CN102159729B

CN102159729B - 肺癌及结肠直肠癌的分子标记

Info

Publication number: CN102159729B
Application number: CN200980137047.XA
Authority: CN
Inventors: 滕涵菁; 李宛真; 陈瑾妤
Original assignee: STASON PHARMACEUTICALS Inc; Advpharma Inc
Current assignee: STASON PHARMACEUTICALS Inc; Advpharma Inc
Priority date: 2008-09-22
Filing date: 2009-08-28
Publication date: 2015-07-15
Anticipated expiration: 2029-08-28
Also published as: TWI540320B; WO2010033371A2; EP2329040B1; US9249465B2; EP2329040A2; TW201013187A; CN102159729A; WO2010033371A3; US20100075323A1

Abstract

本发明揭露一种使用于血液样本中检测肺癌及结肠直肠癌的分子标记及其方法。所述方法包括由个体中取得血液样本，并量测其癌症基因标记的表达量，以检测和/或评估患者在接受癌症治疗后的反应的预后情形。同时本发明亦揭露一种检测、诊断和/或监测肺癌或结肠直肠癌的试剂盒。

Description

肺癌及结肠直肠癌的分子标记

相关申请参考

本申请要求2008年9月22日提交的美国临时申请No.61/099,008的优先权，将所述临时申请的其全部内容纳入本文作为参考。

技术领域

本发明是关于一种肿瘤相关的分子标记，特别是关于一种外周血液中的肿瘤相关的分子标记。

背景技术

肺癌主要可分为两种，非小细胞肺癌(NSCLC)以及小细胞肺癌(NSCLC)。非小细胞肺癌约占了肺癌的80％。在美国三种最常见的非小细胞肺癌为肺腺癌/支气管肺泡癌(35-40％)、鳞状细胞癌(25-30％)及大细胞肺癌(10-15％)。肺癌若在罹患初期诊断出来，是最容易成功治愈的。初期癌症是指还未生长至大体积或转移至身体其它部位。若是较大的或已转移的癌症较难被治疗。

结肠直肠癌(Colorectal cancer)又称为结肠癌(colon cancer)或大肠癌(large bowel cancer)，包括发生在结肠、直肠及阑尾的癌症。为第三常见的癌症，且在西方国家中为致死率排名第二的癌症。许多结肠直肠癌被认为是由结肠的腺瘤息肉发展而成。那些蕈状的息肉通常是良性的，但有些会随时间发展成癌症。大多情况下，局部结肠癌都是以结肠镜进行诊断。

用于早期肺癌及结肠直肠癌的诊断标记，对于这些疾病的发病率及致死率方面具有重大影响。检测癌细胞专一性的生化标记，可作为有效的筛检策略。并可用于筛检手术后残余肿瘤细胞及隐匿性转移(一种肿瘤再生的早期指标)。因此，早期检测可改善患者的存活率，包括在症状为临床上可检测之前、接受治疗时、以及在缓解时。肿瘤组织中某些标记，已知在该领域中可预测患者的罹癌风险，然而，未被预期也不是可预期到的是，同一标记可在血液中被检测到(参阅发明说明；在肿瘤组织的癌症基因标记对照血液样本)。

因此，迄今为止在该领域中存在了一些缺陷及不足之处，特别是关于在外周血液样本中检测肺癌及结肠直肠癌的方法。

发明内容

本发明的实施例是关于检测肺癌和/或结肠直肠癌的存在和/或严重性的方法。该方法包括下列步骤：

(a)由个体取得包括有核酸的体液的检测样本；

(b)量测至少一个癌症基因标记的表达量，该癌症基因标记选自由：

(i)DUSP6、EIF2S3、GRB2、RNF4、MMD、MCM4、NF1及MDM2所组成的群组；或

(ii)DUSP6、EIF2S3、MDM2、NF1、MMD、RNF4、GRB2及EXT2所组成的群组；

(c)以持家基因(housekeeping gene)对该至少一个癌症基因标记的表达量进行标准化；

(d)使用该至少一个癌症基因标记的标准化表达量至逻辑回归预测模型(logistic regression prediction model)，计算出癌症和/或癌症复发风险的机率；以及

(e)基于该计算出的机率以决定肺癌和/或结肠直肠癌的存在和/或严重性。

在本发明的一实施例中，检测样本为血液样本。

在本发明的另一实施例中，利用实时聚合酶链式反应(real-time PCR)量测至少一个癌症基因标的的表达程度。

在本发明的另一实施例中，在步骤(b)通过该检测样本的循环数目以定量出mRNA表达量[Ct(测试)(Ct(test))]，且其中步骤(c)的标准化是通过将持家基因的mRNA表达量[Ct(HK)]减去Ct(test)，以得到该检测样本的标准化mRNA表达量[^ΔCt(test)]。

在本发明的另一实施例中，该持家基因是选自由次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1，HPRT1)及甘油醛3-磷酸去氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)所组成的群组。

在本发明的另一实施例中，步骤(b)是量测DUSP6的表达量。

在本发明的另一实施例中，步骤(b)是量测以下六种癌症基因标记的表达量：DUSP6、MDM2、NF1、EIF2S3、MMD及RNF4的表达量。

在本发明的另一实施例中，其中该至少一个癌症基因标记是选自由DUSP6、EIF2S3、MDM2、NF1、MMD、RNF4、GRB2及EXT2所组成的群组，且其中步骤(e)是决定肺癌和/或结肠直肠癌的存在和/或严重性。

在本发明的另一实施例中，步骤(b)是量测出下列的表达量，包括至少(i)八种癌症基因标记；(ii)七种癌症基因标记；(iii)六种癌症基因标记；(iv)五种癌症基因标记；(v)四种癌症基因标记；(vi)三种癌症基因标记；或(vii)二种癌症基因标记。

在本发明的另一实施例中，步骤(b)是量测出下列的表达量，包括：

(i)该一个癌症基因标记：DUSP6

(ii)该二个癌症基因标记：DUSP6及EIF2S3；

(iii)该三个癌症基因标记：DUSP6、EIF2S3及GRB2；

(iv)该四个癌症基因标记：DUSP6、EIF2S3、GRB2及RNF4；

(v)该五个癌症基因标记：DUSP6、EIF2S3、GRB2、RNF4及MMD；

(vi)该六个癌症基因标记：DUSP6、EIF2S3、GRB2、RNF4、MMD及MCM4或NF1；

(vii)该七个癌症基因标记：DUSP6、EIF2S3、GRB2、RNF4、MMD、MCM4及MDM2或NF1；

(viii)该三个癌症基因标记：DUSP6、EIF2S3及MDM2；

(ix)该四个癌症基因标记：DUSP6、EIF2S3、MDM2及NF1；

(x)该五个癌症基因标记：DUSP6、EIF2S3、MDM2、NF1及MMD；

(xi)该六个癌症基因标记：DUSP6、EIF2S3、MDM2、NF1、MMD及RNF4；

(xii)该七个癌症基因标记：DUSP6、EIF2S3、MDM2、NF1、MMD、RNF4及GRB2；或

(xiii)该八个癌症基因标记：DUSP6、EIF2S3、MDM2、NF1、MMD、RNF4、GRB2及EXT2。

在本发明的另一实施例中，利用实时聚合酶链式反应(real-time PCR)量测各个癌症基因标的的表达程度，所使用的引物对选自由下列引物对1至9 所组成的群组，包括：

(i)DUSP6(SEQ ID NO：9)专一性引物对1：SEQ ID NOs：137及138，或SEQ ID NOs.139及140；

(ii)EIF2S3(SEQ ID NO：1)专一性引物对2：SEQ ID NOs.17及18，SEQ ID NOs.19及20，SEQ ID NOs.21及22，SEQ ID NOs.23及24，SEQ ID NOs.25及26，SEQ ID NOs.27及28，SEQ ID NOs.29及30，或SEQ ID NOs：31及32；

(iii)MDM2(SEQ ID NO：4)专一性引物对3：SEQ ID NOs：75及76，SEQ ID NOs：77及78，SEQ ID NOs：79及80，或SEQ ID NOs：81及82；

(iv)NF1(SEQ ID NO：6)专一性引物对4：SEQ ID NOs：97及98，SEQ ID NOs：99及100，SEQ ID NOs：101及102，SEQ ID NOs：103及104，SEQ ID NOs：105及106，SEQ ID NOs：107及108，SEQ ID NOs：109及110，SEQ ID NOs：111及112，或SEQ ID NOs：113及114；

(v)MMD(SEQ ID NO：7)专一性引物对5：SEQ ID NOs：115及116，SEQ ID NOs：117及118，或SEQ ID NOs：119及120；

(vi)RNF4(SEQ ID NO：8)专一性引物对6：SEQ ID NOs：121及122，SEQ ID NOs：123及124，SEQ ID NOs：125及126，SEQ ID NOs：127及128，SEQ ID NOs：129及130，SEQ ID NOs：131及132，SEQ ID NOs：133及134，或SEQ ID NOs：135及136；

(vii)GRB2(SEQ ID NO：5)专一性引物对7：SEQ ID NOs：83及84，SEQ ID NOs：85及86，SEQ ID NOs：87及88；SEQ ID NOs：89及90，SEQ ID NOs：91及92，SEQ ID NOs：93及94，或SEQ ID NOs：95及96；

(viii)EXT2(SEQ ID NO：2)专一性引物对8：SEQ ID NOs：33及34，SEQ ID NOs：35及36，SEQ ID NOs：37及38，SEQ ID NOs：39及40，SEQ ID NOs：41及42，SEQ ID NOs：43及44，SEQ ID NOs：45及46，SEQ ID NOs：47及48，SEQ ID NOs：49及50，或SEQ ID NOs：51及52；

(ix)MCM4(SEQ ID NO：3)专一性引物对9：SEQ ID NOs：53及54，SEQ ID NOs：55及56，SEQ ID NOs：57及58，SEQ ID NOs：59及60，SEQ ID NOs：61及62，SEQ ID NOs：63及64，SEQ ID NOs：65及66，SEQ ID NOs：67 及68，SEQ ID NOs：69及70，SEQ ID NOs：71及72，或SEQ ID NOs：73及74。

在本发明的另一实施例中，在步骤(e)决定出肺癌的存在和/或严重性时则选择该EIF2S3(SEQ ID NO：1)专一性引物对2：SEQ ID NOs：27及28、及SEQ ID NOs：31及32、该NF1(SEQ ID NO：6)专一性引物对4：SEQ ID NOs：103及104、和/或该GRB2(SEQ ID NO：5)专一性引物对7：SEQ ID NOs：91及92，若在步骤(e)决定结肠直肠癌的存在和/或严重性时则不选用这些引物对。

在本发明的另一实施例中，在步骤(e)决定出结肠直肠癌的存在和/或严重性时则选择该EIF2S3(SEQ ID NO：1)专一性引物对2：SEQ ID NOs：19及20、该NF1(SEQ ID NO：6)专一性引物对4：SEQ ID NOs：113及114、该EXT2(SEQ ID NO：2)专一性引物对8：SEQ ID NOs：47及48、和/或该MCM4(SEQ ID NO：3)专一性引物对9：SEQ ID NOs：67及68，若在步骤(e)决定肺癌的存在和/或严重性时则不选用这些引物对。

本发明另一实施例是关于一种监测和/或评估患者对癌症治疗的预后反应的方法。该方法包括下列步骤：

(a)在接受结肠直肠癌及肺癌的癌症治疗之前及之后，由该患者取得包括有核酸的体液样本群；

(b)量测至少一个癌症基因标记的表达量，该癌症基因标记选自由DUSP6、EIF2S3、GRB2、RNF4、MMD、MCM4、NF1及MDM2所组成的群组；

(d)使用该至少一个癌症基因标记的标准化表达量至逻辑回归预测模型(logistic regression prediction model)计算出癌症和/或癌症复发的机率；以及

