JP6266666B2

JP6266666B2 - 医薬組成物および血管新生に関係する眼疾患の治療方法

Info

Publication number: JP6266666B2
Application number: JP2016020388A
Authority: JP
Inventors: 一紅潘; 心然姚; 美薇林; 亦晃呂; 信頡呉; 湘文曾; 景懷柯; 俊中王; 宗鏗郭; 士弘林; 奕正鄭; 天送童
Original assignee: Industrial Technology Research Institute ITRI
Current assignee: Industrial Technology Research Institute ITRI
Priority date: 2012-12-19
Filing date: 2016-02-05
Publication date: 2018-01-24
Anticipated expiration: 2033-12-12
Also published as: TWI465241B; TW201424739A; JP2016094469A; CN103877129B; CN103877129A; US9682062B2; US20160008319A1; US20140170250A1; JP2014122216A; JP6185830B2

Description

本願は、２０１２年１２月１９日に出願された台湾特許出願第１０１１４８２３０に基づく優先権の利益を主張するものであり、その全内容は参考のため本願に援用される。

本発明は、医薬組成物と、血管新生に関係する眼疾患の治療方法に関するものである。

血管新生とは、既存の血管の近くに新たな血管が形成されるプロセスを意味する。通常の生理学的メカニズムの下では、創傷治癒や女性の月経周期など血管新生のためのシグナル変換刺激に対する応答のプロセスにおいて、制御された血管新生が起こり、おおよそ１〜２週間継続する。しかし、病的な血管新生は、通常の生理学的メカニズムにより制御されるものではない。血管新生の制御は、人体において非常に重要な恒常性の役割を担う。強力な血管新生作用の下では、糖尿病性網膜症や関節リウマチが引き起こされたり、腫瘍の悪化や転移が促進されるおそれがある。また、血管新生が過剰に抑制された場合には、出血、溢血、循環器疾患などに関係した疾患が引き起こされたり、凝固作用不全により患者の創傷治癒に影響が出ることもある。

現在、約１９種の血管新生阻害剤が臨床的に使われており、これら薬剤は、様々な固形がん、老人性黄斑変性、脈絡膜新生血管、糖尿病性黄斑浮腫などに適用されている。血管新生は様々な疾患に関係するので、新たな血管新生阻害剤の開発は、現在においてもまた将来においても、非常に重要な研究動向や開発分野であるといえる。

本発明は、有効成分としてユニペルスキネンシス（Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）の抽出物を有効量含むことを特徴とする、血管新生に関係する眼疾患の治療用医薬組成物を提供する。

また、本発明は、血管新生に関係する眼疾患を治療するために、有効成分としてユニペルスキネンシス（Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）の抽出物を有効量投与することを含むことを特徴とする、血管新生に関係する眼疾患の治療方法を提供する。

さらに、本発明は、有効成分として式（Ｉ）で示されるリグナンを有効量含むことを特徴とする、血管新生に関係する眼疾患を治療するための医薬組成物を提供する。

［式中、Ｒ₁は−Ｈまたは−ＯＣＨ₃を示し、Ｒ₂は−Ｈまたは−ＯＨを示し、Ｒ₃は−Ｈ、−ＯＨまたはβ−Ｏ−グルコシドを示し、Ｒ₄は−Ｈまたは−ＯＣＨ₃を示す］

また、本発明は、血管新生に関係する眼疾患を治療するために、有効成分として式（Ｉ）で示されるリグナンを有効量投与することを特徴とする、血管新生に関係する眼疾患の治療方法を提供する。

添付図面を参照しつつ、以下に示す態様により本発明を詳細に説明する。

本発明は、添付図面を参照しつつ、以下の詳細な説明や実施例を読むことによって、より十分に理解され得る。
図１は、本発明の一実施態様によって、分割抽出物であるＣＢＴ−１４３−Ｓ−Ｆ６Ｆ７を製造するためのプロセスを示す。図２は、本発明の一実施態様によって、カラムクロマトグラフィおよび活性確認分析により分割抽出物であるＣＢＴ−１４３−Ｓ−Ｆ６Ｆ７の有効成分を単離精製するためのプロセスを示す。図３Ａは、本発明の一実施態様である化合物ＪＣ−５の¹ＨＮＭＲスペクトルである。図３Ｂは、本発明の一実施態様である化合物ＪＣ−５の¹³ＣＮＭＲスペクトルである。図４は、本発明の一実施態様であるヤテインの構造を示す。図５は、本発明の一実施態様として、ＪＣ−５、即ちヤテインの網目構造形成に対する阻害活性試験の結果を示す。図６Ａは、本発明の一実施態様である粗抽出物ＣＢＴ−１４３−Ｓの高速液体クロマトグラフィーフィンガープリントを示す。図６Ｂは、本発明の一実施態様である分割抽出物ＣＢＴ−１４３−Ｓ−Ｆ６Ｆ７の高速液体クロマトグラフィーフィンガープリントを示す。図６Ｃは、本発明の一実施態様であるヤテインの標準品の高速液体クロマトグラフィーフィンガープリントを示す。図７は、本発明の一実施態様として、粗抽出物であるＣＢＴ−１４３−ＳによるＨＵＶＥＣの網目構造形成に対する阻害状態を示す。図８は、本発明の一実施態様として、分割抽出物であるＣＢＴ−１４３−Ｓ−Ｆ６Ｆ７によるＨＵＶＥＣの網目構造形成に対する阻害状態を示す。図９は、本発明の一実施態様として、粗抽出物であるＣＢＴ−１４３−Ｓの濃度と、ＨＵＶＥＣの管形成との関係を示す。図１０は、本発明の一実施態様として、分割抽出物であるＣＢＴ−１４３−Ｓ−Ｆ６Ｆ７の濃度と、ＨＵＶＥＣの管形成との関係を示す。図１１は、本発明の一実施態様として、分割抽出物であるＣＢＴ−１４３−Ｓ−Ｆ６Ｆ７の、ＨＵＶＥＣの移動性に対する効果を示す。図１２は、本発明の一実施態様として、粗抽出物であるＣＢＴ−１４３−Ｓと分割抽出物であるＣＢＴ−１４３−Ｓ−Ｆ６Ｆ７の、ＳＫ−Ｈｅｐ−１細胞の移動性に対する効果を示す。図１３は、本発明の一実施態様として、粗抽出物であるＣＢＴ−１４３−Ｓと分割抽出物であるＣＢＴ−１４３−Ｓ−Ｆ６Ｆ７の、増殖因子により誘導されたｉｎｖｉｖｏ血管新生に対する効果を示し、データは平均±標準偏差で表し、＊は増殖因子処置群に対してｐ＜０．０５で有意差があることを示す。図１４は、本発明の一実施態様として、粗抽出物であるＣＢＴ−１４３−Ｓと分割抽出物であるＣＢＴ−１４３−Ｓ−Ｆ６Ｆ７の、コンディショナルメディウムにより誘導されたｉｎｖｉｖｏ血管新生に対する効果を示し、データは平均±標準偏差で表し、＊はコンディショナルメディウム処置群に対してｐ＜０．０５で有意差があることを示す。図１５は、本発明の一実施態様として、分割抽出物であるＣＢＴ−１４３−Ｓ−Ｆ６Ｆ７と粗抽出物であるＣＢＴ−１４３−Ｓの、生体における血管新生に対する効果を示し（１．２５倍）、図１５における１３０１との数字は、被検物質を含む濾紙を示す。図１６は、本発明の一実施態様として、分割抽出物であるＣＢＴ−１４３−Ｓ−Ｆ６Ｆ７と粗抽出物であるＣＢＴ−１４３−Ｓの、生体における血管新生に対する効果を示し（４倍および８倍）、図１６における１４０１との数字は、被検物質を含む濾紙を示す。図１７は、本発明の一実施態様として、分割抽出物であるＣＢＴ−１４３−Ｓ−Ｆ６Ｆ７と粗抽出物であるＣＢＴ−１４３−Ｓの、ＨＵＶＥＣ細胞の細胞増殖に対する効果を示す。図１８Ａは、本発明の一実施態様として、化合物ＪＣ−５のラット角膜血管新生に対する効果を示す。図１８Ｂは、本発明の一実施態様として、化合物ＪＣ−５のラット角膜血管新生に対する効果を示す。図１８Ｃは、本発明の一実施態様として、化合物ＪＣ−５のラット角膜血管新生に対する効果を示す。図１９Ａは、本発明の一実施態様として、化合物ＪＣ−５の、レーザーで誘導された角膜血管新生に対する効果を示す。図１９Ｂは、本発明の一実施態様として、化合物ＪＣ−５の、レーザーで誘導された角膜血管新生に対する効果を示す。

