4具有高程度的甲基化(69％，127/183)。还在81％(13/16)的食道腺癌和77％(17/22)的胃癌中观察到NDRG4的甲基化，但是在皮肤(0/8)、肾(1/10)、卵巢(0/20)、前列腺(0/10)、乳腺(0/16)和食道鳞状细胞癌(0/12)中却没有或几乎没有观察到NDRG4启动子的甲基化。在76％(16/21)的CRC患者的粪便DNA中可检测到NDRG4启动子甲基化，而只有3％的对照(2/67)测试为阳性(灵敏度为76％，特异性为97％)。未发现突变，但30.5％的肿瘤在NDRG4基因座上显示LOH。与正常组织相比，在CRC中NDRG4的RNA和蛋白质水平的表达均有所下降。

结论：在CRC细胞系、结直肠腺瘤和癌及胃肠道的其它腺癌中，NDRG4经常发生甲基化。粪便DNA中NDRG4启动子的甲基化可用作检测CRC的灵敏且特异性的生物标志物。

简介

先前用来鉴定在肿瘤内皮细胞中发生表观遗传调节的基因的微阵列实验揭示出81种基因，其在肿瘤内皮细胞中表达下调并在使用5-氮杂-2’-脱氧胞苷(DAC)和曲古菌素A(TSA)处理后再次表达。肿瘤内皮细胞中这些基因的沉默与启动子组蛋白H3去乙酰化和H3赖氨酸4甲基化缺失相关，而不涉及启动子CpG岛的DNA甲基化。令人感兴趣的是，已报道所述81个基因中的21个基因(26％)在多种类型的肿瘤中都被过度甲基化和沉默，这表明在肿瘤细胞中许多的经鉴定基因启动子都有可能受启动子甲基化的调控(Hellebrekers，Melotte等，2007)。N-myc下调基因-4(NDRG4)是经鉴定的含CpG岛的基因之一，其也被称为Smap-8和Bdm1。NDRG4是NDRG家族的一员，该家族由4个成员组成，即NDRG1、-2、-3和4(其氨基酸序列具有57-65％的同源性)(Zhou，Kokame等，2001；Qu，Zhai等，2002)。系统发生分析证实存在两个亚家族，一个由NDRG1和-3组成，另一个由NDRG-2和-4组成(Qu，Zhai等，2002)。NDRG1是NDRG家族中被研究得最深入的成员。NDRG1的表达在癌细胞中常常下调(van Belzen，Dinjens等，1997；Kurdistani，Arizti等，1998；Guan，Ford等，2000；Bandyopadhyay，Pai等，2003；Bandyopadhyay，Pai等，2004；Shah，Kemeny等，2005)，并被DAC处理所上调(Guan，Ford等2000；Bandyopadhyay，Pai等，2004)。另外，NDRG2也被描述为候选的肿瘤抑制基因(Deng，Yao等，2003；Lusis，Watson等2005)，并且有报道指出其在脑膜瘤(Lusis，Watson等，2005)和不同癌细胞系(Liu，Wang等，2007)中被甲基化。迄今，NDRG3和NDRG4在癌症中的功能尚未被阐明。NDRG4基因位于染色体16q21-q22.3，跨越26kb，包含17个外显子，其覆盖三种cDNA同工型NDRG4-B、NDRG4-Bvar和NDRG4-H的全部序列。NDRG4 mRNA主要存在于细胞质中。目前，NDRG4的表达仅描述于使用Northern印迹分析的脑和心脏中。NDRG4的分子特征和该蛋白在神经系统中的作用主要在大鼠中进行研究(Nakada，Hongo等，2002；Ohki，Hongo等，2002；Maeda，Hongo等，2004；Hongo，Watanabe等，2006)。NDRG4蛋白可参与导致细胞分化和神经突形成的过程(Ohki，Hongo等，2002)。

本文中，我们报道了NDRG4在正常结肠粘膜中表达并在结肠癌组织中下调。此外，还对NDRG4的启动子甲基化、杂合性丢失(LOH)和突变失活进行了研究。我们鉴定了NDRG4启动子在CRC及其它胃肠道肿瘤中经常发生甲基化，并且还研究了其作为CRC患者粪便和对照中生物标志物的潜力。

材料和方法

细胞系、研究群体和组织

将CRC细胞系HT29、SW480、Caco2、Colo205、RKO、LS174T、HCT116和SW480在添加了10％热灭活胎牛血清(Hyclone)的DMEM(Invitrogen)中培养。为了研究抑制DNA甲基转移酶后NDRG4的再次表达，用1μM DAC(Sigma)处理HCT116和RKO。

在一系列充分表征的结直肠癌、腺瘤和对照中研究了NDRG4启动子的甲基化(图9)。第一系列由取自50岁以上患者的经福尔马林固定、石蜡包埋的结直肠癌样品(n＝90)，这些样品是从马斯特里赫特大学医院病理学系回顾性收集的。如果存在的话，还在这些患者中收集正常组织(n＝79)和腺瘤组织(n＝60)。将以下组织选作对照组织：因非特异性腹症接受内窥镜检查之患者的组织学正常活检材料(n＝51)、在10年内未发展成结直肠癌之患者的腺瘤活检材料(n＝22)以及患有各种炎性肠病之患者被切除的结肠粘膜(n＝33)。所述最后一组包含克罗恩病(n＝1)、溃疡性结肠炎(n＝6)、非特异性炎症(n＝9)和憩室炎(n＝18)。另一个独立的结直肠癌系列(n＝200)是从荷兰人群饮食与癌症研究(Netherlands Cohort Study，NLCS)中随机挑选出的，详细情况在别处有所描述(van den Brandt，Goldbohm等，1990；Brink，de Goeij等，2003)。系列特征列于附加的表1中。此外，对存档的经福尔马林固定、石蜡包埋的皮肤癌(n＝8)、肾癌(n＝10)、卵巢癌(n＝10)、前列腺癌(n＝10)、乳腺癌(n＝15)、胃癌(n＝22)和食道癌(n＝28)组织进行NDRG4启动子甲基化的分析。这项研究得到了马斯特里赫特大学和马斯特里赫特大学医院的医学伦理委员会(MEC)的批准。

表45.系列特征

表45：患者特征NDRG4b

＊岁±SD，利用单因素方差分析(One-way ANOVA)进行分析

男/女，利用Pearson’s χ²进行分析

利用Pearson’s χ²进行分析。无法追查到解释不同总样品数的所有样品的位置

CRC+：结直肠癌患者

CRC-：非结直肠癌患者：

NS：不显著

TNM分期：“肿瘤淋巴结转移(Tumour Node Metastasis)”分期

从组织和细胞系分离DNA

将5μm厚的组织块切片用苏木精和曙红染色，并交于病理学家修正(AdB)。在分离DNA前，将5个20μm厚的切片进行脱蜡处理。根据制造商的说明，使用

DNA分离试剂盒(Gentra systems)从这些组织样品和细胞系中提取DNA。简言之，向组织样品中加入细胞裂解液和蛋白酶K(20mg/ml，Qiagen)并在55℃孵育过夜。随后，在37℃抽提DNA 72小时，去除蛋白质，并使用100％异丙醇沉淀DNA。最后，DNA在水化缓冲液中重新水化。

收集和制备粪便DNA

结肠镜检查的阴性对照粪便样品(n＝67)来自于50岁以上的健康人群，他们是在马斯特里赫特大学医院基于工作场所的社区CRC筛查研究计划中筛选出的。马斯特里赫特大学、马斯特里赫特大学医院和the Dutch‘Wet op Bevolkingsonderzoek’(WBO)的医学伦理委员会(MEC)批准了这一筛查研究。对于从阿姆斯特丹自由大学医学中心(Free University Medical Center)采集的粪便样品的结肠镜检查证实了CRC患者(n＝21)覆盖了CRC的各个时期。为了回收人类DNA，将全部粪便样品在7倍过量体积的粪便匀浆缓冲液(Exact sciences，Marlborough，MA，USA)中匀浆，并分成32ml等份(含有相当于4g粪便)。将每等份进行离心，并将上清液与每毫升80单位的核糖核酸酶A在37℃一起孵育60分钟。然后用醋酸钠异丙醇(pH 5.2)沉淀总DNA，再用70％乙醇清洗并重悬于4ml 1×TE(pH 7.4)中。将400μl 10×缓冲液(240mM EDTA(pH 8.0)，750mM NaC)、400μl 10％SDS和20μl蛋白酶K(20mg/ml)加入样品中，在48℃连续震荡孵育过夜，并于次日离心。此外，向样品中加入5ml的酚-氯仿-异戊醇，室温孵育10分钟，然后离心。重复酚-氯仿-异戊醇提取步骤，然后将水相转移到新管中，沉淀、清洗DNA，并将沉淀重悬于2ml LoTE(pH 8.0)中。

亚硫酸氢钠转换、甲基化特异性PCR和亚硫酸氢钠测序

根据制造商的说明，采用EZ DNA甲基化试剂盒(ZYMO researchCo.，Orange，CA)对500ng基因组DNA进行亚硫酸氢钠修饰。通过首先采用侧翼PCR引物扩增经亚硫酸氢盐修饰的DNA(但不区分甲基化或非甲基化的DNA)来利于对取自细胞系和经福尔马林固定、石蜡包埋的组织并用亚硫酸氢盐处理过的DNA进行NDRG4的MSP分析。该PCR产物被用作MSP反应的模板(Herman，Graff等，1996；vanEngeland，Weijenberg等，2003)。侧翼引物、MSP引物和PCR条件列于表2(见上文)中。所有PCR均使用以下对照：未甲基化DNA(来自正常淋巴细胞的DNA)、甲基化DNA(在体外用SssI(New EnglandBiolabs)甲基转移酶处理的正常淋巴细胞的DNA)和无DNA的对照。将10μl的每种MSP反应物直接加样至2％琼脂糖凝胶上，并在紫外光照射下显像。为了对经亚硫酸氢钠转换的DNA进行测序，使用TOPO-TA克隆试剂盒(Invitrogen，Breda，the Netherlands)对PCR产物进行扩增和克隆。选取单个克隆并使用的自动化测序仪(AppliedBiosystems，Foster City，CA)进行测序。所使用的引物序列为SEQ IDNO：5705’-GATYGGGGTGTTTTTTAGGTTT-3’(有义引物)和SEQID NO：65’-CRAACAACCAAAAACCCCTC-3’(反义引物)。

