CN101284005A

CN101284005A - 靛玉红在制备抑制血管新生药物中的应用

Info

Publication number: CN101284005A
Application number: CNA2008100381031A
Authority: CN
Inventors: 易正芳; 张晓丽; 赖力; 张京; 卢彬彬; 易庭芳; 刘明耀
Original assignee: East China Normal University
Current assignee: East China Normal University
Priority date: 2008-05-27
Filing date: 2008-05-27
Publication date: 2008-10-15

Abstract

本发明涉及靛玉红的新用途，具体涉及靛玉红在制备抑制血管新生药物中的应用。靛玉红在制备抑制眼科疾病、肿瘤、关节炎、血管瘤、银屑病等血管新生性疾病。实验表明，靛玉红在HMEC－1(人微血管内皮细胞)细胞增殖实验、HUVEC(人脐静脉内皮细胞)细胞增殖实验、HUVEC细胞(人脐静脉内皮细胞)体外划痕迁移实验、HUVEC细胞(人脐静脉内皮细胞)修饰的Boyden小室迁移实验、HMEC－1(人微血管内皮细胞)细胞成管实验、鸡胚尿囊膜血管新生等均有明显的抑制作用，可用于制备抑制血管新生的药物。

Description

靛玉红在制备抑制血管新生药物中的应用

技术领域

本发明涉及靛玉红的新用途，具体涉及靛玉红在制备抑制血管新生药物中的应用。

背景技术

血管新生是在已有血管基础上产生新血管的过程，包括五个基本过程：①血管基底膜降解；②内皮细胞穿过基底膜迁移到血管周围基质；③内皮细胞增殖、相互黏附并连接；④形成管腔样结构；⑤基质重塑和平滑肌细胞的包绕及血管的相互吻合形成血管网。

血管新生在生理和病理条件下都有发生，生理性血管新生主要发生在胚胎发育和女性生理周期，对于正常的发育非常关键；病理性血管新生是许多种重大疾病发生的重要原因，包括肿瘤、心血管疾病、糖尿病等，另外，关节炎、角膜、视网膜血管新生及老年黄斑病变等眼科疾病等都涉及血管新生。

肿瘤的生长与转移依赖于血管新生，肿瘤在没有养分的供应下，一般只能长到2-3立方毫米，一旦有新生血管与其相连，肿瘤获得营养，以几何级数迅速生长，同时肿瘤细胞还可以通过新生血管转移到其他器官，引起肿瘤转移，导致人体死亡，因此，抑制血管新生可以抑制肿瘤生长与转移，血管新生对肿瘤研究具有重要意义。

2004年美国FDA批准了第一个血管新生抑制剂用于治疗结肠癌，现有多种类似制剂在进行临床试验，一些中草药单体也已被发现具有抗血管新生的作用。

靛玉红(Indirubin)是一种中草药单体，主要来源于马蓝(Baphicacanthuscusia)、蓼蓝(Polygonum tinctorium)及菘蓝(Isatis indigotica)等植物。虽然已有报道称靛玉红可以直接作用于肿瘤细胞而具有抗癌作用，但是目前还没有靛玉红抑制血管新生的报道，或通过抑制血管新生来抑制肿瘤，也没有靛玉红作为抑制血管新生药的报道。

发明内容

本发明的目的是提供靛玉红在制备血管新生药物中应用。

本发明的技术方案是靛玉红在制备抑制血管新生药物中的应用，尤其是靛玉红在制备抑制眼科疾病、肿瘤、关节炎、血管瘤、银屑病等血管新生性疾病。其中制备治疗眼科疾病的药物中眼科疾病是指抑制新生血管性眼病的药物；新生血管性眼病为新生血管性角膜疾病；或者新生血管性视网膜疾病；或者抑制血管新生性虹膜疾病；或者抑制新生血管性青光眼；或者新生血管性脉络膜疾病；或者新生血管性结膜眼病；或者新生血管性玻璃体眼病；或者新生血管性视神经疾病。其中网膜病为糖尿病性视网膜病、视网膜静脉闭塞或者早熟性视网膜病；新生血管性脉络膜疾病为湿性老年黄斑病变。

靛玉红在制备治疗制关节炎病变组织的血管新生的药物中的应用，其中关节炎是指类风湿性关节炎和炎性关节炎。

本发明还提供靛玉红作为制备治疗血管瘤的药物中的应用，其中血管瘤为多发性血管瘤或者血管母细胞瘤。

本发明还提供靛玉红作为制备治疗银屑病病变组织血管新生的药物。

本发明还提供靛玉红作为制备治疗抑制实体瘤病变组织血管新生的药物，其中实体瘤为原发性或者继发性的实体瘤。

提供靛玉红作为制备治疗抑制血管新生药物为抑制Kaposi’s肉瘤病变组织血管新生的药物，以及制备治疗抑制血管新生药物为抑制白血病、淋巴瘤、骨髓瘤血液癌症的药物，以及制备治疗抑制血管新生药物为抑制Paget’s疾病的药物。

