CN113046357B - 一种乐伐替尼耐药基因dusp9、其筛选方法及应用 - Google Patents

一种乐伐替尼耐药基因dusp9、其筛选方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及肿瘤耐药基因技术领域，特别涉及一种乐伐替尼耐药基因DUSP9、其筛选方法及应用，DUSP9的基因的序列为SEQ ID NO：1。其筛选方法包括以下步骤：进行预实验，获得sgRNA文库的最佳MOI，确定乐伐替尼的浓度；进行感染Cas9文库实验，得到稳定株；稳定株加入乐伐替尼处理，通过PCR扩增和高通量测序，分析sgRNA的富集情况；筛选乐伐替尼耐药基因；有效靶基因对肝癌细胞功能表型及介导乐伐替尼耐药的作用验证。本发明通过CRISPR/Cas9全基因文库筛选得到乐伐替尼的耐药基因，为今后减少乐伐替尼耐药性提供了理论依据，为乐伐替尼的临床应用提供了新的耐药靶点，为临床合理用药提供指导。

Description

一种乐伐替尼耐药基因DUSP9、其筛选方法及应用
技术领域
本发明涉及肿瘤耐药基因技术领域，特别涉及一种乐伐替尼耐药基因DUSP9、其筛选方法及应用。
背景技术
肝癌是最常见的恶性肿瘤之一，其发病率在我国所有中位居第三死亡率高居第二位死亡率高居第二位死亡率高居第二位。2018年9月4日乐伐替尼在中国上市，用于晚期肝癌的一线治疗在中国上市，用于晚期肝癌的一线治疗在中国上市，用于晚期肝癌的一线治疗，乐伐替尼正式取代索拉非尼成为国际上晚期肝癌一线治疗的首选药物，是小分子多靶点酪氨酸激酶抑制剂，主要作用于是小分子多靶点酪氨酸激酶抑制剂，乐伐替尼主要作用于是小分子多靶点酪氨酸激酶抑制剂，同时具有抗肿瘤细胞增殖及抗血管生成作用，靶向药物耐药的主要机制包括肿瘤建立代偿信号通路、靶蛋白改变、肿瘤微环境变化、肿瘤异质性产生和肿瘤对靶向药物的适应等，不同的分子靶向药物可能同时具有多种耐药机制，毫无疑问，分子靶向治疗为肿瘤患者提供了生存和预后获益，但耐药也是分子靶向药物面临的主要问题。目前对于乐伐替尼长期使用后产生的耐药性，尚未见报道，因此，积极探索乐伐替尼的耐药靶基因，对于减少乐伐替尼耐药，指导临床用药有着重要意义。
以往，药物耐药基因常用RNAi文库进行高通量筛选。但RNAi技术造成的表型变化不够稳定、明显，且细胞内源性的RNAi途径导致RNAi筛选存在着广泛的脱靶效应。CRISPR/Cas9 作为一种强大的基因组编辑工具，可以对基因进行完全敲除，为高通量筛选带来了革命性技术。在此基础上构建靶向全基因组范围的CRISPR/Cas9敲除文库，可实现全基因组范围的高通量筛选，能够快速产生功能缺失的突变体并且筛选所期望的表型，进而找出候选基因。与 RNAi技术相比，CRISPR/Cas9敲除文库具有相对较低的脱靶效率和更广泛的作用位点，因而逐渐成为功能性基因筛选的热点方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种乐伐替尼耐药基因DUSP9、其筛选方法及应用。
一种乐伐替尼耐药基因DUSP9，该基因的序列为SEQ ID NO：1。
乐伐替尼耐药基因DUSP9的筛选方法为使用HuH7细胞株作为目的细胞，利用CRISPR-Cas9 的高通量功能性筛选技术进行乐伐替尼耐药的差异靶基因筛选，包括以下步骤：
步骤一：进行预实验，获得sgRNA文库的最佳MOI，确定乐伐替尼的浓度；
步骤二：进行感染Cas9文库实验，得到稳定株；
步骤三：稳定株加入乐伐替尼处理，通过PCR扩增和高通量测序，分析sgRNA的富集情况；
步骤四：筛选乐伐替尼耐药基因；
步骤五：有效靶基因对肝癌细胞功能表型及介导乐伐替尼耐药的作用验证。
进一步地，预实验包括：细胞感染预实验、低MOI感染预实验-荧光、低MOI感染预实验-抗性、乐伐替尼药物浓度预实验。
具体地，细胞感染预实验包括：用包装好的GFP慢病毒感染目的细胞，观察不同MOI值下的感染效率，以确定sgRNA文库的最佳MOI；
