CN1954825B - 超微通心络中药组合物及其新用途 - Google Patents

Abstract

一种超微通心络中药组合物，其新的临床用途包括：减轻动脉粥样硬化后血管内皮损伤；能缩小AMI再灌注后无再流面积和梗死范围；对猪冠脉痉挛有明显的解痉作用，同时对管腔狭窄也有明显的抑制作用；抑制高脂血症及动脉粥样硬化的发生；对血管管腔狭窄有明显的改善作用；可使小鼠心肌合血浆NO下降和eNOS表达下降；可通过抑制心肌胶原的合成达到抑制心梗后心室重构的目的；有效改善MCAO大鼠的缺血损伤；可促VEGF表达上调，内皮细胞增殖；对痔疮具有良好治疗效果；对血栓闭塞性脉管炎动脉粥样硬化闭塞症有良好疗效。可抑制血小板聚集；提高大鼠纤溶活性；降低血瘀症大鼠血浆粘度；在促进脂质调控基因PPARγ表达表现出很强的生物学活性。

Description

超微通心络中药组合物及其新用途

技术领域

本发明涉及超微通心络中药组合物及其几种新用途，属于中医药领域。

背景技术

冠状动脉硬化性心脏病是指冠状动脉壁形成斑块，导致血管腔狭窄或阻塞引起心肌缺血、缺氧，与冠脉痉挛归为缺血性心脏病范畴。

通心络胶囊是吴以岭教授研制发明并已获得专利(ZL01131203.3)的治疗心脑血管系统疾病的三类中成药。吴以岭教授首创运用中医络病理论，探讨冠心病的发病机理，并将全蝎、蜈蚣、土元、水蛭和蝉蜕等五种虫类药运用于冠心病心绞痛的治疗中，对于冠心病、心绞痛、脑血栓等疾病具有独特的疗效。通心络胶囊组方由全蝎、水蛭、蜈蚣、土鳖虫、蝉蜕、人参、乳香、赤芍、降香、檀香、冰片和酸枣仁组成，其独特在于集中应用五种活血通络和搜风解痉虫类药全蝎、水蛭、蜈蚣、土鳖虫和蝉蜕，在对冠心病、心绞痛尤其是变异性心绞痛的治疗中体现出很好的疗效。但是由于虫类药在开发与应用中存在许多难点，如多数活性成分不完全明确，提取精制方法尚不成熟，缺乏对照品，所以在生产工艺中它们都采用传统的直接粉碎法制成药粉入药。但是传统的粉碎工艺存在：1)不能破坏细胞结构，影响药材中有效成分的释放和溶出需要穿过细胞膜；2)粉碎过程由于机械热能影响，温度可达80℃以上，对虫类药蛋白质类有效成分的稳定性造成负面影响；3)虫类药材不同部位的粉碎难易程度不同，因颗粒差异而引起混合不均匀的现象，影响产品质量的均一性等问题。这些问题也直接影响到药品药效成分的稳定性和人体的吸收，从而使得药品疗效下降。为此，发明人通过大量的实验进行研究，对这些虫类药的粉碎工艺采用微粉化技术加以改进，获得超微药粉，大大提高了疗效，从而完成了本发明所述的超微通心络中药组合物，并已经在先申请了制备工艺等内容的专利，专利申请号为：200410048292.2。

发明内容

本发明的目的是在现有技术的基础上提供超微通心络中药组合物的几种新的临床用途。

本专利是对已经申请在先的专利(申请号为：200410048292.2)的进一步改进和描述，是在原专利内容的基础上，提供几种新的临床应用，所以申请号200410048292.2的专利内容被全文引用于本发明，此处也不再描述该超微通心络中药组合物组分的用量特征及制备工艺，该部分内容请参见申请号200410048292.2的专利文本。

