CN110172064B - 一类黄酮衍生物及其制备方法和医药用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一类黄酮衍生物，及其制备方法和医药用途。本发明所述黄酮衍生物以脱水淫羊藿素为母核进行基团加减制备得到。经药理学实验表明，此类黄酮衍生物具有激活机体内源性干细胞药理学效用，达到修复血管、神经、内皮细胞和基质损伤性病理变化康复功能的效果，可制备组织损伤病理变化修复的药物，例如康复治疗勃起功能障碍病理变化的药物方面有良好前景。

Description

一类黄酮衍生物及其制备方法和医药用途

技术领域

本发明属于药物化学领域，具体的涉及一类黄酮衍生物及其制备方法和医药用途。

背景技术

危害人类健康的慢性病包括糖尿病、高血压病、肥胖、创伤等常见疾病引起的合并症，主要是发生在重要实质性器官如心脑肾及生殖器组织血管、神经及基质病理生理变化，导致功能细胞凋亡、变性、坏死,发生退行性病理变化引起相关器官功能障碍。因此，探索组织损伤修复的病理生理学机制，探索能够防治这些病理生理变化的药物和方法对维护器官功能是目前重大挑战，本专利发明正是基于此。

勃起功能障碍(erectile dysfunction，ED)指阴茎持续不能达到或维持足够的勃起以完成满意满意性生活，病程3个月以上，是男性最常见的疾病之一。据统计，在年龄40～70岁的男性人群中，其发病率超过50％，预计到2025年我国将有一亿多的ED患者。ED主要分为精神心理性ED和器质性ED两种。ED的发生与多种危险因素有密切的相关性，包括发病率占人口10％以上的老龄化、糖尿病、肥胖、吸烟、高血压、心血管疾病、抑郁、既往盆腔手术，脊髓损伤等 (Krzastek,Bopp et al.2019)。由于世界人口的老龄化，年龄在 61-70岁之间的男性患ED的可能性是51-60岁男性的两倍，而39％的男性在40岁时有一定程度的ED，67％将有这种情况到了70岁。

ED已成为常见慢性病，严重危害男性生殖健康，降低生活质量，影响家庭和谐,因此，防治ED已经成为重要医学研究课题之一。自从 1998年美国辉瑞公司开发口服药物选择性磷酸二酯酶5型抑制剂 (PDE5i)上市以来，ED治疗取得了变革性变化，已经成为ED治疗第一线治疗药物，PDE5i治疗效果不佳可选择第二线治疗方法包括真空辅助勃起装置疗法(VCD)、阴茎海绵体药物注射疗法(ICI)，对各种药物治疗无效和选择阴茎假体植入术治疗。因为目前的PDE5i， ICI，VCD等疗法是一次性症状治疗，临床疗效近70％左右，但是不同程度副作用发生率占15％左右，而且不能修复ED病理变化而治疗 ED，所以绝大多数患者宁愿期待选择具有修复ED病理变化能力的药物。

近年来老龄化、糖尿病、肥胖、吸烟、高血压、心血管疾病、盆腔手术，脊髓损伤等动物实验研究ED的病理生理学变化结果表明， ED勃起器官阴茎海绵体平滑肌细胞凋亡，胶原纤维增生而引起平滑肌/胶原纤维比例失调，内皮细胞损伤和凋亡性病理变化，神经病变以及弹力纤维含量减少，从而影响阴茎海绵体血液动力学障碍导致 ED。因此，ED防治药物必须能够修复这些ED病理生理学变化才能有效恢复勃起功能，但是目前还没有能够修复ED病理变化而恢复勃起功能的药物在临床使用，这是目前ED康复疗治疗研究中所面临的重大挑战。

此外，危害人类健康的慢性病包括糖尿病、高血压病、肥胖、创伤等常见疾病引起的合并症，主要是发生在重要实质性器官如心脑肾及生殖器组织血管、神经及基质病理生理变化，导致功能细胞凋亡、变性、坏死并发生退行性病理变化引起相关器官功能障碍。ED是以上疾病综合引起的阴茎海绵体组织病理生理学变化，对ED治疗具有良好效果的药物，也可在其它慢性疾病中也有良好的应用前景。

发明内容

针对以上缺点，本发明的第一方面在于提供一类具有修复阴茎海绵体平滑肌/胶原纤维比例失调，内皮细胞损伤神经病变而康复勃起功能的效果的人工合成的黄酮类衍生物。

本发明的另一方面为该类衍生物的制备方法。

本发明的再一方面的为该类衍生物的医药用途。

下面论述本发明的第一个目的：本发明人发现一类黄酮衍生物具有修复阴茎海绵体平滑肌/胶原纤维比例失调、内皮细胞损伤、神经病变而恢复勃起功能的效果，其作用机制与激活内源性干细胞有关，其修复阴茎海绵体病理变化而恢复勃起功能的效果比其他已公开的黄酮类衍生物，特别是脱水淫羊藿素显著优越。