低MOI感染预实验-荧光包括：以12孔板每孔3E6的细胞量接种靶细胞于培养皿中，病毒原液从-80℃冰箱取出后冰浴融化，用含5μg/mL Polybrene的新鲜培养基按MOI分别为0.3，0.5，1和2稀释带有GFP的病毒原液，将含有慢病毒稀释液加到对应细胞中，离心感染2h。感染6h后，将细胞传出到6cm皿中，感染48h后，收细胞进行流式检测；
低MOI感染预实验-抗性包括：以12孔板每孔3E6的细胞量接种靶细胞于培养皿中，病毒原液从-80℃冰箱取出后冰浴融化，用含5μg/mL Polybrene的新鲜培养基按MOI分别为0.3，0.5，1和2稀释Cas9sgRNA文库的病毒原液，将含有慢病毒稀释液加到对应细胞中，离心感染2h；感染6h后，将细胞传出到6cm皿中；感染48h后，使用Puro筛选细胞48h，计数；
乐伐替尼药物浓度预实验包括：将细胞接种到96孔板种，每孔细胞量为5W，接种细胞后第二天，加入浓度为10mM的乐伐替尼母液，根据细胞数量随药物浓度加入量的变化指标，选择细胞变化量最小的浓度作为下一步实验所使用的乐伐替尼浓度。
进一步地，感染Cas9文库实验包括：
1)用包装好的lentiCas9-Blast慢病毒感染HuH7细胞，使用杀稻瘟菌素并得到HuH7-Cas9 稳定株；
2)扩增HuH7-Cas9稳定株细胞，再感染sgRNA文库慢病毒；
进一步地，稳定株加入乐伐替尼处理，通过PCR扩增和高通量测序，分析sgRNA的富集情况包括：使用乐伐替尼处理上游嘌呤霉素筛选7天后的细胞；将上游细胞等分为两份，一份为0天对照组，另一份为乐伐替尼组；0天对照组收样，冻存在-80℃；乐伐替尼组持续加药筛选，共筛选21天，期间正常换液或传代，21天后，乐伐替尼抗性细胞得到富集，收样提取DNA；使用特异性引物扩增目的产物并回收，检测PCR效果，进行二代测序，对以上每个样本中的每一种sgRNAreads富集数进行统计，统计各样本中不同sgRNA对应的基因上富集到的reads数，对不同样本的比较组合的sgRNA富集的reads进行聚类分析，根据sgRNA 富集的reads支持数差异筛选出候选基因后，富集分析研究候选基因在GeneOntology中的分布状况以阐明实验中样本候选在基因功能上的体现。
进一步地，筛选乐伐替尼耐药基因包括：
1)sgRNA载体构建：首先合成gRNA序列的单链DNAoligo，然后退火配对产生双链DNAoligo，再通过其两端所含酶切位点将其直接连入酶切后的CRISPR/Cas9载体上；将连接产物转入制备好的细菌感受态细胞，对长出的单克隆菌落进行测序鉴定，比对正确的克隆即为构建成功的CRISPR/Cas9载体；
2)慢病毒包装：用构建的慢病毒载体和包装质粒共转染293T细胞，包装病毒，收集病毒原液，超滤浓缩，并测定滴度；
3)稳转株构建：第一天，培养Huh7-Cas9细胞至对数生长期，悬浮细胞直接收样；计算所需sgRNA慢病毒颗粒数，吸取病毒液加入细胞中，将管中混合溶液吸出加入对应的孔板中，补充培养基至半量体系；离心感染后细胞培养板置于37℃、5％CO2培养箱，过夜培养；第二天，感染16h后，观察细胞状态；若状态明显变差，则及时吸出含慢病毒颗粒的培养液，更换为全量新鲜培养基；若状态正常，则补液至全量培养基即可，第三天再更换为全量新鲜培养基；第四天，继续培养细胞，观察细胞状态是否有异常；第五天，选择合适的真核抗性筛选细胞，药筛两轮，一轮2-3天左右，细胞基本稳定；
将以上细胞株分成NC(-)、乐伐替尼、sgRNA+乐伐替尼三组，对候选基因进行CCK8和克隆形成实验，通过绘制吸光度OD值变化曲线和计算克隆形成率，进行结果分析，确定候选靶基因。
进一步地，有效靶基因对肝癌细胞功能表型及介导乐伐替尼耐药的作用验证包括：
1)建立细胞模型：Huh7、PLC/PRF/5细胞株，并分组处理；
a)对照组(无处理)；
b)有效靶基因过表达组；
c)有效靶基因sgRNA沉默组；
d)乐伐替尼处理组；
e)有效靶基因过表达+乐伐替尼处理组；
f)有效靶基因sgRNA+乐伐替尼处理组；
2)分别将以上分组的细胞进行CCK8、克隆形成实验检测增殖，以及进行Tanswell实验检测迁移和侵袭、通过流式检测细胞周期和凋亡，得到乐伐替尼耐药基因靶点。
一种乐伐替尼耐药基因DUSP9的用途：将乐伐替尼耐药基因DUSP9作为抗乐伐替尼耐药药物的设计靶点。