下面对本发明所涉及的内容逐一进行详细说明。

我们经过在大量的动物试验或临床研究，终于发现超微通心络中药组合物具有以下的临床新用途，并最终经过科学试验得到证明，从而完成了本发明，其具体的新用途包括以下几种：

1、超微粉通心络可通过降低家兔实验性动脉粥样硬化血清胆固醇，抗氧化等途径，减轻动脉粥样硬化后血管内皮损伤，且作用优于普通通心络。

2、通心络超微粉能显著缩小AMI再灌注后无再流面积和梗死范围，且作用优于普通通心络。

3、超微粉通心络对5-HT诱导的猪冠脉痉挛有明显的解痉作用，同时对IL-1包裹部位血管管腔狭窄也有明显的抑制作用，而且作用较普通通心络更强。

4、超微通心络可通过抑制血清高敏C反应蛋白(hs-CRP)等途径抑制高脂血症及动脉粥样硬化的发生，同时对已形成的动脉粥样硬化有明显的稳定作用，而且超微粉通心络作用明显强于普通通心络。

5、超微粉通心络对高脂饮食合并血管成形术后血脂和血管管腔狭窄有明显的改善作用，且作用明显由于普通通心络。

6、超微粉通心络可明显升高垂体后叶素致小鼠心肌和血浆NO下降和eNOS表达下降，且作用由于普通通心络

7、中药通心络超微粉可不同程度地降低梗死区与非梗死区胶原含量，降低心肌局部的Ang II水平，改善超微结构的病理变化，可通过抑制心肌胶原的合成达到干预重构的目的。

8、通心络超微粉能有效改善MCAO大鼠的缺血损伤。

9、通心络超微粉可通过促VEGF表达上调，内皮细胞增殖，从而保护脑毛细血管内皮细胞，促进毛细血管新生。

10、超微通心络胶囊对H期内痔、混合痔两种类型痔疮的临床疗效治疗组与对照组强力痔灵片比较，差异统计学意义(p＜0.05)；对便血、疼痛、坠胀等症状的改善，治疗组明显优于对照组，具有统计学意义。

11、超微粉通心络对月桂酸引起血栓闭塞性脉管炎有良好的预防及治疗作用

12、超微粉通心络胶囊对家兔髂股动脉粥样硬化闭塞症有良好的治疗作用

13、超微通心络可通过抑制血小板聚集从而有抗心肌缺血作用；超微粉通心络对正常大鼠纤溶活性有一定程度提高；超微粉通心络可明显降低血瘀症大鼠血浆粘度，增高其红细胞变形能力。

14、超微粉碎通心络在促进脂质调控基因PPARγ表达，尤其是在缺失CD1d蛋白的细胞中该基因的表达表现出现比普通通心络更强的生物学活性。

具体实施方式

下面通过具体的药理或临床实施例实验对本发明所提供的新用途予以进一步的说明。

实施例药理实验1

通心络超微粉对动脉粥样硬化内皮功能损害作用研究

实验目的  观察通心络超微粉治疗对动脉粥样硬化(AS)血管内皮功能的改变的影响，以评价通心络超微粉对AS的治疗作用。

动物模型的制备和分组  56健康雄性新西兰白兔(体重2.5-3.0Kg)随机分为两组：正常饮食组(普通饲料饲养，6只)，和高脂饮食组(高胆固醇高脂饲料喂养，5只)，8周后高脂饮食组成动脉粥样硬化模型，再将它们随机分为6组：继续高脂饮食组(10只)，普通通心络组0.5g/kg，超微粉通心络组(1、0.5、0.2g/kg)，共喂养12周。

