CN101283994A - 白花丹醌在制备抑制血管新生药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及白花丹醌的新用途，具体涉及白花丹醌在制备抑制血管新生药物中的应用。本发明的技术方案是提供白花丹醌在制备抑制血管新生药物中的应用。尤其是白花丹醌在制备抑制肿瘤血管新生、银屑病、卡波氏肉瘤、糖尿病视网膜病变、非白血性白血病、类风湿性关节炎、十二指肠溃疡、骨髓瘤、淋巴瘤等疾病的血管新生药物中的应用。实验表明，白花丹醌能抑制内皮细胞的增殖、迁移、成管，并能抑制鸡胚尿囊膜的血管新生，可以用于制备抑制血管新生的药物。

Description

白花丹醌在制备抑制血管新生药物中的应用

技术领域

本发明涉及白花丹醌的新用途，具体涉及白花丹醌在制备抑制血管新生药物中的应用。

背景技术

血管新生是微血管从已存在的血管形成新的血管分支及毛细血管丛的过程，是血管内成熟内皮细胞增殖、迁移和重塑的结果。血管生成包括五个阶段：①血管细胞分泌蛋白水解酶降解血管基底膜；②内皮细胞穿过基底膜迁移到血管周围基质；③内皮细胞增殖、相互黏附并连接；④形成管腔样结构；⑤基质重塑和平滑肌细胞的包绕及血管的相互吻合形成血管网。

血管新生在生理和病理条件下都有发生。生理性血管新生主要发生在胚胎发生过程和女性生理周期，对于正常的发育非常关键；病理性血管新生是许多疾病发生的重要原因，包括肿瘤、心血管疾病、糖尿病等，其中肿瘤的生长以及转移都有赖于血管新生。肿瘤从无血管新生期或血管新生前期到血管新生期这个过程中存在一个血管新生开关，它是肿瘤进一步生长和转移时血管新生形成必不可少的。肿瘤一旦产生，肿瘤细胞、其周围的基质细胞和内皮细胞之间发生相互用，它们首先分泌和激活多种基质金属蛋白酶，降解基质，为肿瘤的生长和转移提供空间，然后肿瘤细胞通过分泌VEGF和bFGF来刺激内皮细胞的增殖，从而形成新的血管，为肿瘤的进一步生长和转移提供了物质条件。

目前已经了解到，血管新生的异常表现为血管新生过度和不足，将导致相关的疾病，即血管新生性疾病。这类疾病包括肿瘤、糖尿病视网膜病变、银屑病、血管新生性眼病、类风湿关节炎、卡波氏肉瘤、非白血性白血病、十二指肠溃疡、淋巴瘤、骨髓瘤、月经不调、不孕症等，因此有效控制血管新生已成为人们对相关疾病治疗的新策略。

白花丹醌(Plumbagin，C₁₁H₈O₃)，又称白花丹醌，白花丹精，矶松素。存在于白花丹科植物紫雪花(Plumbago indica L.)的全草，白花丹的根。以前的实验结果表明白花丹醌具有抗肿瘤的作用，可以治疗急性早幼粒细胞白血病，但是目前没有白花丹醌抑制血管新生以及作为抑制血管新生药物的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供白花丹醌在制备抑制血管新生药物中的应用。

为实现本发明的目的，本发明的技术方案是提供白花丹醌在制备抑制血管新生药物中的应用。尤其是白花丹醌在制备抑制肿瘤血管新生、银屑病、卡波氏肉瘤、糖尿病视网膜病变、非自血性白血病、类风湿性关节炎、十二指肠溃疡、骨髓瘤、淋巴瘤等疾病的血管新生药物中的应用。