综上，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
本发明通过CRISPR/Cas9全基因文库筛选得到乐伐替尼的耐药基因，为今后减少乐伐替尼耐药性提供了理论依据，对指导临床用药有着重要意义。
本发明，筛选得到乐伐替尼的耐药基因，可为乐伐替尼的临床应用提供了新的耐药靶点，为临床合理用药提供指导。
附图说明
图1是本发明筛选乐伐替尼耐药基因的流程图。
图2是本发明实施例中细胞感染预实验结果图。
图3是本发明实施例中低MOI感染预实验荧光结果图。
图4是本发明实施例中乐伐替尼药物浓度预实验结果图。
图5是本发明实施例中测序细胞处理流程图。
图6是本发明实施例中sgRNA富集的热图。
图7是本发明实施例中差异sgRNA散点富集图。
图8是本发明实施例中差异基因GO富集柱状图。
图9是本发明实施例中差异基因BP富集柱状图。
图10是本发明实施例中差异基因CC富集柱状图。
图11是本发明实施例中差异基因MF富集柱状图。
图12是本发明实施例中靶基因验证的克隆形成实验的结果图。
图13是本发明实施例中靶基因验证的CCK8实验结果图。
图14是本发明实施例中Huh7细胞中DUSP9功能的初步验证的Western Blot检测Huh7 细胞中DUSP9的表达量.S1:gRNA NC；S2：Cas9-H_DUSP9 gRNA的结果图。
图15是本发明实施例中Huh7细胞中DUSP9功能的初步验证的CCK8实验的结果图。
图16是本发明实施例中Huh7细胞中DUSP9功能的初步验证的细胞生长计数的数据图。
图17是本发明实施例中Huh7细胞中DUSP9功能的初步验证的克隆形成实验的结果图。
图18是本发明实施例中Huh7细胞中DUSP9功能的初步验证的Transwell迁移和侵袭实验的结果图。
图19是本发明实施例中Huh7细胞中DUSP9功能的初步验证的细胞周期实验的结果图。
图20是本发明实施例中Huh7细胞中DUSP9功能的初步验证的凋亡实验的结果图。
图21是本发明实施例中的DUSP9与AKT、ERK磷酸化水平的结果图。
图22是本发明实施例中的miR-20a-5p与DUSP9的调控关系结果图。
图23是本发明实施例中的荧光素酶报告结果图。
图24是本发明实施例中的肝组织原位杂交结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例的乐伐替尼耐药基因为DUSP9，该基因的序列为SEQ ID NO：1。
请参阅图1至图24，本发明的乐伐替尼耐药基因DUSP9的筛选方法包括：
使用HuH7细胞株作为目的细胞，利用CRISPR-Cas9的高通量功能性筛选技术进行乐伐替尼耐药的差异靶基因筛选，步骤如下：
步骤一：请参阅图1至图4，进行预实验，获得sgRNA文库的最佳MOI，确定乐伐替尼的浓度：
进行细胞感染预实验：用包装好的GFP慢病毒感染目的细胞，观察不同MOI值下的感染效率，以确定sgRNA文库的最佳MOI，如图2所示，结果表明MOI＝50，感染效率约为90％，因此选取MOI＝50作为最佳MOI。
进行低MOI感染预实验-荧光：Cas9文库中的sgRNA需要以极低的MOI感染细胞，以保证每个细胞只被1个慢病毒感染。以12孔板每孔3E6的细胞量接种靶细胞于培养皿中，病毒原液从-80℃冰箱取出后冰浴融化，用含5μg/mL Polybrene的新鲜培养基按MOI分别为0.3， 0.5，1和2稀释带有GFP的病毒原液，将含有慢病毒稀释液加到对应细胞中，离心感染2h。感染6h后，将细胞传出到6cm皿中，感染48h后，收细胞进行流式检测，结果如图3所示。
进行低MOI感染预实验-抗性：Cas9文库中的sgRNA需要以极低的MOI感染细胞，以保证每个细胞只被1个慢病毒感染。以12孔板每孔3E6的细胞量接种靶细胞于培养皿中，病毒原液从-80℃冰箱取出后冰浴融化，用含5μg/mL Polybrene的新鲜培养基按MOI分别为0.3， 0.5，1和2稀释Cas9sgRNA文库的病毒原液，将含有慢病毒稀释液加到对应细胞中，离心感染2h。感染6h后，将细胞传出到6cm皿中。感染48h后，使用Puro筛选细胞48h，计数。实验结果如表1所示。