本发明提供的黄酮衍生物或其药学上可接受的盐具有如下结构

其中，

(1)R1独立选自以下取代基团：H、C₁-C₆烷基；

(2)R2独立选自以下取代基团：H、C₁-C₆烷基、C₃-C₈环烷基、C₂-C₆链烯基、C₂-C₆的脂肪酰基、C₇-C₁₂的芳酰基；

(3)R3独立选自以下取代基团：H、C₁-C₆烷基。

进一步的本发明提供的黄酮衍生物或其药学上可接受的盐优选为R1＝H，R2＝C2-C6链烯基，R3＝CH3。

进一步的，本发明提供的黄酮衍生物或其药学上可接受的盐代号为YS10，结构如下式：

下面论述本发明的第二个目的：该类黄酮衍生物的制备方法。

本发明的该类黄酮衍生物都是通过在脱水淫羊藿素进行如上文第一方面所述的基团的替换或者添加实现的。下面以发明人合成的 YS10为例简要论述其合成方法，包括如下步骤：

(1)将脱水淫羊藿素与DMF混合后向其中加无水碳酸钾，搅拌后加入3-溴-2-甲基丙烯，加毕，置于室温下反应。

(2)反应结束后，将反应液倒入冰水中，搅拌后静置，抽滤，

滤饼用水洗涤干燥，得YS10。

合成反应式如下：

进一步的，其制备方法细化如下

(1)将脱水淫羊藿素与DMF混合后向其中加入无水碳酸钾，搅拌10分钟后向其中缓慢滴加3-溴-2-甲基丙烯，加毕，置于室温下反应；

(2)用TLC(石油醚：二氯甲烷：甲醇＝40：40：1)跟踪反应，反应结束，将反应液倒入冰水中，搅拌后静置一小时，有大量浅黄色固体析出，抽滤，滤饼用水洗涤三次后干燥，得YS-10粗产物。将粗产物过硅胶柱(石油醚：二氯甲烷：甲醇＝40：40：1)，得YS-10。

合成反应式如下：

本合成路线步骤少，反应温和已达成，原料易得，成本低，产率高，适合工业化生产。

进一步的，上述YS10也可以使用如图(1)的创新步骤从头合成：

(1)羟基保护：将2,4,6-三羟基苯乙酮溶于丙酮中，在碳酸盐催化剂作用下与氯甲基甲醚反应，得到产物I；

(2)引入B环：以产物I为原料，与对甲氧基苯甲酰氯进行酯化反应，引入B环，得到产物II；

(3)甲基溴化：将产物II进行溴代反应，得溴化物产物III；

(4)引入OBz基团：将产物III与苯甲酰氯反应得到产物IV；

(5)OBz基团重排：将产物IV与氢化钠反应，OBz基团重排得到产物V；

(6)引入异戊烯基：将产物V在催化剂的作用下与1-溴-3-甲基-2-丁烯反应得产物VI；

(7)异戊烯基邻位重排：产物VI与三氟甲烷磺酸铋反应得产物 VII；

(8)C环环合：以产物VII为原料，在混酸的催化下进行C环环合反应，得到目标产物VIII；

(9)3位羟基脱保护：以产物VIII为原料，在碱的催化下脱OBz 保护基得产物IX；

(10)脱水：将产物IX与混酸反应得产物X；

(11)引入丙烯基团：将产物X与3-溴-2-甲基丙烯反应得产物 XI，即所述黄酮衍生物YS10。

本合成路线法合理，反应温和，易于实现，起始原料易于获得，克服了原来从头合成中引入异戊烯基产率低，需要微波辅助或者需要昂贵的铕化物做催化剂，副产物多等不利条件。

下面论述本发明的第三个目的：本发明所述黄酮衍生物用于预防或者治疗勃起功能障碍有关药物中的用途。

我们首先进行本发明所述黄酮衍生物对内源性干细胞激活的体外研究，内源性干细胞(Endogenous Stem Cells，ESC)，是机体内部所有干细胞/前体细胞的统称，包括脂肪干细胞的各类间充质干细胞、造血干细胞等。内源性干细胞具有低分裂或保持静息状态，在特定的病理环境下具有自我更新和多向分化功能而组织损伤修复作用。脂肪干细胞资源丰富，常用于药物疗效和作用机制研究。本发明采用脂肪干细胞作为研究对象，对本发明所述黄酮衍生物的激活作用进行了研究。结果发现，本发明所述黄酮衍生物对脂肪干细胞的激活作用明显优于脱水淫羊藿素，此结果表明，本发明所述黄酮衍生物在特定的病理环境下能够激活内源性干细胞的自我更新和多向分化功能，从而发挥组织损伤修复作用。

随后我们进行本发明所述黄酮衍生物对阴茎海绵体神经损伤性 ED模型大鼠的动物实验，结果证明相比脱水淫羊藿素，本发明所述黄酮衍生物对大鼠阴茎海绵体平滑肌的修复作用更加明显，对大鼠阴茎海绵体纤维化的缓解作用也更加明显，本发明所述黄酮衍生物能够明显改善神经损伤引起的勃起功能障碍。