定量MSP

使用7900HT实时PCR系统(Applied Biosystems)进行定量实时MSP。将2.4μl经修饰的DNA(相当于2.5μg未转换的DNA)加至PCR反应混合物中(总体积为12μl)，其中包含缓冲液(16.6mM(NH₄)₂SO₄、67mM Tris(pH 8.8)、6.7mM MgCl₂、10mM β-巯基乙醇)、dNTP(5mM)、正向引物(6ng)、反向引物(18ng)、分子信标(0.16μM)、BSA(0.1μg)和Jumpstart DNA Taq聚合酶(0.4单位；SigmaAldrich)。PCR程序如下：95℃5分钟，接着是45个循环的95℃30秒，57℃30秒，72℃30秒，然后是72℃5分钟。所使用的引物序列为SEQ ID NO：175’-GTATTTTAGTCGCGTAGAAGGC-3’(正向引物)，SEQ ID NO：185’-AATTTAACGAATATAAACGCTCGAC-3’(反向引物)和SEQ ID NO：195’-FAM-CGACATGCCCGAACGAACCGCGATCCCTGCATGTCG-3’-DABCYL(分子信标)。还包含标准曲线(2×10^6-20拷贝)以通过将Ct值与标准曲线参校来确定未知样品的拷贝数。

杂合性丢失分析

通过使用位于多态微卫星座位侧翼的特异性引物对通过PCR扩增对等位基因状况进行分析。荧光染料标记的位于16q21-22的微卫星标志物DS16S3089(正向引物：SEQ ID NO：526AGCCCTGCCTGATGAA；反向引物：SEQ ID NO：527TGTGTGGGTAGCACCAA)和DS16S3071(正向引物：SEQ ID NO：528AGCTCTCTGATGGGCAGTG；反向引物：SEQ ID NO：529TGGAAGATAGCCCCCAAAT)从基因组公共数据库中选择。DS16S3089位于NDRG4下游1.9Mb，DS16S3071位于NDRG4上游1.8Mb。使用50ng DNA作为模板，在15μl体系(包含0.25mM dNTP，0.3μM引物，1.5mM MgCl₂和0.04单位的Taq聚合酶(platinum，Invitrogen))对匹配的肿瘤/正常样品DNA进行PCR扩增。对所述反应混合物进行如下步骤：在95℃变性3分钟，30个循环的95℃1分钟，60℃退火1分钟，以及72℃1分钟，最后在72℃延伸10分钟。使用自动测序仪对PCR产物进行测序(Applied Biosystems，Foster City，CA)，并使用Genemapper软件4.0版(Applied Biosystems)进行分析。只有基因型表现出两种不同的大小(即杂合的微卫星(MS)等位基因)才被用于评价等位基因状况。将等位基因比率计算为(N1/N2)/(T1/T2)，即肿瘤(T)与正常(N)等位基因区域值的比率。LOH被定义为等位基因比率大于1.35或小于0.67。

突变分析

使用从石蜡包埋的结肠腺癌组织提取的基因组DNA分别扩增NDRG4的编码外显子区域及其侧翼内含子区域。使用巢式PCR方法来进行突变分析。外部PCR使用了125ng基因组DNA、正向和反向引物各50pmol以及1单位的Taq聚合酶混合物(Invitrogen)。使用Thermo-Fast 96孔板(Corning)利用热循环仪进行DNA扩增，步骤如下：一开始95℃变性步骤3分钟开始，接着是35个循环的95℃变性30秒，在每种引物特定的温度下退火30秒，72℃延伸30秒。额外的最后一步延伸为72℃5分钟。在外部PCR完成后，使用与外部PCR同样的条件进行内部PCR。针对每个外显子(包括内含子-外显子边界)的PCR引物组详细地列示于附加表3中。使用Millipore多重筛选96孔板(Millipore)对DNA进行纯化。使用

Terminator v1.1循环测序试剂盒对PCR产物进行扩增，并使用ABI 3730 DNA分析仪(AppliedBiosystems，Foster City，CA)对该扩增产物进行测序。

表46.NDRG4突变分析引物序列和PCR条件。

外显子编号	引物	SEQIDNO：	有义引物	SEQIDNO	反义引物	退火温度
							2	外部	530	CCCAGCCCCGACTTGC	531	CTAAGACCTCAAAGGCGCG	56
	内部	532	TGTCCTTCTCCGCCCGG	531	CTAAGACCTCAAAGGCGCG	62
							3	外部	533	CCCCTCTGTTTGCCTTCC	534	CTGGCCAGGTGGGGTG	56
	内部	533	CCCCTCTGTTTGCCTTCC	535	GCCAGGTGGGGTGAGGG	62
							4	外部	536	CTGCGTCACCTCATTCCC	537	TCACCGCTCTGGCTGATG	56
	内部	538	GAGGAGCCAAGAGCGGAGG	537	TCACCGCTCTGGCTGATG	62
							5	外部	539	CCCCTCTGCTCAGCCATAG	540	GCTGGAGACAGGCAGAGGG	56
	内部	539	CCCCTCTGCTCAGCCATAG	541	GGAGACAGGCAGAGGGGG	56
							6	外部	542	GTAGGTACCCTGAGCCCCC	543	ACCCCTGGGCCCTAGC	56
	内部	544	CCCTCTGCCTGTCTCCAGC	543	ACCCCTGGGCCCTAGC	62
							7	外部	545	GGAAATGGCACCCCTAGC	547	GGGGGCATGGGGAGAC	56
	内部	548	GCACCCCTAGCCCTAGAGT	547	GGGGGCATGGGGAGAC	56
							8	外部	549	CCTTGAAGACTTTACAGAGTGTTTC	550	GTATACCCACCCCACCCC	56
	内部	551	CTGCACCCATCCTGGCC	550	GTATACCCACCCCACCCC	62
							9	外部	552	GGGGTGGGGTGGGTATAC	553	GCTGGGAGGGGCAAATC	56
	内部	552	GGGGTGGGGTGGGTATAC	554	GGCAAATCCCAGATCACCC	62
							10	外部	555	GCCTCCATCCATCTCCCTG	556	GGCTGCTGATCCCACCC	56
	内部	557	CATGCCTCCATCCATCTCC	556	GGCTGCTGATCCCACCC	62
							11+12	外部	558	CACCTCTGCCTCTGCCCC	559	CCCCAGTGAGCCCACAGC	56
	内部	560	CCTCTGCCCCTCCCCC	559	CCCCAGTGAGCCCACAGC	62
							13	外部	561	TGCCTTGGCAATGGGG	562	CAGGGCTGGGGAAGAAAG	56
	内部	563	CTTGGCAATGGGGGTGG	562	CAGGGCTGGGGAAGAAAG	62
							14+15	外部	564	GGAGCTTGTCCTGGAGTGAG	565	GTGGGGTGGAAATGTACTCAC	56
	内部	566	TGGAGTGAGGGCCCTGC	565	GTGGGGTGGAAATGTACTCAC	62
							16	外部	567	TGCCCGCCAGTCCTCAG	568	TAAAGGGAACATGAGCCGG	56
	内部	569	CAGTCCTCAGGCCCATCC	568	TAAAGGGAACATGAGCCGG	56

＊每种情况的循环数均为35

定量逆转录PCR

根据制造商的说明，使用Rneasy Mini试剂盒(Qiagen)从细胞系、正常粘膜和肿瘤组织分离总RNA。使用无RNA酶的DNA酶组合(Qiagen)进行DNA酶处理来去除可能含有的基因组DNA杂质。使用Iscript cDNA合成试剂盒(Bio-Rad)来合成cDNA。用SYBR GreenPCR预混合物(Applied Biosystems，Nieuwekerk a/d IJssel，TheNetherlands)进行实时定量(RT-PCR)。每个反应的实时RT-PCR混合物由以下组分组成：1×iQ SYBR Green Supermix(Bio-Rad)、400nM正向引物(SEQ ID NO：3 5’-GGCCTTCTGCATGTAGTGATCCG-3’)和反向引物(SEQ ID NO：4 5’-GGTGATCTCCTGCATGTCCTCG-3’)以及对应于30ng总RNA的cDNA。作为标准对照，也使用针对亲环素A的引物。使用iCycler(Bio-Rad)以Tm为60℃进行40个循环的反应。使用比较Ct法来计算mRNA的表达差异。为了实现这一点，将每个样品的Ct值根据参照基因进行归一化(ΔCt＝样品Ct-亲环素Ct)。然后，表达倍数的差异计算为2^-ΔΔCt，其中ΔΔCt＝Δ样品Ct-Δ对照Ct。

免疫组化

对经福尔马林固定、石蜡包埋的正常结肠粘膜和CRC组织的组织切片(5μm)进行免疫组化。切片在二甲苯中脱蜡，用1％甲醇再水化及孵育30分钟以使内源性过氧化物酶失活。封闭后，使用NDRG4单克隆抗体(Abnova Corporation)对切片进行染色并孵育60分钟，所述单克隆抗体用含有0.1％吐温和0.5％牛血清白蛋白(BSA)的Tris-缓冲盐溶液(TBS)以1∶6000稀释。然后用第二抗体poly-HRP-GAM/R/RIgG(Immunologic，Immunovision Technologies)孵育切片，使用DAB底物生色团(Dako)显色，可见棕色沉淀，接着使用苏木精复染。未与第一抗体一起孵育的切片作为阴性对照。

数据分析

为了比较非参数的和分类的数据，我们视情况分别使用了Pearson’s χ2或Fisher’s确切检验以及单因素ANOVA、Kruskal-Wallis检验或Mann-Witney检验。为了比较非参数的和分类的数据，分别使用了McNemar检验和配对T-检验对各组中成对的样品进行分析。为了比较针对年龄和组织部位进行调整的分类数据(因为在CRC病例和对照之间观察到针对年龄和不同组织部位的显著差异)，使用了逻辑回归分析。所有提到的p-值都是两面的，p-值等于或小于0.05被认为是统计学显著的。采用Bonferroni方法修正了所有统计学检验以进行多重比较。数据分析是使用SPSS软件实现的(版本12.0.1)。

结果

CRC细胞系中NDRG4启动子的甲基化和表达

NDRG4基因的结构显示了位于相对于转录起始位点-556到+869位的密集的CpG岛(GC含量＞60％，观察到的CpG/预期的CpG的比值＞0.6，最小长度为200bp(Gardiner-Garden和Frommer，1987))，如图10所示。为了测定该区域可能的甲基化，我们设计了扩增CpG岛重叠片段的两对不同的MSP引物(1和2)。这些引物最初用于研究8种CRC细胞系(LS174、HCT116、HT29、RKO、CACO2、COLO2、SW48和SW480)的DNA甲基化。如图11a所示，使用两种引物对通过MSP分析发现，除了SW480以外所有细胞系均被甲基化。为进一步研究CpG岛甲基化的模式，我们对HCT116和SW480进行了亚硫酸氢钠测序。以亚硫酸氢钠修饰的基因组DNA为模板，对跨越39个CpG位点的启动子区域进行PCR扩增，并对每种细胞系的6个克隆进行测序。亚硫酸氢盐测序验证了MSP的数据：HCT116的39个位点几乎完全被甲基化，如图11b所示，而SW480几乎没有被甲基化的CpG位点。在用DAC处理后，CRC细胞系HCT116和RKO中的内源性NDRG4mRNA水平显著提高(图11c)。

