CN110305845A - 一种肝细胞癌仑伐替尼耐药细胞株及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种肝细胞癌仑伐替尼耐药细胞株,其特征在于,该细胞株命名为人肝细胞癌仑伐替尼耐药细胞株ML30,其保藏编号为(C2019127)。其制备方法包括:步骤1:复苏人肝癌细胞株HuH‑7细胞后,用含10%胎牛血清的DMEM培养基,于37℃,5%C02培养箱中培养;步骤2:取对数生长期的人肝癌细胞株HuH‑7细胞,在培养皿中加入仑伐替尼,初始浓度为3μmol/L,适时传代或换液;每次传代之后,增加0.5μmol/L浓度,连续培养6个月以上;直至筛选到在30μmol/L以上仍能快速生长的人肝癌细胞株HuH‑7细胞即为耐药细胞株,命名为人肝细胞癌仑伐替尼耐药细胞株ML30。本发明在研究肝癌耐药机制、逆转肝癌细胞耐药性、指导病人用药、建立耐药动物模型方面都具有重要的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域,具体涉及一种肝细胞癌仑伐替尼耐药细胞株及其制备方法与应用。
背景技术
原发性肝癌是常见的消化系统恶性肿瘤,全球范围内每年新发病例数超过85万,病死人数高达70万,其中一半发生在中国,发病率有逐年上升的趋势,已成为我国恶性肿瘤第二大死因。在所有原发性肝癌中,肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是最常见的类型,约占90%,具有易复发、转移、死亡率高、预后差等特点。临床上大多数肝癌患者明确诊断时已是中、晚期,因而丧失了手术治疗的时机,而药物就成为了不可切除肝癌及肝癌切除后治疗的主力军。
仑伐替尼(lenvatinib)作为一种抗肿瘤的新型多靶点口服药物,可抑制血管内皮生长因子受体(VEGFR 1~3),纤维母细胞生长因子受体(FGFR 1~4),血小板衍生生长因子受体α(PDGFRα)、ret原癌基因(RET),kit原癌基因(KIT)的功能,发挥抗肿瘤血管生成,抑制肿瘤生长,促进肿瘤细胞凋亡的作用。仑伐替尼于2018年被正式批准为的晚期肝癌治疗一线药物,虽然它相较索拉非尼更适合有肝炎背景的东方人群使用,但医生和患者同样会面临肿瘤耐药这一棘手问题,而目前尚未有对仑伐替尼耐药的肝癌细胞株及耐药动物模型,肿瘤耐药细胞株的构建方法也亟需改进。
发明内容
本发明的目的在于提供一种肝细胞癌仑伐替尼耐药细胞株及其制备方法与应用。
为了达到上述目的,本发明提供了一种肝细胞癌仑伐替尼耐药细胞株,其特征在于,该细胞株命名为人肝细胞癌仑伐替尼耐药细胞株HuH-7/ML30,其保藏编号为CCTCC NO:C2019127。
优选地,所述肝细胞癌仑伐替尼耐药细胞株是在30μmol/L仑伐替尼刺激后,仍能快速生长的人肝癌细胞株HuH-7细胞。
更优选地,所述肝细胞癌仑伐替尼耐药细胞株对仑伐替尼的最大耐药浓度为53.29μmol/L。
本发明还提供了上述肝细胞癌仑伐替尼耐药细胞株的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤1:复苏人肝癌细胞株HuH-7细胞后,培养至对数生长期;
步骤2:取对数生长期的人肝癌细胞株HuH-7细胞,在培养基中加入仑伐替尼,初始浓度为3μmol/L,传代或换液;每次传代之后,仑伐替尼浓度增加0.5μmol/L,连续培养6个月以上;直至筛选到在30μmol/L以上浓度仍能快速生长的人肝癌细胞株HuH-7细胞即为耐药细胞株,命名为人肝细胞癌仑伐替尼耐药细胞株HuH-7/ML30。
本发明还提供了上述肝细胞癌仑伐替尼耐药细胞株在筛选抗肿瘤药物中的应用。
本发明还提供了上述肝细胞癌仑伐替尼耐药细胞株在制备抗肿瘤药物中的应用。
本发明还提供了上述肝细胞癌仑伐替尼耐药细胞株在建立耐药动物模型中的应用。
本发明所述的耐药细胞株是在仑伐替尼刺激6个月后,在30μmol/L浓度下仍能快速生长的HuH-7细胞。