以下では、本願発明の説明を目的として、記載された態様の十分な理解のために、具体的な詳細例を多く述べる。しかし、これら具体的な詳細例が無くても、１以上の態様を実施できることは明らかである。その他の例では、図を単純化するために、公知の構造や装置を概略的に示している。

本発明は、ユニペルスキネンシス（Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）の抽出物を主要な有効成分として用い、血管新生阻害効果を示す血管新生阻害医薬組成物を提供する。

上記の血管新生阻害医薬組成物は、それに限定される物ではないが、血管新生を阻害するための活性成分として、ユニペルスキネンシスの抽出物を含む。ある態様では、本発明に係る血管新生阻害医薬組成物は、さらに薬学上許容される担体および／または塩を含むものであってもよい。

本発明において、ユニペルスキネンシスの抽出物を提供するために用いられるユニペルスキネンシスの例としては、ユニペルスキネンシスワリエタスシンパク（Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓｖａｒ．Ｓｈｉｍｐａｋｕ）、ユニペルスキネンシスリンネワリエタスサルゲンティヘンリイ（ＪｕｎｉｐｅｒｕｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓＬ．ｖａｒ．ｓａｒｇｅｎｔｉｉＨｅｎｒｙ）、ユニペルスキネンシスリンネワリエタスキネンシス（原種）（ＪｕｎｉｐｅｒｕｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓＬ．ｖａｒ．ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ（ｐｒｏｔｏ−ｖａｒｉｅｔｙ））、ユニペルスキネンシスリンネワリエタスタイワネンシスＲ．Ｐ．アダムスアンドＣ．Ｆ．シェ（ＪｕｎｉｐｅｒｕｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓＬ．ｖａｒ．ｔａｉｗａｎｅｎｓｉｓＲ．Ｐ．Ａｄａｍｓ＆Ｃ．Ｆ．Ｈｓｉｅｈ）、ユニペルスキネンシスリンネワリエタスカイズカホルテンシスエクスエンドリヒャー（ＪｕｎｉｐｅｒｕｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓＬ．ｖａｒ．ｋａｉｚｕｋａＨｏｒｔ．ｅｘＥｎｄｌ．）、ユニペルスキネンシスリンネワリエタスピラミダリス（カリエール）ホルテンシスエクスレーダー（ＪｕｎｉｐｅｒｕｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓＬ．ｖａｒ．ｐｙｒａｍｉｄａｌｉｓ（Ｃａｒｒ．）Ｈｏｒｔ．ｅｘＲｅｈｄ．）および／またはユニペルスキネンシスカルティバフィッツェリアーナグラウカ（Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓｃｖ．ＰｆｉｔｚｅｒｉａｎａＧｌａｕｃａ）を挙げることができる。ある態様では、ユニペルスキネンシスの抽出物を提供するために用いられるユニペルスキネンシスは、ユニペルスキネンシスリンネワリエタスサルゲンティヘンリイである。

ユニペルスキネンシスの抽出物は、それらに限定されるものではないが、根、幹、枝、葉および／またはこれらの組合せから抽出されたものであってもよい。ある態様では、ユニペルスキネンシスの抽出物は、ユニペルスキネンシスの細枝および葉から抽出されたものであってもよい。

本発明では、ユニペルスキネンシスの抽出物を抽出するために用いられる溶媒としては、それらに限定されるものではないが、メタノール、エタノール、プロパノールなどのアルコール系溶媒；酢酸エチルなどのエステル系溶媒；ヘキサンなどの炭化水素系溶媒；またはジクロロメタンやジクロロエタンなどのハロゲン化炭化水素系溶媒であってもよい。ある態様では、抽出溶媒はエタノールである。

ある態様では、本発明に係るユニペルスキネンシスの抽出物の成分は、血管新生阻害効果を有する少なくとも一つの指標成分であるヤテインを含むものであってもよい。別の態様では、本発明に係るユニペルスキネンシスの抽出物の成分は、少なくとも血管新生阻害効果を有するヤテインを含むものであってもよい。

ある態様では、ユニペルスキネンシスの抽出物はユニペルスキネンシスリンネワリエタスサルゲンティヘンリイから抽出されたものであってもよく、また、エタノールを用いて抽出されるものであってもよい。かかる態様では、上記ユニペルスキネンシス抽出物の成分は、少なくともヤテインを含むものであってもよい。他の態様では、ユニペルスキネンシスの抽出物は、ユニペルスキネンシスリンネワリエタスサルゲンティヘンリイの細枝および葉からエタノールを使って抽出することにより得られる。かかる態様では、上記ユニペルスキネンシス抽出物の成分は、少なくともヤテインを含むものであってよい。

本発明に係る血管新生阻害医薬組成物は、血管新生に関係する疾患を治療するために用いられる。血管新生に関係する疾患としては、それらに限定されるものではないが、血管新生に関係するものであり、当該疾患が、固形腫瘍、加齢性黄斑変性症、脈絡膜血管新生、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜症、悪性腫瘍、網膜静脈閉塞、毛細血管拡張症などを挙げることができる。

また、本発明は、主要な有効成分としてリグナンを用いる、血管新生を阻害するための医薬組成物を提供する。かかる血管新生阻害組成物は、それに限定されるものではないが、式（Ｉ）で表されるリグニンを有効量含むものであってもよい。

ある態様では、前述した血管新生阻害組成物は、さらに薬学上許容される担体を含んでいてもよい。

ある態様では、それに限定されるものではないが、上記リグナンは、ヤテイン、５’−デスメトキシヤテイン（「ブルセヘルニン」ともいう）、７’，７’−ジヒドロキシブルセヘルニン、５’−メトキシヤテイン、ポドリゾールまたはポドリゾール４’−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシドであってもよい。ある例示的な態様では、上記リグナンはヤテインである。

上記の本発明に係る血管新生阻害組成物では、上記の薬学上許容される担体としては、それらに限定されるものではないが、医薬投与に適合する、溶媒、分散媒、コーティング、抗細菌剤、抗真菌剤および等張吸収遅延剤などを挙げることができる。本発明の医薬組成物は、従来技術を利用して、様々な投与形態のための剤形に製剤化することができる。

本発明に係る医薬組成物は、経口、吸入スプレーによる非経口、またはインプラントリザーバーを経由して投与することができる。非経口投与方法としては、点滴投与に加えて、皮下投与、皮内投与、静脈内投与、筋肉内投与、関節内投与、動脈内投与、滑液嚢内投与、胸骨下投与、くも膜下投与および病巣内投与を挙げることができる。

経口投与用組成物としては、それらに限定されるものではないが、錠剤、カプセル剤、エマルション製剤、並びに水性の懸濁液、分散液および溶液を挙げることができる。

また、本発明は、血管新生を阻害する方法も提供する。上記の血管新生阻害方法は、それに限定されるものではないが、患者の必要に応じて、血管新生を阻害するに有効な成分としてユニペルスキネンシスの抽出物の有効量を患者に投与する工程を含む。

患者、即ち本発明に係る血管新生阻害方法の適用対象としては、ヒトの他、ヒトを除く動物を挙げることができ、特にヒトを除く哺乳類を対象とする。

ユニペルスキネンシスの抽出物は、ユニペルスキネンシスから抽出され、ユニペルスキネンシスとしては、それらに限定されるものではないが、ユニペルスキネンシスワリエタスシンパク、ユニペルスキネンシスリンネワリエタスサルゲンティヘンリイ、ユニペルスキネンシスリンネワリエタスキネンシス（原種）、ユニペルスキネンシスリンネワリエタスタイワネンシスＲ．Ｐ．アダムスアンドＣ．Ｆ．シェ、ユニペルスキネンシスリンネワリエタスカイズカホルテンシスエクスエンドリヒャー、ユニペルスキネンシスリンネワリエタスピラミダリス（カリエール）ホルテンシスエクスレーダーおよび／またはユニペルスキネンシスカルティバフィッツェリアーナグラウカを挙げることができる。ある実施態様では、上記ユニペルスキネンシスは、ユニペルスキネンシスワリエタスシンパク、ユニペルスキネンシスリンネワリエタスサルゲンティヘンリイである。

本発明においては、ユニペルスキネンシスの抽出部位として、それらに限定されるものではないが、根、幹、枝、葉および／またはそれらの組合せを挙げることができる。ある実施態様では、ユニペルスキネンシスの前記抽出物は、ユニペルスキネンシスの細枝および葉から抽出される。