正常组织和CRC组织中NDRG4的甲基化

利用亚硫酸氢钠测序，在三对原发肿瘤和与其匹配的正常结肠粘膜中证实了NDRG4的甲基化。图12a所示的结果显示，三个肿瘤样品具有密集的甲基化，而在正常结肠粘膜中则几乎观察不到甲基化。令人感兴趣的是，如图12a所示，与更下游区域相比，NDRG4 CpG岛的上游区域甲基化程度更高。随后，使用两种不同的引物对(1和2)研究了NDRG4在结直肠癌、腺瘤和正常结直肠粘膜中的甲基化状态。使用两种引物对得到的甲基化频率示于表47中。使用引物对2，观察到对照组正常粘膜的甲基化频率(2/48(4％))与CRC患者癌组织的甲基化频率(71/83(86％))具有显著差异(表47，p＝0.042 10-7)。另外，我们将CRC患者的邻接正常粘膜组织(9/78(12％))与非癌症患者的正常粘膜(2/48(4％)中的NDRG4启动子甲基化进行比较，未发现这两组具有显著差异(表47)。此外，为了研究在癌前病变中NDRG4的甲基化，我们将取自CRC患者(其同时或非同时发生肿瘤)的腺瘤与取自追踪10年后未发展成CRC之患者的腺瘤进行比较，我们观察到，来自CRC患者的腺瘤中NDRG4具有较高程度的甲基化，但是这些差异不具有统计学显著性(表47)。

表47.来自CRC患者的正常、腺瘤及癌组织以及非癌患者的正常、腺瘤组织的甲基化频率(％)。甲基化差异通过针对年龄(NDRG4p1，p2)和部位(NDRG4 p1)进行调整的逻辑回归进行分析。

缩写：CRC+，结直肠癌患者；P，P值；NS，不显著

为了证实CRC中NDRG4启动子具有高程度的甲基化，我们分析了另一个独立系列的183个CRC样品。与第一个研究系列的结果类似，我们观察到70％(127/183)的CRC患者表现出NDRG4甲基化。

对于两个独立系列来说，使用引物2对患有与NDRG4启动子甲基化有关的原发CRC之患者的临床病理特征作进一步分析，其显示与诊断时的年龄、性别、肿瘤部位或TNM分期没有任何联系(表49)。

为了研究癌症发展过程中NDRG4启动子的甲基化，我们对患者(可从其获得所有三种组织)的正常粘膜与腺瘤和癌组织中的甲基化频率进行了比较(表48)。我们的结果显示，与肿瘤邻接的正常粘膜(16％)相比，在癌(84％)中NDRG4的甲基化程度明显更高(表48，p＜0.0210-2)。除了癌以外，与正常结肠样品(14％)相比，来自CRC患者的腺瘤样品也显示了明显更高的NDRG4甲基化频率(61％)(表48，p＜0.0310-3)。最后，与腺瘤样品(63％)相比，NDRG4甲基化在癌组织(81％)中升高，尽管这种升高并不显著(引物对2，表48)。

表48.来自结直肠癌患者的癌组织、腺瘤及正常组织的NDRG4甲基化频率(％)。通过Mc Nemar检验分析甲基化差异。

由于某些变量的数据丢失，因此频率可能会发生变化。

缩写：CRC+，结直肠癌患者；P，P值；NS，不显著

使用两种不同的引物对1和2(扩增CpG岛中的重叠片段)对不同系列进行分析，如图10所示。使用引物对1，我们观察到与使用引物对2完全一致的结果，但是我们发现与使用引物对1相比，使用引物对2时所有亚组中的NDRG4甲基化均有所增加。令人感兴趣的是，我们发现了CRC患者腺瘤中的启动子甲基化(55/77(41％))与癌中的启动子甲基化(55/77(71％))相比具有显著性差异(表2，p＝0.012)，这是使用引物2时未观察到。此外，通过对取自CRC患者(其同时或非同时发生肿瘤)的腺瘤中的NDRG4甲基化状态(24/58(41％))与取自未发展成CRC之患者的腺瘤中的NDRG4甲基化状态(4/31(13％)进行比较，我们观察到使用引物对1时取自CRC患者的腺瘤中的NDRG4甲基化有所增加，尽管这些差异也不具有统计学显著性。对于两个独立系列来说，对患有与NDRG4启动子甲基化有关的原发CRC之患者的临床病理特征作进一步分析，其显示与诊断时的年龄、性别或TNM分期没有任何联系。然而，我们发现使用引物对1时启动子甲基化与肿瘤部位具有显著关联性(表49，p＝0.034)。

表49.针对两个独立系列与癌组织临床病理特征有关的NDRG4启动子甲基化程度(％)。采用卡方检测分析甲基化差异。

缩写：P，P值；NS，不显著

其它肿瘤中的NDRG4启动子甲基化

然后，我们想了解NDRG4启动子甲基化是否存在于其它肿瘤组织中。因此，使用MSP引物对2对覆盖7种不同肿瘤类型的119个原发肿瘤样品进行了分析。在皮肤癌(0/8，0％)、肾癌(1/10，10％)、卵巢癌(0/20，0％)、前列腺癌(0/10，0％)和乳腺癌(小叶(0/7，0％)和导管癌(0/9，0％))中未发现或极少发现甲基化。相反地，在食道腺癌(13/16，81％)中常发现NDRG4启动子的甲基化，而在食道鳞状细胞癌(0/12，0％)中未发现甲基化。弥漫型(8/11，73％)和肠型(9/11，82％)胃癌也经常被甲基化，而正常胃粘膜中未显示任何甲基化(0/5，0％)。

粪便DNA中的NDRG4启动子甲基化

CRC中高程度的NDRG4启动子甲基化以及正常结肠粘膜中无甲基化提示，NDRG4启动子甲基化可能是一种用于非侵入性检测CRC的灵敏且特异性的生物标志物。因此，我们采用分子信标技术开发了一种定量MSP测定，并对来自21位CRC患者和67位健康对照的粪便DNA进行了分析。可以在21位CRC患者的16位中检测到NDGR4启动子的甲基化，得到了灵敏度为76％的CRC检测。只有2/67(3％)的健康对照对NDRG4甲基化测试为阳性，其得出该测定的临床特异性为97％。粪便样品来自于覆盖各不同TNM期的CRC患者。该测定对患有早期(I-II期)结肠癌的CRC患者具有75％的灵敏度，对晚期(III-IV期)患者具有80％的灵敏度。

NDRG4的RNA和蛋白质表达

为了分析NDRG4启动子CpG岛的甲基化与基因沉默是否有关，我们研究了NDRG4在CRC细胞系、3对CRC组织及其匹配的正常结肠粘膜中的mRNA表达。与正常结肠粘膜相比，mRNA水平在所有三例CRC中均显著下调(分别为97％，70％和98％)(图12b)。

为了研究NDRG4在正常结肠粘膜和结肠癌中的蛋白表达，我们进行了NDRG4的免疫组化，表明NDRG4蛋白在正常结肠粘膜的细胞质中，而在一半的CRC中其蛋白缺乏表达(图12c)。随后，我们通过免疫组化分析了NDRG4在19个CRC样品中的表达情况。这些患者中的11位具有甲基化的NDRG4启动子。然而，我们不能得出NDRG4启动子甲基化与NDRG4表达显著相关的结论(数据未显示)。这一观察表明，可能是其它机制导致了NDRG4的失活。

CRC中NDRG4基因的杂合性丢失和突变分析

利用微卫星标志物DS16S3089和DS16S3071对86例CRC患者的显微切割(macrodissected)的CRC组织及其对应的正常组织的进行分析。这两种标志物分别显示77.4％和35.4％的杂合性。其中，59例可提供信息；18例肿瘤(30.5％)显示了在16q染色体上至少一个标志物的LOH。

分析12例原发性CRC以及CRC细胞系HCT116和SW480中的NDRG4突变。在12例结直肠癌中未在NDRG4基因的编码区内检出失活突变。然而，我们在SW480细胞系中发现了一个新的非同义突变(40662A→AG Ile65Val)。作为突变分析的一部分，检出了2个先前报道过的SNP(NCBI SNP数据库)。在12位CRC患者的1位中观察到一个SNP(43760G→GG Val224Val refSNP rs 17821543)。在9/12 CRC患者中观察到另一个SNP(48311A→AG Ser354Ser refSNP rs 42945)。

讨论

CRC的发展需要几十年时间从小的良性结直肠腺瘤到较大的愈加发育异常的病变，早期阶段的鉴定将有利于这种疾病的管理和治疗(Brenner和Rennert，2005)。结肠镜检查是目前用于检测50岁以上患者结直肠癌或其早期病变的最好技术。作为结肠镜检查预选测试的粪便隐血测试(FOBT)是唯一的非侵入性且证明有效的筛查方法，当例行使用时，其可降低CRC的发病和死亡风险。

然而，FOBT的灵敏度和特异性都较低，因此迫切需要一种灵敏度和特异性更高的非侵入性的筛查测试。一个有前景的选择就是分析血液和组织中的癌症特异分子如DNA、RNA和蛋白质(的表达)。检测遗传改变的首次尝试显示出前景(Dong，Traverso等，2001；Traverso，Shuber等，2002)，但是仍需要改进。备选的标志物有TP53、K-ras和APC的突变，以及BAT-26的不稳定性和长DNA(结肠上皮细胞非凋亡脱落的标志物)。近期，CpG岛过度甲基化也可用作在不同生物样品中非侵入性检测结直肠癌的(预后)标志物(Esteller 2003；Chen，Han等，2005；Ebert，Model等，2006)。在过去几年中，使用不同的技术已发现若干基因在结直肠癌中被甲基化。