本发明所述的耐药细胞株的最大给药浓度为30μmol/L,最大IC50值为53.29μmol/L。在冻存复苏后(冻存3个月)及撤药培养1个月后,IC50值基本不变。
本发明的原理在于:
本发明采用人肝癌细胞株HuH-7为诱导对象,利用Cell Counting Kit-8试剂盒(简称CCK-8)检测细胞半数抑制浓度(IC50),即为初始给药浓度,后续不断增加药物浓度(细胞每次传代后增加0.5μmol/L),连续处理6个月以上,直至HuH-7细胞可以在10倍及以上初始处理浓度下快速生长(终末IC50值为初始IC50值的10倍及以上),即为仑伐替尼耐药细胞株ML30,并且ML30细胞在经过连续传代、冻存复苏、和无药维持之后依然能保持耐药性状。
本发明的有益效果在于:
本发明首次构建了一种肝癌细胞仑伐替尼耐药细胞株,可用于分析肝癌细胞仑伐替尼耐药后的形态学及生物学表型的变化;研究肿瘤对仑伐替尼耐药的分子机制和逆转肿瘤耐药的方法及筛选其他抗肿瘤药物;发现肿瘤耐药标志物以及筛选和评估新型抗肿瘤药物等,具有较高的科研和生产应用价值。
本发明在研究肝癌耐药机制、逆转肝癌细胞耐药性、指导病人用药、建立耐药动物模型方面都具有重要的应用前景。
本发明获得的人肝细胞癌仑伐替尼耐药细胞株命名为HuH-7/ML30(简称ML30),保藏单位为中国典型培养物保藏中心,保藏编号为CCTCC NO:C2019127,保藏日期:2019年6月25日。
附图说明
图1是光学显微镜下HuH-7和ML30细胞的细胞形态;其中A,B为HuH-7细胞,C,D为ML30细胞;
图2是肝癌细胞系HuH-7的IC50值和耐药株ML30的IC50值;其中A为HuH-7细胞的IC50值,B为ML30细胞的IC50值,C为ML30细胞冻存复苏后的IC50值,D为ML30细胞撤药30天的IC50值;
图3是HuH-7和ML30细胞TUNEL荧光染色图;其中A为HuH-7细胞在10μmol/L浓度下处理48h后的TUNEL荧光染色,B为ML30细胞在10μmol/L浓度下处理48h后的TUNEL荧光染色,C为在200倍视野下两组每200个细胞被染色细胞个数对比(P=0.0003);
图4是HuH-7和ML30细胞的Transwell侵袭、转移实验图;其中A为HuH-7细胞在200倍光镜下转移实验图片,B为ML30细胞在200倍光镜下转移实验图片,C为HuH-7细胞在200倍光镜下侵袭实验图片,D为ML30细胞在200倍光镜下侵袭实验图片,E为在200倍视野下两组转移细胞个数对比(P<0.0001),F为在200倍视野下两组侵袭细胞个数对比(P<0.0001);
图5是HuH-7和ML30细胞的信号通路蛋白免疫印迹图;
图6是HuH-7和ML30细胞的裸鼠皮下瘤种植模型图;其中A为肿瘤体积变化曲线,B为小鼠体重变化曲线;
图7是HuH-7和ML30细胞的裸鼠肝原位瘤种植模型图;A为肿瘤照片;B为肿瘤体积变化曲线,C为小鼠体重变化曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解,在阅读了本发明讲授的内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例所用的人肝癌细胞HuH-7细胞购自中国科学院细胞库;实施例所用的仑伐替尼为市售的Selleck Chemicals公司的Lenvatinib(E7080)50mg规格的产品。
实施例1:肝细胞癌仑伐替尼耐药细胞株的制备
取人肝癌HuH-7细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基(青霉素100单位/mL,链霉素100ug/mL),于37℃,5%C02培养箱中培养;为确定HuH-7细胞的IC50值,将对数期细胞种植在96孔板中,设置仑伐替尼浓度梯度分别为0,1,2.5,5,7.5,10,12.5,15,20,25μmol/L,留置空白对照(只加100ul含10%胎牛血清的DMEM培养基),每个梯度设3个复孔,仑伐替尼处理48小时,使用CCK-8试剂盒测定细胞IC50值,IC50值为3.13μmol/L,得到初始给药浓度为3μmol/L。