具体来说，本发明提供白花丹醌在制备抑制肿瘤血管新生的药物中的应用。以及制备抑制关节炎病变组织的血管新生的药物，其中关节炎是类风湿性关节炎或者炎性关节炎。

本发明还提供白花丹醌在制备抑制血管新生性眼病血管新生的药物中的应用，包括血管新生性角膜疾病；血管新生性视网膜疾病，其中管新生性视网膜疾病为糖尿病性视网膜病、视网膜静脉闭塞或者早熟性视网膜病；抑制血管新生性虹膜疾病；抑制新生血管性青光眼；新生血管性脉络膜疾病，其中脉络膜病为抑制湿性老年黄斑病变；新生血管性结膜眼病；新生血管性玻璃体眼病；新生血管性视神经疾病。

本发明还提供白花丹醌在制备抑制血管瘤病变组织血管新生的药物中的应用，以及制备抑制银屑病病变组织血管新生的药物中的应用；以及抑制实体瘤病变组织血管新生的药物，其中实体瘤包括原发性和继发性的实体瘤；以及制备抑制血管瘤的药物中的应用，其中血管瘤包括多发性血管瘤、血管母细胞瘤和其他一些良性血管增生疾病。本发明还提供白花丹醌在制备抑制Kaposi’s肉瘤病变组织血管新生的药物中的应用，包括抑制白血病、淋巴瘤、骨髓瘤血液癌症的药物，以及抑制Paget’s疾病的药物；25.根据权力要求1所述的应用，其特征在于抑制十二指肠溃疡疾病的药物；以及制备治疗血管新生相关的月经不调的疾病和治疗不孕症的疾病的药物中的应用。

根据本发明可以将治疗有效量的白花丹醌和药学上允许的任意一种辅料制成药物组合物，也可以添加其他与白花丹醌没有拮抗作用的其他抗血管新生药物。其制剂可以是药学上的任意一种剂型，包括但不限于散剂、片剂、浓缩丸、分散片、颗粒剂、大输液、糖浆、滴丸、胶囊剂、半胶囊剂、丸剂、茶剂、酒剂、喷雾剂、搽剂、贴膏剂、软膏剂、口服液、注射剂、栓剂、脂质体、舌下含片、悬浮剂、溶液剂等制剂。

施用该药物载体可采用一种以上固体、半固体或液体状的稀释剂、填充剂及其他处方用的辅助剂。本发明的医药组合物可经口服药、组织内给药、局部给药(经皮给药等)或直肠内给药。以适合于这些给药方法的剂型投药，例如特别好的是口服给药。

本发明的有益效果：

本发明公开了白花丹醌在抑制血管新生中的新用途。实验表明，白花丹醌能抑制内皮细胞的增殖、迁移、成管，并能抑制鸡胚尿囊膜的血管新生，可以用于制备抑制血管新生的药物。

附图说明

图1：白花丹醌抑制HMEC-1(图A)及HUVEC细胞(图B)的增殖。

图2：白花丹醌抑制HUVEC细胞的迁移照片。其中：A，对照；B，100nM白花丹醌。

图3：白花丹醌抑制HUVEC细胞在修饰的Boyden小室中的迁移实验。其中：A，对照；B，100nM白花丹醌。

图4：白花丹醌抑制HMEC-1细胞的成管照片。其中：A，对照；B，10μM白花丹醌。

图5：白花丹醌抑制鸡胚尿囊膜新生血管形成的照片。其中：A，对照；B，15μg/滤纸片白花丹醌。

具体实施方式

实施例1：白花丹醌抑制内皮细胞增殖。

目的和原理：内皮细胞增殖实验采用MTS assay。MTS assay是一种运用比色法确定细胞增殖数量的测定方法在活细胞中，NADPH脱氢酶将MTS四唑盐化合物转变成一种溶于组织培养液的一种有色物质，其颜色深浅与某些细胞株的活细胞数在一定范围内呈高度相关。通过该模型可评价药物对每批细胞增殖能力的影响。

方法：将1×10⁵个/mlHMEC-1(人微血管内皮细胞)或HUVEC(人脐静脉内皮细胞)的细胞悬液接种于96孔板中，每孔50μl，给予含有不同浓度白花丹醌的培养基50μl，在5％CO₂培养箱37℃作用48～72小时，然后每孔加入20μl检测液，孵育1～4小时，然后用酶标仪在490nm处读出每个孔中的光吸收值。

