CN104211807B - 一种抗两种多肽的单克隆抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种抗两种多肽的单克隆抗体及其制备方法和应用。本发明提供了一种通过混合免疫、同步筛选、筛选抗两种多肽的单克隆抗体制备技术，并用于血清多肽标志物的定量检测。所筛选出细胞株3D11分泌的单克隆抗体能与多肽标志物HKP09和HKP15特异性结合，针对HKP09、HKP15的效价均优于1:8000，且不与载体蛋白发生交叉反应，特异性良好。以3D11分泌的单克隆抗体为检测抗体，应用到6种肿瘤与正常血清样本的HKP09、HKP15标志物检测，能够显著区分肿瘤与正常(p<0.001),方法特异性和灵敏度均>80％。本发明所提供的单克隆抗体在检测多肿瘤血清中的应用效果良好。

Description

一种抗两种多肽的单克隆抗体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种抗两种多肽的单克隆抗体及其制备方法和应用。

背景技术

随着血清多肽组学的快速发展，血清多肽类标志物所揭示的生物信息对于肿瘤的辅助诊断已引起研究人员的极大关注，传统中被人们认为是“生物垃圾”的血清多肽已变身为“诊断黄金”。基于多肽标志物的肿瘤诊断技术开始向临床应用转变。同时，一些多肽的联合应用有可能为肿瘤等重大疾病的早期诊断提供革新性的突破，如Villanueva等利用血清多肽研究了前列腺癌、乳腺癌以及膀胱癌，寻找到了几十个可作为肿瘤标志物的多肽片段，对样本的预测准确率达到100％。

高分子量激肽原(High MolecμLar Weight Kininogen.缩写为HWMK或HK)是血浆中的一种糖蛋白，分子量120kDa，其分子可划分为6个结构域，其中D1、D2和D3组成分子的重链，D4含有缓激肽肽段，D5和D6区组成分子的轻链。HK被激肽释放酶活化，释放D4区的缓激肽并产生双链高分子激肽原(HKa)。HKa的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。HK转变为HKa后，发生较大的构像变化，使D5区暴露更加明显，D5是HKa的活性中心，发挥HKa的主要作用，如介导炎症反应、抑制血管内皮细胞增殖及转移、诱导肿瘤细胞凋亡、抑制肿瘤的生长与转移等。目前，有研究报道HKa蛋白可用于肿瘤的早期诊断。多肽标志物HKP09和HKP15由HKa代谢产生，具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的多肽标志物位于HKa蛋白的D5区，具体位于497～511位氨基酸，命名为HKP09。具有SEQ ID NO:2所示氨基酸序列的多肽标志物位于HKa蛋白的D4区，具体位于HKa蛋白的381～389位氨基酸，命名为HKP15。实验证实它们在肿瘤样本中的含量显著(P<0.001)高于正常样本，可用于肿瘤或肝硬化的早期诊断。

多肽-前体蛋白标志物是前体蛋白降解后，多肽标志物未与蛋白完全解离的形式。其中，多肽标志物通过化学键牢固存在于前体蛋白上，且多肽标志物与前体蛋白的抗原决定簇显著不同。HKP09/HKP15-HKa即为HKa降解后，多肽标志物HKP09和HKP15未与其完全解离的形式。采用多肽及其前体蛋白两种特异性抗体，对多肽-前体蛋白进行定量检测，可以更精确的反映样品中标志物的表达情况，更加精确的区分肿瘤样品与正常人样品。

当前用于血清多肽标志物研究的检测技术主要包括免疫质谱法(Immuno-MS)、化学发光法(CLIA)和酶联免疫吸附法(ELISA)。免疫质谱法具有极高的检测灵敏度，如本发明人已公布的专利CN102507936A利用多抗免疫质谱技术检测到目标多肽标志物的峰值比理论峰值的偏差小于0.3Da。化学发光法通过所检标志物与特异性抗体结合，再利用抗体上标记的酶催化底物自身发光，根据发光值的高低来实现生物标志物的定量，灵敏度要明显比ELISA高。酶联免疫吸附法作为一种经典的免疫学检测技术，具有操作简单、研发时间较短、试剂稳定、成本较低的优势，检测特异性和灵敏度也满足临床需求。基于产品的稳定性和市场适用性，CLIA和ELISA已相继开发出相关的多肽和蛋白标志物联合检测的诊断试剂产品，且多采用双抗体夹心检测模式。