表1：低MOI感染预实验-抗性表
moi 0(无嘌呤霉素) 0.3 0.5 1 2
计数(万/ml) 415 110.5 180.75 213 264
细胞存活率 100.00％ 26.63％ 43.55％ 51.33％ 63.61％ 
综合低MOI感染预实验-荧光和低MOI感染预实验-抗性的实验结果，sgRNA文库病毒使用0.5的MOI感染Huh7细胞。
进行乐伐替尼药物浓度预实验包括：将细胞接种到96孔板种，每孔细胞量为5W，接种细胞后第二天，加入浓度为10mM的乐伐替尼母液。加样方法如表2所示。
表2：乐伐替尼药物浓度加样方法表
Figure BDA0002914976670000071
请参阅图4，乐伐替尼药物浓度为1000nM，细胞数量变化最小，故使用1000nM进行正式实验。
通过上述预实验，我们初步确定了sgRNA文库病毒使用0.5的MOI感染Huh7细胞，使用乐伐替尼1000nM进行以下正式实验。
步骤二：请参阅图5，感染Cas9文库实验：
1)用包装好的lentiCas9-Blast慢病毒感染HuH7细胞，使用杀稻瘟菌素并得到HuH7-Cas9 稳定株，使用qPCR验证Cas9感染效果；
2)通过倒置荧光显微镜观察荧光及流式检测估计慢病毒感染目的细胞的效率，抗性实验使用嘌呤霉素筛选细胞48h后计数，最终获得sgRNA文库最佳MOI，按每个sgRNA感染400个细胞，共需要感染5E7的细胞量，正式实验选择1.8E8的细胞量，感染效率在40-50％之间，有效感染数为7.2E7-9E7个细胞；扩增HuH7-Cas9稳定株细胞，再感染sgRNA文库慢病毒；
步骤三：请参阅图5至图11，稳定株加入乐伐替尼处理，通过PCR扩增和高通量测序，分析sgRNA的富集情况：
使用1000nM的乐伐替尼处理上游嘌呤霉素筛选7天后的细胞；将上游细胞等分为两份，一份为0天对照组，另一份为乐伐替尼组；0天对照组收样，冻存在-80℃；乐伐替尼组持续加药筛选，共筛选21天，期间正常换液或传代，21天后，乐伐替尼抗性细胞得到富集，收样提取DNA；选取特异性引物，引物序列如下：
Primer-F:5’-AATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCG-3’
Primer-R:5’-CTTTAGTTTGTATGTCTGTTGCTATTATGTCTACTATTCTTTCC-3’
使用该特异性引物扩增目的产物并回收，检测PCR效果，进行二代测序，对以上每个样本中的每一种sgRNAreads富集数进行统计，统计各样本中不同sgRNA对应的基因上富集到的reads数，对不同样本的比较组合的sgRNA富集的reads进行聚类分析，根据sgRNA富集的reads支持数差异筛选出候选基因后，富集分析研究候选基因在GeneOntology中的分布状况以阐明实验中样本候选在基因功能上的体现。
乐伐替尼抗性细胞富集后收样提DNA。运用Illumina平台进行测序。结果表明，与不加药的对照组相比表达差异超过2倍的有1261个基因，超过6倍的有48个。差异基因GO分析及其中生物过程(BP)表明在基因功能上主要现为genesilencing。
步骤四：请参阅图12至图13，筛选乐伐替尼耐药基因：
选取步骤三中表达差异超过6倍的sgRNA，进行靶基因筛选：
1)sgRNA载体构建：首先合成sgRNA序列的单链DNAoligo，然后退火配对产生双链DNAoligo，再通过其两端所含酶切位点将其直接连入酶切后的 CRISPR/Cas9载体上；将连接产物转入制备好的细菌感受态细胞，对长出的单克隆菌落进行测序鉴定，比对正确的克隆即为构建成功的CRISPR/Cas9载体；
2)慢病毒包装：用构建的慢病毒载体和包装质粒共转染293T细胞，包装病毒，收集病毒原液，超滤浓缩，并测定滴度；
3)稳转株构建：第一天，培养Huh7-Cas9细胞至对数生长期，悬浮细胞直接收样。计算所需sgRNA慢病毒颗粒数，吸取病毒液加入细胞中，将管中混合溶液吸出加入对应的孔板中，补充培养基至半量体系。离心感染后细胞培养板置于37℃、5％CO2培养箱，过夜培养。第二天，感染16h后，观察细胞状态；若状态明显变差，则及时吸出含慢病毒颗粒的培养液，更换为全量新鲜培养基；若状态正常，则补液至全量培养基即可，第三天再更换为全量新鲜培养基；第四天，继续培养细胞，观察细胞状态是否有异常；第五天，选择合适的真核抗性筛选细胞，药筛两轮，一轮2-3天左右，细胞基本稳定。