因此，本发明所述的黄酮衍生物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗勃起功能障碍有关的药物中具有良好的前景。

进一步的，本发明所述黄酮衍生物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗勃起功能障碍有关的药物中本发明所述黄酮衍生物或其药学上可接受的盐的给药剂量为0.5-2mg/kg/d。

进一步的，本发明所述黄酮衍生物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗勃起功能障碍的药物中，所述的药物的制剂可以为片剂、胶囊、喷雾剂或注射剂。

进一步的，由于本发明所述黄酮衍生物在特定的病理环境下能够激活内源性干细胞的自我更新和多向分化功能，从而发挥组织损伤修复作用，因此本发明所述黄酮衍生物或其药学上可接受的盐在制备激活机体内源性干细胞的相关药物中亦有应用前景。

进一步的，危害人类健康的慢性病包括糖尿病、高血压病、肥胖、创伤等常见疾病引起的合并症主要是发生在重要实质性器官如心脑肾及生殖器组织血管、神经及基质病理生理变化，导致功能细胞凋亡、变性、坏死并发生退行性病理变化引起相关器官功能障碍。然而，ED 是以上疾病综合引起的阴茎海绵体组织病理生理学变化，对ED治疗具有良好效果的药物，可在其它慢性疾病中也有良好的应用前景。

此外，由于慢性肾病、生殖功能障碍或视网膜病等疾病有相当多的报道可以通过激活内源性干细胞来治疗，本发明所述黄酮衍生物或其药学上可接受的盐在制备激活机体内源性干细胞的相关药物中的应用，所述药物优选为治疗慢性肾病、生殖功能障碍或视网膜病变的药物。

附图说明：

附图1为黄酮衍生物YS10的HPLC图谱；

附图2为黄酮衍生物YS10的从头合成路线图；

附图3(A)为不同浓度脱水淫羊藿素激活脂肪干细胞表达磷酸化组蛋白3(H3P)的免疫组化图像；(B)为不同浓度下脱水淫羊藿素激活脂肪干细胞百分比的比较；

附图4为脱水淫羊藿素对Wnt/β-catenin信号通路的激活，其中(A)为蛋白质免疫印迹图像；(B)为0-1000nm脱水淫羊藿素对β -catenin表达影响的量化图；(C)为0-1000nm脱水淫羊藿素对Cyclin D1表达影响的量化图；

附图5为黄酮衍生物YS10和脱水淫羊藿素对脂肪干细胞激活作用的比较，其中(A)为脱水淫羊藿素和YS10分别激活脂肪干细胞表达磷酸化组蛋白3(H3P)的免疫组化图像；(B)为脱水淫羊藿素和 YS10对激活脂肪干细胞表达磷酸化组蛋白3(H3P)的定量分析；

附图6(A)为各实验组阴茎海绵体压和平均动脉压测定；(B) 为各实验组ICP/MAP的最大值；(C)为各实验组ICP/MAP的总值；

附图7(A)为各实验组阴茎组织横切面平滑肌α-SMA免疫组化染色；(B)为各实验组Western blot检测阴茎海绵体平滑肌α-SMA 的表达情况；(C)为各实验组Western Blot结果分析；

附图8(A)为各实验组中段阴茎组织横切面Masson染色图像； (B)为半定量分析比较sham组，BCNI组，DE组和YS10组之间平滑肌与胶原纤维的比值；

附图9为黄酮衍生物YS10促进BCNI ED大鼠中a-SMA和nNOS 的表达；(A)为各实验组实验一周后阴茎组织的a-SMA和RECA-1染色；(B)为各实验组实验一周后阴茎组织的nNOS染色和phalloidin 染色；(C)为图(A)的定量分析；(D)为图(B)的定量分析。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所述的室温为15℃-25℃。

实施例1

本发明提供的黄酮衍生物或其药学上可接受的盐具有如下结构：

其中：

(1)R1独立选自以下取代基团：H、C1-C6烷基；

(2)R2独立选自以下取代基团：H、C1-C6烷基、C3-C8环烷基、 C2-C6链烯基、C2-C6的脂肪酰基、C7-C12的芳酰基；

(3)R3独立选自以下取代基团：H、C1-C6烷基。

进一步的，本发明提供的黄酮衍生物或其药学上可接受的盐优选为R1＝H，R2＝C2-C6链烯基，R3＝CH3。

实施例2：

本发明提供的黄酮衍生物或其药学上可接受的盐代号为YS10，结构如下式：

黄酮衍生物YS10的合成，包括以下步骤：

(1)将6g(16.3mmol)脱水淫羊藿素与80mL DMF混合后向其中加入3.38g(24.5mmol)无水碳酸钾，搅拌10分钟后向其中缓慢滴加1.97mL(19.6mmol)3-溴-2-甲基丙烯，加毕，置于室温下反应。