对于血清多肽标志物来说，必须要考虑到多肽的分子量普遍偏小(大部分在5KD以下)，空间结构单一，相应的抗原表位少，免疫原性低等不足，因此多肽抗体的制备难度明显高于蛋白抗体。更进一步，在筛选抗多肽的单克隆细胞株时，考虑到上述不足因素的限制，更加难以制备出针对同一多肽不同抗原表位的特异性抗体，从而限制了对2个或2个以上多肽标志物的同步检测。

发明内容

有鉴于此，本发明所要解决的技术问题在于提供一种抗两种多肽的单克隆抗体及其制备方法和应用。本发明提供的单克隆抗体灵敏度高，特异性强，与多肽标志物HKP09和HKP15均特异性结合。

本发明提供了一种单克隆抗体，由保藏编号为CGMCC No.9331的杂交瘤细胞株3D11分泌产生，与两种多肽HKP09和HKP15特异性结合，HKP09的全长氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示，HKP15的全长氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

本发明中的多肽标志物包含HKP09和HKP15。这两个标志物存在大多数多肽标志物所共同的缺陷：分子量小、空间结构单一、抗原表位单一，免疫原性差，不易制备单克隆抗体或制备出的单克隆抗体灵敏度、低特异性不强，且未有一种抗体可同时与多肽HKP09和HKP15特异性结合的报道。

本发明提供的抗多肽标志物HKP09和多肽标志物HKP15的单克隆抗体，不同于常规的单克隆抗体只能与一种抗原结合，或者只与一种多肽抗原结合，而是既能与多肽HKP09特异性结合又能与多肽HKP15特异性结合，且具有较高的灵敏度和特异性。其中，杂交瘤细胞株3D11所分泌的单克隆抗体针对HKP09的效价为1:8000，针对HKP15的效价为1:16000。

本发明提供的抗HKP09和HKP15的单克隆抗体，其制备方法包括多肽偶联、混合免疫、同步筛选细胞株、体内诱生或体外培养单克隆抗体等核心步骤。

具体地，本发明提供的单克隆抗体的制备方法包括以下步骤：步骤1：分别将多肽HKP15和多肽HKP09与载体蛋白偶联制备免疫抗原HKP09-载体蛋白和HKP15-载体蛋白，以UV和SDS-PAGE联合监测，HKP09-载体蛋白的偶联比为62:1；

步骤2：将所述HKP09-载体蛋白和所述HKP15-载体蛋白混合作为免疫原制备的免疫鼠脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞融合；所述免疫原的用量为150μg/只；

步骤3：经选择性培养，包被多肽HKP09、多肽HKP15作为筛选抗原筛选杂交瘤阳性细胞株，筛选出与多肽HKP09、多肽HKP15均特异性结合的单克隆细胞株，制备单克隆抗体；

与多肽HKP09、多肽HKP15均特异性结合的杂交瘤阳性细胞株为保藏编号为CGMCCNo.9331的杂交瘤细胞株3D11。

本发明中，多肽HKP09和多肽HKP15均采用固相合成法人工合成。

作为优选，载体蛋白为KLH、BSA或OVA。

优选的，与HKP09、HKP15进行偶联制备免疫抗原的载体蛋白为BSA，所制备的免疫抗原为HKP09-BSA、HKP15-BSA。

作为优选，经荧光法检测HKP09-BSA的浓度为1.09mg/mL；HKP15-BSA的浓度为1.05mg/mL。

经UV和SDS-PAGE联合监测，验证了HKP09、HKP15偶联到BSA上。

作为优选，偶联物HKP09-BSA中HKP09与BSA的偶联比为62：1。

作为优选，HKP09-载体蛋白和所述HKP15-载体蛋白混合的质量比例为1:2～2:1。

优选的，HKP09-载体蛋白和所述HKP15-载体蛋白混合的质量比例为1:1.

