CN105669666A

CN105669666A - 小分子化合物yf-452及其在制备抗血管新生药物中的应用

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Publication number: CN105669666A
Application number: CN201610011401.6A
Authority: CN
Inventors: 易正芳; 刘永瑞; 贺源; 杨飞飞; 陈益华; 刘明耀
Original assignee: East China Normal University
Current assignee: East China Normal University
Priority date: 2016-01-08
Filing date: 2016-01-08
Publication date: 2016-06-15

Abstract

本发明公开了一种新的式(A)小分子化合物YF-452或水合物或药学上可接受的盐在制备抑制血管新生药物中的应用。本发明中小分子化合物YF-452或水合物或药学上可接受的盐具有抗血管生成作用，能够作为血管生成抑制剂应用于肿瘤、关节炎、皮肤及眼科疾病、动脉粥样硬化等新生血管依赖性和新生血管相关性疾病的治疗。本发明还提供含有有效量YF-452或水合物或药学上可接受的盐以及药学可接受成分的组合物在制备抑制血管新生药物中的应用。本发明巧妙的以血管新生作为治疗疾病的靶点，具有以下优点：1、血管内皮细胞基因表达相对稳定，故不易产生耐药性。2、血管内皮细胞组织排列于血管腔，直接暴露于血流中，药物在循环过程中直接发挥作用，故疗效高，副作用小。

Description

小分子化合物YF-452及其在制备抗血管新生药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种新的抗血管新生小分子化合物YF-452或水合物或药学上可接受的盐以及该化合物在制备治疗和预防血管新生相关疾病的药物中的应用。

背景技术

血管新生是指在已有血管的基础上再生出新的血管的过程。在胚胎发育过程中，血管新生是成年机体形成成熟血管必不可少的环节。正常生理状态下，成年机体除伤口愈合以及女性生理周期外，很少发生血管新生。然而，在病理条件下，血管新生在癌症、类风湿性关节炎、糖尿病视网膜病变、老年性黄斑病变、脑梗塞、动脉粥样硬化、牛皮鲜等几十种疾病中起着关键作用。

癌症作为人类疾病性死亡的主要因素之一，严重危害着人类的健康。研究表明，当肿瘤长到1-2立方毫米时，肿瘤不但可以通过临近组织的血管吸收氧气和营养物质，而且能够分泌生长因子刺激已有的血管，再生出新的血管嵌入肿瘤内部提供生长必需的营养物质和氧气，与此同时也为肿瘤的转移提供便利条件。因此，血管新生对肿瘤的生长和转移起着尤为关键的作用。肿瘤细胞受到传统靶向肿瘤细胞的化疗药物刺激，容易突变产生耐药性。与之相比，抗血管新生疗法显示出一定的优势：首先，其靶向于肿瘤内部的微血管内皮细胞而非肿瘤细胞本身，肿瘤血管内皮细胞相对比较稳定，不易突变，因而不易产生耐药性，且在抗肿瘤活性方面具有广谱性。其次，血管内皮细胞组织排列于血管腔，直接暴露于血流中，药物在血液循环过程中能直接发挥作用，故疗效高，副作用小。因此，抗血管新生疗法已成为治疗癌症和其他血管新生依赖性疾病的重要方法之一。

目前，已有多种抗血管新生药物如贝伐单抗、受体酪氨酸激酶抑制剂等经美国FDA批准上市用于治疗肿瘤。然而这些药物在临床治疗的过程中并没有显示出与预期相符的疗效，而且治疗过程中产生了一系列如皮肤毒性，蛋白尿，高血压、出血、甲状腺异常肿大等毒副反应。因此，本领域迫切需要开发新的安全有效的小分子化学实体，用于抑制血管新生，克服现有药物导致的毒副作用。

发明内容

本发明提出一种新的小分子化合物YF-452或水合物或药学上可接受的盐作为一种新的小分子化合物可以在低浓度显著抑制血管新生且毒性较低，将有助于满足抗血管新生肿瘤药物领域的医药市场需求。

本发明的目的之一是提供一种结构新颖并且能够抑制血管新生的四氢吲哚类小分子有机化合物，所述化合物YF-452的结构如式(A)所示，分子式C₂₄H₂₆BrN₃O，分子量452.39：

本发明还提供了式(A)化合物YF-452或水合物或药学上可接受的盐在制备抗血管新生药物中的应用。尤其是YF-452或水合物或药学上可接受的盐在制备治疗或预防癌症、糖尿病并发症、牛皮癣、血管瘤等血管新生性疾病药物中的相关应用。