(e)比较该样本群的计算后机率以评估该反应，而借此监测和/或评估该患者对该癌症治疗的预后反应；

其中在接受癌症治疗后该机率的降低是该癌症治疗为正反应(positive response)的表征。

(a)在接受结肠直肠癌及肺癌的癌症治疗之前，由该患者取得包括有核酸的体液的第一样本；

(b)在接受该治疗之后，由该患者取得包括有核酸的体液的第二样本；

(c)量测该第一样本及第二样本中至少一个癌症基因标记的表达量，该癌症基因标记选自由DUSP6、EIF2S3、GRB2、RNF4、MMD、MCM4、NF1及MDM2所组成的群组；以及

(d)比较在该第一样本及第二样本中所量测出的表达量，并借此监测和/或评估该患者对于该癌症治疗的预后反应；其中：

(i)和第一样本中相对应的基因标记相比，在第二样本中DUSP6、GRB2、MCM4和/或NF1表达量的增加，代表该个体具有形成肺癌和/或肺癌复发的风险；

(ii)和第一样本中相对应的基因标记相比，在第二样本中MDM2表达量的增加，代表该个体具有肺癌复发的风险；以及

(iii)和第一样本中相对应的基因标记相比，在第二样本中EIF2S3、MMD和/或RNF4表达量的增加，代表该个体并未有形成肺癌的风险。

本发明的一实施例是关于一种检测肺癌和/或结肠直肠癌的存在和/或严重性的方法。该方法包括下列步骤：

(a)由个体取得包括有核酸的体液的检测样本；

(ii)DUSP6、EIF2S3、MDM2、NF1、MMD、RNF4、GRB2及EXT2所组成的群组；以及

(c)将该至少一个基因标记的表达量与相对应基因标记的表达量作比较，该相对应癌症基因标记取自非癌症对照组的体液检测样本，并借此检测肺癌和/或结肠直肠癌的存在和/或严重性；其中：

(i)和对照组样本中相对应的基因标记相比，在该检测样本中DUSP6、 GRB2、MCM4和/或NF1表达量的增加，代表该个体具有形成肺癌的风险；

(ii)和对照组样本中相对应的基因标记相比，在该检测样本中MDM2表达量的增加，代表该个体具有肺癌复发的风险；

(iii)和对照组样本中相对应的基因标记相比，在该检测样本中EIF2S3、MMD和/或RNF4表达量的减少，代表该个体具有形成肺癌的风险；

(iv)和对照组样本中相对应的基因标记相比，在该检测样本中DUSP6、GRB2、MDM2和/或NF1表达量的增加，代表该个体具有形成结肠直肠癌的风险；

(v)和对照组样本中相对应的基因标记相比，在该检测样本中EIF2S3、MMD、EXT2和/或RNF4表达量的减少，代表该个体具有形成结肠直肠癌的风险；

该方法更包括(a)以持家基因对该至少一个癌症基因标记的表达量进行标准化；(b)使用该至少一个癌症基因标记的标准化表达量至逻辑回归预测模型，计算出癌症和/或癌症复发的机率；以及(c)基于该计算出的机率以决定肺癌和/或结肠直肠癌的存在和/或严重性。

本发明的另一实施例是关于一种使用于上述方法的试剂盒，以检测肺癌和/或结肠直肠癌的存在和/或严重性。该试剂盒包括一或多个引物对，选自由下列基因标记专一性引物对所组成的群组：

(i)DUSP6(SEQ ID NO：9)专一性引物对；

(ii)EIF2S3(SEQ ID NO：1)专一性引物对；

(iii)MDM2(SEQ ID NO：4)专一性引物对；

(iv)NF1(SEQ ID NO：6)专一性引物对；

(v)MMD(SEQ ID NO：7)专一性引物对；

(vi)RNF4(SEQ ID NO：8)专一性引物对；

(vii)GRB2(SEQ ID NO：5)专一性引物对；

(viii)EXT2(SEQ ID NO：2)专一性引物对；

(ix)MCM4(SEQ ID NO：3)专一性引物对。

本发明的另一实施例是关于一种使用于上述方法的试剂盒，以检测肺癌和/或结肠直肠癌的存在和/或严重性。该试剂盒包括一个或多个引物对，选自由下列基因标记专一性引物对1-9所组成的群组：

(i)DUSP6(SEQ ID NO：9)专一性引物对1：SEQ ID NOs：137及138、或SEQ ID NOs.139及140；

(ii)EIF2S3(SEQ ID NO：1)专一性引物对2：SEQ ID NOs.17及18、SEQ ID NOs.19及20、SEQ ID NOs.21及22、SEQ ID NOs.23及24、SEQ ID NOs.25及26、SEQ ID NOs.27及28、SEQ ID NOs.29及30、或SEQ ID NOs：31及32；

(iii)MDM2(SEQ ID NO：4)专一性引物对3：SEQ ID NOs：75及76、SEQ ID NOs：77及78、SEQ ID NOs：79及80、或SEQ ID NOs：81及82；

(iv)NF1(SEQ ID NO：6)专一性引物对4：SEQ ID NOs：97及98、SEQ ID NOs：99及100、SEQ ID NOs：101及102、SEQ ID NOs：103及104、SEQ ID NOs：105及106、SEQ ID NOs：107及108、SEQ ID NOs：109及110、SEQ ID NOs：111及112、或SEQ ID NOs：113及114；

(v)MMD(SEQ ID NO：7)专一性引物对5：SEQ ID NOs：115及116、SEQ ID NOs：117及118、或SEQ ID NOs：119及120；

(vi)RNF4(SEQ ID NO：8)专一性引物对6：SEQ ID NOs：121及122，SEQ ID NOs：123及124、SEQ ID NOs：125及126、SEQ ID NOs：127及128、SEQ ID NOs：129及130、SEQ ID NOs：131及132、SEQ ID NOs：133及134、或SEQ ID NOs：135及136；

(vii)GRB2(SEQ ID NO：5)专一性引物对7：SEQ ID NOs：83及84、SEQ ID NOs：85及86、SEQ ID NOs：87及88；SEQ ID NOs：89及90、SEQ ID NOs：91及92、SEQ ID NOs：93及94、或SEQ ID NOs：95及96；

(viii)EXT2(SEQ ID NO：2)专一性引物对8：SEQ ID NOs：33及34、SEQ ID NOs：35及36、SEQ ID NOs：37及38、SEQ ID NOs：39及40、SEQ ID NOs：41及42、SEQ ID NOs：43及44、SEQ ID NOs：45及46、SEQ ID NOs：47及48、SEQ ID NOs：49及50、或SEQ ID NOs：51及52；

(ix)MCM4(SEQ ID NO：3)专一性引物对9：SEQ ID NOs：53及54、SEQ ID NOs：55及56、SEQ ID NOs：57及58、SEQ ID NOs：59及60、SEQ ID NOs：61及62、SEQ ID NOs：63及64、SEQ ID NOs：65及66、SEQ ID NOs：67 及68、SEQ ID NOs：69及70、SEQ ID NOs：71及72、或SEQ ID NOs：73及74。

该试剂盒更包括专一于持家基因的引物对10。

在本发明的一实施例中，该试剂盒更包括HPRT1专一性引物对10：SEQ ID NOs：153及154。

上述的构想将通过下列较佳实施例的说明及相关附图更为清楚，其中的变化及修改并未超出本案所揭露内容、精神及专利范围。表现本发明的一或多个实施例的图式及其文字说明，可用于解释本发明所请内容。在有可能的情形下，相同的图号标示用于参照实施例中相同或相似的组成组件。

本发明所采用的具体实施例，将通过以下的实施例及附图作进一步的说明。

附图说明

图1为用于预测模型PM-7(N＝300)的接收者操作特性曲线(ROC)图，ROC曲线下面积(AUC)是为0.93136；

图2为用于预测模型PM-14(N＝272)的接收者操作特性曲线(ROC)图，ROC曲线下面积(AUC)是为0.93448；

图3为用于预测模型的接收者操作特性曲线(ROC)图，这些预测模型是使用不同分子标记或表15所列的不同标记的组合。

具体实施方式

本说明书中所使用的用语是在该领域中具有其一般定义，包括在本发明的说明内容，以及特定文字内容部分所使用的用语。以下将讨论本发明所使用的特定用语，亦或说明书的其它部分，以作为实施者在实施本发明的导引。为了便利起见，某些词汇将特别标记，例如使用斜体和/或引号标示。这些标示的使用，将不影响该用语的范围或定义；该用语的范围或定义在文中仍然是相同的，无论其是否有标记。相同的事物可用一种以上的方式描述。因此，在此将使用超过一种的其它用语及同义字，这些用语并无其它特殊含义，无论这些用语是否有特别解释或阐述。在本文中使用了一些同义字，列举一或多种同义字并不代表排除了其它未提及或列举的同义字。在实施例或说明书中所使用的用语仅为用以说明，并非限定其本发明或实施例的范围或定义。同样地，本发明并非受限于说明书中的实施例。

除非另外定义，本文中所使用的技术上或科学上的用语，皆为该领域具有通常知识者所理解在本发明所涉及的一般定义。

本文中所述的“大约”、“约略”或“近似地”一般是指20％的范围内，较佳为10％的范围内，最佳为5％的范围内。本文中的数值为近似值，在未明确定义的情况下可隐含“大约”、“约略”或“近似地”的含义。

本文使用的用语“基因(gene)”，是指一基因体序列的可定位区域。在细胞中，基因是DNA的部分片段，同时包含决定该基因作用的编码(coding)序列，以及决定基因活化(表达)的非编码(non-coding)序列。基因是一种基因体序列的组合，编码一可重迭功能产物的连续组合。由基因表达产生的分子，无论是RNA或是蛋白质，都是已知为基因产物。

本文使用的用语“基因标记(genetic marker)”，是指一种在DNA发生改变，而可指引出特定疾病或异常的风险的增加。

本文使用的用语“基因表达(gene expression)”，是指由基因所生成的蛋白质或功能性RNA产物。

本文使用的用语“基因标签(gene signature/genetic signatures)”，是指细胞中基因活性的特征模式。

本文使用的用语“持家基因(housekeeping gene)”是指一种已知在许多情况下，可维持相对性恒定表达量的基因。持家基因的产物通常是维持细胞所必需的。一般情况下，都是假定其表达量不受实验条件影响。本发明所检测的持家基因是利用临床肿瘤/正常组织，在正常人血液中加入(spike-in)培养的癌细胞，或临床血液样本(肺癌及对照组)是为GAPDH(磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase)；NM_002046；SEQ ID NO：155)，YWHAH(酪氨酸3-单加氧酶/色氨酸5-单加氧酶激活蛋白，η多肽(tyrosine 3-monooxygenase/tryptophan 5-monooxygenase activation protein，eta polypeptide)；NM_003405；SEQ ID NO：156)，SFRS8(智人剪接因子(Homo sapiens splicing factor)，富含精氨酸、丝氨酸8(arginine/serine-rich 8)(抑制因子-白杏-同源(suppressor-of-white-apricot homolog)，果蝇属(Drosophila)；NM_004592；SEQ ID NO：157)，UBA3(泛素激活酶3(Ubiquitin-activating enzyme 3)；NM_003968；SEQ ID NO：158)，RPS24(核糖体蛋白质S24(ribosomal protein S24)；NM_033022；SEQ ID NO：159)，RPL13(核糖体蛋白质L13(ribosomal protein L13)；NM_000977；SEQ ID NO：160)PGK1(磷酸甘油酸激酶1(phosphoglycerate kinase 1)；NM_000291；SEQ ID NO：161)(还参见Dheda等人(2004)生物技术(Biotechniques)37(1)：112-4，116，118-9；人参照基因小组(罗氏)(Human Reference Gene Panel(Roche))；Vandesompele等人(2002)基因组生物学(Genome Biology)3(7)：research0034.1-0034.11)。

本文使用的用语“预后(prognosis)”，是指一种预测疾病的可能发展及结果，特别是复原的可能性。

本文使用的用语“引物(primer)”，是指用于作为DNA复制起始点的DNA的一股。

本文使用的用语“过度表达(overexpressed)”，是指相对于正常或基础表达量而言，具有一种可量测增加的状态。举例而言，一种在疾病中过度表达的分子，与未罹患疾病相比之下，维持其高表达量。