在本文中，我们使用了MSP、定量MSP和亚硫酸氢盐测序来分析NDRG4作为早期检测结直肠癌和其它胃肠道癌的生物标志物。在两个独立的大系列CRC病例中，证明了NDRG4启动子的CpG岛发生甲基化。在第一系列中，我们选取了非癌患者的正常粘膜，这是因为CRC患者的正常粘膜与肿瘤位于肠的同一部分，它们可能被恶性细胞所污染或者场效应(field effect)可能改变该细胞的分子特征，正如MGMT所述(issa，2005)。尽管如此，通过进行统计学分析，我们并未发现这两组之间的甲基化有任何显著差异。先前研究表明，慢性炎症可在正常组织中加快DNA的甲基化(Issa，Ahuja等，2001)。因此，在筛查设置中需要额外的对发炎的结肠粘膜进行筛查。在我们的研究群体中，在对照患者的正常粘膜中加入发炎的粘膜对NDRG4的特异性略有降低(从96％降至94％)。由于我们通过亚硫酸氢盐测序发现了NDRG4启动子区域甲基化密度的差异，因此我们使用两种不同的引物组来研究NDRG4的甲基化状态。令人感兴趣的是，使用引物对2，我们发现癌组织中有86％的甲基化，而使用引物对1，只有71％的甲基化。如表47所示，使用引物对2进行检测在该系列所有亚组中均显示甲基化增加。引物对2位于更接近该基因5’区域的位置。在转录起始位点附近甲基化的频率较低。我们推测NDRG4的过度甲基化起始于NDRG4 CpG岛的5’端，并蔓延至转录起始位点，最终结束于NDRG4 mRNA表达，如在RUNX3中所观察到的一样(Turker，2002；Homma，Tamura等，2006)。此外我们发现，使用引物对1时，在CRC组内的腺瘤组织和癌组织之间甲基化频率存在显著差异(p＝0.012)。因此，我们推测，NDRG4启动子区域的DNA甲基化向转录起始位点蔓延是在癌症发展过程中发生的。

值得注意的是，使用引物对1，与CRC患者的非进行性腺瘤(13％)相比，来自CRC患者的进行性腺瘤(41％)中出现更频繁的过度甲基化。对于CRC筛查来说，能够区分将会发展成癌症的腺瘤与不会发展成癌症的腺瘤是非常重要的(Hermsen，Postma等，2002)。然而，这种差别不能用肉眼判断，用于检测和去除所有腺瘤的内窥镜检查策略具有固有的非特异性。大多数切除的腺瘤不会发展成癌症，因为这种良性前期病变中只有很少部分会发展成癌(Lengauer，Kinzler等，1998)。这些数据可能表明，腺瘤组织中的NDRG4启动子甲基化(在我们的研究的区域内)可能是发展成结肠肿瘤的风险因素。

最近，有报道称可以在生物体液(例如血液、尿或粪便)中检测启动子甲基化，并且可允许早期诊断多种癌症(包括CRC)。一些研究显示，一种基因启动子的甲基化可作为用于检测粪便DNA甲基化的筛查方法。例如，SFR2、波形蛋白和HIC1启动子的甲基化可在CRC患者的粪便DNA中检测到，其灵敏度分别为77％、43％和42％，特异性分别为77％、90％和95％(Muller，Oberwalder等，2004；Chen，Han等，2005；Lenhard，Bommer等，2005)。粪便DNA中NDRG4的甲基化可作为用于区分癌症与对照的单一标志物，其灵敏度为76％，特异性为97％。

为了判断NDRG4甲基化是否是CRC的特异性生物标志物，我们进行了组织特异性分析，发现NDRG4甲基化也出现在其它胃肠道肿瘤中，即食道癌和胃癌。该数据表明，NDRG4甲基化也可作为其它胃肠肿瘤的标志物。

接下来，我们研究了NDRG4甲基化是否与NDRG4 RNA和蛋白质表达的下调有关。到目前为止，通过使用Northern印迹，NDRG4仅报道在脑和心脏中表达。我们观察到，NDRG4在正常结肠组织中表达，而在所有三种肿瘤组织中的表达均下调。随后，我们对来自CRC患者的19个CRC样品的NDRG4表达进行免疫组化分析，所述样品均有可用的石蜡包埋组织。这些患者中有11位的NDRG4启动子发生了甲基化。然而，我们并未发现NDRG4启动子甲基化与NDRG4表达之间的显著相关性。一些肿瘤中存在甲基化的NDRG4启动子，仍表达NDRG4蛋白。我们使用MSP检测到的甲基化可能只反映了少数癌细胞的甲基化或者NDRG4等位基因之一的甲基化(而不能反映另一个等位基因的情况)。然而，一些肿瘤不表达NDRG4蛋白，却也未观察到启动子的甲基化。这一观察结果表明，可能存在其它导致NDRG4失活的机制。未发现突变表明NDRG4基因的突变失活对CRC可能不起主要作用。我们的研究结果证实了先前对NDRG4突变进行研究的结果(Sjoblom，Jones等，2006)。然而，在大约30％的CRC病例中发现了16q处的LOH。16q处高频率的LOH已在多种实体肿瘤类型中有所报道，例如乳腺癌(Rakha，Green等，2006)、肝癌(Sakai，Nagahara等，1992；Bando，Nagai等，2000)、前列腺癌(Elo，Harkonen等，1997)、卵巢癌(Kawakami，Staub等，1999)和维尔姆斯瘤(Wilms’tumor)(Mason，Goodfellow等，2000)，但尚未在CRC中报道。由于与正常结肠上皮细胞相比，NDRG4在大多数结肠癌细胞中表达下调，因此我们猜测NDRG4在癌症中具有肿瘤抑制功能。

综上所述，我们首次描述了NDRG4在癌症中的作用，并且我们的数据表明NDRG4是CRC的潜在的新型标志物，其具有非常高的灵敏度(76％)和特异性(100％)。尽管单独以NDRG4作为标志物即具有非常高的灵敏度和特异性，但是还可以通过分析CRC患者中额外的其它标志物来提高NDRG4的诊断准确率。这可以在基于甲基化的多通道诊断测试中提高鉴定癌症患者的能力。

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5)针对NDRG4和OSMR基因质粒材料测试的附加的实时MSP测定

使用对应于NDRG4和OSMR基因启动子区域的质粒材料来测试另外的实验设计。用于标准曲线的质粒如下构建：利用PCR扩增由引物所限定的启动子序列并进行克隆(使用合适的经分离并经亚硫酸氢盐修饰的细胞系DNA)。通过测序并与已公开的启动子序列进行比较来验证所述序列。将系列稀释的NDRG4或OSMR质粒材料(2×10⁶至2×10¹拷贝/5μl)一式两份加样。将5μl的质粒稀释物或缓冲液(不含模板对照)加至20μl PCR反应混合物(其含有如前所述的特定引物和分子信标探针序列)中。使用带有自动基线和阈值设置的SDS 2.2软件(AppliedBiosystems)生成结果。数据以Ct值(扩增曲线与阈值交叉时的循环数，所述阈值由相关软件自动设置)形式输出。

NDRG4

针对2种不同的NDRG4测定设计的初步实时结果于表50和51中。用于各测定NDRG4_1a和NDRG4_1b的引物和分子信标组合已在上文中描述。NDRG4_1a和1b反映了用于评估NDRG4基因甲基化状态的不同引物和/或分子信标组合。NDRG4_1a对应于优选的NDRG4测定设计，也即指NDRG4(见表4)。两种测定设计得到了类似的结果。本发明所提供的临床样品数据是使用优选的NDRG4测定设计而获得的(＝NDRG4＝NDRG4_1a)

表50.针对质粒材料的NDRG4_1a测定得到的实时MSP结果。所得的标准曲线(y＝-3.3321x+39.862；R2＝0.9991)对应的PCR效率为100％。

测定	任务	Ct	量	Log拷贝数	Ct重测值	Ct平均值	ΔCt
								NDRG4_1a	标准	18.82	2000000	6.30	18.92	18.87	0.09
NDRG4_1a	标准	22.09	200000	5.30	22.22	22.15	0.13
								NDRG4_1a	标准	25.42	20000	4.30	25.47	25.45	0.06
NDRG4_1a	标准	28.86	2000	3.30	28.94	28.90	0.08
								NDRG4_1a	标准	32.58	200	2.30	32.48	32.53	0.10
NDRG4_1a	标准	34.92	20	1.30	35.64	35.28	0.71
								NDRG4_1a	NTC	未测定	0		未测定	未测定	未测定

表51.针对质粒材料的NDRG4_1b测定得到的实时MSP结果。所得的标准曲线(y＝-3.4181x+40.991；R2＝0.9991)对应的PCR效率为99.2％。

测定	任务	Ct	量	Log拷贝数	Ct重测值	Ct平均值	ΔCt
								NDRG4_1b	标准	19.48	2000000	6.30	19.59	19.53	0.12
NDRG4_1b	标准	22.93	200000	5.30	22.92	22.92	0.01
								NDRG4_1b	标准	26.26	20000	4.30	26.18	26.22	0.08
NDRG4_1b	标准	29.65	2000	3.30	29.67	29.66	0.02
								NDRG4_1b	标准	32.82	200	2.30	32.83	32.82	0.01
NDRG4_1b	标准	36.75	20	1.30	36.91	36.83	0.16
								NDRG4_1b	NTC	未测定	0		未测定	未测定	未测定

OSMR

针对3种不同的OSMR测定设计的初步实时结果列于下表52至54中。用于各测定OSMR_1、OSMR_3[＝OMSR(3)]和OSMR_4[＝SMR(4)]的引物和分子信标组合已上文中描述。OSMR_1、_3和_4反映了用于评估OSMR基因甲基化状态的不同引物和/或分子信标组合。所有这三种测定设计得到了类似的结果。

表52.针对质粒材料的OSMR_1测定得到的实时MSP结果。所得的标准曲线(y＝-3.3326x+41.136；R2的＝0.9993)对应的PCR效率为99.6％。

测定	任务	Ct	量	Log拷贝数	Ct重测值	Ct平均值	ΔCt
								OSMR_1	标准	20.04	2000000	6.30	20.14	20.09	0.09
OSMR_1	标准	23.48	200000	5.30	23.41	23.44	0.07
								OSMR_1	标准	26.73	20000	4.30	26.85	26.79	0.12
OSMR_1	标准	30.13	2000	3.30	30.26	30.19	0.13
								OSMR_1	标准	33.55	200	2.30	33.93	33.74	0.38
OSMR_1	标准	36.54	20	1.30	36.58	36.56	0.04
								OSMR_1	NTC	未测定	0		未测定	未测定	未测定

表52.针对质粒材料的OSMR_3测定得到的实时MSP结果。所得的标准曲线(y＝-3.3909x+38.398；R2＝0.9999)对应的PCR效率为97.2％。

测定	任务	Ct	量	Log拷贝数	Ct重测值	Ct平均值	ΔCt
								OSMR_3	标准	16.93	2000000	6.30	17.16	17.04	0.23
OSMR_3	标准	20.41	200000	5.30	20.29	20.35	0.12
								OSMR_3	标准	23.97	20000	4.30	23.83	23.90	0.14
OSMR_3	标准	27.22	2000	3.30	27.16	27.19	0.06
								OSMR_3	标准	30.51	200	2.30	30.67	30.59	0.16
OSMR_3	标准	34.18	20	1.30	33.77	33.98	0.41
								OSMR_3	NTC	38.13	0		未测定	未测定	未测定