其中，所述式(A)小分子化合物或水合物或药学上可接受的盐在制备通过抑制肿瘤血管新生来治疗或预防肿瘤的药物中的应用。

本发明还提供了所述式(A)小分子化合物或水合物或药学上可接受的盐在制备伤口愈合中抑制斑痕形成的药物中的应用。

本发明还提供了所述式(A)小分子或水合物或药学上可接受的盐在制备治疗或预防糖尿病视网膜病、早熟视网膜病及视网膜静脉闭塞药物中的应用。

本发明还提供了所述式(A)小分子或水合物或药学上可接受的盐在制备抑制银屑病病变组织血管新生药物中的应用。

本发明还提供了所述式(A)小分子化合物或水合物或药学上可接受的盐在制备治疗或预防血管瘤、良性血管增生疾病血管新生药物中的应用。

本发明还提供了所述式(A)小分子化合物或水合物或药学上可接受的盐在制备治疗或预防Kaposi’s肉瘤病变组织血管新生药物中的应用。

本发明还提供了所述式(A)小分子化合物或水合物或药学上可接受的盐在制备治疗或预防风湿性关节炎病变组织血管新生药物中的应用。

本发明还提供了所述式(A)小分子化合物或水合物或药学上可接受的盐在制备治疗或预防动脉粥样硬化病变处血管新生药物中的应用。

本发明还提供了所述小分子化合物YF-452或水合物或药学上可接受的盐抑制肿瘤微血管生成并促使肿瘤组织细胞凋亡和坏死中的应用。

本发明还提供了含有有效量的式(A)小分子化合物YF-452或水合物或药学上可接受的盐在制备抑制血管新生药物中的应用。

如式(A)所示的小分子化合物YF-452或水合物或药学上可接受的盐YF-452在抑制HUVEC细胞迁移和成管中的应用。

如式(A)所示的小分子化合物YF-452或水合物或药学上可接受的盐YF-452在抑制大鼠动脉环、鸡胚尿囊膜和小鼠角膜微囊袋新生血管形成中的应用。

如式(A)所示的小分子化合物YF-452或水合物或药学上可接受的盐YF-452在抑制PC-3细胞肿瘤生长中的应用。

本发明还提供了式(A)化合物YF-452或水合物或药学上可接受的盐可以制备抑制血管新生药物，用来治疗类风湿性关节炎、炎性关节炎、新生血管性角膜疾病、新生血管性脉络膜疾病、新生血管性视神经疾病、糖尿病性视网膜病变、视网膜静脉闭塞、早产儿视网膜病变、视网膜动脉闭塞、老年黄斑性病变等。

本发明还提供了含有有效量的式(A)化合物YF-452或水合物或药学上可接受的盐以及药物可接受成分的组合物在制备抑制血管新生药物中的应用。

其中，所述药物可单独使用或与其他药物联合使用。

本发明还提出了式(A)小分子化合物YF-452或水合物或药学上可接受的盐应用于抑制人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖、迁移、血管新生的方法。所述方法包括MTS实验检测HUVEC细胞增殖能力，细胞划痕实验检测HUVEC细胞横向迁移能力，Transwell实验检测HUVEC细胞纵向迁移与浸润的能力，细胞成管实验检测HUVEC管状网络形成能力，大鼠胸主动脉环实验、鸡胚尿囊膜实验和小鼠角膜微囊袋实验分别模拟离体和体内状态下血管新生能力，裸鼠体内皮下荷瘤动物模型检测体内肿瘤血管新生能力。

根据本发明可以将治疗有效量的式(A)化合物YF-452或水合物或药学上可接受的盐和药学上允许的任意一种辅料制成药物组合物，也可以添加其他与式(A)化合物YF-452或水合物或药学上可接受的盐没有拮抗作用的抗血管新生药物。其制剂可以是药学上的任意一种剂型，包括但不限于片剂、颗粒剂、胶囊剂、丸剂、口服液、注射液、脂质体等。

式(A)化合物YF-452或水合物或药学上可接受的盐可通过口服、肠胃外、吸入式喷雾或通过植入式贮存器给药。“肠胃外”包括皮下、皮内、静脉内、肌肉内、关节内、动脉内、滑膜腔内、胸骨内、鞘内、病灶内或输入技术。