作为优选，步骤2中融合的诱导剂为PEG。

作为优选，选择性培养具体为：用含20％胎牛血清的HAT选择性培养基与杂交瘤细胞混匀并加入到种有饲养细胞的96孔板中培养2周。

作为优选，杂交瘤阳性细胞株的筛选采用并行的方式，具体的，以多肽HKP09和多肽HKP15的混合物为筛选抗原筛选杂交瘤阳性细胞株；优选的，多肽HKP09和多肽HKP15的混合物中，多肽HKP09和多肽HKP15的质量比为1:2～2:1。

作为优选，杂交瘤阳性细胞株的筛选采用串行的方式，具体为，先以多肽HKP09为筛选抗原再以多肽HKP15为筛选抗原，筛选杂交瘤阳性细胞株；或者，先以多肽HKP15为筛选抗原再以多肽HKP09为筛选抗原，筛选杂交瘤阳性细胞株。

以杂交瘤阳性细胞株3D11制备本发明提供的单克隆抗体的方法包括体内诱生或体外培养，本发明对此不做限定，但其实施皆在本发明的保护范围之内。

作为优选，杂交瘤阳性细胞株3D11经体内诱生制得本发明提供的单克隆抗体；具体为，将杂交瘤阳性细胞株3D11注射到小鼠腹腔内并滋生出腹水抗体，获得3D11的腹水单克隆抗体。

优选的，3D11的腹水单克隆抗体，既能与HKP09特异结合，又能与HKP15特异结合。

采用Protein G亲和层析法纯化3D11的腹水单克隆抗体，纯化后的3D11腹水单克隆抗体即为本发明提供的单克隆抗体，其浓度为0.47mg/mL，经SDS-PAGE鉴定，纯化后的3D11腹水单克隆抗体，除IgG的重、轻链条带外，无明显杂带，纯化后的3D11单克隆抗体纯度达到95％以上。

采用纯化后的3D11腹水单克隆抗体分别进行抗HKP09，HKP15的效价测定，结果显示，纯化后的3D11腹水单克隆抗体针对HKP09的效价为1:8000，针对HKP15的效价为1:16000。

采用纯化后的3D11腹水单克隆抗体进行抗原特异性验证，结果显示，3D11单克隆抗体只与HKP09，HKP15发生特异性反应，与载体蛋白BSA、OVA、KLH均不发生非特异性反应，证明3D11单克隆抗体的特异性良好。

本发明提供了保藏编号为CGMCC No.9331的杂交瘤细胞株3D11，以及由其分泌产生的抗多肽HKP09和HKP15的单克隆抗体制备方法及其应用。所提供的抗多肽HKP09和HKP15的单克隆抗体既能与HKP09特异性结合又能与特异性HKP15结合，且具有较高的灵敏度和特异性。

本发明提供的单克隆抗体在制备肿瘤相关检测产品中的应用。

作为优选，肿瘤包括食管癌、结直肠癌、胃癌、乳腺癌、肝癌或肺癌。

采用本发明所提供的抗HKP09和HKP15的3D11单克隆抗体，检测6种肿瘤血清和正常人血清，结果表明，6种肿瘤与正常人的HKP09、HKP15含量差异显著，p<0.001，应用的灵敏度和特异性均>80％，证明本发明所提供的单克隆抗体在检测多肿瘤血清中的应用效果良好。