ユニペルスキネンシスの上記抽出物を抽出するために適した溶媒としては、それらに限定されるものではないが、メタノール、エタノール、プロパノールなどのアルコール溶媒；酢酸エチルなどのエステル溶媒；ヘキサンなどのアルカン溶媒；ジクロロメタンやジクロロエタンなどのハロアルカン溶媒を挙げることができる。ある実施態様では、抽出溶媒はエタノールである。

ある実施態様では、ユニペルスキネンシスの上記抽出物の成分としては、血管新生阻害効果を有するヤテインを挙げることができる。

ある実施態様では、ユニペルスキネンシスの抽出物は、ユニペルスキネンシスワリエタスシンパク、ユニペルスキネンシスリンネワリエタスサルゲンティヘンリイから抽出され、抽出のためにエタノールを用いて得られる。ある実施態様では、ユニペルスキネンシスの上抽出物の成分は、少なくともヤテインを含むものであってよい。他の実施態様では、ユニペルスキネンシスの抽出物は、ユニペルスキネンシスワリエタスシンパク、ユニペルスキネンシスリンネワリエタスサルゲンティヘンリイの細枝および葉からエタノールを使って抽出することにより得られる。かかる実施態様では、ユニペルスキネンシスの上記抽出物の成分は、少なくともヤテインを含む。

さらに、本発明は、別の血管新生阻害方法を提供する。当該血管新生阻害方法は、それに限定されるものではないが、患者の必要に応じて、血管新生を阻害するに有効な成分として、式（Ｉ）で表されるリグナンの抽出物の有効量を患者に投与する工程を含む。

ある実施態様では、上記リグナンとしては、それらに限定されるものではないが、ヤテイン、５’−デスメトキシヤテイン（ブルセヘルニン）、７’，７’−ジヒドロキシブルセヘルニン、５’−メトキシヤテイン、ポドリゾールまたはポドリゾール４’−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシドを挙げることができる。ある実施態様では、当該リグナンはヤテインである。

また、当該方法でも、患者、即ち本発明に係る血管新生阻害方法の適用対象としては、ヒトの他、ヒトを除く動物を挙げることができ、特にヒトを除く哺乳類を対象とする。

以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。

Ａ．本実施例では、ユニペルスキネンシスリンネワリエタスサルゲンティヘンリイ（ＪｕｎｉｐｅｒｕｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓＬ．ｖａｒ．ｓａｒｇｅｎｔｉｉＨｅｎｒｙ）の活性成分につき実験し、また、測定を行った。

ユニペルスキネンシスリンネワリエタスサルゲンティヘンリイの細枝と葉（約１０ｇ）を８〜１０重量倍の水、エタノール、プロパノール、酢酸エチルまたはヘキサンに浸漬し、１時間加熱還流することにより抽出液を得た。次いで、濾紙を使って抽出液を濾過し、濃縮した。得られた残渣に純水を加え、超音波照射することにより懸濁液を得た。当該懸濁液を凍結乾燥した。

凍結乾燥により得られた粉末を適切な溶媒に溶解し、ｉｎｖｉｔｒｏの抗血管新生試験に付した。細胞外マトリックス（ＥＣＭ）または低増殖因子濃度マトリゲルにおけるヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の網目構造形成に対する抽出物の阻害能を解析し、その管構造の形成レベルを統合し、定量化のための指標として用いた。結果を表１に示す。

表１は、ユニペルスキネンシスリンネワリエタスサルゲンティヘンリイの細枝および葉から異なる溶媒により抽出した抽出液の、指標成分の含有量と、ヒト臍帯静脈内皮細胞の網目構造形成に対する阻害能を示す。

上記結果により、水抽出物は網目構造（管構造）の形成を阻害することはできない一方で、他の溶媒による抽出物は全て内皮細胞の管構造形成を阻害することができることが示された。

Ｂ．本実施例では、ユニペルスキネンシスリンネワリエタスサルゲンティヘンリイのエタノール抽出物の調製
１．粗抽出物（ＣＢＴ−１４３−Ｓ）の抽出工程
上記結果にしたがって、ユニペルスキネンシスリンネワリエタスサルゲンティヘンリイの細枝および葉を抽出対象として選択し、抽出溶媒としてエタノールを選択した。得られた粗抽出物をＣＢＴ−１４３−Ｓと名付けた。その調製方法を以下に示す。

（１）ユニペルスキネンシスリンネワリエタスサルゲンティヘンリイの細枝および葉（１０ｇ）を８〜１０重量倍の９５％エタノールに浸漬した。

（２）上記工程（１）で浸漬した植物体から溶媒の沸点で１時間抽出した後、孔径：２３０メッシュの金属篩を使って濾過することにより、抽出液を得た。

（３）上記工程（２）で得た抽出液を、濾紙（Ｔｙｐｅ５Ａ，直径：９ｃｍ，孔径７μｍ，厚さ：０．２２ｍｍ，東洋濾紙社製）を使って濾過した。

（４）上記工程（３）で得た濾液をロータリーエバポレーターにより濃縮乾燥することにより、抽出凝固体を得た。

（５）上記工程（４）で得た抽出凝固体を純水と混合し、超音波照射することにより懸濁液を得た。

（６）上記工程（５）で得た懸濁液を、液体窒素を使って凍結乾燥した。

（７）凍結乾燥後、得られたプロダクトを集めてＣＢＴ−１４３−Ｓとした。

２．分割抽出物の調製（ＣＢＴ−１４３−Ｓ−Ｆ６Ｆ７）
粗抽出物の活性を高めるために、ＣＢＴ−１４３−Ｓからの単離精製を行った。単離精製工程を以下に示す。当該分割抽出物の調製工程を図１に示す。

（１）ＣＢＴ−１４３−Ｓ試料（３０ｇ）をドライパッキングにより固定化した。即ち、ＣＢＴ−１４３−Ｓを適切な溶媒に溶解した後、２重量倍（６０ｇ）のシリカゲルを添加した。よく混合した後、ロータリーエバポレーターにより、シリカゲル上にＣＢＴ−１４３−Ｓを均一に固定化した（工程Ｓ１）。

（２）ＣＢＴ−１４３−Ｓ試料の１５重量倍のシリカゲルを含むカラムにより、ＣＢＴ−１４３−Ｓ試料を単離工程に付した。即ち、シリカゲル（４５０ｇ）を直径６ｃｍのガラス製カラムに充填した。充填後、シリカゲルの高さは２８ｃｍ、ドライパッキングマトリックスの高さは４．５ｃｍであった（工程Ｓ２）。

（３）当初の移動相としてアセトン：ｎ−ヘキサン＝１：２の混合溶媒（３３００ｍＬ）を用い、溶出した。溶出液を２０ｍＬ毎にチューブに集め、分割した（工程Ｓ３）（Ｆ１〜Ｆ７チューブ）。

（４）カラムをアセトンで洗浄した（工程Ｓ３’）（Ｆ８チューブ）。

（５）カラムをメタノールで洗浄した（工程Ｓ３’’）（Ｆ９チューブ）。

（６）分割収集した溶出液を、順相薄層クロマトグラフィーで分析した。即ち、移動相としてアセトン：ｎ−ヘキサン＝２：３の混合溶媒を用い、分割収集した溶出液を展開した。展開後、分割収集した溶出液を、硫酸の１０％酢酸エチル溶液を付けた後に１０５℃で加熱することにより染色した。得られた主な染色スポットのＲｆ値を算出した。

（７）Ｒｆ値が０．３５〜０．５５の溶出液を集めた（工程Ｓ４）。

（８）上記溶出液を合わせ、ロータリーエバポレーターで濃縮乾燥することにより、分割抽出物凝固体を得た。

（９）得られた分割抽出物凝固体を等量の純水に添加し、超音波照射により懸濁した後、液体窒素により凍結乾燥した。

（１０）凍結乾燥後、得られた凍結乾燥粉末をＣＢＴ−１４３−Ｓ−Ｆ６Ｆ７とした。

３．活性成分の単離、精製および同定
分割抽出物であるＣＢＴ−１４３−Ｓ−Ｆ６Ｆ７の活性成分を、カラムクロマトグラフィーと活性解析により単離精製した。調製工程を図２に示す。図２のとおり、ＣＢＴ−１４３−Ｓ−Ｆ６Ｆ７を原料とし、条件Ｐ１により分割した後、活性を試験し、条件Ｐ’により濃縮乾燥した。それにより、ＪＣ−５活性成分を含むフラクションであるＣＢＴ−１４３−Ｓ−Ｆ６Ｆ７−Ａ２が得られた。当該フラクションを条件Ｐ２で分割した後、活性を試験し、条件Ｐ’により濃縮乾燥することにより、ＪＣ−５活性成分を含むフラクションであるＣＢＴ−１４３−Ｓ−Ｆ６Ｆ７−Ｂ２が得られた。当該ＣＢＴ−１４３−Ｓ−Ｆ６Ｆ７−Ｂ２フラクションを条件Ｐ３でさらに分割し、活性を試験し、条件Ｐ’により濃縮乾燥した後、条件Ｐ４により再結晶することにより、純粋なＪＣ−５物質が得られた。条件Ｐ１〜Ｐ４と条件Ｐ’を以下に示す。