口服可用固体或液体状的剂量单位，如末剂、散剂、片剂、糖衣剂、胶囊剂、颗粒剂、悬浮剂、溶液剂、糖浆剂、滴剂、舌下含片等剂型进行给药。

末剂是将本发明化合物或水合物或药学上可接受的盐磨成适当额细度而制成。散剂是将本发明化合物磨成适当的细度，然后与同样细度的药用载体(如载体、甘露糖醇之类可食性碳水化合物等)混合制成。根据需要，也可混入矫味剂、防腐剂、分散剂、着色剂、香料等物质。

胶囊剂是将如上所述制成粉末状的末剂或片剂部分所述的颗粒化的物质填充到明胶胶囊外壳中而制成。也可以将润滑剂和助流剂等混合到粉末状物质中，然后在胶囊中进行填充操作。若添加助溶剂和崩解剂等，如聚乙二醇，碳酸钠，可改善胶囊摄取时的药效。

本发明的另一目的是提供式(A)四氢咔碄类小分子有机化合物YF-452的制备方法。

本发明化合物通过下列步骤实施：

由化合物I和甲醛进行扣环合成化合物II，化合物II在四氢呋喃中，与氯乙酰氯反应得化合物III，化合物III在二甲基甲酰胺中与吡咯烷偶联生成化合物IV，最后化合物IV和对溴苄溴反应生成目标化合物YF-452。反应完毕后用冰水淬灭，用乙醚、乙酸乙酯、二氯甲烷、三氯甲烷等萃取，依次用水、饱和食盐水洗涤，干燥，低温减压除去溶剂，经柱层析得最终产物，得到的产物用核磁共振、质谱等方法来证明。

本发明公开了一种新的式(A)小分子化合物YF-452或水合物或药学上可接受的盐在制备抑制血管新生药物中的应用。本发明中小分子化合物YF-452或水合物或药学上可接受的盐具有抗血管生成作用，能够作为血管生成抑制剂应用于肿瘤、关节炎、皮肤及眼科疾病、动脉粥样硬化等新生血管依赖性和新生血管相关性疾病的治疗。本发明还提供含有有效量YF-452或水合物或药学上可接受的盐以及药学可接受成分的组合物在制备抑制血管新生药物中的应用。本发明巧妙的以血管新生作为治疗疾病的靶点，具有以下优点：血管内皮细胞基因表达相对稳定，故不易产生耐药性。血管内皮细胞组织排列于血管腔，直接暴露于血流中，药物在循环过程中直接发挥作用，故疗效高，副作用小。

附图说明

图1为化合物YF-452的制备流程。

图2为化合物YF-452在无毒剂量抑制HUVEC细胞迁移和成管。

图3为化合物YF-452抑制大鼠动脉环、鸡胚尿囊膜和小鼠角膜微囊袋模型新生血管形成。

图4为化合物YF-452在无毒剂量抑制裸鼠PC-3细胞肿瘤生长。

图5为化合物YF-452抑制肿瘤微血管生成并促使肿瘤组织细胞凋亡和坏死。

以上各图中均以p<0.05表示有显著差异；其中，*表示p<0.05；**表示p<0.01；***表示p<0.001。

具体实施方式

结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。

实施例1：YF-452的制备

YF-452的制备所用实验仪器如下：

¹H-NMR用VarianMercuryAMX300型仪器测定；MS用VGZAB-HS或VG-7070型仪测定，除注明外均为EI源(70ev)；所使用的无水溶剂均是按标准方法干燥处理；除说明外，所有反应均是在氩气保护下进行反应，并用TLC跟踪，后处理时均经饱和食盐水洗和无水硫酸钠干燥；产品的纯化过程除说明外均使用硅胶(200-300目)的柱色谱法；所使用的硅胶，包括200-300目和GF254为青岛海洋化工厂或烟台缘博硅胶公司生产。

YF-452的制备流程如下：

取色胺I(5.0克,31.2毫摩尔)于醋酸(25毫升)中，加入甲醛溶液(2.5毫升，32.7毫摩尔)，在常温下反应3小时。产物析出，抽滤，得中间体II(5.2克，96.8％)。

取中间体II(2.0克,11.6毫摩尔)于四氢呋喃(20毫升)中，在0℃加入氯乙酰氯(1.2毫升，15.1毫摩尔)和三乙胺(4.9毫升，34.8毫摩尔)，减压除去大部分溶剂，常规处理后过硅胶柱，得中间体III(1.6克，56.7％)。