根据本发明可以将治疗有效量的靛玉红和药学上允许的任意一种辅料制成药物组合物，也可以添加其他与靛玉红没有拮抗作用的其他抗血管新生药物。其制剂可以是药学上的任意一种剂型，包括但不限于散剂、片剂、浓缩丸、分散片、颗粒剂、大输液、糖浆、滴丸、胶囊剂、半胶囊剂、丸剂、茶剂、酒剂、喷雾剂、搽剂、贴膏剂、软膏剂、口服液、注射剂、栓剂、脂质体、舌下含片、悬浮剂、溶液剂等制剂。

施用该药物的载体可采用一种以上固体、半固体或液体状的稀释剂、填充剂及其他处方用的辅助剂。本发明的医药组合物可经口服药、组织内给药、局部给药(经皮给药等)或直肠内给药。以适合于这些给药方法的剂型投药，例如特别好的是口服给药。

本发明公开了靛玉红的新用途，及靛玉红在制备血管新生药物中的应用。实验表明，靛玉红在HMEC-1(人微血管内皮细胞)细胞增殖实验、HUVEC(人脐静脉内皮细胞)细胞增殖实验、HUVEC细胞(人脐静脉内皮细胞)体外划痕迁移实验、HUVEC细胞(人脐静脉内皮细胞)修饰的Boyden小室迁移实验、HMEC-1(人微血管内皮细胞)细胞成管实验、鸡胚尿囊膜血管新生等均有明显的抑制作用，可用于制备抑制血管新生的药物。

附图说明

图1：靛玉红抑制HMEC-1及HUVEC细胞的增殖

图2：靛玉红抑制HUVEC细胞体外划痕迁移照片

图3：靛玉红抑制HUVEC细胞修饰的Boyden小室迁移照片

图4：靛玉红抑制HMEC-1细胞的成管照片

图5：靛玉红抑制鸡胚尿囊膜新生血管形成的照片

具体实施方式

实施例1：靛玉红抑制人脐静脉内皮细胞及人微血管内皮细胞增殖

目的和原理：内皮细胞增殖实验采用MTS assay。MTS assay是一种运用比色法间接测量活细胞数量的测定方法。在活细胞中，线粒体中的NADPH脱氢酶将MTS四唑盐化合物转变成一种溶于细胞培养液的有色物质。活细胞数越多，就可以更多地转变四唑盐成为这种有色物质。所以测定该物质在490nm处的光吸收值可以间接反应活细胞的数量。通过该方法可评价药物对两种内皮细胞增殖能力的影响。

方法：96孔板中接入内皮细胞(人脐静脉内皮细胞(HUVEC)或人微血管内皮细胞(HMEC-1)，设置对照组和加样组，对照组不加靛玉红，加样组加入含有不同浓度靛玉红的培养基培养，每个浓度重复三个孔，作用48～72小时后，加入20μlCellTiter

Aqueous细胞增殖检测试剂，孵育3小时，用酶标仪在490nm处检测光吸收值。

结果与评价：与对照组相比，加入靛玉红的实验组，内皮细胞的增殖能力受到抑制，说明靛玉红可以抑制内皮细胞的增殖。

实施例2：靛玉红抑制人脐静脉内皮细胞体外划痕迁移实验

目的和原理：通过观察、记录、统计有或无药物作用下，划痕处新迁入的内皮细胞的数量，来评价药物对内皮细胞迁移能力的影响。

方法：6孔板中接入人脐静脉内皮(HUVEC)细胞，待细胞长至对数期，用微量移液器Tip头划十字线，用PBS洗净划下的细胞，加入含不同药物浓度及4ng/mlVEGF的培养基，于5％CO₂培养箱中37℃培养至划线两侧的细胞迁移至划线区域中央。

结果与评价：在OLYMPUS倒置显微镜下观察拍照统计，结果为：其中A为对照组；B为含靛玉红100nM组。与对照组相比，加入靛玉红后，人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的迁移受到抑制，说明靛玉红可以抑制人脐静脉内皮细胞的迁移。

实施例3：靛玉红抑制人脐静脉内皮细胞修饰的Boyden小室迁移实验

目的和原理：Boyben小室最初是Boyden发明的，用于研究白细胞的趋化性，这种研究基于小室被微孔分离成两个部分。细胞置于上面的部分，下面的部分含有趋化因子，在趋化因子的诱导下，上层可以穿过微孔膜迁移至膜的底部并贴附在膜的背面。人脐静脉内皮细胞Boyden小室迁移实验采用Millicell(Millipore)细胞培养小室。细胞在生长因子的诱导下可以透过孔径为8μm的多聚碳酸盐滤膜，此实验可以检测药物对内皮细胞穿过微孔膜能力的影响。

方法：用0.1％的明胶将小室包被，5％CO₂培养箱中37℃孵育20分钟，弃去明胶，用PBS洗三遍。小室外六孔板中加入600μl含有20％血清和10ng/ml的VEGF内皮细胞培养基。小室中接入20000个细胞，细胞在37℃5％CO₂培养箱中孵育四小时。