本文使用的用语“过低表达(underexpressed)”，是指相对于正常或基础表达量而言，具有一种可量测减少的状态。举例而言，一种在疾病中过低表达的分子，与未罹患疾病相比之下，维持其低表达量。

在本文中“检测”或“诊断”等用语是可交替地使用。

本文使用的用语“正常组织样本”或“对照组”，是指肺癌或结肠直肠癌组织和/或取自个体的体液，且该个体确认为未有肺癌或结肠直肠癌。

在本文中，“个体(individual)、宿主、患者及个体(subject)”等用语是可交替地使用，是指哺乳类，包括但不限于诸如鼠类、灵长类、人类、非人类的灵长类动物、猫类、狗类、马类、牛类、猪类及羊类。

在组织与血液样本中癌症基因标记的检测

本发明是关于在血液样本中利用实时性PCR(real time-PCR assays)检测癌症相关核酸。在血液样本中量测到的一组基因标记，可用以检测肺癌和/或结肠直肠癌罹患风险是种无法预期的发现。该领域者已知的是在癌症组织中特定的癌症基因标记，可用于预测患者的罹癌风险。然而，不能预测，也无法预测的是，相同的基因标记同样地可在血液样本中被检测到(参U.S.Application NO.11/437,607案，将其全部内容纳入参考)，在此揭露了一组共12个基因(危险度(Hazard Ratio)大于1)，由于被认为是风险因子，因此在血液样本中进行检测。其中4个对于肺癌预后具有风险的基因，HGF、HMMR、ErbB3及DLG2，系因mRNA表达量相当低(其Ct值大于30)。另外，此四个基因有时在血液中无法量测。更进一步，无法预期的是，在实验结果中显示出2个基因MMD及RNF4，在本发明的逻辑回归模型(logistic regression model)中似乎扮演了保护的角色(参阅美国专利申请(U.S.Application)NO.11/437,607)。

经过进一步证实，在组织样本中的癌症标记，在血液样本中不能预测也无法预测，包括如下：EIF2S3在血液检测的预测模型中被认为是保护基因，然而在组织样本检测中，却是肺癌转移的风险基因；MCM4经证实在肺癌组织中为一种癌症相关标记。在血液样本中似乎是肺癌的风险因子，但在结肠直肠癌的整体模型(full model)中似乎扮演保护的角色(表14)。GRB2的表达量与肺癌转移为正相关。由表4及表9的胜算比(odds ration，OR)可知，GRB2基因的转录产物表达量，对肺癌及结肠直肠癌而言为风险因子，但在结肠直肠癌的整体模型(full model)中似乎也是扮演保护的角色(表14)。CPEB4在组织样本研究中为风险因子，但在血液样本检测中为保护因子(表14)。在组织样本研究中，POLDIP2在组织样本检测中为一种保护基因，但在血液样本检测中为风险因子(表14)

因此，在此所揭露用在血液样本的癌症风险诊断及预测癌症标记，并非一种可预期的结果。

肺癌及结肠直肠癌相关基因标记

本发明关于基因标签的确认及应用于检测、诊断肺癌和/或结肠直肠癌，监测治疗结果，及预后的预测，例如复发率。由患者及对照组的血液样本中检测及测量肺癌及结肠直肠癌基因标记的表达量。

在一实施例中，利用实时PCR检测血液中8个基因标记的表达量。由肺癌和/或结肠直肠癌患者的血液样本中显示出其中3个基因DUSP6、MCM4及NF1具有较高表达量，显示出此3个基因与肺癌和/或结肠直肠癌具有关联性。因此，可做为检测肺癌和/或结肠直肠癌风险的基因标记。针对此8个基因的mRNA表达量，利用统计学方法建立数个预测模型，用以预测一个体罹患肺癌和/或结肠直肠癌的风险。表1列示了肺癌及结肠直肠癌基因标记。

表1

基因标记的表达量可利用许多不同检测技术，包括反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、实时性RT-PCR、TAQMAN分析、RNA印迹法、原位杂交及微阵列技术等。

因此，可设计专一于所揭露的基因标记核苷酸的PCR引物。或是可将引物设计用于与相关核苷酸进行交叉反应，例如可杂交于癌症基因标记的变异体 (variants)。以PCR分析基因的转录物表达，可同时检测单核苷酸或多核苷酸(多重(multiplex)PCR)。再利用电泳分析PCR扩增所得产物。对应各个癌症基因标记的各个PCR产物可经由在电泳中移动快慢予以区别。或是，可将PCR引物加上标定物以检测PCR产物。包括有荧光标记的引物而其PCR产物可通过荧光检测，亦可在PCR反应中同时使用具有不同标定物的引物混合物以同时进行检测复数种多核苷酸。以在鉴定产物时利用其不同的标定物予以区别。例如，可利用具有不同吸收光谱的荧光标记的引物。

癌症基因标记的多核苷酸表达量可利用基因表达连续分析法(SAGE)以及大规模平行信号测序(Massively Parallel Signature Sequencing，MPSS)进行检测。可参阅Brenner等人，“在微珠阵列上通过大规模平行信号测序(MPSS)的基因表达分析(Gene expression analysis by massively parallel signature sequencing(MPS S)on microbead arrays)，”自然生物技术(Nature Biotechnology)18：630-34(2000)。

预测模型

基因标记表达量的统计分析可用于预测个体具有肺癌和/或结肠直肠癌的风险。可利用胜算比(Odds Ratio，OR)估算具有肺癌和/或结肠直肠癌的相对风险。胜算比(OR)是一种效应值的量测，说明关联性的强度或两个二元数据值之间的非独立性(non-independence)，用以作为一种描述性统计以及在逻辑回归中扮演一重要角色。

胜算比(OR)的定义为，事件发生在一群体中相对于发生于另一群体中的成功率。统计学上，成功率是发生某一事件的机率除以不发生该事件的机率。胜算比是一种对于两群体，比较某一特定事件发生机率是否相同的方法。胜算比等于1时，显示该事件发生于二个群体中的倾向相同。胜算比大于1时，显示该事件较倾向于发生于第一群体中。胜算比小于1时，显示该事件较不倾向于发生于第一群体中。

若某事件在各个群体中发生的机率分别为p₁(第一群体)及p₂(第二群体)，则其胜算比为：

\frac{p_{1} / (1 - p_{1})}{p_{2} / (1 - p_{2})}

逻辑回归(也称逻辑模型(logistic model)或对数成败比率模型(logit model))是通过拟合数据于逻辑曲线，用于预测事件的发生机率。逻辑回归模型得出发生的反应作为自变量指数函数的机率。该模型以机率(P)表示，其范围由0到1。

逻辑回归以逻辑方程式表示：

f (Y) = \frac{1}{1 + \exp^{- Y}} = P

输入值为Y而输出值为f(Y)，即是P。输出值限于0到1之间。变量Y代表曝露于某些风险因子，而f(Y)代表由这些风险因子所得出的特定结果的机率。该变量Y是模型中所使用的所有风险因子的总体衡量，也被称为对数优劣比(logit)。

变量Y通常定义为Y＝β₀+β₁x₁+β₂x₂+...+β_kx_k，β₀即称为截距(intercept)，β₁，β₂，β₃等分别称为x₁，x₂，x₃的回归系数(regression coefficients)。当所有风险因子为0时(即在某个不具任何风险因子的个体的z值)，Y的值即等于截距。各个回归系数描述了该风险因子的贡献度大小。正回归系数表示该风险因子增加了结果的机率，而负回归系数表示该风险因子降低了结果的机率；较大的回归系数表示该风险因子大幅影响了结果的机率；而一个接近0的回归系数表示该风险因子只会微幅影响结果的机率。逻辑回归在评估一或多个风险因子及结果方面，是一种相当有用的工具。

在本发明中，个体若是其计算出的机率(P)值大于0.5时，将被怀疑具有肺癌或结肠直肠癌。然而，对于具有预测模型的较高敏感性或专一性的机率，可得到其临界值(cut-offvalue)的设定。

更进一步，实验检测的临床表现，可利用诊断准确性的方式予以表现，或是正确地将个体分类为临床相对次群组的能力(Zweig和Campbell，1993，接收者操作特性曲线(Receiver-Operating Characteristic(ROC)plots).临床化学(Clinical Chemistry)39：561-577)。在诊断测试时，用于评估临床表现的项目包括敏感性、专一性、效率、准确性、实用性、有用性及有效性。

利用ROC曲线可提供准确性的完全指针，通过显示检测能力的极限，以在健康的其它状态与整体操作条件间予以区分。ROC曲线为敏感性(sensitivity)对1-专一性(1-specificity)作图的二元分类系统，其区别阈值为可变动的(图1)。ROC曲线可等效地表现，通过绘出真阳性(真阳性率TPR)的部份对假阳性(假阳性率FPR)的部份。ROC曲线越接近左上角的部份，其准确性越好，是因为其真阳性为1，而其假阳性为0。ROC曲线用以评估以分子标记为基础的临床检测而言，具有很好的效果。

ROC曲线下的面积(AUC)表示用于将疾病群组(肺癌或结肠直肠癌)从正常个体中区分出来的检测能力(预测模型)。AUC越大，检测效果越好。一般而言，AUC值至少在0.7～0.8之间才是有效的检测，0.8～0.9之间表示是不错的检测，而在大于0.9以上则是极佳的检测(Nakamur等人(2004)，“癌症诊断，现在和未来趋势(Cancer Diagnostics，Current and Future Trends)”Humana Press，Totowa，New Jersey，USA；p403)。

这些癌症标记可进一步以组合方式使用，例如在一组别或预测模型中包含两个以上的癌症标记。在一组别预测模型中，可利用3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个癌症标记。表示可能有多种肺癌将会过度表达在基因标记DUSP6、MDM2、MCM4、NF1及GRB2的至少一个，和/或过低表达于基因标记EIF2S3、MMD及RNF4的至少一个，以及可能有多种结肠直肠癌将会过度表达在基因标记MDM2、GRB2、NF1及DUSP6的至少一个，和/或过低表达于基因标记EIF2S3、EXT2、MMD及RNF4的至少一个。因此，将这些标记组合于一个预测模型中将可对特定癌症提供一种全面性筛检。

一种试剂盒(kit)，在各容器中可能包括有一个或多个多核苷酸引物对，包含与SEQ ID NO：1-9的基因或至少与其90％相同的mRNA互补序列。

实施例

以下所记载的实施例，包括实施说明、装置、方法及其相关结果，并非限制本案的专利范围。实施例中所使用的标题或副标题，仅是为方便进行说明，并非限制本案的专利范围。进一步地，在此揭露的特定理论，无论其对或错，只要本发明可据以实施，皆不影响本案的专利范围。

实施例1

肺癌及结肠直肠癌的分子标记的血液检测步骤

单核细胞的制备。由肺癌及结肠直肠癌患者取其外周血液(5-8ml)，并以BD vacutainer CPT^TM tube(BD，USA)，依其使用说明，分离出正常个体的单核细胞(MNC)。将MNC部分加入三倍于全血样本体积的PBS缓冲液，以2000rpm离心10分钟。再将MNC部分以1ml的PBS缓冲液洗涤，以2000rpm离心5分钟。将最终沉淀物加入2ml的Super RNApure^TM reagent(包含在SuperRNApure^TM kit，Genesis，Taiwan)。

癌症标记基因表达的实时PCR(Real-time PCR)分析。利用Super RNApure^TM试剂盒，依据使用说明，从MNC部份中萃取出全RNA。将RNA沉淀溶解于DEPC处理过的水中，在使用前皆保存于-80℃下。RNA的质量以1％琼脂电泳分析，并确认其OD₂₆₀/OD₂₈₀比值大于1.7。取大约1μg的全RNA，以随意引物对(random hexamer primers)(Amersham Bioscience，UK)及Superscript^TM II反转录酶(Invitrogen，USA)进行cDNA合成，其步骤接依照使用说明进行。