取吡咯烷(0.83毫升,9.9毫摩尔)溶于二甲基甲酰胺中，在0℃滴加三乙胺(2.76毫升,19.8毫摩尔)，将中间体III(1.6克,6.6毫摩尔)加入反应体系，常温反应3小时,水灭活EA萃取，常规后处理后过硅胶柱，中间体IV(1.4克，74.9％)；其中，三乙胺是促进反应进行的一种碱。

取中间体IV(1.4克，5.0毫摩尔)溶于二甲基甲酰胺(7毫升)中，在0℃加入氢化钠(400毫克，10毫摩尔，将对溴苄溴(1.5克，6.0毫摩尔)加入反应体系，常温反应3小时,水灭活EA萃取，常规后处理后过硅胶柱，得目标化合物YF-452(1.1g，46.1％)。¹HNMR(DMSO,300MHz):7.53-7.51(m,1H),7.38(d,J＝8.4Hz,2H),7.21(dd,J＝8.4,8.4Hz,1H),7.16-7.13(m,2H),6.88(d,J＝8.4Hz,2H),5.21(s,2H),4.68(s,2H),3.88(t,J＝6.6Hz,2H),3.23(s,2H),2.88(t,J＝6.6Hz,2H),2.62-2.57(m,4H),1.84-1.79(m,4H).

实施例2：YF-452在无毒剂量抑制HUVEC细胞迁移和成管

技术方法

1、HUVEC细胞划线迁移实验

目的和原理：通过在培养板中达到一定密度的单层内皮细胞上制造划痕，HUVEC细胞可以向没有细胞的划痕区迁移。通过在显微镜下观察迁入划痕区的内皮细胞数量，来评价YF-452是否具有抑制HUVEC细胞迁移的能力。

方法：在6孔板中加入HUVEC细胞，待细胞密度长至80％时，用微量移液器200微升枪头在每孔中划一条划痕。用PBS洗净划下的漂浮细胞，再分别向培养孔中加入含有不同浓度YF-452的培养基，对照组加入等量的DMSO，于培养箱37℃培养约12小时左右，直至对照组划痕区长满细胞。

2、HUVEC细胞Transwell小室迁移实验

目的和原理：Transwell小室被含有微孔的多聚碳酸盐滤膜分离成上下两个部分。细胞置于上层，下层含有趋化因子，在趋化因子的诱导下，上层细胞可以穿过膜的微孔迁移至膜的底部并贴附于膜的背面。此实验可以检测药物对内皮细胞迁移能力的影响。

方法：小室中加入明胶放入37℃培养箱包被半小时，弃去明胶，PBS清洗三遍。将小室置于24孔板中，小室内接入适量细胞，加入含有不同浓度YF-452的无血清培养基，对照组加入等量的DMSO，小室外24孔板内加入含有血清和不同浓度YF-452的内皮细胞培养基，37℃培养箱中孵育4-8小时后，弃去培养基，用多聚甲醛固定，PBS洗三遍，2‰结晶紫染液将细胞染色5分钟，PBS洗去未结合的结晶紫染液，用棉签轻轻擦拭小室的上侧，将未迁移到下侧的细胞擦掉。自然干燥，显微镜下拍照，统计多个视野的细胞数目。

3、HUVEC细胞成管实验

目的和原理：Matrigel是从EHS小鼠肉瘤中抽提得到的可溶性基底膜抽提物，富含细胞外基质蛋白。HUVEC细胞具有在Matrigel上形成管状网络结构的能力，可以用来研究药物对血管生成的影响。

方法：将Matrigel加入96孔板中，培养箱孵育待其凝固。HUVEC细胞以10000/孔细胞密度加入96孔板，同时加入相同体积含不同浓度YF-452的培养基，对照组加入等量的DMSO。在培养箱中孵育8-12个小时后在显微镜下观察微管形成情况并拍照。

4、HUVEC细胞凋亡实验

目的和原理：在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸由脂膜内侧翻向外侧。AnnexinV与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此AnnexinV被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。碘化丙啶(PI)是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但是PI能够透过凋亡中晚期的细胞和死细胞的细胞膜而使细胞核染红。因此将AnnexinV与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。此实验可以用来评价化合物对HUVEC细胞血管生成的影响是否源自对细胞本身的毒性作用。