使用3μmol/L浓度仑伐替尼对细胞进行处理,每48h进行换液,当细胞长满后进行传代,传代细胞贴壁后在之前浓度基础上增加0.5μmol/L,若增加仑伐替尼浓度后,培养皿中存活细胞数量过少时(<培养皿底部面积的30%),可换用小号培养皿或孔板进行培养,保证细胞密度不低于培养皿面积的50%(若连续2周细胞未增殖,则降低0.25μmol/L浓度直至细胞传代,传代后再增加0.25μmol/L用药浓度)。连续培养6个月以上,直至筛选到在30μmol/L以上仍能快速生长的人肝癌细胞株HuH-7细胞即为耐药细胞株,命名为人肝细胞癌仑伐替尼耐药细胞株ML30。
实施例2:肝癌细胞系HuH-7的IC50值和耐药株ML30的IC50值
取对数生长期的HuH-7、ML30细胞,用0.5%胰酶(Gibco)消化并计数,按每孔5000个细胞的密度接种入96孔板,含10%胎牛血清的DMEM,6小时后待细胞贴壁,去除培养基,加入含不同浓度仑伐替尼的培养基(含10%胎牛血清的DMEM),浓度梯度为0,1,10,20,30,40,50μmol/L(超过50μmol/L仑伐替尼不能溶解于培养基,影响细胞状态和吸光度测定),留置空白对照(只加含10%胎牛血清的DMEM培养基),每个浓度设置3个复孔,每孔加入100μL培养基,放置于37℃,5%C02培养箱中培养48小时。
向每孔各加10μL CCK-8工作液(日本同仁),加入过程中避免气泡产生。在37℃培养箱中孵育1.5小时后,在450nm波长下用酶标仪检测每孔的OD值并计算细胞活力。以药物浓度为横坐标、OD值为纵坐标,用GraphPad Prism 7.0绘制成细胞活力曲线(图2A,2B)。细胞活力(%)=[A(加药)-A(空白)]/[A(O加药)-A(空白)]X 100;
A(加药):具有细胞、CCK-8溶液和药物溶液的孔的吸光度;
A(空白):具有培养基和CCK-8溶液而没有细胞的孔的吸光度;
A(O加药):具有细胞、CCK-8溶液而没有药物溶液的孔的吸光度;
取对数期的ML30细胞,用1ml 0.5%胰酶(Gibco)消化后,用2ml DMEM(含10%胎牛血清)进行中和,然后在1000转/分钟速度下离心3分钟,吸去上清,用1ml细胞冻存液(血清:DMSO=9:1)重悬,置入冻存管内,液氮或-80℃低温保存。
冻存的ML30细胞在37℃水浴锅中快速震荡,直至复温。在1000转/分钟速度下离心3分钟,吸去上清,用1ml DMEM(10%胎牛血清)将ML30细胞重悬后接种于无仑伐替尼的培养皿中,24小时后换液,48小时后进行IC50值测定(图2C)。
取对数期的ML30细胞,撤药培养30天,测IC50值(图2D)。
实验结果显示,HuH-7细胞的IC50值为3.13μmol/L,ML30细胞的IC50值为53.29μmol/L,3个月前冻存的ML30细胞复苏48小时后其IC50值为37.73μmol/L,而连续一个月撤药培养后,ML30细胞的IC50对应浓度依然可以维持在42.12μmol/L。
实施例3:光学显微镜下HuH-7和ML30细胞的细胞形态
倒置相差显微镜观察活细胞形态:分别取对数生长期的HuH-7细胞和ML30耐药细胞,PBS(pH=7.2-7.4)换液后,在倒置显微镜下观察活细胞形态。通过光镜可以观察到HuH-7细胞大小基本一致,细胞呈多角形,四周伸出伪足,部分为圆形(如图1A,1B所示);而ML30耐药细胞大小不一,且形态各异,更多细胞融合成细胞集落生长(如图1C,1D所示)。
实施例4:HuH-7和ML30细胞TUNEL荧光染色图