表54.针对质粒材料的OSMR_4测定得到的实时MSP结果。所得的标准曲线(y＝-3.2795x+38.77；R2＝0.9997)对应的PCR效率为100.8％

测定	任务	Ct	量	Log拷贝数	Ct重测值	Ct平均值	ΔCt
								OSMR_4	标准	18.24	2000000	6.30	17.90	18.07	0.33
OSMR_4	标准	21.56	200000	5.30	21.05	21.31	0.51
								OSMR_4	标准	24.79	20000	4.30	24.64	24.72	0.15
OSMR_4	标准	28.24	2000	3.30	27.91	28.08	0.33
								OSMR_4	标准	31.37	200	2.30	31.18	31.28	0.19
OSMR_4	标准	34.63	20	1.30	34.12	34.37	0.50
								OSMR_4	NTC	未测定	0		未测定	未测定	未测定

6)在体液测试样品中测试和验证其它CRC标志物

加入的新标志物为：BNIP3、FOXE1、JAM3、PHACTR3、TPFI2、SOX17和SYNE1(以及JPH3粪便数据)。用于确定这些基因的甲基化状态的合适引物和探针列于上文的表12(和13至18)中。

方法和结果

临床样品

样品从德国和荷兰的中心收集而来。

表55.用于从血浆(血液来源)中提取DNA的样品

类型	样品数
		正常	10
结直肠癌III期	6
		结直肠癌IV期	4

表56.用于从粪便中提取DNA的样品

类型	样品数
		对照(正常)	7
病例(结直肠癌)	1
		病例(结直肠癌)	6

针对临床样品的标志物测试

如前所述进行实验。简言之，从粪便和/或血浆中提取DNA，然后用亚硫酸氢盐进行处理。利用实时MSP测定来测试样品，其使用了384孔板，终体积为12μl。模板量为2.4μl，混合物体积为9.6μl。使用SDS 2.2软件(Applied Biosystems)生成结果，并以Ct值形式输出(扩增曲线与阈值交叉时的循环数，所述阈值由相关软件自动设置)。使用标准曲线推算出拷贝数。

在血浆和粪便样品中，8种基因TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3、JAM3和JPH3各自的检测效果列于表15(除JPH3以外：只有粪便数据)。对血浆和粪便检测的灵敏度值分别为30～70％和0～57％，对应的特异性为100％。当针对灵敏度进行优化时，在血浆样品检测中TFPI2的灵敏度为80％，PHACTR3的灵敏度为50％，其对应的特异性为90％。与粪便样品相比，观察到一些标志物(TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1和SOX17)在血浆样品中对结直肠癌检测的灵敏度更高。

表57.各基因的检测效果：标志物TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3、JAM3对粪便和血浆样品检测的灵敏度和特异性。使用该样品组只获得了标志物JPH3对粪便样品检测的灵敏度和特异性结果，对血浆样品的数据可在较早的样品组中获得。

本发明并不局限于本文所述的具体实施方案的范围。事实上，从前面的描述和附图来看，本发明的各种修改以及本文所述的内容对于本领域技术人员是显而易见的。这些修改旨在落入所附权利要求的范围内。此外，视情况，本文所述的所有实施方案被认为广泛适用，并可与任何及所有其它相符的实施方案联合。

本文引用了多种公开文献，其公开内容通过引入以整体并入本文中。

序列表

<110>癌甲基化组科学公司

<120>选定基因中的表观遗传变化和癌症

<130>P90428WO00

<160>569

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>18

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>1

cctgaggaga agccgctg                                                 18

<210>2

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>2

atgtcatgtt ccttccagtc tgt                                           23

<210>3

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>3

ggccttctgc atgtagtgat ccg                                           23

<210>4

<211>22

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>4

ggtgatctcc tgcatgtcct cg                                            22

<210>5

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>5

ggttygttyg ggattagttt tagg                                                24

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>6

craacaacca aaaacccctc                                                     20

<210>7

<211>29

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>7

gattagtttt aggtttggta ttgttttgt                                           29

<210>8

<211>26

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>8

aaaaccaaac taaaaacaat acacca                                              26

<210>9

<211>22

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>9

tttaggttcg gtatcgtttc gc                                                  22

<210>10

<211>21

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>10

cgaactaaaa acgatacgcc g                                                   21

<210>11

<211>21

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>11

atyggggtgt tttttaggtt t                                                   21

<210>12

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>12

ataccraacc taaaactaat ccc                                                 23

<210>13

<211>25

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>13

gggtgttttt taggtttcgc gtcgc                                               25

<210>14

<211>25

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>14

cctaaaacta atcccaaaca aacca                                               25

<210>15

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>15

ttttttaggt ttcgcgtcgc                                                  20

<210>16

<211>21

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>16

aaactaatcc cgaacgaacc g                                                21

<210>17

<211>22

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>17

gtattttagt cgcgtagaag gc                                               22

<210>18

<211>25

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>18

aatttaacga atataaacgc tcgac                                            25

<210>19

<211>36

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>分子信标探针

<400>19

cgacatgccc gaacgaaccg cgatccctgc atgtcg                                36

<210>20

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>20

ygttttttat ttatagyggt tttt                                                  24

<210>21

<211>27

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>21

tcctaatacc tctcctctct ttactac                                               27

<210>22

<211>30

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>22

ttttatttat agtggttttt tgtatttttt                                            30

<210>23

<211>26

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>23

tctcctctct ttactacatc ccaaca                                                26

<210>24

<211>25

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>24

tttatagcgg tttttcgtat ttttc                                                 25

<210>25

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>25

cctctcttta ctacgtcccg acg                                                     23

<210>26

<211>26

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>26

tagggagtat ataggttggg gaagtt                                                  26

<210>27

<211>27

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>27

aacacacaat aacaaacaca aattcac                                                 27

<210>28

<211>42

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>分子信标探针

<400>28

cgactgcgtg tggggtggtg atggaggagg tttaggcagt cg                                42

<210>29

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>29

aggttagtta gcgttttagg gtc                                                     23

<210>30

<211>19

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>30

acgacgacga aacctctcg                                                     19

<210>31

<211>40

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>分子信标探针

<400>31

cgacatgcct cgcgactcga atccccgacc cagcatgtcg                              40

<210>32

<211>26

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>32

agttcgtttt taggttagtt ttcggc                                             26

<210>33

<211>25

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>33

ccaatacaac taaacgaacg aaccg                                              25

<210>34

<211>45

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>分子信标探针

<400>34

cgacatgcgt agggaggtag agggttcggg attcgtagca tgtcg                        45

<210>35

<211>26

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>35

tgtagttttc ggagttagtg tcgcgc                                              26

<210>36

<211>25

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>36

cctacgatcg aaaacgacgc gaacg                                               25

<210>37

<211>47

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>分子信标探针

<400>37

cgacatgctc gggagtcggg gcgtatttag ttcgtagcgg catgtcg                       47

<210>38

<211>25

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>38

gggtcggagt ttttcggagt tgcgc                                               25

<210>39

<211>26

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>39

ccgctctctt cgctaaatac gactcg                                              26

<210>40

<211>48

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>分子信标探针

<400>40

cgacatgcgg tgtttcgttt tttcgcgttt tagtcgtcgg gcatgtcg                   48

<210>41

<211>19

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>41

gaaccaaaac gctccccat                                                   19

<210>42

<211>27

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>42

ttatatgtcg gttacgtgcg tttatat                                          27

<210>43

<211>38

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>分子信标探针

<400>43

cgtctgcccc gtcgaaaacc cgccgattaa cgcagacg                              38

<210>44

<211>19

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>44

gaaggacgag aagtaggcg                                                   19

<210>45

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>45

ctaacgaact acaaccttac cga                                                     23

<210>46

<211>37

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>分子信标探针

<400>46

cgacatgccc ccgacccgca cgccgccctg catgtcg                                      37

<210>47

<211>21

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>47

tttggtcggg gtaggagtag c                                                       21

<210>48

<211>22

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>48

cgaactttac gaacgaacga ac                                                      22

<210>49

<211>32

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>分子信标探针

<400>49

cgacatgccc gtaccccgcg cgcagcatgt cg                                           32

<210>50

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>50

aaaaacttaa aaaccgaaaa ctcg                                                    24

<210>51

<211>24

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>51

ttagatttcg taaacggtga aaac                                                    24

<210>52

<211>19

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>52

tctcctccga aaaacgctc                                                          19

<210>53

<211>33

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>分子信标探针

<400>53

cgtctgcaac cgccgacgac cgcgacgcag acg                                          33

<210>54

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>54

tttcgacgtt cgtaggtttt cgc                                                     23

<210>55

<211>22

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>55

gcactcttcc gaaaacgaaa cg                                                     22

<210>56

<211>50

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>分子信标探针

<400>56

cgtctcgcgt gcgtatcgtt tgcgatttgg tgagtgtttg gggcgagacg                       50

<210>57

<211>36

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>分子信标探针

<400>57

cgacatgcag ggatcgcggt tcgttcgggc atgtcg                                      36

<210>58

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>58

ggtattttag tcgcgtagaa ggc                                                    23

<210>59

<211>21

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>59

gaatataaac gctcgacccg c                                                      21

<210>60

<211>46

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>分子信标探针

<400>60

cgacatgcgc ggttcgttcg ggattagttt taggttcggc atgtcg                     46

<210>61

<211>39

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>分子信标探针

<400>61

cgtacccgcg tttatattcg ttaaatttac gcgggtacg                             39

<210>62

<211>19

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>62

tagtcgcgta gaaggcgga                                                   19

<210>63

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>63

gactacaaaa acgaaaaccg aac                                              23

<210>64

<211>31

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>分子信标探针

<400>64

cgacatcggg tacgttttcg cggcgatgtc g                                     31

<210>65

<211>21

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>65

ctacaaaaac gaaaaccgaa c                                                21

<210>66

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>分子信标探针

<400>66

cgtttcgcgg gtcgagcgaa acg                                                    23

<210>67

<211>21

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>67

cgaaaaccga actaaaaacg a                                                      21

<210>68

<211>43

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>分子信标探针

<400>68

cgacatgccg cggttcgttc gggattagtt ttagggcatg tcg                              43

<210>69

<211>19

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>69

tttcgttcgt ttatcgggt                                                         19

<210>70

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>70

cgaacctaaa actaatcccg aac                                                    23

<210>71

<211>36

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>分子信标探针

<400>71

cgacacgcgt agaaggcgga agttacgcgc gtgtcg                                  36

<210>72

<211>27

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>72

ggtttcgtag cgtatttagt atagttc                                            27

<210>73

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>73

gtaacttccg ccttctacgc                                                    20

<210>74

<211>42

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>分子信标探针

<400>74

cgacatgcgc ggatcgatcg gggtgttttt tagggcatgt cg                           42

<210>75

<211>23

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>75

gagttgtttt tgtcgtttcg ttt                                                23

<210>76

<211>19

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

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<223>分子信标探针

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<223>分子信标探针

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cgacatgcgg cggtggcggt gggtcggcat gtcg                                     34