方法：将HUVEC细胞以合适密度接种于6孔板，经过24小时培养后，加入不同浓度的YF-452处理12小时后，收集的细胞经PBS洗涤，每管加入100微升1×的结合缓冲液，不染组不加PI以及AnnexinV，单染PI组加入5微升PI，单染AnnexinV组加入5微升AnnexinV，Annexin-V-PI双染组均加入PI和AnnexinV各5微升，混匀。室温避光孵育15分钟，将细胞转移到流式管中，上机检测。

5、HUVEC细胞增殖实验

目的和原理：内皮细胞增殖实验采用MTS实验。MTS实验是一种运用比色法间接测定活细胞数量的方法。MTS是一种新合成的四唑类化合物，通过被活细胞内线粒体内的琥珀酸脱氢酶还原成橙黄色的甲瓒，在490纳米处测量还原产物的吸光值与活细胞的数量呈正比，从而反映细胞活力情况。此实验可以用来评价化合物在不同时间段对HUVEC细胞增殖的影响，从而判断化合物对HUVEC细胞血管生成的影响是否源自对细胞增殖的抑制作用。

方法：96孔板中以4000-5000个/孔加入HUVEC细胞，设置对照组和加样组，对照组加溶剂DMSO，加样组加入含有不同浓度YF-452，孵育48-72小时后，加入20微升MTS孵育1-3小时，用酶标仪检测490纳米处的吸光值。

实施结果

小分子化合物YF-452结构式(图2A)。细胞划线迁移实验结果表明YF-452在6-12小时短时间内就能以剂量和时间依赖性地抑制HUVEC细胞的横向迁移(图2B)。内皮细胞侵袭突破基底膜在血管新生过程中起着关键的作用。Transwell小室迁移实验表明YF-452在12小时就能以剂量依赖性地抑制HUVEC细胞的纵向侵袭(图2C)。内皮细胞在Matrigel上会发生融合紧密排列形成管状网络结构。HUVEC细胞成管实验中，用不同浓度YF-452处理后，细胞球形孤立，管状网络结构变得松散、缺失，说明YF-452能够剂量依赖性地抑制HUVEC细胞管状网络的形成(图2D)。同时，YF-452在发挥抑制细胞迁移和成管功能的时间(12小时内)，并不引起细胞凋亡(图2E)。细胞增殖实验中，YF-452只有在长时间(24-48小时)处理HUVEC时，才会抑制细胞增殖(图2F)。图2E和图2F说明，YF-452对HUVEC细胞迁移、血管生成的抑制作用并不是来源于YF-452对HUVEC的细胞毒性。

实施例3：YF-452抑制大鼠动脉环、鸡胚尿囊膜和小鼠角膜微囊袋模型新生血管形成

1、大鼠动脉环血管新生实验

目的与原理：Matrigel中富含细胞外基质蛋白和生长因子，将大鼠胸主动脉取出切成环状，包被在Matigel中呈夹心状，动脉环外缘的内皮细胞可在生长因子的刺激下，降解基质层，同时向外迁移、侵袭，最后在动脉环周围形成放射状的毛细血管网。大鼠动脉环模型可以用来评价在离体状态下药物对微血管萌发的影响。

方法：将Matrigel加入48孔板中，培养箱孵育待其凝固。取出大鼠胸主动脉，用无血清培养基将血管中的血液冲洗干净并剔除血管周围结缔组织，将胸主动脉切成1-1.5毫米长的动脉环，放入预先铺有Matrigel的48孔板中，在动脉环上再覆盖一层Matrigel形成夹心状。待上层Matrigel凝固后，向每孔加入相同体积含不同浓度YF-452的培养基，对照组加入等量的DMSO，每两天更换一次培养基。于培养箱中培养5-7天后在显微镜下观察动脉环微管萌发情况，并统计萌发出的微血管面积。

2、鸡胚尿囊膜血管新生实验

目的和原理：抗血管生成药物会抑制鸡胚血管的自然生长。在鸡胚绒毛尿囊膜的血管生成早期，机体免疫系统尚未完全建立，因此对各种异物几乎不发生排斥反应。因此，可以将含有药物载体置于鸡胚绒毛尿囊膜表面，观察各种抑制剂对血管生成的影响。由于其对抗血管生成药物敏感，目前被认为是一种理想的药物筛选模型。