(2)TLC(石油醚：二氯甲烷：甲醇＝40：40：1)跟踪反应，约8 小时后反应完全。反应结束，将反应液倒入500mL冰水中，搅拌后静置一小时，有大量浅黄色固体析出，抽滤，滤饼用水洗涤三次后干燥，得YS-10粗产物。将粗产物过硅胶柱(石油醚：二氯甲烷：甲醇＝40：40：1)，得YS-10(6.4g,收率93.3％)，HPLC图谱见图1。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ12.43(s,1H),8.11(d,2H),7.02(d, 2H),6.25(s,1H),5.09(m,1H),4.95(m,1H)4.49(s,2H),3.91(s,3H),2.87(t,J＝6.8Hz,2H),1.89(t,J＝6.8Hz,2H), 1.77(s,3H),1.39(s,6H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ178.78, 161.52,160.01,159.51,155.45,153.81,141.07,137.67,130.18 (2C),123.31,113.95(2C),113.74,105.71,99.94,99.46,75.93, 75.90,55.41,31.77,26.63,19.72,16.29.Exact mass:422.17。

合成反应式如下：

上述YS10也可以通过如图2的创新步骤从头合成：

(1)羟基保护：将2,4,6-三羟基苯乙酮0.1mol溶于500ml丙酮中，加入0.7mol碳酸钾，搅拌30min后降温至0度，向其中缓慢滴加0.2mol氯甲基甲醚，置于室温下反应。反应结束后向反应液中加入500ml冰水，乙酸乙酯萃取*3，合并乙酸乙酯层，将其用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸干，过硅胶柱以得到目标产物I (22g,产率86％)。

(2)引入B环：将0.1mol产物I溶于500ml无水四氢呋喃中，降至0度后加入0.15molNaH，搅拌5min后加入0.12mol倍量对甲氧基苯甲酰氯，将反应液缓慢升温至室温，反应结束后将反应液倒入冰水中，乙酸乙酯萃取*3，合并乙酸乙酯层，将其用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸干，过硅胶柱以得到目标产物II(33g,产率85％)。

(3)甲基溴化：将0.1mol产物II溶于500ml乙酸乙酯中，加入0.2mol溴化铜，室温下反应。反应结束后，将反应液过硅藻土，二氯甲烷洗脱，洗脱液减压蒸干即得目标产物III(39g,产率83％)。

(4)引入OBz基团：将0.1mol产物III溶于1000ml乙腈中，加入0.2mol苯甲酰氯，回流反应。反应结束后将反应液冷却至室温，用水稀释，乙酸乙酯萃取*3，合并乙酸乙酯层，将其水洗三次后再用饱和食盐水洗，减压蒸干，过硅胶柱以得到目标产物IV(43g,产率86％)。

(5)OBz基团重排：将0.15molNaH分散于500ml无水四氢呋喃中，加入0.1mol产物IV，回流反应。反应结束后，将反应液冷却至室温后倒入冰水中，减压浓缩后乙酸乙酯萃取*3，合并乙酸乙酯层，将其用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸干，过硅胶柱以得到目标产物V(44g,产率86％)。

(6)引入异戊烯基：将0.1mol产物V溶于丙酮中，加入0.25mol 无水碳酸钾，搅拌30min，此为溶液①；将0.28mol 3,3-二甲基烯丙溴溶于丙酮中，此为溶液②；将溶液①移至冰浴，待其降至0度后向其中缓缓滴加溶液②。缓慢移除冰盐浴后于室温下继续反应。反应结束后将反应液抽滤，滤液蒸干，二氯溶解后用水反萃。弃去水层，将二氯层用无水硫酸钠干燥后减压蒸干，得黄色油状物。将其用少量二氯甲烷溶解后过硅胶柱即得产物VI(52g,产率90％)。

(7)异戊烯基邻位重排：将0.1mol产物VI溶于500ml乙腈，加热回流后向其中加入0.05倍量的三氟甲烷磺酸铋(III)。反应结束后，将反应液减压浓缩，过硅胶柱以得到目标产物VII(50g,产率 87％)。

(8)C环环合：将0.1mol产物VII溶于2L冰醋酸中，向其中加入200ml浓硫酸，升温至60度反应。反应结束后，将反应液倒入冰水中，减压浓缩后乙酸乙酯萃取*3，合并乙酸乙酯层，将其用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸干，过硅胶柱以得到目标产物 VIII(45g,产率95％)。

(9)3位羟基脱保护：将0.1mol产物VIII溶于1000ml乙醇中，向其中缓慢滴加500ml5％NaOH水溶液，将其升温至60度反应。反应结束后，将反应液用2L 1M HCl溶液酸化，乙酸乙酯萃取*3，合并乙酸乙酯层，将其用饱和碳酸钠溶液洗涤、饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压蒸干，过硅胶柱以得到目标产物IX(32g,产率87％)。

(10)脱水：将3L 80％冰醋酸与900ml 5mol/L硫酸置于茄形瓶中，搅拌均匀后，向其中加入0.1mol产物IX，升温至90℃回流反应。TLC(石油醚：二氯甲烷：甲醇＝40：40：1)跟踪反应，约6小时后反应完全。反应结束，待反应液冷却至室温后用饱和碳酸氢钠溶液将其pH调至7-8。静置一小时，有大量黄色固体析出，抽滤，滤饼用水洗涤三次后低温干燥，得产物X(34g,产率92％)。