表1列出16种基因，是被选为肺癌及结肠直肠癌的基因标记，并用于进行实时PCR分析其mRNA表达量。分别是(1)eukaryotic translation initiation factor 2，subunit 3 gamma，52kDa(EIF2S3)，(2)exostoses(multiple)2(EXT2)，(3)minichromosome maintenance complex component 4(MCM4)，(4)Mdm2，transformed 3T3 cell double minute 2，p53 binding protein(mouse)(MDM2)，(5)growth factor receptor-bound protein 2(GRB2)，(6)neurofibromin 1(neurofibromatosis，von Recklinghausen disease，Watson disease)(NF1)，(7)monocyte to macrophage differentiation-associated(MMD)，(8)ring finger protein 4(RNF4)，(9)dual specificity phosphatase 6(DUSP6)，(10)cytoplasmic polyadenylation element binding protein 4(CPEB4)，(11)wee+(S.pombe)homolog(WEE1)，(12)interferon regulatory factor 4(IRF4)，(13)signal transducer and activator of transcription 2，113kD(STAT2)，(14)zinc finger protein 264(ZNF264)，(15)DNA polymerase delta interacting protein 2 (POLDIP2)，及(16)hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1(HPRT 1)。

实时PCR分析是使用Roche LightCycler 1.5试剂盒，依据其使用说明，进行mRNA表达量的分析。反应混合液总体积为20μl，包括20-100ng的cDNA、引物、探针(Universal ProbeLibrary probe)以及Master Mix LightCycler TaqMan Master Mix(Roche，Germany)。扩增反应以95℃进行10分钟后，再以95℃、5秒，60℃、20秒及72℃、1秒进行40个循环。并以仅有反应物而不包含cDNA的样本作为对照组，以确定分析进行是在无污染的环境下。

表2列出进行RT-PCR扩增时所使用的引物及探针。基因专一性引物对及核苷酸探针的组合细选自Universal ProbeLibrary^TM(F.Hoffmann-La Roche Ltd，Basel，Switzerland)，可在实时聚合酶链式反应(Real-time PCR)分析时更具有专一性。

表2

^*：探针编号是指Universal ProbLibrary probe^TM编号。

^**：HPRT1是作为对照基因。

^#：引物序列184-1R(SEQ ID NO.149)是可完美配对于变异体2(NM_203506)，在变异体1(SEQ ID NO.5，NM_002086)的5′位置具有一错配(mismatch)。两个变异体的mRNAs皆可以184-1F/184-1R引物对进行扩增。

^##：只有变异体1(SEQ ID NO.5，NM_002086)可利用引物对扩增。

^###：两个变异体的mRNAs(SEQ ID No.5，NM_002086 and NM_203506)皆可得到相同的扩增。

实施例2

肺癌分子标记的血液检测

材料及方法

血液样本是取自肺癌患者。本实施例是以150位经过组织切片确认的肺癌患者(选自3家不同医院)进行分析。其中40位来自台大医院(Taipei，Taiwan；A地区)，30位来自三军总医院(Taipei，Taiwan；A地区)，以及80位来自台中荣民总医院(Taichung，Taiwan；B地区)(2006年4月至2007年3月之间)。最后一组是包括28位复发的肺癌患者。表3列出所有详细的临床病理特征，包括全体肺癌患者(n＝150)，及其中新的肺癌患者(n＝122)。所有患者皆分别经由各医院的人体试验委员会(IRB)核准。

表3

^*：NSCLC表示非小细胞癌 ^**：SCLC表示小细胞癌

对照组样本。由78个正常个体中收集其外周血液样本，包括28位男性及50位女性，平均年龄为60.9±11.0，A地区(台北)。在B地区(台中)，取自正常个体的72个外周血液样本(临床上未罹癌)，包括24位男性及48位女性，平均年龄为55.3±9.3。皆取得捐赠样本的本人同意。

每位患者收集8ml的外周血液(使用BD vacutainer CPT^TM tube(BD，USA))。由血液样本中制备MNC，依据实施例1的方法，萃取其全RNA及进行RT-PCR分析其癌症基因标记表达。

资料标准化及统计分析。实时定量PCR(qPCR)技术是依据在对数期间，检测各个循环的PCR产物。实时分析的器材，包括结合荧光检测及热循环，量测每个循环的信号改变(相对荧光单位(RFU))。由指数期所得结果，可估算出最佳的起始物含量。在扩增曲线通过阈值的循环数即为样本的循环阈值(Ct)。当初始DNA样本的增加，则Ct值呈线性减少，可用于定量分析基因的 mRNA表达量。

各基因的mRNA表达的相对定量的统计分析是利用统计软件SAS version 9.1.3 Service Pack 3。数据经过下列标准化：^ΔCt(test)＝Ct(HK)-Ct(test)，其中Ct(test)代表分析基因的循环数，Ct(HK)代表内生性持家基因HPRT1(HK)的循环数。

结果

利用卡方检定(Chi-Square Test)及变异数分析(ANOVA)进行数据分析。变异数分析是可检定二个或二个以上的母体平均数是否相等的方法，或检定因子(factor)对变量是否有影响。在对照组中所有欲检测基因的mRNA表达量显示与地域参数具有极大关联性，然而仅有肺癌患者的EIF2S3、MDM2及DUSP6的mRNA表达量极度相关。在本发明中的“地域”因素的影响已受到控制，因为对照组的血液样本是从两个相同地区的肺癌患者群组中所取得。

多重逻辑回归可用于评估基因表达量与肺癌之间的关联性，因为在预测方程式中包括有超过一个的独立变量。将第一组及第二组的资料分别进行分析其统计意义。

第一组病例与对照研究组别具有300个样本数(N)，包括150个肺癌患者(新的及复发的案例)以及150个对照组。由第一组所得统计结果显示出，包括下列7个基因的mRNA表达量与肺癌极为相关(p＜0.05)：EIF2S3、MCM4、MDM2、GRB2、MMD、RNF4及DUSP6(表4)。

在表4中，OR大于1显示患者的该基因具有较高的mRNA表达量，例如MCM4、MDM2、GRB2或DUSP6，该患者较易被归类到肺癌群组中。GRB2基因的mRNA表达量的OR值为11.873，是指该个体在肺癌群组中与在对照组的个体相比，具有超过10倍发展为肺癌的风险，当GRB2 mRNA的ΔCt(test)增加了一单位。OR小于1显示该个体的EIF2S3、MMD或RNF4基因具有较高的mRNA表达量，其罹患肺癌的风险较低。

第二组病例与对照研究组别具有272个样本数(N)，包括122个新肺癌患者以及150个对照组(同第一组)。第二组仅包括新肺癌案例，而无该28个复发的案例。由第二组所得OR值显示出，包括下列7个基因的mRNA表达量与肺癌极为相关：EIF2S3、MCM4、GRB2、NF1、MMD、RNF4及DUSP6。在这些基因中，除了NF1的外的其它6个基因在两个组别皆有关联性(表4)。MCM4、GRB2、NF1及DUSP6基因具有较高的mRNA表达量，被认为是肺癌的风险因子，而EIF2S3、MMD及RNF4基因则被认为是保护性基因(表4)。

MDM2的mRNA表达量与肺癌复发的28个案例具有非常显著的关连性，显示MDM2基因表达对于肺癌复发率极度相关。第一组与第二组的比较，显示NF1基因表达可能与肺癌发生较具有关联性。

表4

^*：OR代表胜算比(odds ratio)

实施例3

肺癌的基因标签及临床结果的预测

预测模型是基于欲检测基因的mRNA表达量所建立，用于预测罹患肺癌的风险，评估特定药物或疗程的治疗结果。预测模型的方程式是利用多重回归的逐步变量选择法，且p值(p-value)小于0.1。

首先利用统计分析软件选择DUSP6基因，使用逻辑回归以形成N＝300及N＝272的预测模型。在预测模型中加入EIF2S3基因进行相同分析。再依序加入其它重要的基因，且以前述流程依序加入，直到满足N＝300及N＝272的病例与对照研究组别中的理想有效指标，诸如敏感性大于80％，专一性大于80％，准确性大于85％以及AUC(ROC下的面积)大于0.9。

表5显示有效指针的计算，诸如敏感性、专一性及准确性。当一个体进行癌症方面的检测时，检测结果可以是阳性(sick)或阴性(healthty)，敏感性＝ (真阳性数目)/(真阳性数目+伪阴性数目)；专一性＝(真阴性数目)/(真阴性数目+假阳性数目)；准确性＝(真阳性数目+真阴性数目)/(真阳性数目+伪阴性数目+假阳性数目+真阴性数目)。

表5

单基因标签：DUSP6

在肺癌患者的外周血液样本中检测到DUSP6基因mRNA表达量的增加，但未在对照组中检测到此结果。在两组别的病例与对照研究组别中，其mRNA表达量的增加皆与肺癌高度相关。另外，在两个组别中(N＝300及N＝272的组别)，DUSP6基因mRNA表达量的OR值为5.3与8.7(表4)，显示该个体具有较高DUSP6基因mRNA表达量，和表达量较低个体相比之下，其具有5-9倍发展为肺癌的风险。

DUSP6基因mRNA表达量的量测，足以分别作为N＝300组别的预测模型PM-1及N＝272组别的预测模型PM-8中的单一变量。两模型中同时得到良好的有效指标，诸如敏感性＝69-72％，专一性＝80-83％，准确性＝72-77％，以及AUC＝79-81％(表6及7)。这些结果显示DUSP6基因mRNA表达量可作为用于检测肺癌的分子标记，一般认为AUC为0.8至0.9即为良好的检测。

DUSP6基因可进一步作为一种预后标记(prognostic marker)，用于监测治疗后反应、复发率以及存活率，因为在肺癌患者取得的外周血液样本中，一致地发现DUSP6基因mRNA表达量较高，但在正常对照组的样本中则未得到此结果。举例而言，DUSP6基因mRNA表达量降低，可作为在治疗后阳性反应的直接或间接结果、或作为具有较低的复发率、较佳的预后、以及较长存活期的表征。

表6

预测模型方程式如下：(1)PM-1：Y＝-2.9954+1.5474xDUSP6；(2)PM-2：Y＝2.2095+2.0365xDUSP6-1.7257xEIF2S3；(3)PM-3：Y＝1.4289+1.4017xDUSP6-2.5814xEIF2S3+1.9511xGRB2；(4)PM-4：Y＝3.1608+1.5836xDUSP6-2.7234xEIF2S3+2.5838xGRB2-1.3237xRNF4；(5)PM-5：Y＝3.5445+1.7293xDUSP6-2.3917xEIF2S3+2.7266xGRB2-1.6062xRNF4-0.7211xMMD；(6)PM-6：Y＝6.0403+1.7820xDUSP6-2.4374xEIF2S3+2.5568xGRB2-1.8151xRNF4-0.7617xMMD+1.0296xMCM4；(7) PM-7：Y＝9.0793+1.6680xDUSP6-2.9325xEIF2S3+2.4742xGRB2-1.9206xRNF4-0.8141xMMD+1.0983xMCM4+0.9274xMDM2.

表7

预测模型方程式如下：(1)PM-8：Y＝-3.8260+1.8525xDUSP6；(2)PM-9：Y＝1.4569-1.7287xEIF2S3+2.3448xDUSP6；(3)PM-10：Y＝0.6016-2.4501xEIF2S3+1.7576xGRB2+1.7607xDUSP6；(4)PM-11：Y＝2.1254-2.5506xEIF2S3+2.3450xGRB2-1.2167xRNF4+1.8972xDUSP6；(5)PM-12：Y＝2.7212-2.2022xEIF2S3+2.5379xGRB2-0.8757xMMD-1.5887xRNF4+2.1095xDUSP6；(6)PM-13：Y＝4.7530-3.1491xEIF2S3+1.5388xNF1+2.8198xGRB2-1.1177xMMD-1.7172xRNF4+2.1433xDUSP6；(7)PM-14：Y＝6.7266-3.2199xEIF2S3+0.8119xMCM4+1.5322xNF1+2.6894xGRB2-1.1209xMMD-1.8324xRNF4+2.1659xDUSP6.