Ｐ１：フラッシュパフォーマンス液体クロマトグラフィー − ＦＰＬＣ
カラム：シリカゲルカラム（０．０１５〜０．０４０μｍ）（内径：２．０ｃｍ×長さ：３０ｃｍ）
移動相：酢酸エチル：ｎ−ヘキサン＝１：１
流速：５ｍＬ／分
フラクションコレクター：１０ｍＬ容チューブ

Ｐ２：フラッシュパフォーマンス液体クロマトグラフィー − ＦＰＬＣ
カラム：シリカゲルカラム（０．０１５〜０．０４０μｍ）（内径：２．０ｃｍ×長さ：３０ｃｍ）
移動相：酢酸エチル：ｎ−ヘキサン＝１：１．５
流速：５ｍＬ／分
フラクションコレクター：１０ｍＬ容チューブ

Ｐ３：フラッシュパフォーマンス液体クロマトグラフィー − ＦＰＬＣ
カラム：シリカゲルカラム（０．０１５〜０．０４０μｍ）（内径：１．５ｃｍ×長さ：３０ｃｍ）
移動相：酢酸エチル：ｎ−ヘキサン＝１：１．５
流速：５ｍＬ／分
フラクションコレクター：１０ｍＬ容チューブ

Ｐ４：メタノールを用いた再結晶

Ｐ’：薄層クロマトグラフィー − ＴＬＣ

薄層クロマトグラフィーアルミニウムシート（ＴＬＣＳｉｌｉｃａｇｅｌ６０Ｆ２５４，メルク社製）を長さ：５ｃｍ×幅：７ｃｍにカットし、カットしたアルミニウムシートの下から１ｃｍの箇所に、定量キャピラリーを用いて試料１μＬを滴下した。サンプルをアルミニウムシートに滴下し、乾燥した後、当該アルミニウムシートを展開タンクに入れ、展開液として酢酸エチル：ｎ−ヘキサン＝１：１の混合溶媒を用い、試料を４ｃｍまで展開した。展開が完了し、アルミニウムシートを乾燥した後、着色剤（硫酸の１０％酢酸エチル溶液）をアルミニウムシートへ均一に塗布し、１０５℃で５分間加熱した。着色工程後、ＪＣ−５を含む領域（Ｒｆ値：０．５５〜０．６１，黒点）を観察し、当該スポットを含む試料の一部を集め、濃縮乾燥した。

精製したＪＣ−５を、核磁気共鳴分光（ＮＭＲ）で同定した。結果を図３Ａと図３Ｂに示す。図３Ａは、化合物ＪＣ−５の¹ＨＮＭＲスペクトルであり、当該スペクトルには、化合物ＪＣ−５の構造に含まれる水素原子の数が示されている。水素原子が検出された位置（δ値）と積算値の割合により、ＪＣ−５の構造中には合計で２４の水素原子が存在していることが推定された。図３Ｂは、化合物ＪＣ−５の¹³ＣＮＭＲスペクトルであり、当該スペクトルには、化合物ＪＣ−５中には合計で２２の炭素原子が存在していることが示されていた。

図３Ａと図３Ｂから得られるデータを、文献（Ikeda，R．；Nagao，T．；Okabe，H．；Nakano，Y．；Matsunaga，H．；Katano，M．；Mori，M．，Chem．Pharm．Bull．，1998，46，871-874）に示されているヤテインに関する記載と比較した。データを表２にまとめる。上記結果を比較したところ、化合物ＪＣ−５はヤテインであると同定された。ヤテインの構造を図４に示す。

表２は、ヤテインの構造に含まれる水素原子と炭素原子の分布を示す。

さらに、マトリックスとしてマトリゲル（ＢＤ社製，Ｃａｔ．Ｎｏ．３５６２３１）を用い、マトリックス上に網目構造を構築するヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の状態を観察することにより、ＨＵＶＥＣの網目構造形成に対するＪＣ−５（ヤテイン）の阻害能を分析した。分析の基準や条件を以下に示す。網目構造の合計長さは、ＮＩＳｅｌｅｍｅｎｔｉｍａｇｅａｎａｌｙｓｉｓｓｏｆｔｗａｒｅ（ニコン社製，代理店：ＬｉｎＴｒａｄｉｎｇ社，台湾）により算出した。薬剤を添加しない群で形成された網目構造の合計長さを１００％とし、ＨＵＶＥＣによる網目構造形成に対するＪＣ−５の阻害状態を分析した。

上記の網目構造形成阻害能の分析結果により、管形成に対するヤテインの５０％阻害濃度（ＩＣ₅₀）は０．３３５μＭであることが分かった（図５）。よって、ヤテインは活性成分であると決定された。

４．粗抽出物（ＣＢＴ−１４３−Ｓ）と分割抽出物（ＣＢＴ−１４３−Ｓ−Ｆ６Ｆ７）の高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）フィンガープリント
分析方法
試料調製：ＣＢＴ−１４３−Ｓの粉末（１０ｍｇ）とＣＢＴ−１４３−Ｓ−Ｆ６Ｆ７の粉末（１０ｍｇ）をそれぞれ１０ｍＬの容量フラスコに入れた。次いで、９５％エタノールを添加して各容量を１０ｍＬとし、当該フラスコに超音波を照射することにより粉末を完全に溶解した。

高速液体クロマトグラフィーの条件
クロマトグラフィーカラム：Ｃｏｓｍｏｓｉｌ５Ｃ１８−ＭＳ−ＩＩ４．６×２５０
流速：０．８ｍＬ／分
観測波長：２８０ｎｍ
移動相：Ａ：０．１％Ｈ₃ＰＯ₄；Ｂ：ＣＨ₃ＣＮ；Ｃ：ＭｅＯＨ
グラディエント：Ａ／Ｂ／Ｃ＝６５／２５／１０（６０分間） → Ａ／Ｂ／Ｃ＝２５／６０／１５（１分間） → Ａ／Ｂ／Ｃ＝６５／２５／１０（９分間）

分析結果
図６Ａと図６Ｂは、それぞれ粗抽出物（ＣＢＴ−１４３−Ｓ）と分割抽出物（ＣＢＴ−１４３−Ｓ−Ｆ６Ｆ７）の品質管理分析のための高速液体クロマトグラフィーグラフを示し、本願発明に係る抽出物の品質管理の基準として用いることができる。

精製したヤテイン（ＪＣ−５）の純品を管理基準として用いることにより、粗抽出物（ＣＢＴ−１４３−Ｓ）および分割抽出物（ＣＢＴ−１４３−Ｓ−Ｆ６Ｆ７）のための高速液体クロマトグラフィー質的／量的分析方法を開発し、粗抽出物（ＣＢＴ−１４３−Ｓ）および分割抽出物（ＣＢＴ−１４３−Ｓ−Ｆ６Ｆ７）の高速液体クロマトグラフィーグラフを、ヤテインの管理基準の高速液体クロマトグラフィーフィンガープリント（図６Ｃ）とそれぞれ比較した。図６Ａと図６Ｂにより、粗抽出物（ＣＢＴ−１４３−Ｓ）および分割抽出物（ＣＢＴ−１４３−Ｓ−Ｆ６Ｆ７）の高速液体クロマトグラフィーグラフには、両方ともＪＣ−５活性成分のメインピークが存在していた。また、ユニペルスキネンシスリンネワリエタスサルゲンティヘンリイの細枝と葉から様々な溶媒により抽出された抽出物も分析した。それらのヤテイン含有量は、表１に示す。