结果与评价：与对照组相比，给予白花丹醌后，内皮细胞的增殖受到抑制，说明白花丹醌可以抑制内皮细胞的增殖，并呈剂量依赖性。

实施例2：白花丹醌抑制内皮细胞迁移

目的和原理：该细胞迁移实验又叫体外划痕实验。本实验通过在单层内皮细胞上制造划痕，并在显微镜下观察并记录下划痕边缘细胞往空隙部分迁移的情况来评价药物对内皮细胞迁移能力的影响。

方法：将4×10⁴个/ml HUVEC细胞接种于6孔板中，2ml/孔。待细胞长至90％以上以后在每孔中制造一条划痕。将此时浮于上层的死细胞洗净，再将药物浓度不同的含4ng/ml VEGF的培养基加入到六孔板中，于5％CO₂培养箱37℃培养。

结果与评价：在显微镜下观察，待VEGF对照组的划痕空隙部分已被细胞完全覆盖后通过显微镜拍照，结果为：其中A为VEGF对照组；B为100nM白花丹醌。与对照组A相比，给予白花丹醌后，内皮细胞的迁移受到抑制，说明白花丹醌可以抑制内皮细胞的迁移。

实施例3：白花丹醌抑制内皮细胞Boyden小室迁移实验

目的和原理：本实验采用Boyden小室细胞培养小室。细胞在生长因子的诱导下可以透过孔径为8μm的多聚碳酸盐滤膜，此实验可以检测药物对内皮细胞在有阻力条件下的迁移能力的影响。

方法：用0.1％的明胶将6孔板包被，小室外六孔板中加入600μl含有10ng/ml VEGF₁₆₅的内皮细胞培养基。小室中接入50μl的浓度为4×10⁵cells/mlHUVEC细胞悬液与50μl含不同浓度白花丹醌的培养基，37℃5％CO₂培养箱中孵育四小时。

结果与评价：四小时后，将小室内外的细胞培养液吸去，下层细胞迁移的细胞用4％多聚甲醛固定20分钟，用PBS漂洗干净，苏木精伊红染色各20分钟，用PBS将背景多余染料洗去，室温晾干。OLYMPUS显微镜下拍照计数统计穿过膜的细胞的个数。结果为：其中A为对照组；B为100nM白花丹醌；与对照组A比，给予白花丹醌后，内皮细胞迁移能力受到影响，说明白花丹醌可以抑制内皮细胞的穿过微孔的迁移能力。

实施例4：白花丹醌抑制内皮细胞细胞成管实验

目的和原理：Matrigel是从ESH小鼠肉瘤中抽提得到的可溶性基底膜提取物，富含细胞外基质蛋白。在室温下，此Matrigel基质可聚合成一种具有生物活性的基质材料，作用与哺乳动物细胞基底膜类似。其对于血管内皮细胞粘附有效应作用。Matrigel可以诱导内皮细胞形成管腔结构，建立血管形成的体外培养体系，然后施加实验样品。利用这种特性，可以来研究药物对血管形成的影响。

方法：用预冷的移液器将Matrigel铺到48孔板上，100μl/孔，37℃孵育30min。待其凝固后，每孔加入500μl浓度为12×10⁴/ml的HMEC-1细胞悬液，再加入500μl含有不同浓度白花丹醌的培养基，混匀。于37℃5％培养箱中培养16-18h在显微镜下观察微管形成情况。

结果与评价：内皮细胞在Matrigel中生长16-18h后，细胞不发生融合，由原来的多角形变成长梭形，并形成相互连接的毛细血管样的血管网络。结果为：其中A为对照组；B为10μM白花丹醌；与对照组相比，给予白花丹醌之后，内皮细胞的成管过程受到显著抑制，血管网络结构受到破坏，说明白花丹醌可以抑制内皮细胞微管形成。

实施例5：白花丹醌抑制鸡胚尿囊膜血管新生。

目的和原理：鸡胚尿囊膜的血管新生早期，其机体免疫系统尚未完全建立，对异物几乎不发生排斥，将含样品的载体(滤纸片)置于其表面，可观察到药物对血管新生的影响，也是目前研究血管生成最常用、简捷的体内试验模型.