方法：蛋壳表面消毒后置于培养箱中孵化5天，在超净工作台中，在蛋壳钝端(气室端)开口，在两根大血管中间血管稀疏的地方撕开气室膜暴露出尿囊膜，放入含有不同浓度YF-452的直径5毫米的圆形滤纸片，用灭菌的透明胶带封口，继续孵育48小时，剥开蛋壳暴露出尿囊膜，在显微镜下观察拍照，并用IPP软件对新生血管面积进行统计。

3、小鼠角膜微囊袋新生血管的形成

目的和原理：在生理状态下小鼠的角膜没有血管生成，在倒置显微镜下用针头在角膜上制作微囊袋，植入含有血管内皮细胞生长因子(VEGF)的缓释颗粒，可以诱导角巩缘处的血管向缓释颗粒处生长，在缓释颗粒上加入YF-452，可以利用这一模型评价YF-452对小鼠角膜新生血管形成的抑制作用。这个模型被称为“血管新生研究模型的金标准”。

方法：将C57/BL6小鼠麻醉后固定，在显微镜下用1毫升注射器针头在角膜上制作微囊袋，植入缓释颗粒，对照组含VEGF和溶剂，实验组含VEGF和不同浓度的YF-452。颗粒放好后，在小鼠眼球上涂金霉素眼膏防止感染。实验结束后待小鼠复苏，继续饲养一周，显微镜下观察并拍照。

实施结果

大鼠胸主动脉环微血管萌发实验表明离体状态下YF-452对微血管形成的影响。环状结构为离体的大鼠动脉环，箭头指示结构为动脉环周围萌发出分支状的微血管。对照组动脉环周围形成密集放射状的毛细血管网,而用YF-452处理后，动脉环周围只有很少的微血管形成,YF-452剂量越高新生毛细管网的萌发越少(图3A)。鸡胚尿囊膜血管新生实验中，图中的箭头指示的即为新生的微血管，位于中央的圆形物质即为载有小分子化合YF-452的滤纸片。从图中可以看出，对照组的有大量的新血管分支，而实验组新生血管分支明显减少，表明YF-452可以抑制鸡胚尿囊膜新生血管的生成(图3B)。生理情况下，小鼠角膜是个无血管区，如图中所示，大箭头为缓释颗粒的位置，小箭头所指为由角巩缘处诱导产生的新血管。对照组中，VEGF诱导形成了大量新生血管，而YF-452处理组中的血管新生受到显著抑制(图3C)。小鼠角膜新生血管的统计指标分别为钟点数、新生血管的长度、新生血管的面积。这三个血管新生模拟实验均说明YF-452能够显著抑制血管新生。

实施例4：YF-452在无毒剂量抑制裸鼠PC-3细胞肿瘤生长

1、裸鼠皮下荷瘤实验

目的与原理：在裸鼠皮下注射肿瘤细胞，肿瘤细胞吸收小鼠体内的营养物质，迅速增殖形成肿瘤，对小鼠给药处理，可以观察药物对肿瘤的作用效果。

方法：将1×10⁶个人前列腺癌细胞PC-3M皮下注射到免疫缺陷小鼠(BALB/c-nude，裸鼠)背部皮下，待皮下肿瘤长到100立方毫米左右时，随机分为三组，低剂量组每天腹腔注射20毫克/千克溶于DMSO的YF-452，高剂量组每天腹腔注射40毫克/千克溶于DMSO的YF-452，，对照组每天腹腔注射等体积的DMSO，每四天测量肿瘤体积和小鼠体重，连续给药一个月后处死小鼠并剥离皮下肿瘤，称重并拍照。

2、裸鼠体内毒性检测实验

方法：将小鼠的心，肝，脾，肺，肾取材，通过HE染色进行固定、脱水、包埋、切片，用苏木精伊红染色，在倒置显微镜下观察并拍照，检测化合物YF-452对内脏组织的影响。

实施结果

动物实验显示YF-452能够显著抑制实体肿瘤生长，剂量依赖性抑制肿瘤重量(图4A)和肿瘤体积(图4B)，YF-452给药期间对小鼠的体重并没有产生明显影响(图4C)。此外，检测肝、脾、肺、肾的组织切片病理变化，并未观察到YF-452实验组和对照有明显的差异(图4D)。说明YF-452在抑制肿瘤生长的同时显示出较低的毒性。