５．粗抽出物（ＣＢＴ−１４３−Ｓ）と分割抽出物（ＣＢＴ−１４３−Ｓ−Ｆ６Ｆ７）の活性のｉｎｖｉｔｒｏ評価
（１）血管チューブ形成の阻害
マトリックスとしてマトリゲル（ＢＤ社製，Ｃａｔ．Ｎｏ．３５６２３１）を用い、マトリックス上に網目構造を構築するヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の状態を観察することにより、粗抽出物（ＣＢＴ−１４３−Ｓ）と分割抽出物（ＣＢＴ−１４３−Ｓ−Ｆ６Ｆ７）の阻害能を分析した。分析の基準や条件を以下に示す。網目構造の合計長さは、ＮＩＳｅｌｅｍｅｎｔｉｍａｇｅａｎａｌｙｓｉｓｓｏｆｔｗａｒｅ（ニコン社製，代理店：ＬｉｎＴｒａｄｉｎｇ社，台湾）により算出した。薬剤を添加しない群で形成された網目構造の合計長さを１００％とし、ＨＵＶＥＣによる網目構造形成に対する粗抽出物（ＣＢＴ−１４３−Ｓ）と分割抽出物（ＣＢＴ−１４３−Ｓ−Ｆ６Ｆ７）の阻害状態を分析した。

図７と図８に示される実験結果から、被検物質の濃度が高くなるほど、粗抽出物（ＣＢＴ−１４３−Ｓ）と分割抽出物（ＣＢＴ−１４３−Ｓ−Ｆ６Ｆ７）の管形成に対する阻害効果も高くなり、有意な用量依存的な効果が明らかとなった。

また、計算したところ、粗抽出物（ＣＢＴ−１４３−Ｓ）と分割抽出物（ＣＢＴ−１４３−Ｓ−Ｆ６Ｆ７）の管形成に対する５０％阻害濃度（ＩＣ₅₀）は、それぞれ０．２２１μｇ／ｍＬと０．０１２３μｇ／ｍＬであった（図９と図１０）。かかる結果から、精製工程により、分割抽出物（ＣＢＴ−１４３−Ｓ−Ｆ６Ｆ７）の活性は、粗抽出物（ＣＢＴ−１４３−Ｓ）に比べて２０．３倍になったことが明らかとなった。

（２）血管内皮細胞の運動性の阻害試験（ＨＵＶＥＣ移動アッセイ）
ＢＤトランスウェルシステムを用い、ＨＵＶＥＣを活性化する栄養の存在下、膜を透過して下方に移動するＨＵＶＥＣの状態を観察した。活性化のための血清を用いない群を陰性対照として用い、活性化のための血清を用いる群を陽性対照として用いて、細胞の移動の観察が容易になるようクリスタルバイオレットで細胞を染色し、内皮細胞の移動に対する抽出物の阻害作用を観察した。その結果、分割抽出物（ＣＢＴ−１４３−Ｓ−Ｆ６Ｆ７）が内皮細胞の移動に対する阻害活性を有することが明らかとなった。

（３）肝細胞がん細胞の運動性の阻害試験（創傷治癒移動アッセイ）
高い運動性を示す肝細胞がん細胞株であるＳＫ−Ｈｅｐ−１株を選択した。先ず、当該細胞株を６ウェルプレートに接種した。細胞がプレートに付着した後、その一部を分離してプレート上に線を形成した。２４時間後と４８時間後に当該線から細胞を分離し、洗浄した後、線上に移動した細胞の状態を観察した（図１２）。得られた結果より、様々な濃度の粗抽出物（ＣＢＴ−１４３−Ｓ）と分割抽出物（ＣＢＴ−１４３−Ｓ−Ｆ６Ｆ７）で処理することによって、細胞の移動が抑制されることが明らかとなった。

４８時間後、観察を終了し、細胞の生存能力を測定するために、プレート中の細胞に対してＭＴＴアッセイを直ぐに行った。細胞の生存能力と細胞の運動性を比較することにより、粗抽出物（ＣＢＴ−１４３−Ｓ）と分割抽出物（ＣＢＴ−１４３−Ｓ−Ｆ６Ｆ７）が、ＳＫ−Ｈｅｐ−１株の運動性の阻害効果を有することを明らかにすることができた。

以上の試験結果により、ＳＫ−Ｈｅｐ−１株の移動に対する粗抽出物（ＣＢＴ−１４３−Ｓ）と分割抽出物（ＣＢＴ−１４３−Ｓ−Ｆ６Ｆ７）の阻害効果は、経時的に高まることが分かった。

６．粗抽出物（ＣＢＴ−１４３−Ｓ）と分割抽出物（ＣＢＴ−１４３−Ｓ−Ｆ６Ｆ７）のｉｎｖｉｖｏ抗血管新生試験
ＢＡＬＢ／ｃマウスにマトリゲルを皮下注射して埋設物を形成し、被検物質が、血管内皮細殖因子またはＨｅｐ−３Ｂコンディショナルメディウム（ＣＭ）により誘導された血管新生に対する阻害能を有するか否か、試験を行った。

（１）マトリゲルプラグアッセイ
Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ−Ｓｗａｒｍ（ＥＨＳ）マウスの肉腫からマトリゲルを抽出した。当該マトリゲルは、細胞外マトリックスタンパク質を豊富に含み、また、血管の成長に必要な様々な因子も含む。室温および３７℃の条件では、マトリゲルは固体ゲル状に重合することができ、血管内皮細胞の増殖にとりより好適な環境を提供することができる。

マトリゲルと、血管内皮細殖因子（ＦＧＦｂ＋ＶＥＧＦ）またはＨｅｐ−３Ｂコンディショナルメディウム（ＣＭ）を混合した後、被検物質を加えて混合した。

実験方法を以下に示す。

（ａ）動物系統：雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒｌＢｌｔｗ，ＢｉｏＬａｓｃｏＴａｉｗａｎ社から購入）６〜８週齢

（ｂ）ＰＢＳと混合したマトリゲルで処理した群を陰性対照として用い、ＦＧＦｂ（５００ｎｇ／ｍｌ）＋ＶＥＧＦ（５００ｎｇ／ｍｌ）またはＨｅｐ−３Ｂコンディショナルメディウム（ＣＭ）と混合したマトリゲルで処理した群を陽性対照として用いた。血管内皮増殖因子を含むマトリゲルと被検物質を混合した後、ＢＡＬＢ／ｃマウスへ皮下注射し、被検物質がマトリゲル中の血管新生を阻害できるか否か観察した。

（ｃ）マトリゲル中の新生血管量を評価するために、マトリゲル中のヘモグロビン含量を、ＱｕａｎｔｉＣｈｒｏｍＴＭＨｅｍｏｇｌｏｂｉｎＡｓｓａｙＫｉｔ（ＤＩＨＢ−２５０）で定量した。

ＢＡＬＢ／ｃマウスに１４日間皮下注射した後、マウスの皮下組織におけるマトリゲルプラグを取り出し、等量のディスパーゼを加えて混合し、３７℃で１６時間反応させることにより、細胞間物質ゲルを溶解した。次いで、反応混合物を１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清を別の微量遠心管に移した。５０μＬの上清と、ヘモグロビンアッセイキットに含まれている反応試薬２００μＬとを混合した。上清と当該試薬とを５分間反応させた後、４００ｎｍの光学濃度（Ｏ．Ｄ．）を測定した。下記式により、光学濃度（Ｏ．Ｄ．）の値を単位濃度に変換した。

（（ＯＤ_Sample−ＯＤ_Blank）／（ＯＤ_Calibration−ＯＤ_Blank））×１００×ｎ（ｍｇ／ｄＬ）
［式中、１００は校正濃度を示し、ｎは希釈倍率を示す］

実験結果は、以下のとおりである。

（ａ）増殖因子により誘導される血管新生のｉｎｖｉｖｏ評価アッセイ
増殖因子により誘導される血管新生のｉｎｖｉｖｏ評価アッセイにおいて、ＰＢＳでのみ処理した陰性対照群では、マウスの皮下組織に１４日間埋め込まれたマトリゲルプラグのヘモグロビン濃度は、バックグラウンド値に近い１７．６８±１１．６４ｍｇ／ｄＬであった。一方、ＦＧＦｂ（５００ｎｇ／ｍＬ）＋ＶＥＧＦ（５００ｎｇ／ｍＬ）を添加した場合、マトリゲルプラグには有意な血管新生が見られ、ヘモグロビン濃度は５２．６４±２６．１８ｍｇ／ｄＬに達した。ネクサバール（３０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）を毎日経口投与された群では、ヘモグロビン濃度は２７．０９±５．８８ｍｇ／ｄＬと有意に低減された。粗抽出物（ＣＢＴ−１４３−Ｓ）（１００μｇ／ｍＬ）を投与された群では、ヘモグロビン濃度は２７．９２±９．６２ｍｇ／ｄＬであった。さらに、３０μｇ／ｍＬおよび１００μｇ／ｍＬの分割抽出物（ＣＢＴ−１４３−Ｓ−Ｆ６Ｆ７）で処理された群では、ヘモグロビン濃度はそれぞれ５６．７０±５．５８ｍｇ／ｄＬおよび２５．０８±９．５９ｍｇ／ｄＬとなった。