取对数期HuH-7和ML30细胞接种于48孔板(Corning),按每孔1x104个细胞的密度接种,每组设置3个复孔,分别加入浓度为10μmol/L仑伐替尼的DMEM培养基1ml,37℃,5%C02培养箱中培养48小时。
去除培养基,PBS洗涤一次,吸净PBS,加入4%多聚甲醛固定细胞30分钟。去除多聚甲醛,用PBS涮洗一遍,加入含0.3%Triton X-100的PBS(pH=7.2-7.4),室温孵育5分钟。吸净PBS,在样品上加50μl TUNEL检测液(碧云天C1090),37℃避光孵育1h。PBS洗涤3次,用抗荧光淬灭封片液封片后荧光显微镜下观察。Cy3的激发波长为550nm,发射波长为570nm(红色荧光)。200倍视野下分别取4个视野下阳性细胞数的平均值进行统计计算。
结果如图3所示,HuH-7细胞出现大量凋亡,而ML30细胞则很少凋亡,其结果具有统计学意义(P=0.0003)。
实施例5:HuH-7和ML30细胞转移、侵袭实验图
转移实验:胰酶消化对数期的HuH-7和ML30细胞,以1000转/分钟的速度,离心3分钟。吸去上清后加入无血清DMEM,混匀。每孔加入细胞5x104个。下室加入800μl含20%胎牛血清的DMEM),置于37℃,5%CO2培养箱培养48小时。取出Transwell小室,吸弃液体,立即4%甲醛固定15分钟去除固定液后PBS漂洗2遍,每遍5分钟,再用0.5%结晶紫溶液染色10分钟,大量双蒸水漂洗后用棉签檫净基底膜胶,200倍镜下观察,选取上中下左右5个视野计数并拍照。
侵袭实验:将Matrigel原液于冰箱内4℃冰浴过夜使融化。用融化的Matrigel原液和预冷无血清DMEM培养液配制Transwell chamber(Corning 8μm)上室凝胶液(凝胶:DMEM=1:7),以每孔100μl包被Transwell上室,37℃放置2-4小时使其凝固。后续同转移实验步骤。
如图4所示,实验结果显示,ML30相较于HuH-7细胞具有更强的转移和侵袭能力,其差异具有统计学意义(P<0.0001)。
实施例6:HuH-7和ML30细胞的信号通路蛋白免疫印迹图
配胶:
分离胶(10%)
浓缩胶(5%)
浓缩胶中插入10孔梳子,待胶凝固后上样。
分别对数期的HuH-7和ML30细胞,去除培养基,用PBS(pH=7.2-7.4)漂洗3遍,吸净PBS后加入1X上样缓冲液1ml,用细胞刮板将所有细胞刮下并移入1.5ml EP管。沸水煮10分钟。将凝胶插入电泳槽中,并加入电泳液(Tris-base 3.03g/L,甘氨酸14.42g/L,SDS 1g/L),拔掉梳子,每孔上样20ul。以60V恒定电压使蛋白穿过浓缩胶,进入分离胶后用100V恒定电压直至溴酚蓝距胶底部0.5cm时结束。
将预先裁好的与胶等大的PVDF膜用甲醇活化30秒,然后置于转膜缓冲液(Tris-base 3.03g/L,甘氨酸14.42g/L,甲醇200ml/L)中,按顺序将垫子、滤纸、凝胶、PVDF膜、滤纸、垫子置于转膜夹子中,然后将转膜夹子置于电转槽内,凝胶靠近负极侧。转膜槽内放置冰盒,外部置于冰上,以200mA恒定电流转膜100分钟。转膜完成后,将PVDF膜取出置于封闭液中(1xTBS,0.1%Tween-20,5%脱脂奶粉),摇床30转/分钟,封闭60分钟。
封闭结束后TBST漂洗3遍,每遍5分钟,置于一抗(Cell signaling Technology公司)
Phospho-p44/42 MAPK(Erk1/2)(Thr202/Tyr204)(197G2)Rabbit mAb#4377(1:1000)
p44/42MAPK(Erk1/2)(137F5)Rabbit mAb#4695(1:1000)
Phospho-Stat3(Tyr705)(M9C6)Mouse mAb#4113(1:2000)
Stat3(79D7)Rabbit mAb#4904(1:2000)
Akt Antibody#9272(1:1000)
Phospho-Akt(Thr450)Antibody#9267(1:1000)