实例5：YF-452抑制肿瘤微血管生成并促使肿瘤组织细胞凋亡和坏死

1、肿瘤微血管新生检测实验

目的与原理:血小板-内皮细胞粘附分子CD31作为血管内皮细胞标记物，可以用来检测组织中的微血管分布情况。

方法：将剥离的肿瘤进行4％多聚甲醛固定，样品经过脱水、包埋、切片，用带有荧光二抗的CD31抗体免疫荧光染色，在荧光显微镜下拍照并用软件进行统计。

2、细胞凋亡免疫组化和肿瘤组织结构HE染色实验

目的与原理:Caspase与真核细胞凋亡密切相关，并参与细胞的生长、分化与凋亡调节。Cleavedcaspase-3作为细胞凋亡过程中最主要的标志物，也是细胞毒性T淋巴细胞杀伤机制的重要组成部分。通过检测肿瘤组织中的cleavedcaspase-3含量可以反映YF-452对肿瘤中细胞凋亡的影响。通过苏木精伊红(HE)染色可以检测YF-452抑制血管新生后对肿瘤组织结构的影响。

方法：将剥离的肿瘤进行4％多聚甲醛固定，样品经过脱水、包埋、切片，或通过cleavedcaspase-3免疫组化染色，或用苏木精伊红染色，在显微镜下观察拍照并用软件进行统计。

实施结果

观察剥离肿瘤块，如图中箭头指示，YF-452实验组裸鼠背部肿瘤组织血管与对照组相比明显减少(图5A)。用血管内皮细胞标记物CD31对肿瘤组织进行免疫荧光，如图中箭头指示，YF-452处理后肿瘤组织中血管新生明显减少(图5B)。在肿瘤组织HE染色中YF-452实验组肿瘤组织结构变得松散，内部有大量的坏死区域(图中*标记的区域)，并且有大量粒细胞的浸润(图5C)。用cleavedcaspase-3免疫组化染色分析YF-452对PC-3异种移植肿瘤中细胞凋亡情况进行了检测，如果图中箭头指示，YF-452实验组肿瘤组织中凋亡细胞比例明显升高(图5D)。上述这些结果表明，YF-452通过抑制肿瘤内通过抑制肿瘤内血管新生，使肿瘤组织发生细胞凋亡和坏死，进而抑制PC-3肿瘤生长。

Claims

1.一种新的小分子化合物YF-452，其结构如式(A)所示：

2.如式(A)所示的小分子化合物YF-452或水合物或药学上可接受的盐在制备抗血管新生药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述小分子化合物或水合物或药学上可接受的盐在制备通过抑制肿瘤血管新生来治疗或预防肿瘤的药物中的应用。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述小分子化合物或水合物或药学上可接受的盐在制备伤口愈合中抑制斑痕形成的药物中的应用。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述小分子化合物或水合物或药学上可接受的盐在制备治疗或预防糖尿病视网膜病、早熟视网膜病及视网膜静脉闭塞药物中的应用。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述小分子化合物或水合物或药学上可接受的盐在制备抑制银屑病病变组织血管新生药物中的应用。

7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述小分子化合物或水合物或药学上可接受的盐在制备治疗或预防血管瘤、良性血管增生疾病血管新生药物中的应用。

8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述小分子化合物或水合物或药学上可接受的盐在制备治疗或预防Kaposi^,s肉瘤病变组织血管新生药物中的应用。

9.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述小分子化合物或水合物或药学上可接受的盐在制备治疗或预防风湿性关节炎病变组织血管新生药物中的应用。

10.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述小分子化合物或水合物或药学上可接受的盐在制备治疗或预防动脉粥样硬化病变处血管新生药物中的应用。

11.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述小分子化合物YF-452或水合物或药学上可接受的盐抑制肿瘤微血管生成并促使肿瘤组织细胞凋亡和坏死中的应用。

12.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，含有有效量的式(A)小分子化合物YF-452或水合物或药学上可接受的盐在制备抑制血管新生药物中的应用。

13.如式(A)所示的小分子化合物YF-452或水合物或药学上可接受的盐YF-452在抑制HUVEC细胞迁移和成管中的应用。

14.如式(A)所示的小分子化合物YF-452或水合物或药学上可接受的盐YF-452在抑制大鼠动脉环、鸡胚尿囊膜和小鼠角膜微囊袋新生血管形成中的应用。

15.如式(A)所示的小分子化合物YF-452或水合物或药学上可接受的盐YF-452在抑制PC-3细胞肿瘤生长中的应用。

16.根据权利要求2-15中任一项所述的应用，其特征在于，所述药物单独使用或与其他药物联合使用。