双基因标签：DUSP6、EIF2S3

选择EIF2S3基因是用以改善两个病例与对照研究组别的预测表达。EIF2S3基因mRNA表达量似乎与肺癌发生率为负相关。极低的EIF2S3基因 OR值(表4，0.004及0.053)显示每增加一个单位的^ΔCt(test)，可分别在病例与对照研究组别(N＝272及N＝300)中，导致具有肺癌的机率下降99.6％(＝(1-0.004)x100％)以及94.7％(＝(1-0.053)x100％)。

预测模型PM-2及PM-9各包括二个分子标记EIF2S3及DUSP6基因，以高专一性(PM-9为87％以及PM-2为81％)，以区分肺癌患者及非癌症对照组样本。此两个使用双基因标签的预测模型，比起使用单基因标签的模型，其三个有效指标：专一性、准确性及AUC增加6-9％(表6及7)。

在病例与对照研究组别中(N＝272)，和使用单基因标签的预测模型相比，使用双基因标签的预测模型具有较佳的专一性，然而在N＝300的病例与对照研究组别中，专一性维持不变。

使用双基因标签的预测模型中，在ROC曲线下的面积值(AUC＝0.86998for N＝300；AUC＝0.87221 for N＝272)显示出其具有较佳的诊断正确性。在临床上的可能应用包括肺癌检测、治疗结果的监测以及预后情形，诸如在其后特定时间内的复发机率及存活率。

三基因标签：DUSP6、EIF2S3、GRB2

和使用双基因标签的预测模型(PM-2，表6)相比，使用三基因标签的预测模型(PM-3)的病例与对照研究组别(N＝300)的有效指标较高。然而，和使用双基因标签的预测模型(PM-9，表7)相比，在N＝272的病例与对照研究组别中，使用三基因标签的(PM-10)的预测模型仅微幅地改善了专一性。

使用三基因标签的两预测模型，其较高的AUC值(至0.89)显示出可用于临床应用，包括肺癌检测、治疗结果的监测以及预后情形，诸如在其后特定时间内的复发机率及存活率。

四基因标签：DUSP6、EIF2S3、GRB2、RNF4

RNF4基因的mRNA表达量与肺癌为负相关，并且是加入模型的第4个重要因子(PM-4及PM-11；表6及7)。因为在N＝300及N＝272的病例与对照研究组别中，RNF4基因的OR值分别为0.147及0.16，显示每增加1个单位的^ΔCt(test)，具有肺癌的机率降低85.3％((1-0.147)x100％)，以及84％((1-0.16)x100％)。

一肺癌患者可准确地与未罹患癌症个体区分，通过使用四基因标签的模型，因为AUC在二模型中皆大于0.9，一般认为此为完美的检测。在该二模型中的其它有效指针亦符合良好诊断检测的标准，诸如80-82％的敏感性，89-91％的专一性，以及86％的准确性(表6及7)。

四基因标签可进行的临床应用包括有：肺癌检测、治疗结果的监测以及预后情形，诸如在其后特定时间内的复发机率及存活率。

五基因标签：DUSP6、EIF2S3、GRB2、RNF4、MMD

加入MMD基因作为第5个癌症相关分子标记，以形成预测模型PM-5及PM-12(表6及7)。MMD、EIF2S3及RNF4基因的mRNA表达量与肺癌呈现负相关，因为在N＝300的病例与对照研究组别中，这些基因的OR值为0.443、0.053及0.147，在N＝272的病例与对照研究组别中，这些基因的OR值为0.326、0.004及0.160(表4)。因此在预测模型中，这些基因被认为对于肺癌是一种保护基因。

和使用四基因标签的预测模型(PM-4及PM-11)相比，使用五基因标签的预测模型(PM-5及PM-12)的诊断效果稍为较佳。在病例与对照研究组别中，仅有AUC值从0.908增加至0.918(N＝300)，以及0.906增加至0.923(N＝272)，而其它有效指标诸如敏感性、专一性以及准确性几乎皆相同。五基因标签可进行的临床应用包括有肺癌检测、治疗结果的监测以及预后情形，诸如在其后特定时间内的复发机率及存活率。

六基因标签：DUSP6、EIF2S3、GRB2、RNF4、MMD、MCM4/或NF1

选择MCM4基因作为第6个癌症相关分子标记，加入在N＝300的病例与对照研究组别的预测模型PM-6中，而NF1基因是加入在N＝272的病例与对照研究组别的预测模型PM-13中。因为在N＝300的病例与对照研究组别中，其OR值为2.999，而在N＝272的病例与对照研究组别中，其OR值为2.252，当一个体的MCM4基因的mRNA表达量增加1个单位的^ΔCt(test)，则形成肺癌的风险增加2-3倍。NF1基因的mRNA表达量越高，代表形成肺癌的风险越大。

在N＝300的病例与对照研究组别中，关于敏感性、专一性、准确性以及AUC，预测模型PM-6的诊断效果稍微优于PM-5(表6)。预测模型PM-13对于在N＝272的病例与对照研究组别中显示，与预测模型PM-12几乎具有相同效果(表7)。使用六基因标签的二预测模型可进行的临床应用包括有，肺癌检测、治疗结果的监测以及预后情形，诸如在其后特定时间内的复发机率及存活率。

七基因标签：DUSP6、EIF2S3、GRB2、RNF4、MMD、MCM4及MDM2或NF1

相较于前6个分子标记：DUSP6、EIF2S3、GRB2、RNF4、MMD及MCM4，在使用多重逻辑回归的预测模型PM-7对N＝300的病例与对照研究组别中(表6)，MDM2基因是为第7个加入的分子标记。在仅包括复发及新罹患的病例与对照研究组别中，较高的MDM2基因的mRNA表达量与肺癌高度相关。然而，在除去复发的案例后，即不是重要的分子标记。由结果显示出，MDM2的mRNA表达量可能在肺癌复发上扮演了一个特殊角色。

N＝300的病例与对照研究组别中，使用七基因标签的预测模型PM-7，用于清楚区分肺癌患者与正常个体的对照组，其具有完美的诊断结果，诸如82％的敏感性、88％的专一性、85％的准确性以及一计算后的AUC为0.93136。第1图显示用于预测模型PM-7的ROC曲线，以及估算区域(C)的值。

对于N＝272的病例与对照研究组别，预测模型PM-14包括7个肺癌相关分子标记：DUSP6、EIF2S3、GRB2、RNF4、MMD、NF1及MCM4基因(表7)。在包括仅有新肺癌案例的N＝272的病例与对照研究组别中，较高的NF1基因的mRNA表达量，代表具有形成肺癌的较大风险。

预测模型PM-14显示出完美的诊断效果，具有80％的敏感性，90％的专一性，86％的准确性及一估算后的AUC为0.93448，其相似于预测模型PM-7。预测模型PM-14的有效指针诸如专一性及AUC稍微高于PM-7(表7)。第2图显示预测模型PM-7的ROC曲线，以及在ROC曲线下的估算面积值(AUC)。

实施例4

结肠直肠癌分子标记的血液检测步骤

50位经过组织切片确认的结肠直肠癌患者，所有患者皆经由振兴复健医学中心(台北，台湾)的人体试验委员会(IRB)核准。表8列出了所有病患的详细的临床病理特征。

利用BD vacutainer CPT^TM tubes(BD，USA)，由各患者抽取8ml的外周血液样本。在对照组样本方面，对78个正常自愿受试者(临床上未罹癌，台北)的外周血液样本进行统计分析。对照组包括了28位男性及50位女性，平均年龄为60.9±11.0。

由血液样本中萃取全RNA，依据实施例1的方法合成cDNA。各样本的EIF2S3、EXT2、MCM4、MDM2、GRB2、NF1、MMD、RNF4、DUSP6、CPEB4、WEE1、IRF4、STAT2、ZNF264、POLDIP2及HPRT1(作为对照基因)的16个基因的mRNA表达，是依据实施例1的方法，进行实时(real-time)PCR分析其癌症基因标记表达。资料标准化及统计分析是如实施例2所述。

表8

结果

利用卡方检定(Chi-Square Test)及变异数分析(ANOVA)分析由患者群组及对照组群组的样本中，所欲检测基因的mRNA表达量，以测试其关连性及变异数的独立性。

在结肠直肠癌患者群组及对照组群组中，皆已确认不存在年龄及性别相关的基因表达。并已排除地域因素的影响，因为对照组及结肠直肠癌样本皆取自相同的地理区域。

EIF2S3、MDM2、GRB2、NF1、MMD、RNF4及DUSP6基因的mRNA表达量与结肠直肠癌具有高度关联性，其p值＜0.05(表9)。虽然EXT2基因的mRNA表达量的p值为0.06，接近于0.05，其仍用于做为结肠直肠癌相关的分子标记。

OR值大于1表示，一个体的所欲检测基因诸如MDM2、GRB2、NF1或DUSP6基因的mRNA表达量较高，和具有相同基因的mRNA表达量较低的个体相比，比较容易形成结肠直肠癌。OR值小于1表示，一个体的所欲检测基因诸如EIF2S3、EXT2、MMD或RNF4基因的mRNA表达量较低，比较容易形成结肠直肠癌。换言之，在外周血液样本中，MDM2、GRB2、NF1或DUSP6基因的mRNA表达量较高，被认为是具有形成结肠直肠癌的风险因子，而EIF2S3、EXT2、MMD或RNF4基因的mRNA表达量较高，则似乎被认为是扮演一保护者的角色。

表9

*：p＜0.05；**：p＜0.01；***：p＜0.001

实施例5

结肠直肠癌的基因标签

用于预测结肠直肠癌、评估治疗后反应及预后情形的统计学方法是如实施例2所述。简言之，预测模型是以所欲检测基因的mRNA表达量为基础。预测模型的方程式是使用多重回归的渐进式变异数选择法，且p值＜0.1(表9)。DUSP6基因是由统计分析程序所选出的第一个基因，以建立预测模型。EIF2S3基因再加入该预测模型以进行相同的分析步骤。其它重要的基因依序加入，且进行如上述步骤，直到出现理想的有效指标，诸如＞80％的敏感性、＞85％的专一性、＞85％的准确性以及AUC(ROC曲线下的面积)＞0.9(表10)。

表10

预测模型方程式如下：(1)PM-15：Y＝-3.5600+1.5766x DUSP6；(2)PM-16：Y＝1.8263-1.5721x EIF2S3+1.6581x DUSP6；(3)PM-17：Y＝8.5768-2.9997x EIF2S3+2.5961x MDM2+1.2722x DUSP6；(4)PM-18：Y＝9.1597-3.9042x EIF2S3+1.9563x MDM2+2.4926x NF1+1.3385x DUSP6；(5)PM-19：Y＝9.9823-3.9749x EIF2S3+1.8787x MDM2+2.8088x NF1-0.7192x MMD+1.6132x DUSP6；(6)PM-20：Y＝14.9816-4.0103x EIF2S3+2.5131x MDM2+2.6702x NF1-1.1964x MMD-1.7016x RNF4+2.0085x DUSP6；(7)PM-21：Y＝15.0677-4.6737x EIF2S3+2.4380x MDM2+1.3340x GRB2+3.2085x NF1-1.3968x MMD-1.9878x RNF4+1.7477x DUSP6；(8)PM-22：Y＝13.9614-5.1493x EIF2S3-1.428x EXT2+2.8761x MDM2+1.9449x GRB2+3.7571xNF1-1.4987xMMD-1.6345xRNF4+1.6694xDUSP6.

