CN101336909A - 紫铆因在制备抑制血管新生药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及紫铆因的新用途，具体涉及紫铆因在制备抑制血管新生药物中的应用。具体指的是紫铆因在制备抑制乳腺癌、结肠癌、淋巴瘤、急性骨髓性白血病、类风湿性关节炎、牛皮癣、糖尿病综合症、血管瘤等血管新生依赖性疾病中的相关应用。紫铆因在人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)增殖实验、HUVEC细胞迁移实验、HUVEC细胞侵袭实验、人微血管内皮细胞(HMEC－1)细胞成管实验、鸡胚尿囊膜血管新生等均有明显的抑制作用，可用于制备抑制血管新生的药物。

Description

紫铆因在制备抑制血管新生药物中的应用

技术领域

本发明涉及紫铆因的新用途，具体涉及紫铆因在制备抑制血管新生药物中的应用。

背景技术

血管新生，是在原有血管基础上产生新血管的过程。血管新生过程包括了5个步骤：1.血管新生刺激因子的产生；2.静息内皮细胞血管新生显型的变化，后者被激活；3.内皮细胞侵袭，基底膜降解；4.细胞外基质重塑，增殖和移动；5.内皮细胞聚集，形成新的微血管，血管周细胞的补充和新基质膜的获得。通常情况下，血管新生发生在胚胎和胚胎发育后期、生殖周期和伤口愈合期，受到各种相关因子的调控，处于动态平衡状态；如果该状态失衡(即血管新生过剩或不足)，可引起多种疾病。

已知有70多种疾病与血管新生有关，如肿瘤、糖尿病视网膜病变、心血管疾病、血管瘤、关节炎、银屑病和动脉硬化症等均与血管新生密切相关。

肿瘤一直对人类健康造成极大威胁，其生长和转移都依赖于血管新生。肿瘤生长包括血管前期与血管期，在血管前期，肿瘤一般长至2～3立方毫米，为了自身的生长，肿瘤分泌血管生长因子(如血管内皮细胞生长因子)，肿瘤生长进入血管期，获得更多的营养，以几何级数迅速生长；肿瘤还通过新生的血管排除其代谢产物，并转移到人体其他部位，形成肿瘤转移，最终导致人体死亡，因此抑制血管新生是抑制肿瘤生长与转移的有效途径，已经有多种血管新生抑制剂用于临床肿瘤治疗或处于临床试验阶段，血管新生疗法已经被全球科学界称为继放疗、化疗、手术治疗后的第四种肿瘤治疗方法。

相对传统的化疗放疗等治疗方式，抗血管新生疗法靶向于肿瘤的微血管而不是肿瘤本身，具有疗效明显、毒副作用小等诸多优点。它可以抑制内皮细胞增殖及其活性；直接抑制血管新生蛋白的产生，或者中和这些蛋白的作用；或是通过阻止血管新生蛋白与内皮细胞的作用而起效。抗血管新生药物的不断发展已成为治疗癌症和其他血管新生依赖性疾病的有效方法。

一些中草药单体被发现具有抗血管新生的作用。紫铆因(Butein)又称紫铆花素，是一种植物多酚类物质，为腰果树(Semecarpus anacardium)的茎皮，黄檀属(Dalbergia odorifera)的心皮，传统的中藏药本草锦鸡属(Caragana jubata)以及漆树(Rhus verniciflua)的茎的主要活性成分。以前的报道表明，紫铆因可以直接抑制肿瘤细胞增殖而具有抗肿瘤活性，还具有抑制糖尿病综合症、抗炎等作用，但是目前还没有报道显示紫铆因可以抑制新生，或通过抑制血管新生抑制肿瘤，也没有作为抑制血管新生药的报道。

发明内容

本发明的目的在于开发紫铆因作为一种新的血管生成抑制剂的药理用途。

本发明在于紫铆因在制备血管新生抑制药物中的应用，尤其是紫铆因在制备抑制乳腺癌、结肠癌、淋巴瘤、急性骨髓性白血病、类风湿性关节炎、牛皮癣、血管瘤等血管新生依赖性疾病中的相关应用。