上記結果により、粗抽出物（ＣＢＴ−１４３−Ｓ）（１００μｇ／ｍＬ）と分割抽出物（ＣＢＴ−１４３−Ｓ−Ｆ６Ｆ７）は、より高用量で血管新生阻害能を示すことが明らかとなった（図１３）。

（ｂ）コンディショナルメディウムで誘導されたＨｅｐ−３Ｂ肝細胞がん細胞の血管新生のｉｎｖｉｖｏ評価アッセイ
コンディショナルメディウムで誘導されたＨｅｐ−３Ｂ肝細胞がん細胞の血管新生のｉｎｖｉｖｏ評価アッセイにおいて、ＰＢＳでのみ処理した陰性対照群では、マウスの皮下組織に１４日間埋め込まれたマトリゲルプラグのヘモグロビン濃度は１６．２３±１１．６４ｍｇ／ｄＬであった。一方、コンディショナルメディウムを添加した場合、マトリゲルプラグには有意な血管新生が見られ、ヘモグロビン濃度は５２．６１±１３．１４ｍｇ／ｄＬに達した。ネクサバール（３０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）を経口投与された群では、ヘモグロビン濃度は２５．０５±１７．５９ｍｇ／ｄＬと有意に低減された。粗抽出物（ＣＢＴ−１４３−Ｓ）（１００μｇ／ｍＬ）を投与された群では、ヘモグロビン濃度は２２．９１±１５．９５ｍｇ／ｄＬであった。さらに、３０μｇ／ｍＬおよび１００μｇ／ｍＬの分割抽出物（ＣＢＴ−１４３−Ｓ−Ｆ６Ｆ７）で処理された群では、ヘモグロビン濃度はそれぞれ５１．４９±８．９７ｍｇ／ｄＬおよび２０．６１±７．５２ｍｇ／ｄＬとなった。

上記結果により、粗抽出物（ＣＢＴ−１４３−Ｓ）（１００μｇ／ｍＬ）と分割抽出物（ＣＢＴ−１４３−Ｓ−Ｆ６Ｆ７）は、より高用量で血管新生阻害能を示すことが明らかとなった（図１４）。

（２）ｉｎｖｉｖｏ抗血管新生実験（しょう尿膜（ＣＡＭ）アッセイ）
濾紙に被検物質またはＰＢＳを浸み込ませた後、ニワトリ胚のしょう尿膜（ＣＡＭ）の上に置き、血管新生を観察した。

特定病原体除去（ＳＰＦ）ホワイトレグホン種ニワトリのニワトリ胚を、３７．３℃、相対湿度５５〜６０％のインキュベーター中に横方向に置いた。インキュベーションの４日目に、２０Ｇ注射針を使って２．５ｍＬのアルブミンを吸引し、胚上に擬似空気室を設けた。次いで、注射針穴と擬似空気室のオープニングを３Ｍ通気性テープで覆った。７日目に、被検物質をＤＭＳＯに溶解し、ＰＢＳで希釈した。ＰＢＳ対照群を含んだ各群において、ＤＭＳＯの最終濃度は１％とした。直径６ｍｍの円形Ａｄｖａｎｔｅｃ（登録商標）濾紙（東洋濾紙社製）を使い、希釈した被検物質を吸収した。吸収量は２５μＬであった。各被検物質は、胚当たり５０，２５および１０μｇの３投与量準備した。さらに、７日目に濾紙をしょう尿膜上に置き、９日目に、１．２５×対物レンズを付けた解剖顕微鏡ＳＺＸ１６（オリンパス社製）を使って、しょう尿膜を撮影した。血管新生の状態を評価するために、濾紙を中心として、直径７，８，９および１０ｍｍの４つの同心円を写真上にマークした。４つの同心円の総外周は１０６．８ｍｍであり、総外周は濾紙への近さを示す。同心円と交差する血管の量、即ち、血管濃度指標またはＶＤＩは、裸眼で測定した。写真毎に、血管濃度指標を３名により測定し、その平均値を採用した。各被検物質処理群の血管濃度指標を、対照群と比較することにより、有意差の有無を求めた。４×および８×の対物レンズを用い、血管形態が異常な部位を観察して撮影した。

実験結果
表３と図１５のとおり、胚あたり２５μｇの分割抽出物（ＣＢＴ−１４３−Ｓ−Ｆ６Ｆ７）と胚あたり５０μｇの粗抽出物（ＣＢＴ−１４３−Ｓ）は、両方とも、しょう尿膜血管新生を有意に低減した。図１５において、１３０１との数字は、被検物質を含む濾紙を示す。また、図１６のとおり、分割抽出物（ＣＢＴ−１４３−Ｓ−Ｆ６Ｆ７）の中程度投与群および高度投与群は、毛細血管の形態的変化を引き起こした。図１６において、１４０１との数字は、被検物質を含む濾紙を示す。

表３は、ｉｎｖｉｖｏ抗血管新生実験（絨毛尿膜（ＣＡＭ）アッセイ）の結果を示す。

７．粗抽出物（ＣＢＴ−１４３−Ｓ）と分割抽出物（ＣＢＴ−１４３−Ｓ−Ｆ６Ｆ７）の正常細胞に対する毒性試験
粗抽出物（ＣＢＴ−１４３−Ｓ）と分割抽出物（ＣＢＴ−１４３−Ｓ−Ｆ６Ｆ７）の上記の阻害作用が毒性によるものか否か試験するために、粗抽出物（ＣＢＴ−１４３−Ｓ）と分割抽出物（ＣＢＴ−１４３−Ｓ−Ｆ６Ｆ７）について、正常細胞であるＰＢＭＣに対する細胞生存アッセイとＨＵＶＥＣに対する増殖阻害アッセイを行った。比較対象として、市販の臨床薬であるソラフェニブを用いた。

（１）正常細胞であるＰＢＭＣに対する毒性試験（アラマーブルー細胞生存アッセイ）
アラマーブルーは、通常、青色を示す植物色素である。当該色素は、細胞増殖により分解し、青色からピンク色に還元される。その結果、５７０ｎｍでのＯ．Ｄ．が高まることが観察される。逆に、死細胞の方が多いと、測定される当該Ｏ．Ｄ．値はより低くなる。

１×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌのＰＢＭＣ細胞を、９６ウェルプレートでインキュベートし、様々な濃度（３００，１００，３０，１０，３および１μｇ／ｍＬ）の粗抽出物（ＣＢＴ−１４３−Ｓ）や分割抽出物（ＣＢＴ−１４３−Ｓ−Ｆ６Ｆ７）などを、当該プレートに添加した。７２時間インキュベートした後、当該プレートにアラマーブルーを添加し、３７℃で２４時間インキュベートした。次いで、ＥＬＩＳＡリーダーを用い、５７０ｎｍ／６００ｎｍのＯ．Ｄ．値を測定した。その後、測定されたＯ．Ｄ．値を、以下の計算式に代入した。

λ₁＝５７０
λ₂＝６００
（ε_OX）λ₂＝１１７，２１６（ＯＸは酸化を示す）
（ε_OX）λ₁＝８０，５８６
Ａλ₁＝０．６５テストウェルで測定された吸光度
Ａλ₂＝０．３６テストウェルで測定された吸光度
Ａ⁰λ₂＝０．７８陽性テストウェルで測定された吸光度
Ａ⁰λ₁＝０．１９陽性テストウェルで測定された吸光度

試験結果（表４）によれば、分割抽出物（ＣＢＴ−１４３−Ｓ−Ｆ６Ｆ７）の濃度が３０μｇ／ｍＬであった場合には、ＰＢＭＣの細胞生存率は５０％よりも高かった。この結果は、分割抽出物（ＣＢＴ−１４３−Ｓ−Ｆ６Ｆ７）のＩＣ₅₀値が３０μｇ／ｍＬよりも高いことを示している。