单基因标签：DUSP6

在结肠直肠癌患者的外周血液样本中检测到DUSP6基因的mRNA表达量一致的增加，但未在对照组中检测到此结果。DUSP6基因的mRNA表达量与结肠直肠癌高度相关(p值＝0.0019)。DUSP6基因mRNA表达量的OR值为5.3，显示具有较高DUSP6基因mRNA表达量的个体，和表达量较低的个体相比，其具有5倍多发展为结肠直肠癌的风险(每减少一单位的^ΔCt(test))。

在预测模型PM-15中，DUSP6基因的mRNA表达量的量测已足够，并得到一较高专一性(0.82)，以及其它良好的有效指标(如表10)。结果显示DUSP6基因的mRNA表达量可作为用于检测结肠直肠癌的分子标记，因为其AUC为0.7至0.8，一般认为此为最低限度的有效检测。

DUSP6基因的mRNA表达量可进一步作为指标，用于监测治疗后反应及作为一预后标记，以评估其后特定时间内的复发机率及存活率。举例来说，DUSP6基因mRNA表达量降低，可作为在治疗后阳性反应的直接或间接结果、或作为具有较低的复发率、较佳的预后、以及较长存活期的表征。

双基因标签：DUSP6，EIF2S3

EIF2S3基因的mRNA表达量是选择作为第二个结肠直肠癌相关分子标记(p值＜0.0001)，以改善预测模型的效果(表10)。EIF2S3基因其极低的OR值(OR＝0.006)表示增加1个单位的^ΔCt(test)可导致减少至99.4％((1-0.006)*100)具有结肠直肠癌的机率。

预测模型PM-16是以EIF2S3及DUSP6基因的mRNA表达量为基础，以一高专一性(约85％)，由对照组中区分出结肠直肠癌患者。预测模型PM-16和仅包括一个分子标记DUSP6的预测模型PM-15相比，预测模型PM-16的其它诊断表现特征，诸如敏感性、准确性及AUC，增加约5-10％。

预测模型PM-16的AUC值为0.82615(表10)，其符合理想诊断检测的标准。双基因标签检测的可能临床病理应用，包括检测结肠直肠癌、监测治疗后反应、预后的预测，即其后特定时间内复发率及存活率。

三基因标签：DUSP6，EIF2S3，MDM2

MDM2基因(p值＝0.0009)，具有高OR值(OR＝17.745)，是为第三个加入预测模型PM-16的癌症相关分子标记。具有较高MDM2基因的mRNA表达量的一个体，相对于一较低MDM2基因的mRNA表达量的个体而言，约有17倍形成结肠直肠癌的风险(降低每一单位的^ΔCt(test))。

和PM-16预测模型相比，使用PM-17预测模型的敏感性增加10％。其它有效指标：专一性、准确性及AUC，在此模型中符合理想诊断检测的标准。PM-17预测模型的AUC＝0.88679，显示可能临床病理应用，包括检测结肠直肠癌、监测治疗后反应、预后的预测，即其后特定时间内复发率及存活率。

四基因标签：DUSP6，EIF2S3，MDM2，NF1

NF1基因是为第四个加入预测模型的癌症相关分子标记(p值＝0.0032)。PM-18预测模型表现一四基因标签(表10)。NF1基因具有相当高的OR值(OR＝42.825)，显示NF1基因具有高mRNA表达量的个体，和mRNA表达量较低者相较(降低每一单位的^ΔCt(test))，具有约43倍形成结肠直肠癌的风险。

PM-18预测模型的AUC为0.90641，一般认为此可作为理想的临床检测。进一步地，预测模型的高专一性(87％)及准确性(81％)符合理想临床检测的标准。可能的临床病理应用，包括检测结肠直肠癌、监测治疗后反应、预后的预测，即其后特定时间内复发率及存活率。

五基因标签：DUSP6，EIF2S3，MDM2，NF1，MMD

MMD基因是为第五个加入预测模型PM-19的癌症相关分子标记(p值＝0.0003)。MMD基因的mRNA表达量较高，被认为具有对抗结肠直肠癌的保护作用，其OR值为0.223(小于1)。

和使用四基因标签的PM-18预测模型相比，使用五基因标签的PM-19预测模型的检测效果较佳，因为所有四个有效指标，诸如敏感性、专一性、准确性及AUC皆为增加(表10)。五基因标签可应用于包括，检测结肠直肠癌、监测治疗后反应、预后的预测，即其后特定时间内复发率及存活率。

六基因标签：DUSP6，EIF2S3，MDM2，NF1，MMD，RNF4

RNF4基因是为第六个重要因子(p值＝0.0117)用于使预测模型效果更佳。基于其OR＝0.195，其具有减少结肠直肠癌风险80.5％的机率(每增加一个单位的^ΔCt(test))，其为标准化后的RNF4基因的mRNA表达量。

PM-20预测模型的有效指针符合理想临床检测的标准，包括80％的敏感性、90％的专一性、86％的准确性以及AUC为0.94。六基因标签的检测可应用于包括，检测结肠直肠癌、监测治疗后反应、预后的预测，即其后特定时间内复发率及存活率。

七基因标签：DUSP6，EIF2S3，MDM2，NF1，MMD，RNF4，GRB2

GRB2基因是选择作为第七个分子标记(p值＝0.0153)，用于进一步改善预测模型的预测效果。GRB2基因的高OR值(OR＝6.993)，表示具有较高GRB2基因mRNA表达量的个体，与具有较低GRB2基因mRNA表达量的个体相比，具有约7倍形成结肠直肠癌的风险(降低每1个单位的^ΔCt(test))。

高专一性(91％)、准确性(84％)及AUC(0.94410)是指七基因标签检测是为完美的诊断检测，更胜于用于筛选的目的，因为其敏感性为74％。截距值的修正可进一步增加检测的敏感性。七基因标签检测可较佳地使用于检测结肠直肠癌、监测治疗后反应、预后的预测，即其后特定时间内复发率及存活率。

八基因标签：DUSP6，EIF2S3，MDM2，NF1，MMD，RNF4，GRB2，EXT2

EXT2基因是假定为结肠直肠癌相关分子标记(p值＝0.0623)，非常接近于重要值。EXT2基因的mRNA表达量似乎在结肠直肠癌上扮演保护角色，因为其OR＝0.24。

八基因标签的PM-22预测模型的诊断准确性相当优异，其AUC为0.94551。综合其它有效指针而言，八基因标签检测可较佳地使用于检测结肠直肠癌、监测治疗后反应、预后的预测，即其后特定时间内复发率及存活率。

实施例6

用于量测癌症相关基因表达的引物及探针

表2列出用于量测癌症相关基因表达的引物及探针的相关信息。为测试引物的专一性，cDNA模板是取自10种不同的肺癌及结肠癌细胞(购自财团法人食品工业研究所(FIRDI)及美国模式培养物保藏所(American Type Culture Collection)(ATCC；Manassas，USA))。培养条件及方法是如使用说明所记载。用于制备cDNA模板的哺乳细胞株如下：人类结肠腺癌细胞株CC-M1(FIRDI/BCRC 60448)、DLD-1(FIRDI/BCRC 60132)、LS174T(FIRDI/BCRC60053)，人类肺癌细胞株A549(FIRDI/BCRC 60074)，人类肺腺癌细胞株 NCI-H23(ATCC/CRL 5800)，人类肺鳞状细胞癌细胞株NCI-H520(FIRDI/BCRC 60124)，人类前列腺癌细胞株PC3(FIRDI/BCRC 60122)，人类乳癌细胞株MCF-7(FIRDI/BCRC 60436)，人类正常前列腺细胞株PZ-HPV-7(FIRDI/BCRC 60136)，以及人类正常肺细胞株WI38(FIRDI/BCRC 60047)。

由细胞株中萃取全mRNA及使用反转录酶合成cDNA的步骤如实施例1所述。以PCR扩增反应制备三种不同的cDNA模板。第一种是为肺癌细胞的cDNA，包含由三种肺癌细胞株(A549、NCI-H23及NCI-H520)所制得的等量cDNA。第二种是为结肠癌细胞的cDNA，包含由三种结肠癌细胞株(CC-M1、DLD-1及LS174T)所制得的等量cDNA。第三种混合的cDNA，是取自七种不同来源的癌症及正常细胞株，包括A549、LS174T、MCF-7、CC-M1、PZ-HPV-7、PC3及WI38的等量cDNA所混合而成。

利用设计引物及探针的三种程序，包含网站接口的ProbeFinder software、Primer Select(Lasergene，DNASTAR，USA)以及Primer Express Software，LightCycler Probe Design Software 2.0。由Universal ProbeLibrary Assay Design Center来的ProbeFinder software，可帮助选择Universal ProbeLibrary probe(F.Hoffmann-La Roche Ltd，Basel，Switzerland)的理想组合，以及基因专一性的引物组，可利用实时PCR分析基因表达。ProbeLibrary引物包含了8-9个核苷酸长度且其标的序列常接近外显子间的连结(exon-exon junctions)。因此，在制备全RNA时若被染色体DNA污染，将不会影响到该基因转录表达的量测。表2列出了关于引物对、探针组及各个对应的扩增产物的理论序列等信息。

在进行PCR扩增反应时，反应试剂包含50ng的cDNA模板，各0.2μM的正向及反向引物，以及Taq DNA Polymerase Kit(TaKaRa；Japan)。扩增反应的装置是使用MJ Research PTC-100^TM(Global Medical Instrumentation，Inc，MN，USA)。PCR条件设定为50℃(2min)，95℃(10min)，44个循环的95℃(15sec)及60℃(1min)。将扩增产物以3％琼脂电泳确认其专一性。

结果

扩增反应使用的的引物对，大部分皆具有高度专一性。在负对照组中并未观察到有扩增产物(例如无cDNA模板的对照组)(表11)。部份引物对，例如EIF2S3-F19/R20(NOs：19及20)、EXT2-F47/R48(SEQ ID NOs：47及48)、 MCM4-F67/R68(NOs.67及68)以及NF1-F113/R114(SEQ ID NOs.113及114)，可能不适于分析肺癌细胞的样本，而适合分析结肠直肠癌样本。表2列示引物的序列编号(SEQ ID NOs)。

部份引物对，例如EIF2S3-F27/R28(SEQ ID NOs.27及28)、EIF2S3-F31/R32(SEQ ID NOs.31及32)、GRB2-F91/R92(SEQ ID NOs.91及92)及NF1-F103/R104(SEQ ID NOs.103及104)，可能不适于分析结肠直肠癌细胞的样本，而适合分析肺癌样本。

表11^*

^*：表11中使用的简称，其全名如下：“NTC”为负对照组包含相同反应混合物，但不含模板；“H”为具有高度专一性，仅获得单一产物所具有；“O”为具有专一性，扩增产物未出现在NTC检测中；“NN”表示未出现预期的产物。

实施例7

以病例对照研究(case-control studies)为基础的结肠直肠癌基因标记表达分析

将15个分子标记更进一步用于检测使用病例对照研究的结肠直肠癌个体，这些病例为结肠直肠癌患者，对照组为临床上未罹癌的个体。

方法

65位经过组织切片确认为结肠直肠癌的患者，皆经由振兴复健医学中心(台北，台湾)的人体试验委员会(IRB)核准。在这些样本中，除实施例4(表8)所提到的患者外，更额外包括15位结肠直肠癌患者。以实施例2所述的方法，由各患者取得其外周血液样本。表12列出了这些患者的详细临床病理特征。

表12

在A地区(台北，台湾)中(如实施例2)，选出作为对照组的65位正常的自愿受试者(未罹癌)，包含35位男性及30位女性，平均年龄为59.55(SE为1.63)。包括样本准备、全RNA萃取、反转录反应、以实时PCR定量mRNA表达量以及粗数据的标准化，皆如实施1所述。

在一配对的病例与对照研究组别中(N＝130)，设计为具有一对照组对应各个患者。配对标准包括年龄与性别。65个患者经确认具有结肠直肠癌，符合纳入标准，同时65个对照组具有相符的年龄(±3)及性别。卡方检定(Chi-square test)及t-test是用以确认患者与对照组间的性别及年龄分布。使用t-test统计测试患者与对照组的15个所欲检测基因的mRNA表达量。逻辑回归模型及胜算比是用以建立一模型，是使用所欲检测基因的组合以预测个体是否具有结肠直肠癌。ROC曲线及AUC是指各检测基因和/或多基因组合在预测个体(患者)是否具有结肠直肠癌的机率。统计学的显著水平(statistical αlevel)为0.05。

表13列出9个基因的mRNA表达量，RNF4、GRB2、MDM2、DUSP6、NF1、IRF4、EIF2S3、EXT2及POLDIP2，在案例及对照组(p值＜0.05)，及利用t-test指出患者与对照组间的显著差异(表13)。