本发明提供紫铆因在制备抑制肿瘤血管新生的药物中的应用，以及制备抑制关节炎病变组织的血管新生的药物中的应用，所述的关节炎是类风湿性关节炎和炎性关节炎。

本发明还提供紫铆因在制备抑制新生血管性眼病的药物中的应用。其中新生血管性眼病为新生血管性角膜疾病、新生血管性视网膜疾病、血管新生性虹膜疾病、新生血管性结膜眼病、生成血管型白内障、新生血管性玻璃体眼病、新生血管性视神经疾病、新生血管性青光眼或者新生血管性脉络膜疾病。而且其中新生血管性视网膜疾病为糖尿病性视网膜病变、视网膜静脉闭塞、早产儿视网膜病变或者视网膜动脉闭塞；新生血管性脉络膜疾病为湿性老年黄斑病变。

本发明还提供紫铆因在制备抑制血管瘤病变组织血管新生的药物中的应用；制备抑制银屑病病变组织血管新生的药物中的应用；制备抑制实体瘤病变组织血管新生的药物中的应用；制备抑制血管瘤的药物中的应用。其中，实体瘤为原发性或者继发性的实体瘤；血管瘤为多发性血管瘤或者血管母细胞瘤。

本发明还提供紫铆因在制备抑制Kaposi’s肉瘤病变组织血管新生的药物中的应用；制备抑制白血病、淋巴瘤或者骨髓瘤血液癌症的药物中的应用；以及制备抑制Paget’s疾病的药物中的应用，以及紫铆因在制备血管新生抑制剂组合物上的应用。

根据本发明可以将治疗有效量的紫铆因和药学上允许的任意一种辅料制成药物组合物，也可以添加其他与紫铆因没有拮抗作用的抗血管新生药物。其制剂可以是药学上的任意一种剂型，包括但不限于片剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂、口服液、注射剂、脂质体等。

为实施本发明的方法，紫铆因可通过口服、肠胃外、吸入式喷雾或通过植入式贮存器给药。“肠胃外”包括皮下、皮内、静脉内、肌肉内、关节内、动脉内、滑膜腔内、胸骨内、鞘内、病灶内及颅内注射或输入技术。

口服可用固体或液体状的剂量单位，如末剂、散剂、片剂、糖衣剂、胶囊剂、颗粒剂、悬浮剂、溶液剂、糖浆剂、滴剂、舌下含片等剂型进行给药。

末剂是将本发明化合物磨成适当的细度而制成。散剂是将本发明化合物磨成适当的细度，然后与同样细度的医药用载体(如载体、甘露糖醇之类可食性碳水化合物等)混合制成。根据需要，也可混入矫味剂、防腐剂、分散剂、着色剂、香料等物质。

胶囊剂是将如上所述制成粉末状的末剂和散剂或入片剂部分所述的颗粒化的物质填充到如明胶胶囊外壳中而制成。也可将润滑剂和助流剂等混合到粉末状物质中，然后在胶囊中进行填充操作。若添加助溶剂和崩解剂等，如聚乙二醇，碳酸钠，可改善胶囊摄取时的药效。

本发明公开了紫铆因在制备血管新生药物中的应用。实验表明，紫铆因在人脐带静脉内皮细胞(HUVEC)增殖实验、HUVEC细胞迁移实验、HUVEC细胞侵袭实验、人微血管内皮细胞(HMEC-1)细胞成管实验、鸡胚尿囊膜血管新生等均有明显的抑制作用，可用于制备抑制血管新生的药物。

附图说明

图1：紫铆因抑制HUVEC细胞的增殖

图2：紫铆因抑制HUVEC细胞的体外划痕迁移照片

其中：A.对照；B.10nM紫铆因

图3：紫铆因抑制HUVEC细胞的修饰的Boyden小室迁移照片

其中：A.对照；B.100nM紫铆因

图4：紫铆因抑制HMEC-1细胞的成管照片

其中：A.对照；B.10μM紫铆因

图5：紫铆因抑制鸡胚尿囊膜新生血管形成的照片

其中：A.对照；B.1μg/disc紫铆因

具体实施方式

实施例1：紫铆因抑制HUVEC细胞增殖

目的和原理：细胞增殖实验采用MTS assay。MTS assay是一种在活细胞中运用比色法确定细胞增殖数量的测定方法。NADPH脱氢酶将MTS四唑盐化合物转变成一种溶于组织培养液的一种有色物质，其颜色深浅与细胞株的活细胞数目在一定范围内高度相关。通过该模型可评价药物对细胞增殖能力的影响。