(11)引入丙烯基团：将0.1mol产物X与500ml二甲基甲酰胺混合后向其中加入0.15mol的无水碳酸钾，搅拌10分钟后向其中缓慢滴加0.12mol倍量的3-溴-2-甲基丙烯，加毕，置于室温下反应。TLC(石油醚：二氯甲烷：甲醇＝40：40：1)跟踪反应，约8小时后反应完全。反应结束，将反应液倒入500mL冰水中，搅拌后静置一小时，有大量浅黄色固体析出，抽滤，滤饼用水洗涤三次后干燥，得 YS-10粗产物。将粗产物过硅胶柱(石油醚：二氯甲烷：甲醇＝40： 40：1)，得产物XI即YS-10(37g,产率88％)。1H NMR(400MHz,CDCl3) δ12.43(s,1H),8.11(d,2H),7.02(d,2H),6.25(s,1H),5.09 (m,1H),4.95(m,1H)4.49(s,2H),3.91(s,3H),2.87(t,J ＝6.8Hz,2H),1.89(t,J＝6.8Hz,2H),1.77(s,3H),1.39(s, 6H).13C NMR(100MHz,CDCl3)δ178.78,161.52,160.01,159.51, 155.45,153.81,141.07,137.67,130.18(2C),123.31,113.95 (2C),113.74,105.71,99.94,99.46,75.93,75.90,55.41,31.77, 26.63,19.72,16.29.Exact mass:422.17。

实施例3

黄酮衍生物YS10在用于预防或者治疗勃起功能障碍的药物中的用途。

第一部分，体外实验：黄酮衍生物YS10与脱水淫羊藿素对脂肪干细胞激活作用的比较。

研究背景：

危害人类健康的慢性病包括糖尿病、高血压病、肥胖、创伤等常见疾病引起的合并症，主要是发生在重要实质性器官如心脑肾及生殖器组织血管、神经及基质病理生理变化，导致功能细胞凋亡、变性、坏死,发生退行性病理变化引起相关器官功能障碍。因此，探索组织损伤修复的病理生理学机制，探索能够防治这些病理生理变化的药物和方法对维护器官功能是目前重大挑战，本专利发明正是基于此。

本研究以阴茎勃起功能障碍为例进行阐述。阴茎勃起器官是由一对阴茎海绵体组成的独特器官，阴茎海绵体由血管、神经和内皮细胞和细胞基质组成特殊的海绵体窦为功能单位，有性刺激时在神经- 内分泌调节下，激活多种生物信号通路，促使阴茎海绵体动脉扩张、阴茎海绵体窦膨胀、压迫白膜下静脉血液流出，阴茎海绵体内压力快速增高而诱导阴茎勃起和维持阴茎勃起保证完成满意的性生活。如果阴茎海绵体组织发生损伤性病理变化，将引起勃起功能障碍。近期研究表明，成体阴茎组织中存在静息状态内源性干细胞，而且，某种药物能够激活内源性干细胞可分化成血管、神经和内皮细胞，修复阴茎海绵体窦病理变化康复勃起功能的潜能。

实验准备：脂肪干细胞的分离和培养。

用含有1％青霉素和链霉素的PBS冲洗脂肪组织，切碎成小块，然后在含有0.075％IA型胶原酶(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO) 的溶液中于37℃温育1小时。剧烈摇晃，除去顶部脂质层，将剩余的液体部分在室温下以220g离心10分钟。将沉淀物用160mM NH 4Cl 处理10分钟以裂解红细胞。将剩余的细胞悬浮在10％胎牛血清(FBS) 的DMEM中，通过40μm细胞滤网(BD Biosciences，Bedford，MA) 过滤，并以10cm细胞培养皿有1×10⁶个细胞的密度铺板。在达到80％汇合后，收获细胞并以5×10⁵个细胞/ml冷冻培养基(DMEM， 20％FBS和10％DMSO)的密度储存在液氮中。根据需要将冷冻的细胞解冻用于实验。

正式实验：包括以下步骤：

(1)验证脱水淫羊藿素对脂肪干细胞的激活作用和剂量依赖，确定YS10的实验用量。

首先将P3-P4代的脂肪干细胞种植于10cm的细胞培养皿中，加入10uM的EdU标记过夜，然后加入不同浓度的脱水淫羊藿素，分别是0.1,1,10,100nM的脱水淫羊藿素。48小时后，冰甲醇固定，然后进行免疫荧光染色，检测磷酸化组蛋白3检测(该基因的表达，表明细胞处在有丝分裂期)。同时检测EdU的阳性表达率。实验结果如图3所示，脱水淫羊藿素可以在体外激活脂肪干细胞进行有丝分裂，表达H3P，这个作用有剂量依赖曲线，在10nM时达到大约 8.5％的激活率。