将以上细胞株分成NC(-)、乐伐替尼、sgRNA+乐伐替尼三组，对候选基因进行CCK8和克隆形成实验，通过绘制吸光度OD值变化曲线和计算克隆形成率，进行结果分析。
在表达差异的基因中，有48个基因表达差异超过6倍，我们通过以上功能分析和文献阅读，挑选了其中的18个潜在基因进行了靶基因验证，如表3所示。通过克隆形成和CCK8实验发现，感染DUSP9sgRNA后，细胞生长状况与对照组相比，在两个实验中均有明显差别。据此确定DUSP9为候选靶基因。
表3：选择验证的基因列表(部分sgRNA靶向两个基因)
NO. TargetSeq
NC ACGGAGGCTAAGCGTCGCAA
H_ARHGAP28 AATGTTCAGAAAACCAGATT
H_BBS7 TTGTGTAGCTCTGTGTCTTG
H_BBS7 AAGACACAGAGCTACACAAA
H_C20orf195 CAACTCATACTGCTCCGATG
H_CHMP4C AAACAGCTCACTCAGATTGA
H_CRYAB TTTCTAGATGCGCCTGGAGA
H_CRYAB GTGGTGGATGGCGATGTCCA
H_DUSP9 TCTCAACGATGCCTATGACC
H_DUSP9 GTGTGGCACCCTCCGAATCC
H_MAMLD1 ATCTTCTTCCTCCATCCACG
H_NF1 GTTGTGCTCAGTACTGACTT
H_NF1 AGTCAGTACTGAGCACAACA
H_OR51V1 CTTCTCCTCAATCTATGCCA
H_OR51V1 TAGTTACTATGCCCTGATGC
H_ORC3 TTTCTGCAAAAATCACATTC
H_PLAT CTCCTCTTCTGAATCGGGCA
H_RTDR1 CAACCAGAACATCCGCAGCA
H_SSH1 ATTTAAGCCTGTGTCTGTCC
H_USP26 TCATGCATCATGAACGCCAC 
步骤五：请参阅图14至图20，有效靶基因对肝癌细胞功能表型及介导乐伐替尼耐药的作用验证：
1)建立细胞模型：Huh7、PLC/PRF/5细胞株，并分组处理；
a)对照组(无处理)；
b)DUSP9过表达组；
c)DUSP9 sgRNA因沉默组；
d)乐伐替尼处理组；
e)DUSP9过表达+乐伐替尼处理组；
f)DUSP9 sgRNA+乐伐替尼处理组；
2)分别将以上分组的细胞进行CCK8、克隆形成实验检测增殖，以及进行Tanswell实验检测迁移和侵袭、通过流式检测细胞周期和凋亡，结果表明，DUSP9sgRNA可将DUSP9敲除；DUSP9敲除后的细胞能逆转乐伐替尼对癌细胞的抑制作用，但对细胞凋亡没有影响。
一种乐伐替尼耐药基因DUSP9作为抗乐伐替尼耐药药物设计靶点的用途：
特异生物标志物和治疗靶点，具有重要科学意义和潜在临床应用价值。
请参阅图21，乐伐替尼可抑制癌症进展相关的RTKs，阻断促进细胞分裂的 PI3K/AKT/mTOR和RAS/Raf/MAPK信号通路发挥抑癌作用，AKT、ERK是RAS/Raf/MAPK 信号通路关键标志物，检测敲低DUSP9后AKT、ERK的磷酸化水平，请参阅图21，结果表明，乐伐替尼可抑制AKT、ERK磷酸化，而DUSP9敲低可以使ERK磷酸化重新激活，但对AKT磷酸化水平无影响。
请参阅图22和图23，通过starbase数据库可知，miR-20a-5p与DUSP9有结合位点，荧光素酶报告显示miR-20a-5p能抑制DUSP9 WT UTR表达的30％，突变结合位点后，该抑制消失。请参阅图24，通过前期在临床上收集的3例珍贵的乐伐替尼治疗后耐药的肝癌组织，原位杂交结果表明癌组织中miR-20a-5p表达明显增强，高于癌旁组织和正常肝组织，提示miR-20a-5p上调，抑制DUSP9表达，从而导致乐伐替尼耐药。