表13

^*：p＜0.05；^**：p＜0.01；^***：p＜0.001

逻辑回归模型

在逻辑回归分析中(表14)，RNF4、MDM2、DUSP6、MMD、NF1及EIF2S3等六个基因的mRNA表达量，是具有统计上重要性以区分患者是否具有结肠直肠癌。GRB2、EXT2及POLDIP2等三个基因，于逻辑回归分析中控制其它检测基因后，便不再具有统计上重要性且和前述六个基因相比，可能与结肠直肠癌仅具有轻微的关连性。当将患者群与对照组间的年龄及性别控制后，GRB2基因表达量与结肠直肠癌之间并无关联性(p值＝0.125；表14)。GRB2基因表达可能与年龄或性别具有关联性。当实施例4的年龄及性别并未再控制时，上调控的GRB2基因是与结肠直肠癌具有关联性(表9)。然而，在实施例4的结肠直肠癌患者与正常个体具有相似的年龄范围(66.3±12.6 vs.60.9±11.0)。

在结肠直肠癌患者的外周血液样本中发现，MDM2、DUSP6及NF1基因的mRNA表达量增加，而RNF4、MMD及EIF2S3基因的mRNA表达量降低。因此，MDM2、DUSP6及NF1基因被认为是结肠直肠癌的风险基因。

MDM2、DUSP6及NF1等表达量增加的基因，其胜算比(95％信赖区间)分别为9.19(1.93～43.67)、6.017(1.864～19.415)及84.164(6.596～1073.92)，而RNF4、MMD及EIF2S3等表达量降低的基因，其胜算比则为0.072(0.016～0.32)、0.385(0.168～0.877)及0.039(0.007～0.209)。以全体15个基因为基础的预测模型的方程式如下：Y＝9.999-0.928xMCM4+0.763xZNF264-2.636xRNF4-1.437xGRB2+2.218xMDM2+1.216xSTAT2+0.066xWEE1+1.795xDUSP6-0.153xCPEB4-0.955xMMD+4.433xNF1+0.081xIRF4-3.248xEIF2S3-0.973xEXT2+1.539xPOLDIP2。其具有82.3％的准确性，81.5％的敏感性及83.1％的专一性。

表14

B：回归系数；OR：胜算比；C.I.：信赖区间；

^*：p＜0.05；^**：p＜0.01；^***：p＜0.001.

渐进式逻辑回归模型

渐进式逻辑回归分析显示出，RNF4、MDM2、DUSP6、MMD，NF1及EIF2S3等六个基因，对于鉴定一个体是否有结肠直肠癌是相当重要的。在结肠直肠癌患者中，MDM2、DUSP6及NF1基因是为上调控，而RNF4、MMD及EIF2S3基因是为下调控。MDM2、DUSP6及NF1上调控的基因，其胜算比(95％信赖区间)分别为5.694(1.717～18.885)、6.127(2.429～15.46)及34.182(4.964～235.386)，而RNF4、MMD及EIF2S3下调控的基因，其胜算比则分别为0.132(0.048～0.369)、0.432(0.241～0.773)及0.05(0.012～0.211)。Hosmer-Lemeshow检测(Hosmer-Lemeshow test)为无显著意义(p＝0.281)，且准确性为84.6％。

表15

^*：p＜0.05；^**：p＜0.01；^***：p＜0.001；B：回归系数；OR：胜算比；C.I.：信赖区间

表16列出所有可能的预测模型，是利用渐进式的多重回归分析，对病例与对照研究组别(N＝130)。下列预测模型具有良好的诊断效果，且可能用于检测结肠直肠癌、监测治疗后反应及预后，即其后特定时间内复发率及存活率。

单基因标签：DUSP6、RNF4、MDM2、EIF2S3、NF1或MMD

DUSP6、RNF4、MDM2、EIF2S3、NF1及MMD基因等各个结肠直肠癌相关分子标记，对于预测模型PM-23、PM-24、PM-25、PM-26、PM-27及PM-28而言(表16)，分别为单一变数。利用单基因标签的预测模型，其敏感性、专一性及AUC的范围，分别为44.6至67.7％、50.8至72.3％以及0.486至约0.727。对其他利用单基因标签的预测模型而言，包含DUSP6基因的PM-23 预测模型显示出具有最佳的诊断效果，特别是AUC的部分。基于病例与对照研究组别(N＝130)的PM-23预测模型，DUSP6基因的mRNA表达量足以作为单一变量。虽然在二研究组别间样本族群不同，相同的结果显示于实施例5的PM-15预测模型中。PM-23预测模型具有一良好的有效指标AUC为0.727。

双基因标签：DUSP6及RNF4

RNF4基因的mRNA表达量是被选为第二个结肠直肠癌分子标记，用于预测模型PM-29。PM-29的敏感性(67.7％)是小幅高于PM-16(64％)，然而PM-16预测模型的专一性、准确性及AUC具有较佳的表达。PM-29预测模型的AUC为0.786，一般认为是有效的检测。

三基因标签：DUSP6、RNF4及MDM2

在以三基因标签的PM-30预测模型中，MDM2基因被选为第三个结肠直肠癌分子标记，与在PM-17预测模型(实施例5)相同。PM-30预测模型的诊断效果显示出敏感性、准确性及AUC的改善。PM-30预测模型的AUC为0.818，已达到良好诊断检测的标准。

四基因标签：DUSP6、RNF4、MDM2及EIF2S3

在多数结肠直肠癌案例中，EIF2S3基因的mRNA表达量为下调控，故在PM-31预测模型中，被选为除了DUSP6、RNF4及MDM2外的第四个因子。

PM-31预测模型的AUC为0.86，已达到良好诊断检测的标准。其它有效指标如敏感性、专一性及准确性皆高于76％。

五基因标签：DUSP6、RNF4、MDM2、EIF2S3及NF1

在PM-32预测模型中，NF1基因被选为第五个结肠直肠癌分子标记。在病例与对照研究组别(N＝130)中，NF1基因的OR值(34.2)为所有结肠直肠癌分子标记中最高的。相同的结果可在实施例5中观察到，甚至在用于统计分析的数目不相同的病例与对照研究组别。

另外，使用五基因标签的预测模型中，PM-32预测模型的RNF4基因，和实施例4的PM-19预测模型相比，是为惟一不同的基因。与PM-19预测模型相比，PM-32预测模型显示出较佳的敏感性。

PM-32预测模型(五基因标签)的整体诊断表达，胜过PM-31预测模型(四基因标签)。敏感性、专一性及准确性高于81％。特别是，PM-32预测模型的AUC为0.893，已符合优异的诊断检测的标准。

六基因标签：DUSP6、RNF4、MDM2、EIF2S3、NF1及MMD

MMD基因被选为第六个分子标记，以用于建立预测模型PM-33。相同的第六个结肠直肠癌相关分子标记被选入于PM-33及PM-20模型(实施例5)，但其回归系数不同。在谨慎的病例与对照研究组别的统计分析可能是造成不同的原因。

PM-33模型的有效标记已达到优异诊断检测的标准，其敏感性为87.7％、专一性为81.5％，准确性为84.6％及AUC为0.912。

结论

以病例与对照研究组别(N＝130)为基础，结肠直肠癌的风险是相关于MDM2、DUSP6及NF1基因的上调控，以及RNF4、MMD及EIF2S3基因的下调控。患者的MDM2、DUSP6及NF1基因表达量为上调控时，结肠直肠癌的风险性较高。而RNF4、MMD及EIF2S3基因的表达，对结肠直肠癌而言，似乎是独立的抑制子。相同的结果可参阅实施例4。

用于预测患者是否具有结肠直肠癌的单基因标签预测模型的AUC，其范围是由49％至73％。渐进式加入癌症相关标记的预测模型，其AUC的增加表现于第3图及表16中。预测模型的准确率(敏感性、专一性及准确性)可清楚地改善。最佳化的预测模型PM-33，是使用多重分子标记，得到最佳的诊断表达，其有效指标为：88％的敏感性、82％的专一性、85％的准确性，及0.912的AUC。

表16

AUC：ROC曲线下面积；C.I.：信赖区间；(a)：非参数计算；(b)：归零假说为AUC＝0.5.

预测模型的方程式如下：PM-23＝Y＝-2.141+1.127xDUSP6；PM-24：Y＝2.47-0.988xRNF4；PM-25：Y＝0.335+0.982xMDM2；PM-26：Y＝3.216-0.916xEIF2S3；PM-27：Y＝-0.928+1.07xNF1；PM-28：Y＝0.049-0.027xMMD；PM-29：Y＝0.512+1.342xDUSP6-1.221xRNF4；PM-30：Y＝2.19+1.235xDUSP6-1.602xRNF4+1.527xMDM2；PM-31：Y＝8.174+1.185xDUSP6-1.602xRNF4+2.094xMDM2-1.607xEIF2S3；PM-32：Y＝9.64+1.287xDUSP6-1.488xRNF4+1.648xMDM2-2.952xEIF2S3+2.93xNF1；PM-33：Y＝11.231+1.813xDUSP6-2.022xRNF4+1.739xMDM2-3.003xEIF2S3+3.532xNF1-0.84xMMD。

有或无症状的患者的肺癌或结肠直肠癌的初期诊断，可经由医生进行。当医生怀疑该患者可能具有肺癌或结肠直肠癌，或具有罹患肺癌或结肠直肠癌的风险时，医生可采集血液样本或组织，依据本发明的实施例，进行癌症筛检。本发明亦可用于一般患者筛检的工具。癌症相关基因的表达量，可在治疗之前或进行时，预测特定疗程治疗后的反应。相似地，对于肺癌或结肠直肠癌的预后，亦可由比较癌症相关基因表达而确定。

表17显示在两个血液样本中，利用实时PCR量测癌症基因标记的mRNA表达量。mRNA量的单位为循环数(Ct)。

表17

各基因表达量的标准化是以参考基因HPRT1的循环数减去各基因的循环数。以DUSP6为例，其标准化的mRNA表达量为Ct(HPRT1)-Ct(DUSP6)。表18显示经过标准化的各基因mRNA表达量。

表18

使用逻辑回归模型，将标准化后的数据用于预测模型例如PM-1、PM-6或PM-7，以得到Y及机率(P)。

表19

对机率以0.5的截距值，LTS077样本被预测为对肺癌为阳性，而NCI301样本被预测为对肺癌为阴性(正常)。

上述所列的参考文献全体皆引用作为本说明书的揭示内容。

前述本发明所列的实施例是用以阐明本发明的精神而设，并非用以限定本发明的范围，且不当视为本发明范畴的定义，任何熟习此技艺者，在不脱离本发明的精神和范围内，当可做些许更动与润饰。因此本发明的保护范围当视后附的申请专利范围所界定者为准。

本发明所使用的文献及专利文件仅用于本发明的叙述说明，不表示这些文件为本发明的前案，且以如个别所示般全文列为本案参考。

Claims

1.一种引物对在制备检测肺癌存在的试剂盒中的应用，其步骤包括：

(a)从个体取得包含核酸的体液的检测样本；

(b)量测下列癌症基因标记的表达量，其中步骤(b)通过该检测样本的循环数目定量mRNA表达量[Ct(test)]：

(i)DUSP6、EIF2S3、MMD、RNF4、GRB2、MCM4以及MDM2或NF1；或

(ii)DUSP6、EIF2S3、MMD、RNF4、GRB2以及MCM4或NF1，

(c)以持家基因对该表达量进行标准化，其中步骤(c)的标准化是通过将持家基因的mRNA表达量[Ct(HK)]减去Ct(test)，以得到该检测样本的标准化mRNA表达量[^ΔCt(test)]；

(d)使用标准化表达量至逻辑回归预测模型，计算出癌症和/或癌症复发风险的机率；以及

(e)基于该计算后的机率决定肺癌的存在；

其中用于检测肺癌基因标记：DUSP6、MDM2、MCM4、GRB2、NF1为过度表现基因，以及RNF4、EIF2S3、MMD为过低表现基因；

且各该癌症基因标记的表达量经由实时聚合酶链式反应量测，且利用选自由下列癌症基因标记专一性引物对1至7及9所组成的群组中引物对：

(i)SEQ ID NO:9所示的DUSP6-专一性引物对1:SEQ ID NOs:137及138、SEQ ID NOs.139及140；

(ii)SEQ ID NO:1所示的EIF2S3-专一性引物对2:SEQ ID NOs.17及18、SEQ ID NOs.21及22、SEQ ID NOs.23及24、SEQ ID NOs.25及26、SEQ IDNOs.27及28、SEQ ID NOs.29及30、或SEQ ID NOs:31及32；