本发明提供的单克隆抗体在制备肝硬化检测产品中的应用。采用本发明所提供的抗HKP09和HKP15的3D11单克隆抗体，检测肝硬化血清和正常人血清，结果表明，肝硬化与正常人血清中的HKP09、HKP15含量差异显著，p<0.001，应用的灵敏度和特异性均>80％，证明本发明所提供的单克隆抗体在检测肝硬化血清中的应用效果良好。

生物保藏说明

保藏编号为CGMCC No.9331的单克隆抗体杂交瘤细胞3D11于2014年07月02日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

附图说明

图1示UV监测多肽HKP09与载体蛋白BSA偶联制备免疫抗原；

图2示UV监测多肽HKP15与载体蛋白BSA偶联制备免疫抗原；

图3示SDS-PAGE监测多肽HKP09、HKP15与载体蛋白BSA偶联；

图4示Protein G亲和层析法纯化3D11腹水抗体纯度鉴定；

图5示3D11纯化抗体检测HKP09、HKP15的效价；

图6示3D11纯化抗体鉴定特异性；

图7示应用3D11纯化抗体检测血清中HKP09、HKP15的含量差异。

具体实施方式

本发明提供了一种抗两种多肽的单克隆抗体及其制备方法和应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明：

实施例1：碳二亚胺法制备多肽HKP09，HKP15与BSA的偶联抗原

将如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列多肽标志物记为HKP09，将如SEQ ID NO:2所示氨基酸序列多肽标志物记为HKP15。

取配制的10mg/mL碳二亚胺溶液400μL，加入到1000μL，4mg/mL的多肽(HKP09，或HKP15)溶液中，25中搅拌活化5min。取10mg/mL的BSA溶液400μL，加入到上述活化液中，混匀后于25℃恒温反应2小时。置于12～14kDa透析袋中，以0.02mol/L，pH值为7.4的PBS缓冲液透析24小时。荧光定量试剂盒检测浓度，采用UV和SDS-PAGE鉴定偶联物(HKP09-BSA，或HKP15-BSA)。

计算得到偶联物HKP09-BSA，HKP15-BSA的浓度、特征吸收波长、偶联比如表1所示。

表1HKP09-BSA，HKP15-BSA检测信息

此外，附图1、附图2分别给出了HKP09-BSA，HKP15-BSA在偶联后的峰形和特征吸收波长变化。附图3给出了HKP09-BSA，HKP15-BSA的特征偶联物条带(虚线框所示)。

实施例2：抗多肽标志物HKP09和HKP15的单克隆抗体的制备

1、动物免疫

取免疫抗原HKP09-BSA、HKP15-BSA，按照质量比为1:1进行混合。首次免疫时，加入等体积弗氏完全佐剂进行乳化，第二、三次免疫时，加入等体积弗氏不完全佐剂进行乳化，最后一次不加佐剂，共免疫4次。免疫采用Balb/C小鼠，免疫剂量为150ug/只。取免疫小鼠的尾血检测免疫血清效价，免疫血清效价优于1:8000，针对HKP09、HKP15的效价分别为1:16000、1:32000。收集免疫后的Balb/C小鼠的脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤进行细胞融合。

2、杂交瘤细胞株的筛选

取Balb/C小鼠脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤细胞在PEG作用下融合，同时采用并行法和串行法筛选细胞阳性杂交瘤细胞株。

优选的并行法筛选方式为：将多肽HKP09、HKP15按1:1混合后作为筛选抗原，进行杂交瘤阳性细胞株的筛选。

优选的串行法筛选方式为：先以多肽HKP09为筛选抗原，再以HKP15为筛选抗原；或者先以HKP15为筛选抗原，再以HKP09为筛选抗原，进行杂交瘤阳性细胞株的筛选。

取杂交瘤细胞株培养上清进行检测，筛选检测值均为阳性的杂交瘤细胞株为进一步克隆细胞株。最终成功筛选得既能与HKP09特异结合，又能与HKP15特异结合的细胞株，所述细胞株的名称为3D11，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9331。对3D11进行上清灵敏度检测，结果为10ng/mL。