GAPDH(D16H11)XP Rabbit mAb#5174(1:1000))中,4℃摇床过夜孵育(30转/分钟)。TBST洗3遍,每遍10分钟。二抗(HRP标记的羊抗鼠IgG单克隆抗体1:2000,HRP标记的羊抗兔IgG单克隆抗体1:2000)室温下孵育1小时,TBST洗涤3遍,每遍10分钟。超敏发光液(Millipore)室温曝光显影。
如图5所示,蛋白免疫印迹结果显示ML30细胞较HuH-7细胞p-Stat3,p-Akt,p-Erk蛋白表达均有增加,提示其可能与ML30转移能力增强,抗凋亡相关。
实施例7:HuH-7和ML30细胞的裸鼠皮下瘤种植模型图
4周龄雄性BALB/c-nu/nu裸鼠20只,随机均分为4组(HuH-7PBS组,HuH-7给药组,ML30PBS组,ML30给药组),取对数生长期的HuH-7细胞分别接种于HuH-7PBS组、HuH-7给药组裸鼠皮下(5x106个/只),另取对数生长期的ML30细胞(5x106个/只)分别接种于ML30PBS组、ML30给药组裸鼠皮下(5x106个/只)2周后,待肿瘤平均直径达到5mm,给药组予以10mg/kg甲磺酸仑伐替尼(Selleck)灌胃治疗,PBS组予以500μl PBS灌胃,灌胃频率为每天一次,每周6天。每周末测量体重及瘤块大小,4周后取出瘤块。瘤块体积=0.5x肿瘤最长径x肿瘤最短径2。
如图6所示,皮下瘤结果显示:ML30给药组与ML30PBS组和HuH-7PBS组肿瘤体积差别不明显,而HuH-7给药组肿瘤体积显著缩小,且具有显著统计学差异(P<0.001)
实施例8:HuH-7和ML30细胞的裸鼠肝原位瘤种植模型图
待HuH-7和ML30细胞皮下瘤长至1cm3,取出皮下瘤,无菌条件下切成1mm3,将瘤块种植于4周龄雄性BALB/c-nu/nu裸鼠肝包膜下,裸鼠分为3组(HuH-7PBS组,HuH-7给药组,ML30给药组),每组5只,2周后待能触及到肝脏肿块后,给药组予以10mg/kg甲磺酸仑伐替尼灌胃治疗,PBS组予以500μl PBS灌胃。灌胃频率为每天一次,每周6天。每周末测量体重,4周后取出瘤块,测量瘤块体积。
如图7所示,原位瘤模型再次印证了耐药结果,ML30给药组较HuH-7给药组肿瘤更大,且具有显著统计学差异(P<0.0001)。
Claims (7)
1.一种肝细胞癌仑伐替尼耐药细胞株,其特征在于,该细胞株命名为人肝细胞癌仑伐替尼耐药细胞株HuH-7/ML30,其保藏编号为CCTCC NO:C2019127。
2.如权利要求1所述肝细胞癌仑伐替尼耐药细胞株,其特征在于,所述肝细胞癌仑伐替尼耐药细胞株是在30μmol/L仑伐替尼刺激后,仍能快速生长的人肝癌细胞株HuH-7细胞。
3.如权利要求2所述肝细胞癌仑伐替尼耐药细胞株,其特征在于,所述肝细胞癌仑伐替尼耐药细胞株对仑伐替尼的最大耐药浓度为53.29μmol/L。
4.权利要求1所述肝细胞癌仑伐替尼耐药细胞株的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤1:复苏人肝癌细胞株HuH-7细胞后,培养至对数生长期;
步骤2:取对数生长期的人肝癌细胞株HuH-7细胞,在培养基中加入仑伐替尼,初始浓度为3μmol/L,传代或换液;每次传代之后,仑伐替尼浓度增加0.5μmol/L,连续培养6个月以上;直至筛选到在30μmol/L以上仍能快速生长的人肝癌细胞株HuH-7细胞即为耐药细胞株,命名为人肝细胞癌仑伐替尼耐药细胞株HuH-7/ML30。
5.权利要求1所述肝细胞癌仑伐替尼耐药细胞株在筛选抗肿瘤药物中的应用。
6.权利要求1所述上述肝细胞癌仑伐替尼耐药细胞株在制备抗肿瘤药物中的应用。
7.权利要求1所述肝细胞癌仑伐替尼耐药细胞株在在建立耐药动物模型中的应用。
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