方法：将受精卵置于孵化箱中孵化5天，在超净工作台中，用酒精擦拭卵壳表面，在卵壳钝端用镊子小心地敲开一个直径约1cm圆形小口，通过小孔观察胚胎所在的位置，在血管稀疏的地方用镊子撕开气室膜。将事先准备好的加了不同浓度白花丹醌的载体滤纸片加在尿囊膜无血管区域。用透明胶带封口。A为对照组，不加白花丹醌；15μg/鸡胚)

结果与评价：放入载体滤纸片的鸡胚放入孵育箱中继续孵育两天，揭去透明胶带，在OLYMPUS体视显微镜下拍照。结果为：与对照组A比较，给予白花丹醌之后，新的微血管生成受到抑制，说明白花丹醌可以抑制鸡胚尿囊膜的血管新成。

Claims (27)

1.白花丹醌在制备抑制血管新生药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于抑制血管新生药物为抑制肿瘤血管新生的药物。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于抑制血管新生药物为抑制关节炎病变组织的血管新生的药物。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于关节炎是类风湿性关节炎或者炎性关节炎。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于抑制血管新生药物为抑制血管新生性眼病血管新生的药物。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于血管新生性眼病为血管新生性角膜疾病。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于血管新生性眼病为血管新生性视网膜疾病。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于血管新生性视网膜疾病为糖尿病性视网膜病、视网膜静脉闭塞或者早熟性视网膜病。

9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于血管新生性眼病为抑制血管新生性虹膜疾病。

10.根据权利要求5所述的应用，其特征在于血管新生性眼病为抑制新生血管性青光眼。

11.根据权利要求5所述的应用，其特征在于血管新生性眼病为新生血管性脉络膜疾病。

12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于脉络膜病为抑制湿性老年黄斑病变。

13.根据权利要求5所述的应用，其特征在于血管新生性眼病为新生血管性结膜眼病。

14.根据权利要求5所述的应用，其特征在于眼病为新生血管性玻璃体眼病。

15.根据权利要求5所述的应用，其特征在于血管新生性眼病为新生血管性视神经疾病。

16.根据权利要求1所述的应用，其特征在于抑制血管新生药物为抑制血管瘤病变组织血管新生的药物。

17.根据权利要求1所述的应用，其特征在于抑制血管新生药物为抑制银屑病病变组织血管新生的药物。

18.根据权利要求1所述的应用，其特征在于抑制血管新生药物为抑制实体瘤病变组织血管新生的药物。

19.根据权利要求18所述的应用，其特征在于实体瘤包括原发性和继发性的实体瘤。

20.根据权利要求1所述的应用，其特征在于抑制血管新生的药物为抑制血管瘤的药物。

21.根据权利要求20所述的应用，其特征在于血管瘤包括多发性血管瘤或者血管母细胞瘤。

22.根据权利要求1所述的应用，其特征在于抑制血管新生药物为抑制Kaposi’s肉瘤病变组织血管新生的药物。

23.根据权利要求1所述的应用，其特征在于抑制血管新生药物为抑制白血病、淋巴瘤或者骨髓瘤血液癌症的药物。

24.根据权利要求1所述的应用，其特征在于抑制血管新生药物为抑制Paget’s疾病的药物。

25.根据权利要求1所述的应用，其特征在于抑制十二指肠溃疡疾病的药物。

26.根据权利要求1所述的应用，其特征在于治疗血管新生相关的月经不调疾病的药物中的应用。

27.根据权利要求1所述的应用，其特征在于制备治疗不孕症的药物中的应用。

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