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<211>21

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<211>22

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<211>22

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<212>DNA

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<220>

<223>分子信标探针

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<212>DNA

<213>人工的

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<223>引物

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<212>DNA

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<211>23

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<210>525

<211>1980

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<223>甲基化的NDRG2序列

<400>525

gtttgttttg cgtttttgcg taggtttttt attaggtttt ttttgagtta ttttgattta      60

gagacgaatt tagatgttgg aatttttagg tttttttttt ttttatttta agtaagacga     120

tttttgataa agaaaagttt gtaggtaaaa gtttttattc gaggtttttt ttttttttag     180

gtttttttgg tgttgatgag attttttttg ttttgcgtat ttttggttgt gatttttatt     240

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gtgtgtgtgt aaagtttata gtggtaaatt tattcgggta tcgagaggga cgcggtagat    1020

tttgagatta tttttcgggt attgcgattt agcgggtttg agttggtttt ttattttggg    1080

tcggattggg aggggttagc ggcgaagtta tagggttttt tgggttttag tttaggatat    1140

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tatttatagc ggtttttcgt atttttcgtt tttatttttt cgttttgttg tttaattttt    1380

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<210>557

<211>18

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>557

cacctctgcc tctgcccc                                            18

<210>558

<211>18

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>558

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<210>559

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<213>人工的

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<223>引物

<400>559

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<210>560

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<220>

<223>引物

<400>560

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<210>561

<211>18

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>561

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<210>562

<211>17

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<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>562

cttggcaatg ggggtgg                                             17

<210>563

<211>20

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>563

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<210>564

<211>21

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>564

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<210>565

<211>17

<212>DNA

<213>人工的

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<223>引物

<400>565

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<210>566

<211>17

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>566

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<210>567

<211>19

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<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>567

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<210>568

<211>18

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>568

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<210>569

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<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>引物

<400>569

gatyggggtg ttttttaggt tt                                        22

Claims (173)

1.检测样品中癌症易感性或发病的方法，其包括检测至少一种基因的表现遗传变化，所述基因选自NDRG4/NDRG2亚家族基因、GATA4、OSMR、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3，其中所述表观遗传变化的检出指示癌症的易感性或发病。

2.权利要求1所述的方法，其中所述癌症是结直肠癌，所述至少一种基因选自GATA4、OSMR、NDRG4、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC和MGMT。

3.权利要求1或2所述的方法，其中所述测试样品是粪便测试样品。

4.权利要求1所述的方法，其包括检测NDRG4/NDRG2亚家族基因的表观遗传沉默，其中所述基因的表观遗传沉默指示癌症、癌症易感性或晚期腺瘤。

5.权利要求1所述的方法，其中测定NDRG4/NDRG2亚家族基因的表达，其中所述基因表达水平降低指示结肠癌和/或胃癌、结肠癌和/或胃癌易感性或晚期腺瘤。

6.权利要求1所述的方法，其中测定NDRG4/NDRG2亚家族基因的甲基化状态，其中所述基因的甲基化指示结肠癌和/或胃癌、结肠癌和/或胃癌易感性或晚期腺瘤。

7.权利要求1所述的方法，其中所述癌症是结直肠癌，所述样品是血液样品或其衍生物，所述至少一种基因选自OSMR、SFRP1、NDRG4、GATA5、ADAM23、JPH3、SFRP2和APC。

8.权利要求1所述的方法，其中所述癌症是结直肠癌，所述样品是组织样品，所述至少一种基因是包括OSMR、GATA4和ADAM23或者OSMR、GATA4和GATA5的基因组合，其中所述组合的至少一种基因中检出表观遗传变化指示结直肠癌的易感性或发病。

9.权利要求1所述的方法，其中所述癌症包括胃肠道癌。

10.权利要求9所述的方法，其中所述胃肠道癌包括结直肠癌、胃癌、胃癌和/或食道癌。

11.权利要求10所述的方法，其中所述胃肠道癌是结直肠癌。

12.权利要求10所述的方法，其中所述食道癌是食道腺癌。

13.权利要求10所述的方法，其中所述胃癌包括弥漫型和/或肠型胃癌。

14.根据前述任一权利要求的方法，其中所述至少一种基因是NDRG4/NDRG2亚家族基因。

15.根据前述任一权利要求的方法，其中所述NDRG4/NDRG2亚家族基因包括NDRG4基因或由其组成。

16.权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述至少一种基因选自GATA4、OSMR、NDRG4和SFRP2。

17.权利要求1至13中任一项所述的方法，其中所述至少一种基因选自OSMR、NDRG4、GATA5和ADAM23。

18.根据前述任一权利要求的方法，其包括检测包含至少两种、三种、四种、五种或六种所述基因的基因组合的表观遗传变化，其中所述基因组合的至少一种基因中检出表观遗传变化指示癌症的易感性或发病。

19.权利要求18所述的方法，其中所述基因组合包含两种、三种、四种、五种或六种基因。

20.权利要求18或19所述的方法，其中所述基因组合包括GATA4和OSMR、GATA4和NDRG4、GATA4和SFRP2、OSMR和NDRG4、OSMR和SFRP2、NDRG4和SFRP2、APC和SFRP2、APC和OSMR、APC和GATA4、APC和NDRG4、MGMT和OSMR、MGMT和GATA4、MGMT和NDRG4、MGMT和SFRP2、MGMT和APC、SFRP1和MGMT、SFRP1和OSMR、SFRP1和GATA4、SFRP1和NDRG4、SFRP1和SFRP2、SFRP1和APC、GATA5和SFRP1、GATA5和MGMT、GATA5和OSMR、GATA5和GATA4、GATA5和NDRG4、GATA5和SFRP2或者GATA5和APC。

21.权利要求18至20中任一项所述的方法，其中所述基因组合包括GATA4、OSMR和NDRG4，GATA4、OSMR和SFRP2，GATA4、NDRG4和SFRP2，SFRP1、SFRP2和APC，SFRP2、OSMR和APC或者OSMR、NDRG4和SFRP2。

22.权利要求18至21中任一项所述的方法，其中所述基因组合由GATA4、OSMR、NDRG4和SFRP2组成。

23.权利要求18至20中任一项所述的方法，其中所述基因组合包含NDRG4、OSMR、SFRP1、ADAM23、GATA5、GATA4和MGMT。

24.权利要求18或19的方法，其中所述基因组合是三基因组合，所述基因选自OSMR、NDRG4、GATAJ和ADAM23。

25.权利要求24所述的方法，其中所述基因组合由OSMR、NDRG4、GATA5和ADAM23组成。

26.权利要求18或19所述的方法，其中所述基因组合包括OSMR、GATA4和ADAM23或者OSMR、GATA4和GATA5。

27.权利要求18至20中任一项所述的方法，其中在单一反应中检测所述基因组合中每个基因的表观遗传变化。

28.根据前述任一权利要求的方法，其中所述样品包括组织样品和/或体液样品。

29.权利要求28所述的方法，其中所述体液样品包括粪便样品。

30.权利要求29所述的方法，其中所述至少一种基因选自GATA4、OSMR、NDRG4、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC和MGMT和/或选自TFPI2、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3。

31.权利要求28所述的方法，其中所述组织样品包括结肠和/或直肠和/或阑尾样品。

32.权利要求28所述的方法，其中所述体液样品包括血液样品。

33.权利要求32所述的方法，其中所述血液样品或其衍生物包括血浆或血清样品。

34.权利要求32或34所述的方法，其中所述至少一种基因选自TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3、JPH3和JAM3。

35.权利要求33或34所述的方法，其中所述血浆样品通过对全血离心而获得。

36.权利要求35所述的方法，其中采用多步离心来获取血浆样品。

37.权利要求36所述的方法，其中采用两步离心来获取血浆样品。

38.权利要求37所述的方法，其中排除体积小于2ml的血浆样品。

39.根据前述任一权利要求的方法，其中所述癌症是结直肠癌，其中所述结直肠癌包括早期结直肠癌。

40.权利要求39所述的方法，其中所述早期结直肠癌包括0-II期结直肠癌。

41.根据前述任一权利要求的方法，其中所述表观遗传变化是甲基化。

42.权利要求41所述的方法，其中检测所述基因启动子区的过度甲基化。

43.权利要求41或42所述的方法，其中使用甲基化特异性PCR/扩增来测定甲基化。

44.权利要求43所述的方法，其中所述甲基化特异性PCR/扩增以实时或终点方式实施。

45.权利要求41至44中任一项所述的方法，其中针对参照基因的甲基化来对甲基化定量。

46.权利要求43至44中任一项所述的方法，其使用选自包含表2至表18中所示核苷酸序列之引物的引物。

47.权利要求43至46中任一项所述的方法，其使用选自包含表2至表18中所示核苷酸序列之探针的探针。

48.根据前述任一权利要求的方法，其与检测所述样品中DNA完整性或至少一种DNA癌基因突变联用或者与检测DNA完整性和至少一种DNA癌基因突变的组合联用，从而检测结直肠癌的易感性或发病。

49.根据前述任一权利要求的方法，其中测定包含SEQ ID NO：524和/或SEQ ID NO：525所示核苷酸序列的CpG岛的甲基化状态。

50.根据前述任一权利要求的方法，其中通过测定其在基因表达水平上的效果来检测所述表观遗传变化。

51.权利要求50所述的方法，其中在蛋白质水平测定基因表达。

52.权利要求50所述的方法，其中在RNA水平测定基因表达。

53.权利要求52所述的方法，其中应用实时或终点检测。

54.测定样品中癌症特别是胃肠道癌的组织病理学阶段的方法，其包括检测至少一种基因的表观遗传变化，所述基因选自NDRG4/NDRG2亚家族基因、GATA4、OSMR、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3，其中所述表观遗传变化的检出指示癌症的组织病理学阶段。

55.权利要求54所述的方法，其中所述癌症是结直肠癌，所述至少一种基因选自GATA4、OSMR、NDRG4、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC和MGMT。