癌组织中miR-20a-5p上调，负调控DUSP9，通过激活ERK磷酸化逆转乐伐替尼对癌细胞增殖、侵袭、迁移的抑制作用，导致乐伐替尼耐药，由此，DUSP9能够作为抗乐伐替尼耐药药物设计靶点使用。
本发明通过CRISPR/Cas9全基因文库筛选得到乐伐替尼的耐药基因，为今后减少乐伐替尼耐药性提供了理论依据，对指导临床用药有着重要意义。
本发明，筛选得到乐伐替尼的耐药基因，可为乐伐替尼的临床应用提供了新的耐药靶点，为临床合理用药提供指导。
上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。
Figure BDA0002914976670000111
Figure BDA0002914976670000121
                         序列表
<110>  柳州市柳铁中心医院
<120>  一种乐伐替尼耐药基因DUSP9、其筛选方法及应用
<160>  1
<170>  SIPOSequenceListing 1.0
<210>  1
<211>  2434
<212>  DNA
<213>  Homo sapiens
<400>  1
aaggtggaag ctgggtccgg ctgccaggaa gcggccggtg cgcgggctgc gcgggctgcg 60
cggggctcgg cttccacgtg cgagcctgca ccgccgcccc gccctctcct ggcggccagg 120
cctggggact ctctgccgcg ggacggcgcc tcgcgttccg ccgtggcagt ggccgtggcc 180
agaacgtcca cgcgcggtcg tccaccgccg gatctcgctc cagcgcccgt ggtccagcgt 240
gtagggagcc gatcgcccat ggagggtctg ggccgctcgt gcctgtggct gcgtcgggag 300
ctgtcgcccc cgcggccgcg gctcctgctc ctggactgcc gcagccgcga gctgtacgag 360
tcggcgcgca tcggtggggc gctgagcgtg gccctgccgg cgctcctgct gcgccgcctg 420
cggaggggca gcctgtcggt gcgcgcgctc ctgcctgggc cgccgctgca gccgcccccg 480
cctgcccccg tgctcctgta cgaccagggc gggggccggc gccggcgcgg ggaggccgag 540
gccgaggccg aggagtggga ggccgagtcg gtgctgggca ccctgctgca gaagctgcga 600
gaggaaggct acctggccta ctacctccag ggaggcttca gcagattcca ggccgagtgc 660
cctcacctgt gtgagaccag ccttgctggc cgtgccggct ccagcatggc gccggtgccc 720
ggtccagtgc ccgtggtggg gttgggcagc ctgtgcctgg gctccgactg ctctgatgcg 780
gaatccgagg ctgaccgcga ctccatgagc tgtggcctgg attcggaggg tgccacaccc 840
ccaccagtgg ggctgcgggc atccttccct gtccagatcc tgcccaacct ctatctgggc 900
agtgcccggg attccgccaa tttggagagc ctggccaaac tgggcatccg ctacatcctc 960
aatgtcaccc ccaacctccc aaacttcttc gagaagaatg gtgactttca ctacaagcag 1020
atccccatct ccgaccactg gagccagaac ctgtcgcggt tctttccgga ggccattgag 1080