(2)验证脱水淫羊藿素对Wnt/β-catenin信号通路的激活。

首先将P3-P4代的脂肪干细胞种植于10CM的细胞培养皿中，然后加入10nM的脱水淫羊藿素,48小时后，通过在含有1％IGEPAL CA-630,0.5％脱氧胆酸钠，0.1％十二烷基硫酸钠，抑肽酶(10mg/ mL)，亮抑酶肽(10mg/mL)和PBS的裂解缓冲液中均质化细胞来制备细胞蛋白样品。含有20μg蛋白质的细胞裂解物在十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳中电泳，然后转移到聚偏二氟乙烯膜(Millipore Corp，Bedford，MA)。用Ponceau S对膜进行染色以验证转移的蛋白质的完整性并监测所有蛋白质样品的无偏移转移。使用电化学发光试剂盒(Amersham Life Sciences Inc，Arlington Heights，IL)，使用针对β-连环蛋白(1：500)，细胞周期蛋白D1(1：500)和β- 肌动蛋白(1：1000)(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)。在二抗杂交后，用ChemiImager 4000(Alpha Innotec，Kasendorf，Germany)分析所得图像，以确定每个蛋白质条带的积分密度值。实验结果如图4所示，发现脱水淫羊藿素可以显著激活β-catenin和 Cyclin D1表达，从机理上揭示了，黄酮类衍生物是通过 Wnt/β-catenin信号通路激活脂肪干细胞进行有丝分裂的。

(3)黄酮衍生物YS10与脱水淫羊藿素对脂肪干细胞激活作用的比较。

基于脱水淫羊藿素对脂肪干细胞的激活作用和剂量依赖的结果，本实验采用10nM的YS10对脂肪干细胞进行比较实验。首先将P3-P4 代的脂肪干细胞种植于10CM的细胞培养皿中，加入10μM的EdU标记过夜，然后加入10nM的YS10。48小时后，冰甲醇固定，然后进行进行免疫荧光染色，检测磷酸化组蛋白3的表达(该基因的表达，表明细胞处在有丝分裂期)。同时检测EdU的阳性表达率，实验结果如图5所示，在10nm的剂量条件下，YS10对脂肪干细胞的激活率是脱水淫羊藿素的两倍，是空白对照的10倍以上。

实验结论：黄酮衍生物YS10具有激活脂肪干细胞的作用，比较脱水淫羊藿素显著优越。揭示了YS10在特定的病理环境下具有激活干细胞自我更新，多向分化伤修组织损伤的作用。

第二部分：体内实验：黄酮衍生物YS10对阴茎海绵体神经损伤性ED大鼠模型的治疗效果。

阴茎勃起器官是由一对阴茎海绵体组成的独特器官，阴茎海绵体由血管、神经和内皮细胞和细胞基质组成特殊的海绵体窦为功能单位，有性刺激时在神经-内分泌调节下，激活多种生物信号通路，促使阴茎海绵体动脉扩张、阴茎海绵体窦膨胀、压迫白膜下静脉血液流出，阴茎海绵体内压力快速增高而诱导阴茎勃起和维持阴茎勃起保证完成满意的性生活。如果阴茎海绵体组织发生损伤性病理变化，将引起勃起功能障碍。近期研究表明，成体阴茎组织中存在静息状态内源性干细胞，而且，某种药物能够激活内源性干细胞可分化成血管、神经和内皮细胞，修复阴茎海绵体窦病理变化康复勃起功能的潜能。

本实验利用神经损伤引起勃起功能障碍的大鼠模型，评估前期细胞实验筛选的黄酮衍生物YS10对阴茎海绵体神经损伤性ED大鼠模型的治疗效果。

实验1.阴茎海绵体神经损伤性勃起功能障碍大鼠模型建立。

将48只SD雄性大鼠随机平均分成4组，即正常组(Sham)，双侧海绵体神经夹伤组(BCNI)，海绵体神经夹伤-脱水淫羊藿素治疗组 (DE)，海绵体神经夹伤-YS10治疗组(YS10)，每组12只，用苦味酸给大鼠编号，称其体重并做好记录。用事先配置好并滤过除菌的5％戊巴比妥钠麻醉，麻醉剂用量为0.1mL/100g。麻醉时注意腹腔内麻醉，如果误将麻醉剂注入皮下，肌肉，腹腔脏器或膀胱内，则不能在 3min钟内将动物麻醉到手术状态。若手术过程中，大鼠苏醒并挣扎，可补充原麻醉剂量的1/3。大鼠麻醉后，下腹部备皮，将大鼠置于恒温手术台，可处于自然仰卧位，无需固定。做下腹部正中切口，切口位于尿道外口上0.5cm，长度约为2.5cm。皮肤切开后，止血钳夹起肌肉，再用剪刀切开，以免伤到小肠而致大鼠死亡。用消毒棉棒检查腹腔，确定无脏器损伤后，用眼科剪开脐正中韧带，随后放置撑开器，撑开腹腔。暴露膀胱，前列腺。用一只棉棒放置在前列腺外侧，另一只棉棒将精索轻柔的拨向外上方，则可暴露前列腺后外侧叶上的盆底神经节，显微镜下可见盆底神经节向内下发出一条粗的神经，即海绵体神经，在海绵体神经周围有细的海绵体神经分支。用显微尖头镊将海绵体神经及其分支从前列腺膜上仔细分离，分离近端靠近盆底神经节，分离长度约0.5cm，接着用止血钳夹住海绵体神经，移除尖头镊，持续夹闭神经2min，然后用同样的方法夹伤另一侧海绵体神经。对于海绵体神经切除组，则将分离的约0.5cm的海绵体神经切除。用青链霉素擦下切口，用5-0可吸收线将大鼠肌肉间断缝合，酒精消毒后用4-0丝线缝合皮肤，用碘伏消毒切口后将大鼠放回笼内，保持大鼠处于侧卧位。检查饲料和饮水，做好建模记录。建模后第二天开始灌药，均为1mg/kg，每天灌药1次，灌药3周，洗脱期1周。