56.权利要求54或55所述的方法，其中所述测试样品是粪便样品。

57.权利要求51所述的方法，其用于测定腺瘤和/或结直肠癌的组织病理学阶段，其包括测定所述NDRG4/NDRG2亚家族基因的表观遗传沉默，其中所述NDRG2/NDRG4家族基因的表观遗传沉默与癌症的组织病理学阶段相关。

58.权利要求54所述的方法，其用于测定血液样品或其衍生物中结直肠癌的组织病理学阶段，其包括测定至少一种基因的表观遗传变化，所述基因选自OSMR、SFRP1、NDRG4、GATA5、ADAM23、JPH3、SFRP2和APC和/或选自TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3，其中所述表观遗传变化的检出指示结直肠癌的组织病理学阶段。

59.权利要求54所述的方法，其用于测定组织样品中结直肠癌的组织病理学阶段，其包括检测包含OSMR、GATA4和ADAM23或者OSMR、GATA4和GATA5的基因组合的表观遗传变化，其中在所述基因组合的至少一种基因中检出表观遗传变化指示结直肠癌的组织病理学阶段。

60.用于预测或监测腺瘤向癌症发展的方法，其包括测定合适的测试样品中NDRG2/NDRG4亚家族基因的甲基化状态，其中与甲基化水平较低的情形相比，甲基化水平的提高或增加表明腺瘤更有可能发展成癌。

61.权利要求60所述的方法，其中测定NDRG4基因的甲基化状态。

62.权利要求61所述的方法，其中测定如下区域中的NDRG4基因甲基化状态，所述区域位于包含表2中所示核苷酸序列之引物的引物结合位点之间并包含所述引物结合位点。

63.用于预测或监测胃肠道癌发展的方法，其包括测定合适的测试样品中NDRG4基因的甲基化状态，其中与甲基化水平较低的情形相比，接近转录起始位点的甲基化水平的提高或增加表明癌更加恶化。

64.权利要求63所述的方法，其中所述胃肠道癌是结直肠癌。

65.用于预测使用DNA去甲基化剂和/或DNA甲基转移酶抑制剂和/或HDAC抑制剂治疗癌症特别是胃肠道癌之成功可能性的方法，其包括检测至少一种基因的表观遗传变化，所述基因选自NDRG4/NDRG2亚家族基因、GATA4、OSMR、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3，其中与检测不出表观遗传修饰的情形相比，所述表观遗传变化的检出表明成功治疗的可能性更高。

66.权利要求65所述的方法，其中所述癌症是结直肠癌，所述至少一种基因选自GATA4、OSMR、NDRG4、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC和MGMT。

67.权利要求65或66所述的方法，其中所述测试样品是粪便样品。

68.权利要求65所述的方法，其包括测定取自对象的样品中NDRG4/2家族基因的甲基化状态，其中与NDRG4/2家族基因未甲基化或甲基化程度较低相比，如果NDRG4/2家族基因被甲基化特别是过度甲基化，则成功治疗的可能性更高。

69.权利要求65所述的方法，其包括测量取自对象的样品中NDRG4/2家族基因的表达水平，其中与NDRG4/2家族基因较高水平表达的情形相比，表达水平降低表明成功治疗的可能性更高。

70.权利要求65所述的方法，其中所述癌症是结直肠癌，所述至少一种基因选自OSMR、SFRP1、NDRG4、GATA5、ADAM23、JPH3、SFRP2和APC和/或选自TFPI1、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3，并且所述样品是血液样品或其衍生物。

71.权利要求65所述的方法，其中所述癌症是结直肠癌，该方法包括检测组织样品中包含OSMR、GATA4和ADAM23或者OSMR、GATA4和GATA5的基因组合的表观遗传变化，其中与检测不出表观遗传修饰的情形相比，在所述基因组合的至少一种基因中检出表观遗传变化指示更高的成功治疗可能性。

72.用于预测对使用DNA去甲基化剂和/或DNA甲基转移酶抑制剂和/或HDAC抑制剂治疗癌症特别是胃肠道癌的抗性可能性的方法，其包括检测至少一种基因的表观遗传变化，所述基因选自NDRG4/NDRG2亚家族基因、GATA4、OSMR、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3，其中与检测不出表观遗传修饰的情形相比，所述表观遗传变化的检出表明治疗抗性的可能性更低。

73.权利要求72所述的方法，其中所述癌症是结直肠癌，所述至少一种基因选自GATA4、OSMR、NDRG4、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC和MGMT。

74.权利要求72或73所述的方法，其中所述测试样品是粪便样品。

75.权利要求72所述的方法，其包括测定取自对象的样品中NDRG4/2家族基因的甲基化状态，其中与NDRG4/2家族基因被甲基化或过度甲基化的情形相比，如果NDRG4/2家族基因未甲基化或甲基化程度较低，则治疗抗性可能性更高。

76.权利要求72所述的方法，其包括测量取自对象的样品中NDRG4/2家族基因的表达水平，其中与NDRG4/2家族基因低水平表达的情形相比，表达水平较高表明治疗抗性可能性更高。

77.权利要求72所述的方法，其中所述癌症是结直肠癌，所述至少一种基因选自OSMR、SFRP1、NDRG4、GATA5、ADAM23、JPH3、SFRP2和APC和/或选自TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3，并且所述样品是血液样品或其衍生物。

78.权利要求72所述的方法，其中所述癌症是结直肠癌，该方法包括检测组织样品中包含OSMR、GATA4和ADAM23或者OSMR、GATA4和GATA5的基因组合的表观遗传变化，其中与检测不出表观遗传修饰的情形相比，在所述基因组合的至少一种基因中检出表观遗传变化指示更高的成功治疗可能性。

79.用于选择癌症特别是胃肠道癌的合适治疗方案的方法，其包括检测至少一种基因的表观遗传变化，所述基因选自NDRG4/NDRG2亚家族基因、GATA4、OSMR、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC、MGMT、TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3，其中所述表观遗传变化的检出导致选用DNA去甲基化剂和/或DNA甲基转移酶抑制剂和/或HDAC抑制剂进行治疗，如果未检出所述表观遗传变化，则不选用DNA去甲基化剂和/或DNA甲基转移酶抑制剂和/或HDAC抑制剂进行治疗。

80.权利要求79所述的方法，其中所述癌症是结直肠癌，所述至少一种基因选自GATA4、OSMR、NDRG4、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC和MGMT。

81.权利要求79或80所述的方法，其中所述样品是粪便样品。

82.权利要求79所述的方法，其包括测定取自对象的样品中NDRG4/2家族基因的表观遗传沉默，其中如果所述基因被表观遗传沉默，特别是被过度甲基化或表达降低，则选用DNA去甲基化剂和/或DNA甲基转移酶抑制剂和/或HDAC抑制剂进行治疗。

83.权利要求79所述的方法，其用于为癌症或癌症易感性或晚期腺瘤选择合适的治疗方案，其包括测定取自对象的样品中NDRG4/2家族基因的甲基化状态和/或表达水平，其中如果所述基因未甲基化或较高水平表达，则指示不选用DNA去甲基化剂和/或DNA甲基转移酶抑制剂和/或HDAC抑制剂进行治疗。

84.权利要求79所述的方法，其中所述癌症是结直肠癌，所述至少一种基因选自OSMR、SFRP1、NDRG4、GATA5、ADAM23、JPH3、SFRP2和APC和/或选自TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3，并且所述样品是血液样品或其衍生物。

85.权利要求79所述的方法，其中所述癌症是结直肠癌，该方法包括检测组织样品中包含OSMR、GATA4和ADAM23或者OSMR、GATA4和GATA5的基因组合的表观遗传变化，其中在所述基因组合的至少一种基因中检出表观遗传变化导致选用DNA去甲基化剂和/或DNA甲基转移酶抑制剂和/或HDAC抑制剂进行治疗，其中如果在所述基因组合的至少一种基因中未检出表观遗传变化，则不选用DNA去甲基化剂和/或DNA甲基转移酶抑制剂和/或HDAC抑制剂进行治疗。

86.根据权利要求54至85中任一项的方法，其特征还在于权利要求1至53中任一项之方法的技术特征。

87.治疗对象中癌症的方法，其包括施用DNA去甲基化剂和/或HDAC抑制剂和/或DNA甲基转移酶抑制剂，其中已基于前述任一权利要求的方法选择所述对象进行治疗。

88.权利要求87所述的方法，其中已基于测量NDRG2/NDRG4家族基因启动子的甲基化状态、NDRG2/NDRG4家族基因的表达水平或二者的组合选择所述对象进行治疗。

89.权利要求87或88所述的方法，其中所述癌症包括胃肠道癌。

90.权利要求89所述的方法，其中所述胃肠道癌包括结直肠癌、胃癌、胃癌和/或食道癌，特别是结直肠癌。

91.权利要求90所述的方法，其中所述食道癌是食道腺癌。

92.权利要求90所述的方法，其中所述胃癌包含弥漫型和/或肠型胃癌。

93.一种试剂盒，其用于：

(a)预测使用DNA损伤剂和/或DNA甲基转移酶抑制剂和/或HDAC抑制剂成功治疗癌症的可能性和/或癌症治疗抗性的可能性；

(b)选择合适的癌症治疗方案；

(c)诊断癌症或癌症易感性，其包含运载工具，其中包含一组用于检测至少一种基因甲基化状态的引物，所述基因选自NDRG2/NDRG4家族基因、GATA4、OSMR、GATA5、SERP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC和MGMT和/或选自TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3。

94.权利要求93所述的试剂盒，其中所述至少一种基因是NDRG2/NDRG4亚家族基因。

95.权利要求94所述的试剂盒，其中所述NDRG2/NDRG4亚家族基因是NDRG4。

96.权利要求93至95中任一项所述的试剂盒，其还包含选择性修饰所述样品所含DNA中未甲基化的胞嘧啶残基的试剂以产生可检测的经修饰残基，但该试剂不修饰甲基化的胞嘧啶残基。

97.权利要求96所述的试剂盒，其中所述试剂包含亚硫酸氢盐试剂。

98.权利要求97所述的试剂盒，其中所述亚硫酸氢盐试剂包含亚硫酸氢钠。

99.用于检测样品中胃肠道癌特别是结直肠癌的易感性或发病的试剂盒，其包含：

(a)检测至少一种基因表观遗传变化的工具，所述基因选自GATA4、OSMR、NDRG4、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC和MGMT和/或选自TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3；

(b)处理粪便样品的工具。

100.权利要求93至99中任一项所述的试剂盒，其中所述至少一种基因选自GATA4、OSMR、NDRG4、GATA5、SFRP1、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC和MGMT。