方法：将1×10⁵个/ml的HUVEC细胞悬液接种于96孔板中，分别加入含有不同浓度紫铆因的培养基作用48小时，然后每孔加入显色剂，孵育3小时，再用酶标仪在490nm处读出每个孔中的光吸收值。

结果与评价：与对照组相比，加入紫铆因后，内皮细胞的增殖能力受到抑制，说明紫铆因可以抑制内皮细胞的增殖。

实施例2：紫铆因抑制HUVEC细胞体外划痕迁移实验

目的和原理：细胞迁移实验又叫体外划痕实验。本实验通过在培养板中长满的单层内皮细胞上制造划痕，在显微镜下观察，并记录下划痕边缘细胞朝划痕部位迁移的情况，来评价药物对内皮细胞迁移能力的影响。

方法：将细胞接种于6孔板中。待细胞长至90％以上，用微量移液器的1ml的吸头在每孔中划一条线。用PBS将划掉的死细胞洗净，再加入VEGF₁₆₅以及含有不同药物浓度的培养基，于5％CO₂培养箱37℃培养约24小时左右，直至VEGF₁₆₅组长满。

结果与评价：在显微镜下观察并拍照，结果为：其中A为对照组；B为10nM紫铆因，与对照组相比，给予紫铆因后，内皮细胞的迁移受到抑制，说明紫铆因可以抑制内皮细胞的迁移运动。

实施例3：紫铆因抑制HUVEC细胞修饰的Boyden小室迁移实验

目的和原理：内皮细胞修饰的Boyden小室迁移实验采用Millicell(Millopore)小室。修饰的Boyden小室是一类可插入细胞培养板的培养皿，底层有孔径为8μm的多聚碳酸盐滤膜，在生长因子的诱导下细胞可以透过膜的一侧粘附于含有高浓度生长因子的另一侧。此实验可以检测药物对内皮细胞有阻力迁移能力的影响。

方法：向24孔板中加入明胶于37℃孵育30分钟，弃去明胶，用PBS洗三遍。小室外24孔板中加入含有血清和VEGF₁₆₅内皮细胞培养基。小室中接入细胞，之后再加入不同浓度的药物，于37℃5％CO₂培养箱中孵育四小时。

结果与评价：四小时后，将小室内外的细胞培养液吸去，下层细胞迁移的细胞用4％多聚甲醛固定20分钟，用PBS洗三遍，吸干，用苏木精伊红染色20分钟，用PBS将背景多余染料洗去，室温晾干。OLYMPUS显微镜下拍照计数统计数据。结果为：其中A为对照组；B为100nM紫铆因组；与对照组比，给予紫铆因后，内皮细胞迁移能力受到影响，说明紫铆因可以抑制内皮细胞有阻力的迁移的能力。

实施例4：

紫铆因抑制HMEC-1细胞成管实验

目的和原理：Matrigel(基质胶)是从EHS(Engelbreth-Holm-Swarm)小鼠肉瘤中抽提得到的可溶性的基底膜抽提物，富含细胞外基质蛋白，其主要成份是层粘连蛋白，还有胶原IV、内功素、硫酸肝素糖蛋白以及TGF-β、纤维母细胞生长因子、组织纤溶酶原激活物(tPA.)和其它的生长因子。在室温下，Matrigel可聚合成一种具有生物活性的基质材料，作用与哺乳动物细胞基底膜类似，对细胞的粘附和分化有作用。内皮细胞可以在Matrigel上融合形成微管，利用这种特性可以用来研究药物对血管形成的影响。

方法：将Matrigel铺到48孔板上，每孔100μl，于37℃，5％CO₂培养箱放置30min待其凝固。每孔加入HMEC-1，再加入含有不同浓度紫铆因的培养基，混匀。于37℃5％培养箱中培养16-18h后在显微镜下观察微管形成情况。每孔选择不同部位，计算微管形成数量并进行统计学分析。