ttcattgatg aggccttgtc ccagaactgc ggggtgctcg tccactgctt ggcgggggtc 1140
agccgttctg tcaccgtcac tgtggcctac ctcatgcaga agctccacct ctctctcaac 1200
gatgcctatg acctggtcaa gaggaagaag tctaacatct cccccaactt caacttcatg 1260
gggcagttgc tggactttga gcgcagcttg cggctggagg agcgccactc gcaggagcag 1320
ggcagtgggg ggcaggcatc tgcggcctcc aacccgccct ccttcttcac cacccccacc 1380
agtgatggcg ccttcgagct ggcccccacc tagggccccg tggccggcag gccggcccct 1440
gccccacccc cacccacggg tgtccctgcc cactcgtgtg gcaagggagg ggagggcagg 1500
agggctcggc ctgagcaggg tgctgggggg agagcgcaat acctcacgcg ggctgccgtc 1560
ctaatcaacg tgcctatggc gggaccacgc tcggagcctg cctcttctgc gactgttact 1620
ttttctttgc gggatggggg tgggggttcc ctctccaggt ggttgtccag gcccaggtcc 1680
cggccctggg tgctcagcca gctcggctag gccctgcgcc tccctgcgct tcccccttca 1740
ggaagggtgt gtgccacctc gttgcactgg atcccagtgg ctgcttgggg gagaggcgtt 1800
tgccatcact ggtgttgtca cctccctgtt tctccaccaa gggcttgggc ctctcggggc 1860
tggggcctcc caggggatgg ggacccagag tgcagtggcc gcccacatcc atggcctagg 1920
agctactggg caggttcccg gccacacatc tggtgggctg ttttgttttt tttttttcct 1980
cttcccccag atgtcttgac gggatcactg gggctctttg tgagtgaggg tggccaaact 2040
accgccggag gagatggggt ctcagagcga gagctgcgga gggggagggg aagaagaagg 2100
cctcactttt gctgctgcgg ggcccacaca gccgctgcta ctttgggggg tggggaaggg 2160
gccaagctgc agacacacac agtcattcat ttctgtccac acccctgtgg gtggcgggtg 2220
tgcgtgtgtg tgcttgtgtg tgcgcacgtg tcggcgctca cacacacatg ctagcccact 2280
gatgcaccca gcccagggct ggcagtcttt gcagcgtggg gccgtctcac cctggagcct 2340
ggagaggatc tatgcttgtt tgtttttgta atccatatca tagttgcttt ctttaattgt 2400
tccttctgaa taaacagttt atttaagata ctga                             2434

Claims (1)

1.一种乐伐替尼耐药基因DUSP9的用途，其特征在于：将乐伐替尼耐药基因DUSP9作为抗乐伐替尼耐药药物的设计靶点，所述基因DUSP9的序列如SEQ ID NO.1所示。
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