101.权利要求93所述的试剂盒，其中所述至少一种基因选自GATA4、OSMR、NDRG4和SFRP2。

102.权利要求93至101中任一项所述的试剂盒，其包含用于检测含有至少两种、三种、四种、五种或六种所述基因的基因组合中表观遗传变化的工具，其中在所述基因组合的至少一种基因中检出表观遗传变化指示结直肠癌的易感性或发病。

103.权利要求102所述的试剂盒，其中所述基因组合包含两种、三种、四种、五种或六种基因。

104.权利要求102或103所述的试剂盒，其中所述基因组合包括GATA4和OSMR、GATA4和NDRG4、GATA4和SFRP2、OSMR和NDRG4、OSMR和SFRP2或者NDRG4和SFRP2。

105.权利要求102至104中任一项所述的试剂盒，其中所述基因组合包括GATA4、OSMR和NDRG4，GATA4、OSMR和SFRP2，GATA4，NDRG4和SFRP2或者OSMR、NDRG4和SFRP2。

106.权利要求102至105中任一项所述的试剂盒，其中所述三种或四种基因的组合选自由GATA4、OSMR、NDRG4和SFRP2组成的基因。

107.权利要求102或103所述的试剂盒，其中所述基因组合包含NDRG4、OSMR、SFRP1、ADAM23、GATA5和MGMT。

108.权利要求99至107中任一项所述的试剂盒，其中所述用于处理粪便样品的工具包含用于收集粪便样品的可密封容器。

109.权利要求99至108中任一项所述的试剂盒，其中所述用于处理粪便样品的工具包含匀浆缓冲液。

110.权利要求99至109中任一项所述的试剂盒，其中所述用于处理粪便样品的工具包含用于提取/分离/浓缩/纯化DNA的试剂。

111.权利要求99至110中任一项所述的试剂盒，其中所述用于处理粪便样品的工具包含用于指导所述样品中DNA扩增的引物。

112.用于检测样品中胃肠道癌特别是结直肠癌的易感性或发病的试剂盒，其包含：

(a)用于检测至少一种基因表观遗传变化的工具，所述基因选自OSMR、SFRP1、NDRG4、GATA5、ADAM23、JPH3、SFRP2和APC和/或选自TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3；

(b)用于处理血液样品或其衍生物的工具。

113.权利要求112所述的试剂盒，其中所述至少一种基因选自OSMR、SFRP1、NDRG4、GATA5、ADAM23、JPH3、SFRP2和APC。

114.权利要求112或113所述的试剂盒，其中所述血液样品或其衍生物包含血浆或血清样品。

115.权利要求112至114中任一项所述的试剂盒，其中所述至少一种基因选自OSMR、NDRG4、GATA5和ADAM23。

116.权利要求112至115中任一项所述的试剂盒，其包含用于检测包含至少两种、三种、四种、五种或六种所述基因的基因组合中表观遗传变化的工具，其中在所述基因组合的至少一种基因中检出表观遗传变化指示结直肠癌的易感性或发病。

117.权利要求116所述的试剂盒，其中所述基因组合包含两种、三种、四种、五种或六种基因。

118.权利要求116或117所述的试剂盒，其中所述基因组合由OSMR、NDRG4、GATA5和ADAM23组成。

119.权利要求112至118中任一项所述的试剂盒，其中所述结直肠癌包括早期结直肠癌。

120.权利要求119所述的试剂盒，其中所述早期结直肠癌包括0-II期结直肠癌。

121.权利要求112至120中任一项所述的试剂盒，其中所述用于处理血液样品或其衍生物的工具包含用于收集血液样品的可密封容器。

122.权利要求112至121中任一项所述的试剂盒，其中所述用于处理血液样品或其衍生物的工具包含用于从血液样品或其衍生物中提取/分离/浓缩/纯化DNA的试剂。

123.权利要求122所述的试剂盒，其中所述用于从血液样品或其衍生物中提取/分离/浓缩/纯化DNA的试剂选自表1的试剂盒。

124.权利要求112至123中任一项所述的试剂盒，其中所述用于处理血液样品或其衍生物的方法包含稳定剂。

125.用于检测样品中结直肠癌的易感性或发病的试剂盒，其包含：

(a)用于检测包含OSMR、GATA4和ADAM23或者OSMR、GATA4和GATA5的基因组合中表观遗传变化的工具；

(b)用于处理结肠、直肠或阑尾组织样品的工具。

126.权利要求93至125中任一项所述的试剂盒，其中用于检测所述基因组合中表观遗传变化的工具能够使所述检测在单一反应中进行。

127.权利要求93至126中任一项所述的试剂盒，其中所述表观遗传变化是甲基化。

128.权利要求127所述的试剂盒，其中检测所述基因启动子区的过度甲基化。

129.权利要求127或128所述的试剂盒，其中用于检测甲基化的工具包含甲基化特异性PCR的引物。

130.权利要求129所述的试剂盒，其还包含用于进行所述实时或终点甲基化特异性PCR的工具。

131.权利要求129或130所述的试剂盒，其中所述甲基化特异性PCR引物选自包含表2至表18中所示核苷酸序列的引物。

132.权利要求130或131所述的试剂盒，其包含选自含有表2至表18中所示核苷酸序列之探针的探针。

133.权利要求99至132中任一项所述的试剂盒，其中所述用于处理粪便样品或者血液样品或其衍生物或者组织样品的工具包含选择性修饰所述样品所含DNA中未甲基化胞嘧啶残基的试剂以产生可检测的经修饰残基，但该试剂不修饰甲基化的胞嘧啶残基。

134.权利要求133所述的试剂盒，其中所述试剂包含亚硫酸氢盐试剂。

135.权利要求134所述的试剂盒，其中所述亚硫酸氢盐试剂包含亚硫酸氢钠。

136.测定血浆或血清样品中至少一种基因甲基化状态的方法，其包括：

(a)从血浆或血清样品中分离DNA，

(b)用试剂处理经分离的DNA，所述试剂选择性修饰所述样品所含DNA中未甲基化的胞嘧啶残基以产生可检测的经修饰残基，但该试剂不修饰甲基化的胞嘧啶残基

(c)扩增经处理的分离DNA，从而测定至少一种基因的甲基化状态，其特征在于每个扩增反应使用相当于0.07～0.72ml血浆或血清样品的DNA。

137.权利要求136所述的方法，其中所述血浆或血清样品是血浆样品。

138.权利要求137所述的方法，其中所述血浆样品通过对全血离心而获得。

139.权利要求138所述的方法，其中采用多步离心获取所述血浆样品。

140.权利要求1381所述的方法，其中采用两步离心获取所述血浆样品。

141.权利要求136至140中任一项所述的方法，其中在分离DNA前排除体积小于2ml的血浆样品。

142.权利要求136至141中任一项所述的方法，其中所述试剂包含亚硫酸氢盐试剂。

143.权利要求136至142中任一项所述的方法，其中所述血液样品或其衍生物的体积约为10ml。

144.权利要求136至143中任一项所述的方法，其还包括在步骤(b)之后、扩增之前浓缩所述经处理的分离DNA。

145.权利要求136至143中任一项所述的方法，其还包括使用稳定剂稳定血浆或血清样品。

146.权利要求136至145中任一项所述的方法，其中所述至少一种基因选自OSMR、SFRP1、NDRG4、GATA5、ADAM23、JPH3、SFRP2、APC和MGMT和/或选自TFPI2、BNIP3、FOXE1、SYNE1、SOX17、PHACTR3和JAM3。

147.权利要求146所述的方法，其中所述至少一种基因选自OSMR、SFRP1、NDRG4、GATA5、ADAM23、JPH3、SFRP2和APC。

148.权利要求147所述的方法，其中所述至少一种基因选自OSMR、NDRG4、GATA5和ADAM23。

149.权利要求136至148中任一项所述的方法，其中所述至少一种基因构成基因组合的一部分，所述基因组合包含至少两种、三种、四种、五种或六种基因，其中检对每种所述基因的甲基化状态进行测定。

150.权利要求149所述的方法，其中所述基因组合包含两种、三种、四种、五种或六种基因。

151.权利要求149或150所述的方法，其中所述基因组合由OSMR、NDRG4、GATA5和ADAM23组成。

152.权利要求149至151中任一项所述的方法，其中测定所述基因组合中每个基因的表观遗传变化在单一反应中进行。

153.根据前述任一权利要求的方法，其中所述扩增步骤包括聚合酶链式反应(PCR)。

154.权利要求153所述的方法，其中所述PCR是甲基化特异性PCR。

155.权利要求154所述的方法，其中所述甲基化特异性PCR以实时或终点方式实施。

156.权利要求136至155中任一项所述的方法，其使用选自包含表2至表18中所示核苷酸序列之引物和探针的引物和/或探针，以测定所述至少一种基因的甲基化状态。

157.权利要求136至156中任一项所述的方法，其中所述至少一种基因的甲基化状态与疾病的发病相关，并且所述方法用于检测该疾病的易感性或发病。

158.权利要求157所述的方法，其中所述疾病包括细胞增殖失调。

159.权利要求158所述的方法，其中所述细胞增殖失调包括癌症。

160.权利要求159所述的方法，其中所述癌症包括胃肠道癌。

161.权利要求160所述的方法，其中所述胃肠道癌包括结直肠癌。

162.权利要求161所述的方法，其中所述结直肠癌包括早期结直肠癌。

163.权利要求162所述的方法，其中所述早期结直肠癌包括0-II期结直肠癌。

164.处理粪便样品以分离和制备用于检测粪便样品中结直肠癌易感性或发病的DNA的方法，其包括：

(a)从所述粪便样品中分离DNA；

(b)使用试剂处理每个扩增反应所需的至少2.5μg经分离DNA，所述试剂选择性修饰所述样品所含DNA中未甲基化的胞嘧啶残基以产生可检测的经修饰残基，但该试剂不修饰甲基化的胞嘧啶残基；

(c)扩增经处理的分离DNA。

165.权利要求164所述的方法，其包括在步骤(a)之前向所述粪便样品添加匀浆缓冲液。

166.权利要求164或165所述的方法，其中所述试剂包含亚硫酸氢盐试剂。

167.权利要求166所述的方法，其中所述亚硫酸氢盐试剂包含亚硫酸氢钠。

168.权利要求5164至167中任一项所述的方法，其还包括在步骤(b)之后、步骤(c)之前浓缩所述经处理的分离DNA。

169.权利要求164至168中任一项所述的方法，其中所述粪便样品的重量至少为4g。

170.权利要求164至169中任一项所述的方法，其还包括对所述扩增的经处理DNA实施权利要求1至58中任一项所述的方法。

171.选自包含表2至表18中所示核苷酸序列之引物对的引物对。

172.选自包含表2至表18中所示核苷酸序列之探针的探针。

173.包含权利要求171的引物对和对应的权利要求172的探针的试剂盒。

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