3、抗体的纯化

采用Protein G亲和层析法将3D11所制备的小鼠腹水单克隆抗体进行纯化，纯化后单克隆抗体的浓度为0.47mg/mL。纯化单抗的SDS-PAGE鉴定如附图4所示，纯化后的抗体纯度达到95％以上。

实施例3：3D11纯化抗体的效价测定

1)将多肽HKP09、HKP15及HKP09+HKP15(质量比1:1)用包被缓冲液稀释至1μg/mL，按照100μL/孔的量，加入到96孔酶联板中，4℃包被过夜。

2)弃溶液，用PBST洗板5次后，以2％的OVA为封闭剂，按照300μL/孔的量，加入到包被板孔中，37℃封闭2小时。

3)弃溶液，用PBST洗板5次后，将等比稀释的3D11纯化抗体加入到封闭孔中，37℃孵育1小时。

4)弃溶液，用PBST洗板5次后，用2％OVA将HRP-羊抗鼠稀释5000倍(1:5000)，按照100μL/孔，加入到孵育有3D11抗体板孔中，37℃孵育40分钟；

5)弃溶液，用PBST洗板5次后，将TMB显色液按1:1(A液:B液)混合，按照100μL/孔，加入到孵育有HRP-羊抗鼠的板孔中，37℃避光显色15分钟；

6)按照50μL/孔,加入2mol/L的硫酸终止液，用酶联检测仪测定波长为450nm处的OD值。

效价检测结果如附图5所示，检测结果表明，3D11纯化抗体对HKP09、HKP15均有效价，分别为1:8000,1:16000，均高于1:8000，说明3D11所分泌的单克隆抗体既能与HKP09特异性结合又能与HKP15特异性结合。

实施例4：3D11纯化抗体的特异性鉴定

以多肽HKP09、HKP15及常见的载体蛋白BSA、OVA、KLH作为待检抗原，按照间接ELISA方法进行检测，结果如附图6所示。检测结果表明，3D11与HKP09，HKP15以及二者的混合抗原呈阳性反应，而与潜在的交叉抗原BSA、OVA、KLH反应呈阴性，说明3D11所分泌的单克隆抗体不与常见的载体蛋白存在交叉反应，抗体特异性良好。

实施例5:应用3D11纯化抗体检测血清中HKP09、HKP15的含量差异

以3D11的纯化抗体作为检测抗体，应用到食管癌(32例)、结直肠癌(32例)、胃癌(32例)、乳腺癌(32例)、肝癌(32例)、肺癌(32例)与正常人(108例)血清中的HKP09、HKP15的定量检测，该标志物在各肿瘤和正常人血清样品中的含量表如下表所示，含量分布如图7所示。

结果显示：108例正常人血清中HKP09、HKP15的平均含量为10.9mg/mL，检测值的标准偏差SD为8.78，与正常样本相比，各肿瘤组样本的标志物含量要显著升高(P<0.001)。其中，在肺癌、胃癌、肠癌、食管癌样本中平均含量最高，乳腺癌中含量次之，在肝癌中的含量相对低。特异性分析表明，3D11纯化抗体应用到6种肿瘤与正常血清样本的HKP09，HKP15标志物检测，方法特异性和灵敏度均>80％。说明本发明所提供的单克隆抗体在检测多肿瘤血清中的应用效果良好。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (4)

1.一种单克隆抗体，其特征在于，由保藏编号为CGMCC No.9331的杂交瘤细胞株3D11分泌产生，与两种多肽HKP09和HKP15特异性结合，HKP09的全长氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，HKP15的全长氨基酸序列如SEQ IDNo.2所示。

2.权利要求1所述的单克隆抗体在制备肿瘤相关检测产品中的应用。

3.根据权利要求2的应用，其特征在于，所述肿瘤为食管癌、结直肠癌、胃癌、乳腺癌、肝癌或肺癌。

4.权利要求1所述的单克隆抗体在制备肝硬化检测产品中的应用。