结果与评价：内皮细胞在Matrigel中生长16-18h后，细胞由原来的多角形变成长梭形，在Matrigel中延伸生长，单个细胞卷成管状并相互连接，形成三维网状结构。结果为：其中A：对照组；B：10μM紫铆因；与对照组相比，给予紫铆因之后，内皮成管过程受到影响，三维网络结构受到破坏，说明紫铆因可以抑制内皮细胞微管形成。

实施例5：紫铆因抑制鸡胚尿囊膜血管新生

目的和原理：在鸡胚生长早期，其机体免疫系统尚未完全建立，处于对各种外来抗原免疫耐受阶段，对所加的测试药物不会产生排斥反应。将含药物的载体置于其表面，可观察到药物对鸡胚尿囊膜新生血管的影响。目前来说，是一种较为理想的研究血管生成的器官水平的活体模型。

方法：用1‰的新洁尔灭消毒种蛋外壳，将其置于恒温恒湿培养箱中孵育5天。在超净工作台中，用酒精棉擦拭其表面，在蛋壳钝端(气室端)用镊子轻敲并小心地开一个直径约1厘米的小口。通过开出的小孔观察胚胎所在的位置，在血管稀疏的地方用镊子撕开气室膜从而露出尿囊膜。之前准备好加入不同浓度紫铆因、经高压灭菌的直径为5毫米圆形滤纸片，将滤纸片加在尿囊膜上无血管或血管稀疏的区域，用灭菌的透明胶带封口。(A：对照组，不加紫铆因B：1μg/disc紫铆因)

结果与评价：放入滤纸片的鸡胚放入孵育箱中继续孵育两天，之后揭去透明胶带，剥壳将尿囊膜尽量暴露，在OLYMPUS体视显微镜下拍照。试验表明：与对照组比较，给予紫铆因之后，新的微血管生成受到抑制，说明紫铆因可以抑制鸡胚尿囊膜新血管的生成。

Claims (18)

1.紫铆因在制备抑制血管新生药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于抑制血管新生药物为抑制肿瘤血管新生的药物。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于抑制血管新生药物为抑制关节炎病变组织的血管新生的药物。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于关节炎是类风湿性关节炎和炎性关节炎。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于抑制血管新生药物为抑制新生血管性眼病的药物。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于新生血管性眼病为新生血管性角膜疾病、新生血管性视网膜疾病、血管新生性虹膜疾病、新生血管性结膜眼病、生成血管型白内障、新生血管性玻璃体眼病、新生血管性视神经疾病、新生血管性青光眼或者新生血管性脉络膜疾病。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于新生血管性视网膜疾病为糖尿病性视网膜病变、视网膜静脉闭塞、早产儿视网膜病变或者视网膜动脉闭塞。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于新生血管性脉络膜疾病为湿性老年黄斑病变。

9.根据权利要求求1所述的应用，其特征在于抑制血管新生药物为抑制血管瘤病变组织血管新生的药物。

10.根据权利要求1所述的应用，其特征在于抑制血管新生药物为抑制银屑病病变组织血管新生的药物。

11.根据权利要求1所述的应用，其特征在于抑制血管新生药物为抑制实体瘤病变组织血管新生的药物。

12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于实体瘤为原发性或者继发性的实体瘤。

13.根据权利要求1所述的应用，其特征在于抑制血管新生的药物为抑制血管瘤的药物。

14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于血管瘤为多发性血管瘤或者血管母细胞瘤。

15.根据权利要求1所述的应用，其特征在于抑制血管新生药物为抑制Kaposi’s肉瘤病变组织血管新生的药物。

16.根据权利要求1所述的应用，其特征在于抑制血管新生药物为抑制白血病、淋巴瘤或者骨髓瘤血液癌症的药物。

17.根据权利要求1所述的应用，其特征在于抑制血管新生药物为抑制Paget’s疾病的药物。

18.根据权利要求1-17所述的应用。其特征在于紫铆因在制备血管新生抑制剂组合物上的应用。

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