实验2阴茎海绵体内压(ICP)和颈动脉压测定(MAP)评估勃起功能。

建模后4周，对大鼠进行勃起功能测定，即海绵体内压和颈动脉压及其比值测定。将大鼠称重，使用5％戊巴比妥钠0.1mL/100g腹腔麻醉，麻醉剂用量非常严格，麻醉过深将严重影响海绵体压和血压。在大鼠麻醉时可以打开多通道生理仪MP150，连接计算机，打开调试好的双通道测压软件，用含有肝素的生理盐水将测压管道中的空气排出并将各通道的压力调零。设置电刺激的参数为5V，20HZ,刺激波宽为1ms。将麻醉好的大鼠放置于恒温手术台，自然仰卧位即可。先将大鼠头端朝向自己，消毒颈部皮肤，用剪刀沿大鼠颈部中线剪开皮肤和皮肤下筋膜，可暴露颈部肌肉，钝性分离颈部肌肉，眼科剪小心剪开深部筋膜，暴露颈动脉。用弯止血钳和眼科弯镊分离颈动脉和迷走神经，分离长度约2cm。用动脉夹夹闭近心端，用4-0丝线结扎远心端，并在近心端打一个松结，将眼科镊柄端置于分离的颈动脉下，用眼科剪在远心端剪一斜口，将Y型24G留置针的针芯(引导针芯的尖端剪掉磨平)和导管插入颈动脉，拔出针芯，然后将松结打紧，再打一结固定置留针。将大鼠的尾侧朝向自己，分离阴茎，经阴茎包皮切掉，并且将阴茎的韧带切除后，暴露完整的阴茎。然后做下腹部正中切口，切口位于阴茎根部上0.5cm，长度约为2.5cm。皮肤切开后，止血钳夹起肌肉，再用剪刀切开，以免损伤其他脏器。眼科剪剪开脐正中韧带，随后放置撑开器，撑开腹腔，暴露膀胱，前列腺。用一只棉棒顶在前列腺外侧，另一只棉棒将精索轻柔的拨向外上方，则可暴露前列腺后外侧叶上的盆底神经节，建模后大鼠神经节周围有不同程度的黏连，有的神经节被脂肪覆盖，应缓慢分离。盆底神经节向内下发出一条粗的神经，即海绵体神经，将双极电极置于海绵体神经下方。接着进行阴茎海绵体穿刺，在冠状沟下0.5cm处穿刺，深度为0.3mm 左右。穿刺后向阴茎中注入少量的生理盐水，观察阴茎海绵体是否勃起，如果勃起则证明穿刺成功。去掉动脉夹，开始进行海绵体压和颈动脉压测定，在电刺激海绵体神经前，先测20s的海绵体基础压，然后电刺激60s，测海绵体的勃起压。阴茎海绵体压和颈动脉压比值的最大值(max ICP/MAP)，曲线下面积(area of ICP/MAP)由MP150 自带的软件AcqKnowledge测得。实验结果如图6所示，与正常组 (Sham)相比，双侧海绵体神经夹伤组(BCNI)的海绵体压显著降低；海绵体神经夹伤-脱水淫羊藿素治疗组(DE)和海绵体神经夹伤-YS10 治疗组(YS10)相比双侧海绵体神经夹伤组(BCNI)的海绵体压明显增高，其中YS10对大鼠的勃起功能的提高作用更加明显。