表４は、正常細胞であるＰＢＭＣに対する粗抽出物（ＣＢＴ−１４３−Ｓ）と分割抽出物（ＣＢＴ−１４３−Ｓ−Ｆ６Ｆ７）の毒性試験結果を示す。

（２）ＨＵＶＥＣに対する増殖阻害アッセイ
同様に、細胞の生存活性を評価するために、アラマーブルーアッセイを用いた。１×１０⁴ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌのＨＵＶＥＣ細胞を９６ウェルプレートに接種した。様々な濃度（３００，１００，３０，１０，３および１μｇ／ｍＬ）の粗抽出物（ＣＢＴ−１４３−Ｓ）および分割抽出物（ＣＢＴ−１４３−Ｓ−Ｆ６Ｆ７）試料などをプレートに添加し、細胞増殖が被検物質により影響を受けているか否か評価するために、０時間後および４８時間後における吸光度を記録した。得られた結果によれば、粗抽出物（ＣＢＴ−１４３−Ｓ）および分割抽出物（ＣＢＴ−１４３−Ｓ−Ｆ６Ｆ７）の５０％増殖阻害濃度（ＧＩ₅₀）は、それぞれ０．５２μｇ／ｍＬおよび０．００６μｇ／ｍＬであった（図１７）。以上のとおり、ユニペルスキネンシスリンネワリエタスサルゲンティヘンリイ抽出物のＨＵＶＥＣ増殖に対する阻害活性は極めて明白である。

８．ラット角膜血管新生アッセイ
ヒドロンポリマー（ポリＨＥＭＥ）と被検物質またはＤＭＳＯからなるペレットを、ラットの角膜表面に移植し、その血管新生を観察した。

撹拌器を用い、３７℃で一晩、ヒドロンポリマー（ポリＨＥＭＥ）を１２ｗ／ｖ％の濃度で無水エタノールに溶解した後、ペレットの作製まで室温で保管した。角膜ポケットアッセイに用いた各ペレットは、ヒドロンポリマーとファクター−スクラルファート−ＰＢＳの５０：５０（ｖｏｌ／ｖｏｌ）混合物で構成されているキャスティングゲル３μＬ中、６０ｎｇのｂＦＧＦ、または１μｇのＪＣ−５および２０μｇのスクラルファートを含むものであった。当該キャスティングゲルは、直ぐに、オートクレーブされて滅菌され、約２×２ｍｍの孔径を有する２０×２０ｍｍのナイロンメッシュ片上にピペットでとった。当該ペレットは、無菌状態の層流フード中、角膜手術の前日に調製した。次に、メッシュの繊維を除去し、２×２×０．４ｍｍ₃の均一な大きさのものを選択して移植に用いた。全ての手順は、無菌状態で行った。かかるペレットは、生物活性が低減することなく、−２０℃で数日凍結保存することができる。各群には、６つの眼球がある。雄性ラット（ＳｐｒａｇｕｅＤａｗｌｅｙ，ＮａｔｉｏｎａｌＬａｂｏｒａｔｏｒｙＡｎｉｍａｌＣｅｎｔｅｒ，Ｔａｉｗａｎより購入）をケタミンで麻酔し、眼球を０．５％プロパラカインで局所麻酔した。手術用顕微鏡を用い、１２時の位置に手術用ナイフで２．５ｍｍの長さの中央基質内直線状角膜切開を行った。層状のマイクロポケットを、縁から２ｍｍのところで切断した。上記ペレットを、当該ポケットの端まで置いた。感染を防ぎ、また、眼球表面の違和感を低減するために、抗生物質軟膏（エリスロマイシン）を手術した目に一度適用した。ペレットの移植から７日目と１４日目に、ケタミンによりラットを麻酔した。眼球を露出させ、角膜と結膜の間の血管網からペレットまで広がった血管新生ゾーンの最大血管長さ（ＶＬ）を測定した。写真も撮影した。血管新生の連続的な円周ゾーン（ＣＮ）を、時計での時間で（即ち、３０°は１時間に相当する）３６０°網線で測定した。

実験結果は、以下のとおりである。

徐放性ポリマーであるヒドロンに加えてＰＢＳのみ、ｂＦＧＦのみ、またはｂＦＧＦとＪＣ−５を含むペレットを、ラットの角膜に移植した。ＰＢＳのみ含むペレット（全ての群において眼球数Ｎ＝６）では、血管新生は誘導されなかった（図１８Ａ、１８Ｂおよび１８Ｃの「ＰＢＳ」）。ｂＦＧＦを６０ｎｇ含むペレットでは、手術から７日目に血管新生が誘導された（図１８Ａ、１８Ｂおよび１８Ｃの「ｂＦＧＦ」）。移植を受けた角膜における６０ｎｇのｂＦＧＦによる血管新生応答は、７日目において、１μｇのＪＣ−５により阻害された（図１８Ａ、１８Ｂおよび１８Ｃの「ｂＦＧＦ＋ＪＣ−５」）。ラット角膜ポケットアッセイのこれら結果により、ＪＣ−５は角膜の血管新生を阻害することが明らかにされた。

９．レーザー誘導脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）アッセイ
雄性ラット（ブラウンノルウェイラット，ＢｉｏＬＡＳＣＯＣｏ．（台湾）より購入）を用いた。ラットの眼球に、レーザー光凝固によりＣＮＶ病変を誘導した。簡潔にいえば、ラットを麻酔した後、その瞳孔を１％トロピカミドで拡張させた。１８×２４ｍｍ²の標準カバーガラスを、光凝固を適用するためのコンタクトレンズとして用いた。アルゴンレーザーを、スリットランプを通して照射した。レーザーのパラメーターは、以下のとおりに設定した。

スポットサイズ：５０μｍ
強度：１２０ｍＷ
照射時間：０．１秒間

臨床的には中央の気泡形成として認められる、ブルッフ膜の破壊を企てた。その際、網膜内または脈絡膜に出血が認められる場合と認められない場合とがあった。各眼底の主要な網膜血管の間に、４〜６の病変部位が形成された。レーザー処理の１日前に、実験動物の硝子体内の両側に、２μＬのＪＣ−５（１μｇ／眼球，Ｎ＝６）または２μLの溶媒（ＤＭＳＯ，Ｎ＝６）を注射した。１４日後、管理を容易にするために、眼球に自己保持型眼検鏡をおいた。３０ゲージ針を用い、眼球ごとに、２μＬのＪＣ−５または溶媒の硝子体内注射を行った。硝子体内注射に続いて、抗生物質点眼剤であるビガモックス（０．５％塩酸モキシフロキサシン）を局所投与した。デジタルイメージングシステムを用い、フルオレセイン血管造影により、レーザー誘導ＣＮＶを解析した。瞳孔の拡張とそれに続く２．５％フルオロセインナトリウム（Ａｌｃｏｎ，ＣＩＴＹ，ドイツ）２．５ｍＬの腹腔内注射の後、一般的な麻酔状態下でマウスを解析した。各実験においては、注射から１〜３分間後という初期段階の画像を撮影した。フルオロセイン漏出の定量的分析のため、フルオロセイン漏出領域をそれぞれＩｍａｇｅＪソフトウェア（ＮＩＨ，米国）を用いて測定した。フルオロセイン漏出領域は、通常の網膜血管が全く観察されない過蛍光領域として測定した。

結果を以下に示す。

ＪＣ−５処理後、レーザー誘導ＣＮＶを解析するためのフルオレセイン血管造影法を使って、ＪＣ−５（１μｇ／μＬＤＭＳＯ溶液）の経時的な治療効果を評価した。ＪＣ−５で処理した眼球は、フルオレセント色素の取り込みとＣＮＶの範囲がより小さかった（図１９Ａ）。また、ＪＣ−５処理ラットの７日目および１４日目のＣＮＶ病変部位は、ＤＭＳＯラットに比べて、有意に低減されていた（図１９Ａおよび図１９Ｂ）。これら結果から、局所的なＪＣ−５投与によって、実験的なＣＮＶの重篤度が低減されることが明らかにされた。

当業者であれば、記載された態様に様々な修飾や変更を加えられることは明らかである。本願明細書や実施例は、単なる例示に過ぎないとされるべきであり、本願発明の真の範囲は特許請求の範囲やその等価物として解釈されるべきである。