结果与评价：四小时后，将小室内外的细胞培养液吸去，用棉棒将上层细胞拭去，将小室浸泡在4％多聚甲醛中固定20分钟，用PBS洗三遍吸干，苏木精伊红染色，用PBS将背景多余染料洗去，室温晾干。OLYMPUS显微镜下拍照计数统计数据。结果为：其中A为对照组；B为含靛玉红100nM组。与对照组比，给予靛玉红后，人脐静脉内皮细胞穿过Boyden小室的能力受到抑制，说明靛玉红可以抑制内皮细胞穿过微孔膜的能力。

实施例4：靛玉红抑制人微血管内皮细胞成管实验

目的和原理：Matrigel是从小鼠肉瘤EHS(Engkebreth-Holm-Swarm)中抽提得到的可容性基底膜抽提物。富含细胞外基质蛋白，其主要成份是层粘连蛋白、胶原IV、硫酸肝素糖蛋白、TGF-β等。人脐静脉内皮细胞和人微管内皮细胞可以在Matrigel上贴附成管，可以利用人微血管内皮细胞在Mtrigel上的这种成管特性来研究药物对内皮细胞成管的影响。

方法：将Matrigel铺到24孔板上，37℃，5％CO₂，放置30min待其多聚化。每孔加入60000个细胞，加入含有不同浓度靛玉红的培养基，混匀。于37℃5％CO₂培养箱中培养16-18h，在显微镜下观察微管形成情况，每孔选择四个不同部位，计算微管形成数量进行统计学分析。

结果与评价：人微血管内皮细胞在Matrigel中生长16-18h后，细胞Matrigel中延伸生长，单个细胞卷成管装相互连接，形成三维网状结构。结果为：其中A：对照组；B：10μM。与对照组相比，给予靛玉红之后，内皮成管过程受到影响，三维网络结构受到破坏，说明靛玉红可以抑制人微血管内皮细胞微管形成。

实施例5：靛玉红抑制鸡胚尿囊膜血管新生

目的和原理：鸡胚尿囊膜模型目前来说，是一种较为理想的国内外筛选血管新生类药物公认的筛选模型。经含药物载体置于受精鸡胚尿囊膜表面的无血管区，可观察到药物对新的微血管生成的影响。

方法：将受精的鸡胚置于孵化箱中孵化5天，在超净工作台中，用70％酒精浸泡的棉球擦拭其表面，在卵壳钝端用镊子小心地开一个直径约0.5厘米的小口，观察胚胎所在位置，剥除外壳，撕开气室膜，露出尿囊膜。将含不同量的靛玉红加到直径为0.5平方毫米的灭菌滤纸上，将滤纸片加在尿囊膜上无血管区，用灭菌胶带封口，继续孵育。(A：对照组，不加靛玉红B：10μg/disc)

结果与评价：放入滤纸的鸡胚继续孵育两天后，揭去胶带，在OLYMPUS体视显微镜下拍照，计算滤纸周围2.5毫米环形范围内新生微血管数量，统计。结果为：与对照组比较，加靛玉红之后，新的微血管生成受到抑制，说明靛玉红可以抑制鸡胚尿囊膜新血管的生成。

Claims

1.靛玉红在制备抑制血管新生药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于抑制血管新生药物为抑制肿瘤血管新生的药物。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于抑制血管新生药物为抑制关节炎病变组织的血管新生的药物。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于关节炎是类风湿性关节炎或者炎性关节炎。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于抑制血管新生药物为抑制新生血管性眼病的药物。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于新生血管性眼病为新生血管性角膜疾病；或者新生血管性视网膜疾病；或者抑制血管新生性虹膜疾病；或者抑制新生血管性青光眼；或者新生血管性脉络膜疾病；或者新生血管性结膜眼病；或者新生血管性玻璃体眼病；或者新生血管性视神经疾病。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于视网膜病为糖尿病性视网膜病、视网膜静脉闭塞或者早熟性视网膜病。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于新生血管性脉络膜疾病为湿性老年黄斑病变。

9.根据权利要求1所述的应用，其特征在于抑制血管新生药物为抑制血管瘤病变组织血管新生的药物。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于血管瘤为多发性血管瘤或者血管母细胞瘤。

11.根据权利要求1所述的应用，其特征在于抑制血管新生药物为抑制银屑病病变组织血管新生的药物。

12.根据权利要求1所述的应用，其特征在于抑制血管新生药物为抑制实体瘤病变组织血管新生的药物。

13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于实体瘤为原发性或者继发性的实体瘤。

14.根据权利要求1所述的应用，其特征在于抑制血管新生药物为抑制Kaposi’s肉瘤病变组织血管新生的药物。

15.根据权利要求1所述的应用，其特征在于抑制血管新生药物为抑制白血病、淋巴瘤或者骨髓瘤血液癌症的药物。

16.根据权利要求1所述的应用，其特征在于抑制血管新生药物为抑制Paget’s疾病的药物。