实验3各实验组海绵体组织染色实验。

实验方法和准备：准备实验阴茎、海绵体神经和盆底神经节的取材，固定，包埋，切片，染色。

剪取海绵体神经和盆底神经节，为了维持其结构形态，可带一部分前列腺组织，将所取组织放入4％的甲醛固定过夜，然后放入30％的蔗糖溶液脱水过夜。完整剪取大鼠阴茎后，注意用棉球按压阴茎，挤出海绵体内血液，将含有阴茎骨的阴茎头端剪掉，将大鼠阴茎在PBS缓冲液中洗2遍，从中间剪断，远侧端因有穿刺针孔，用于冻存和提取蛋白，近侧端放入4％的甲醛中固定过夜。取出固定的阴茎，然后从中间切断，远侧端放入30％的蔗糖溶液中过夜，用于冰冻包埋。近侧端用于石蜡包埋，先将组织块取出，用滤纸吸干固定液，用眼科剪进一步修剪组织，然后放入包埋盒并做好标记，将包埋盒放入大烧杯，流水缓慢冲洗过夜。第二天，将包埋盒取出，依次放入浓度为 75％，85％，95％的乙醇中，梯度脱水各1.5h，然后放入100％I，100％II 无水乙醇中各0.5h，再将组织放入香柏油中过夜。第三天，将组织块从香柏油中取出，放入二甲苯中15min媒浸，从二甲苯中取出，吸干二甲苯，将组织浸入蜡中，分别浸软蜡I,软蜡II，硬蜡各1.5h，最后进行包埋。包埋后进行石蜡切片，切片厚度为5um，在34℃的水浴锅中展片，捞片，在37摄氏度的烤箱中将玻片烤干并收集到玻片盒待用。阴茎远侧端和盆底神经节经蔗糖脱水过夜后，取出组织，滤纸吸去蔗糖溶液，进一步修剪组织，在-27℃的冰冻切片机中进行冰冻包埋，并进行切片，厚度为5um,将组织贴于玻片上，放入玻片盒并置于-80℃冰箱中保存。免疫组化染色的平均光密度和免疫荧光染色的平均荧光强度由Imagepro Plus测得，采用SPSS19.0统计软件进行t检验，P<0.05具有统计学意义。

(1)阴茎海绵体平滑肌组织α-SMA染色实验。

实验结果如图7所示，通过免疫组化和Western blot检测阴茎海绵体平滑肌α-SMA的表达情况可知，脱水淫羊藿素和YS10对大鼠海绵体平滑肌具有显著的修复作用，YS10对大鼠平滑肌的修复作用更加明显。

(2)阴茎海绵体平滑肌组织Masson染色实验。

实验结果如图8所示，通过Masson染色查看平滑肌中肌纤维和胶原纤维的分布，半定量得出脱水淫羊藿素和YS10可有效缓解大鼠阴茎海绵体胶原纤维增多和沉积，其中YS10对大鼠阴茎海绵体纤维化的缓解作用更加明显。

(3)阴茎海绵体内皮细胞和nNOS(神经型一氧化氮合酶)的表达测定实验。

实验结果如图9所示，通过α-SMA/RECA-1双染色，以及nNOS/ 鬼笔环肽双染色可以得出建模后，大鼠阴茎海绵体内皮细胞和nNOS (神经元型一氧化氮合酶)均显著减少，脱水淫羊藿素和YS10可有效修复该病理变化，而YS10对大鼠阴茎阴茎海绵体内皮细胞和nNOS的恢复具有更显著的效果。

综上实验表明黄酮衍生物YS10具有修复阴茎海绵体平滑肌/胶原纤维比例失调，修复内皮细胞损伤，修复神经病变，恢复勃起功能的效果。黄酮衍生物YS10修复阴茎海绵体病理变化而恢复勃起功能的效果与脱水淫羊藿素比更好，其作用机制与激活内源性干细胞有关。黄酮衍生物YS10作为治疗ED的药物的组成物具有良好的应用前景。

Claims (8)

1.结构如下式的黄酮衍生物或其药学上可接受的盐，

其中，所述R1＝H，R2＝C₂-C₆链烯基，R3＝CH₃。

2.根据权利要求1所述黄酮衍生物或其药学上可接受的盐，其特征在于所述黄酮衍生物为，结构式如下：

3.根据权利要求2所述的黄酮衍生物或其药学上可接受的盐的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将脱水淫羊藿素与DMF混合后向其中加无水碳酸钾，搅拌后加入3-溴-2-甲基丙烯，加毕，置于室温下反应；

(2)反应结束后，将反应液倒入冰水中，搅拌后静置，抽滤，滤饼用水洗涤干燥，得所述的黄酮衍生物；

合成反应式如下：

4.根据权利要求1-2任一项所述的黄酮衍生物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗勃起功能障碍的药物中的用途。

5.根据权利要求4所述的黄酮衍生物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗勃起功能障碍的药物中的用途，其特征在于，所述黄酮衍生物或其药学上可接受的盐的给药剂量为0.5-2mg/kg/d。

6.根据权利要求1-2任一项所述的黄酮衍生物或其药学上可接受的盐在制备激活机体内源性干细胞的药物中的用途，其特征在于，所述药物用于治疗退行性病变，所述退行性病变包括慢性肾病、生殖功能障碍或视网膜病变。

7.根据权利要求4所述黄酮衍生物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗勃起功能障碍的药物中的用途，其特征在于，所述药物的制剂为片剂、胶囊、喷雾剂或注射剂。

8.根据权利要求6所述黄酮衍生物或其药学上可接受的盐在制备激活机体内源性干细胞的药物中的用途，其特征在于，所述药物的制剂为片剂、胶囊、喷雾剂或注射剂。

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