Claims

血管新生に関係する眼疾患を治療するための医薬組成物を製造するための方法であって、
ユニペルスキネンシス（Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）から、アルコール系溶媒、エステル系溶媒、炭化水素系溶媒またはハロゲン化炭化水素系溶媒により抽出物を抽出する工程を含み、
上記医薬組成物が、有効成分としてユニペルスキネンシス（Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）の上記抽出物を有効量含み、
上記血管新生に関係する眼疾患が、加齢性黄斑変性症、脈絡膜血管新生、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜症または網膜静脈閉塞であることを特徴とする、血管新生に関係する眼疾患の治療用医薬組成物の製造方法。
上記ユニペルスキネンシス（Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）が、ユニペルスキネンシスワリエタスシンパク（Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓｖａｒ．Ｓｈｉｍｐａｋｕ）、ユニペルスキネンシスリンネワリエタスサルゲンティヘンリイ（ＪｕｎｉｐｅｒｕｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓＬ．ｖａｒ．ｓａｒｇｅｎｔｉｉＨｅｎｒｙ）、ユニペルスキネンシスリンネワリエタスキネンシス（原種）（ＪｕｎｉｐｅｒｕｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓＬ．ｖａｒ．ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ（原種））、ユニペルスキネンシスリンネワリエタスタイワネンシスＲ．Ｐ．アダムスアンドＣ．Ｆ．シェ（ＪｕｎｉｐｅｒｕｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓＬ．ｖａｒ．ｔａｉｗａｎｅｎｓｉｓＲ．Ｐ．Ａｄａｍｓ＆Ｃ．Ｆ．Ｈｓｉｅｈ）、ユニペルスキネンシスリンネワリエタスカイズカホルテンシスエクスエンドリヒャー（ＪｕｎｉｐｅｒｕｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓＬ．ｖａｒ．ｋａｉｚｕｋａＨｏｒｔ．ｅｘＥｎｄｌ．）、ユニペルスキネンシスリンネワリエタスピラミダリス（カリエール）ホルテンシスエクスレーダー（ＪｕｎｉｐｅｒｕｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓＬ．ｖａｒ．ｐｙｒａｍｉｄａｌｉｓ（Ｃａｒｒ．）Ｈｏｒｔ．ｅｘＲｅｈｄ．）および／またはユニペルスキネンシスカルティバフィッツェリアーナグラウカ（Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓｃｖ．ＰｆｉｔｚｅｒｉａｎａＧｌａｕｃａ）である請求項１に記載の血管新生に関係する眼疾患の治療用医薬組成物の製造方法。
上記抽出物が、ユニペルスキネンシス（Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）の根、幹、枝、葉および／またはこれらの組合せから抽出されたものである請求項１または２に記載の血管新生に関係する眼疾患の治療用医薬組成物の製造方法。
上記抽出物がヤテインを含む請求項１〜３のいずれかに記載の血管新生に関係する眼疾患の治療用医薬組成物の製造方法。
上記ユニペルスキネンシス（Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）がユニペルスキネンシスリンネワリエタスサルゲンティヘンリイ（ＪｕｎｉｐｅｒｕｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓＬ．ｖａｒ．ｓａｒｇｅｎｔｉｉＨｅｎｒｙ）であり、且つ、上記抽出物がエタノールで抽出されたものである請求項１〜４のいずれかに記載の血管新生に関係する眼疾患の治療用医薬組成物の製造方法。
上記抽出物が、ユニペルスキネンシス（Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）の細枝および／または葉からエタノールで抽出されたものである請求項１〜５のいずれかに記載の血管新生に関係する眼疾患の治療用医薬組成物の製造方法。
上記医薬組成物が、さらに、薬学上許容される担体を含む請求項１〜６のいずれかに記載の血管新生に関係する眼疾患の治療用医薬組成物の製造方法。
血管新生に関係する眼疾患を治療するための方法であって、
上記血管新生に関係する眼疾患が、加齢性黄斑変性症、脈絡膜血管新生、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜症または網膜静脈閉塞であり、
請求項１〜７のいずれかに記載の血管新生に関係する眼疾患の治療用医薬組成物の製造方法により、上記抽出物を製造する工程、および、
有効成分としてユニペルスキネンシス（Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）を含む上記抽出物を、ヒトを除く動物に有効量投与する工程を含むことを特徴とする方法。
上記ユニペルスキネンシス（Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）が、ユニペルスキネンシスワリエタスシンパク（Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓｖａｒ．Ｓｈｉｍｐａｋｕ）、ユニペルスキネンシスリンネワリエタスサルゲンティヘンリイ（ＪｕｎｉｐｅｒｕｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓＬ．ｖａｒ．ｓａｒｇｅｎｔｉｉＨｅｎｒｙ）、ユニペルスキネンシスリンネワリエタスキネンシス（原種）（ＪｕｎｉｐｅｒｕｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓＬ．ｖａｒ．ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ（原種））、ユニペルスキネンシスリンネワリエタスタイワネンシスＲ．Ｐ．アダムスアンドＣ．Ｆ．シェ（ＪｕｎｉｐｅｒｕｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓＬ．ｖａｒ．ｔａｉｗａｎｅｎｓｉｓＲ．Ｐ．Ａｄａｍｓ＆Ｃ．Ｆ．Ｈｓｉｅｈ）、ユニペルスキネンシスリンネワリエタスカイズカホルテンシスエクスエンドリヒャー（ＪｕｎｉｐｅｒｕｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓＬ．ｖａｒ．ｋａｉｚｕｋａＨｏｒｔ．ｅｘＥｎｄｌ．）、ユニペルスキネンシスリンネワリエタスピラミダリス（カリエール）ホルテンシスエクスレーダー（ＪｕｎｉｐｅｒｕｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓＬ．ｖａｒ．ｐｙｒａｍｉｄａｌｉｓ（Ｃａｒｒ．）Ｈｏｒｔ．ｅｘＲｅｈｄ．）および／またはユニペルスキネンシスカルティバフィッツェリアーナグラウカ（Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓｃｖ．ＰｆｉｔｚｅｒｉａｎａＧｌａｕｃａ）である請求項８に記載の方法。
上記抽出物が、ユニペルスキネンシス（Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）の根、幹、枝、葉および／またはこれらの組合せから抽出されたものである請求項８または９に記載の方法。
上記抽出物がヤテインを含む請求項８〜１０のいずれかに記載の方法。
上記ユニペルスキネンシス（Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）がユニペルスキネンシスリンネワリエタスサルゲンティヘンリイ（ＪｕｎｉｐｅｒｕｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓＬ．ｖａｒ．ｓａｒｇｅｎｔｉｉＨｅｎｒｙ）であり、且つ、上記抽出物がエタノールで抽出されたものである請求項８〜１１のいずれかに記載の方法。
上記抽出物が、ユニペルスキネンシス（Ｊｕｎｉｐｅｒｕｓｃｈｉｎｅｎｓｉｓ）の細枝および／または葉からエタノールで抽出されたものである請求項８〜１２のいずれかに記載の方法。
血管新生に関係する眼疾患を治療するための医薬組成物であって、
有効成分として式（Ｉ）で表されるリグナンを有効量含み、
［式中、Ｒ₁は−Ｈまたは−ＯＣＨ₃を示し、Ｒ₂は−Ｈまたは−ＯＨを示し、Ｒ₃は−Ｈ、−ＯＨまたはβ−Ｏ−グルコシドを示し、Ｒ₄は−Ｈまたは−ＯＣＨ₃を示す］
上記血管新生に関係する眼疾患が、加齢性黄斑変性症、脈絡膜血管新生、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜症または網膜静脈閉塞であることを特徴とする、血管新生に関係する眼疾患の治療用医薬組成物。
上記リグナンが、ヤテイン、５’−デスメトキシヤテイン、７’，７’−ジヒドロキシブルセヘルニン、５’−メトキシヤテイン、ポドリゾールまたはポドリゾール４’−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシドである請求項１４に記載の血管新生に関係する眼疾患の治療用医薬組成物。
さらに、薬学上許容される担体を含む請求項１４または１５に記載の血管新生に関係する眼疾患の治療用医薬組成物。
血管新生に関係する眼疾患を治療するための方法であって、
上記血管新生に関係する眼疾患が、加齢性黄斑変性症、脈絡膜血管新生、糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜症または網膜静脈閉塞であり、
有効成分として式（Ｉ）で表されるリグナンを、ヒトを除く動物に有効量投与する工程を含むことを特徴とする方法。
［式中、Ｒ₁は−Ｈまたは−ＯＣＨ₃を示し、Ｒ₂は−Ｈまたは−ＯＨを示し、Ｒ₃は−Ｈ、−ＯＨまたはβ−Ｏ−グルコシドを示し、Ｒ₄は−Ｈまたは−ＯＣＨ₃を示す］
上記リグナンが、ヤテイン、５’−デスメトキシヤテイン、７’，７’−ジヒドロキシブルセヘルニン、５’−メトキシヤテイン、ポドリゾールまたはポドリゾール４’−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシドである請求項１７に記載の方法。