(iii)SEQ ID NO:4所示的MDM2-专一性引物对3:SEQ ID NOs:75及76、SEQ ID NOs:77及78、SEQ ID NOs:79及80、或SEQ ID NOs:81及82；

(iv)SEQ ID NO:6所示的NF1-专一性引物对4:SEQ ID NOs:97及98、SEQ ID NOs:99及100、SEQ ID NOs:101及102、SEQ ID NOs:103及104、SEQ ID NOs:105及106、SEQ ID NOs:107及108、SEQ ID NOs:109及110或SEQ ID NOs:111及112；

(v)SEQ ID NO:7所示的MMD-专一性引物对5:SEQ ID NOs:115及116、SEQ ID NOs:117及118、或SEQ ID NOs:119及120；

(vi)SEQ ID NO:8所示的RNF4-专一性引物对6:SEQ ID NOs:121及122、SEQ ID NOs:123及124、SEQ ID NOs:125及126、SEQ ID NOs:127及128、SEQ ID NOs:129及130、SEQ ID NOs:131及132、SEQ ID NOs:133及134、或SEQ ID NOs:135及136；

(vii)SEQ ID NO:5所示的GRB2-专一性引物对7:SEQ ID NOs:83及84、SEQ ID NOs:85及86、SEQ ID NOs:87及88；SEQ ID NOs:89及90、SEQ IDNOs:91及92、SEQ ID NOs:93及94、或SEQ ID NOs:95及96；及

(viii)SEQ ID NO:3所示的MCM4专一性引物对9:SEQ ID NOs:53及54、SEQ ID NOs:55及56、SEQ ID NOs:57及58、SEQ ID NOs:59及60、SEQ IDNOs:61及62、SEQ ID NOs:63及64、SEQ ID NOs:65及66、SEQ ID NOs:69及70、SEQ ID NOs:71及72、或SEQ ID NOs:73及74。

2.一种引物对在制备检测结肠直肠癌的存在的试剂盒中的应用，其步骤包括：

(a)从个体取得包含核酸的体液的检测样本；

(i)DUSP6、EIF2S3、MDM2、NF1、MMD及RNF4；

(ii)DUSP6、EIF2S3、MDM2、NF1、MMD、RNF4及GRB2；或

(iii)DUSP6、EIF2S3、MDM2、NF1、MMD、RNF4、GRB2及EXT2，

(e)基于该计算后的机率决定结肠直肠癌的存在；

其中用于检测结肠直肠癌基因标记：DUSP6、MDM2、GRB2、NF1为过度表现基因，以及RNF4、EIF2S3、MMD、EXT2为过低表现基因；

且各该癌症基因标记的表达量经由实时聚合酶链式反应量测，且利用选自由下列癌症基因标记专一性引物对1至8所组成的群组中引物对：

(ix)SEQ ID NO:9所示的DUSP6-专一性引物对1:SEQ ID NOs:137及138、SEQ ID NOs.139及140；

(x)SEQ ID NO:1所示的EIF2S3-专一性引物对2:SEQ ID NOs.17及18、SEQ ID NOs.19及20、SEQ ID NOs.21及22、SEQ ID NOs.23及24、SEQ IDNOs.25及26或SEQ ID NOs.29及30；

(xi)SEQ ID NO:4所示的MDM2-专一性引物对3:SEQ ID NOs:75及76、SEQ ID NOs:77及78、SEQ ID NOs:79及80、或SEQ ID NOs:81及82；

(xii)SEQ ID NO:6所示的NF1-专一性引物对4:SEQ ID NOs:97及98、SEQ ID NOs:99及100、SEQ ID NOs:101及102、SEQ ID NOs:105及106、SEQ ID NOs:107及108、SEQ ID NOs:109及110、SEQ ID NOs:111及112、或SEQ ID NOs:113及114；

(xiii)SEQ ID NO:7所示的MMD-专一性引物对5:SEQ ID NOs:115及116、SEQ ID NOs:117及118、或SEQ ID NOs:119及120；

(xiv)SEQ ID NO:8所示的RNF4-专一性引物对6:SEQ ID NOs:121及122、SEQ ID NOs:123及124、SEQ ID NOs:125及126、SEQ ID NOs:127及128、SEQ ID NOs:129及130、SEQ ID NOs:131及132、SEQ ID NOs:133及134、或SEQ ID NOs:135及136；

(xv)SEQ ID NO:5所示的GRB2-专一性引物对7:SEQ ID NOs:83及84、SEQ ID NOs:85及86、SEQ ID NOs:87及88；SEQ ID NOs:89及90、SEQ IDNOs:93及94、或SEQ ID NOs:95及96；

(xvi)SEQ ID NO:2所示的EXT2-专一性引物对8:SEQ ID NOs:33及34、SEQ ID NOs:35及36、SEQ ID NOs:37及38、SEQ ID NOs:39及40、SEQ IDNOs:41及42、SEQ ID NOs:43及44、SEQ ID NOs:45及46、SEQ ID NOs:47及48、SEQ ID NOs:49及50、或SEQ ID NOs:51及52。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其中该检测样本为血液样本。

4.根据权利要求1或2所述的应用，其中步骤(b)经由实时聚合酶链式反应量测。

5.根据权利要求1或2所述的应用，其中所述持家基因选自由次黄嘌呤磷酸核糖转移酶及甘油醛3-磷酸去氢酶所组成的群组。

6.一种引物对在制备监测和/或评估患者对癌症治疗之前及之后该癌症存在风险是否降低的试剂盒中的应用，其步骤包括：

(a)在接受肺癌的癌症治疗之前及之后，由该患者取得包括有核酸的体液样本群；

(i)DUSP6、EIF2S3、MMD、RNF4、GRB2、MCM4以及MDM2或NF1；或

(ii)DUSP6、EIF2S3、MMD、RNF4、GRB2以及MCM4或NF1；

(d)使用该癌症基因标记的标准化表达量至逻辑回归预测模型计算出癌症和/或癌症复发风险的机率；以及

其中在接受癌症治疗后该机率的降低是该癌症治疗为正反应的表征；

其中各该癌症基因标记的表现量系经由即时聚合酶链锁反应(real-timePCR)量测，且系利用选自由下列癌症基因标记专一性引物对1至7及9所组成的群组中的引物对：

7.一种引物对在制备监测和/或评估患者对癌症治疗之前及之后该癌症存在风险是否降低的试剂盒中的应用，其步骤包括：

(a)在接受结肠直肠癌的癌症治疗之前及之后，由该患者取得包括有核酸的体液样本群；

(i)DUSP6、EIF2S3、MDM2、NF1、MMD及RNF4；

(ii)DUSP6、EIF2S3、MDM2、NF1、MMD、RNF4及GRB2；或

(iii)DUSP6、EIF2S3、MDM2、NF1、MMD、RNF4、GRB2及EXT2；

其中各该癌症基因标记的表现量系经由即时聚合酶链锁反应(real-timePCR)量测，且系利用选自由下列癌症基因标记专一性引物对1至8所组成的群组中的引物对：

8.根据权利要求6或7所述的应用，其中该检测样本为血液样本。

9.根据权利要求6或7所述的应用，其中步骤(b)经由实时聚合酶链式反应量测。

10.一种引物对在监测和/或评估患者对癌症治疗之前及之后该癌症存在风险是否降低的试剂盒中的应用，其步骤包括：

(a)在接受肺癌的癌症治疗之前，由该患者取得包括有核酸的体液的第一样本；

(c)量测该第一样本及第二样本中下列癌症基因标记的表达量，其中步骤(c)通过该检测样本的循环数目定量mRNA表达量[Ct(test)]：

(i)DUSP6、EIF2S3、MMD、RNF4、GRB2、MCM4以及MDM2或NF1；或

(ii)DUSP6、EIF2S3、MMD、RNF4、GRB2以及MCM4或NF1；

(d)比较在该第一样本及第二样本中所量测出该基因的表达量，并借此监测和/或评估该患者对于该癌症治疗的预后反应；

得依选择的该些癌症基因标记，选择以下判断方式：

(1)和第一样本中相对应的基因标记相比，在第二样本中DUSP6、GRB2、MCM4和NF1表达量的增加，代表该个体具有形成肺癌和/或肺癌复发的风险；

(2)和第一样本中相对应的基因标记相比，在第二样本中MDM2表达量的增加，代表该个体具有肺癌复发的风险；以及

(3)和第一样本中相对应的基因标记相比，在第二样本中EIF2S3、MMD和RNF4表达量的增加，代表该个体并未有形成肺癌的风险；

(iv)SEQ ID NO:6所示的NF1-专一性引物对4:SEQ ID NOs:97及98、SEQ ID NOs:99及100、SEQ ID NOs:101及102、SEQ ID NOs:103及104、SEQ ID NOs:105及106、SEQ ID NOs:107及108、SEQ ID NOs:109及110、或SEQ ID NOs:111及112；

11.一种引物对在制备检测肺癌的存在的试剂盒中的应用，包括下列步骤：

(a)由一个体取得包括有核酸的体液的检测样本；

(I)DUSP6、EIF2S3、MMD、RNF4、GRB2、MCM4以及MDM2或NF1；或

(II)DUSP6、EIF2S3、MMD、RNF4、GRB2以及MCM4或NF1；

(e)基于该计算后的机率决定肺癌的存在；

其中，将该癌症基因标记的表达量与相对应癌症基因标记的表达量作比较，该相对应癌症基因标记取自非癌症对照组的体液检测样本，并借此检测肺癌的存在，得依选择的该些癌症基因标记，选择以下判断方式：

(1)和对照组样本中相对应的基因标记相比，在该检测样本中DUSP6、GRB2、MCM4和NF1表达量的增加，代表该个体具有形成肺癌的风险；

(2)和对照组样本中相对应的基因标记相比，在该检测样本中MDM2表达量的增加，代表该个体具有肺癌复发的风险；以及

(3)和对照组样本中相对应的基因标记相比，在该检测样本中EIF2S3、MMD和RNF4表达量的减少，代表该个体具有形成肺癌的风险；

其中各该癌症基因标记的表现量系经由即时聚合酶链锁反应(real-time PCR)量测，且系利用选自由下列癌症基因标记专一性引物对1至7及9所组成的群组中的引物对：

12.一种引物对在制备检测结肠直肠癌的存在的试剂盒中的应用，包括下列步骤：

(a)由一个体取得包括有核酸的体液的检测样本；

(I)DUSP6、EIF2S3、MDM2、NF1、MMD及RNF4；

(II)DUSP6、EIF2S3、MDM2、NF1、MMD、RNF4、及GRB2；或

(III)DUSP6、EIF2S3、MDM2、NF1、MMD、RNF4、GRB2及EXT2；

c)以持家基因对该表达量进行标准化，其中步骤(c)的标准化是通过将持家基因的mRNA表达量[Ct(HK)]减去Ct(test)，以得到该检测样本的标准化mRNA表达量[^ΔCt(test)]；

(e)基于该计算后的机率决定结肠直肠癌的存在；

其中，将该癌症基因标记的表达量与相对应癌症基因标记的表达量作比较，该相对应癌症基因标记取自非癌症对照组的体液检测样本，并借此检测结肠直肠癌的存在，得依选择的该些癌症基因标记，选择以下判断方式：

(1)和对照组样本中相对应的基因标记相比，在该检测样本中DUSP6、GRB2、MDM2和NF1表达量的增加，代表该个体具有形成结肠直肠癌的风险；以及

(2)和对照组样本中相对应的基因标记相比，在该检测样本中EIF2S3、MMD、EXT2和RNF4表达量的减少，代表该个体具有形成结肠直肠癌的风险；

13.根据权利要求11或12所述的应用，其中该检测样本为血液样本。