指标检测

血清总胆固醇浓度测定  于实验开始前，第8周，第12周兔耳中央动脉取血行血清总胆固醇测定。

血管内皮功能的检测  通心络超微粉治疗4周后所有家兔均经气体检塞法处死，迅速取其胸主动脉作离体实验，观察它们对不同浓度乙酰胆碱(Ach)的舒张反应，以判断内皮功能。具体实验步骤如下：离体胸主动脉置于通以95％O₂+5％CO₂混合气体的克氏液(NaCl 118，KCl 4.8，MgSO₄ 1.2，NaCO₃ 24，葡萄糖11，及依地酸0.03mol/L)中。清除血管周围组织，冲洗血管内血液，剪成长4～5mm血管环，冲洗血管内血液，用不锈钢钩固定于含克氏液的浴槽，并通过张力换能器将血管收缩与舒张反应记录于二道生理记录仪。设定静息张力为3g，平衡120分钟后，用苯肾上腺素(Phe 10^-7mol/L)预收缩血管环，达坪值后分别用10^-9～10^-5mol/L Ach累加剂量舒张血管环，观察Ach引起的内皮依赖性血管舒张(EDR)反应。血管环冲洗后平衡15min，再用苯肾上腺素收缩血管环，达坪值后分别用累加剂量的硝普钠(SNP，10^-8～10^-6mol/L)舒张血管，观察SNP引起的非内皮依赖性舒张反应。

胸主动脉丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、总NOS活性的检测：MDA、GSH-PX活力、总NOS活性测定试剂购自南京建成生物工程研究所。MDA应用硫代巴比妥酸比色法测定，GSH-PX活力用二硫代二硝基苯甲酸比色法测定，总NOS活性用催化L-Arg法测定。数据处理：11.0软件包，所有数据均以X±SD表示，组间比较用方差分析。

实验结果

血脂

8周时高脂饮食组动物血脂水平显著升高，而通心络超微粉治疗后血脂水平下降，超微粉高剂量显著下降(见表1)。

表1超微粉通心络对家兔血胆固醇水平的变化

注：与正常对照组比较：*：P＜0.01；与高脂饮食组比较：##：P＜0.01

内皮依赖性血管舒张反应(EDR)

高脂饮食组动物主动脉对不同浓度Ach的舒张反应明显减弱，而通心络超微粉和氟伐他汀治疗可改善高脂饮食动物的EDR。各组动物对硝普钠的非内皮依赖舒张反应无显著性差异。GSH-PX，MDA和NOS水平测定

与高脂饮食组比较，通心络超微粉组和普通通心络组GSH-PX活性增高，MDA水平下降，NOS活性水平升高，与普通通心络组比较，超微粉高剂量可明显降低MDA含量，升高NOS水平见表2。

表2超微粉通心络对家兔胸主动脉GSH-PX/MDA和NOS水平的影响

注：与正常对照组比较：*：P＜0.05；与高脂饮食组比较：#P＜0.05，##：P＜0.01；与普通通心络组比※P＜0.05。

分析：综合以上实验结果，超微粉通心络可通过降低家兔实验性动脉粥样硬化血清胆固醇，抗氧化等途径，减轻动脉粥样硬化后血管内皮损伤，且作用优于普通通心络。

实施例药理实验2

超微粉通心络对急性心肌梗死再灌注后无再流的影响

实验目的：本研究应用MCE技术和病理学检查评价通心络超微粉对AMI再灌注后无再流的影响。

分组与给药：采用超微粉通心络胶囊剂S1，其给药量分别为0.05g生药/Kg、0.2g生药/Kg和0.5g生药/Kg；采用普通通心络胶囊剂D1，其给药量为0.2g生药/Kg；另设模型组对照组。

实验动物：选用中华小型猪40只(购于农业大学)，雌雄不拘，体重30kg左右。

造模方法：于猪胸骨正中打开胸腔，纵行切开心包膜，暴露心脏，并将心包膜缝合于胸壁呈吊篮状，于冠状动脉左前降支(LAD)远端1/3-1/2处，将结扎线穿入一长约3-4cm的硅胶管腔内结扎3小时，再松解1小时建立AMI及再灌注模型。假手术组冠脉下只穿线，不结扎，无AMI，也无再灌注。

指标检测

MCE检查和图像分析

使用HP5500型超声仪，置探头于心脏表面的水囊中，取左心室短轴乳头肌水平切面，于AMI前、AMI后3小时、再灌注1小时三个不同时间点行MCE检查，从右侧股静脉以弹丸注射方式推注0.05ml/kg声学造影剂SONOVUE(Bracco Inc.，Geneva，Switzerland)，用录像带(VCR)持续记录自造影剂注射前30秒至心肌显影消失的MCE图像。图像分析时，在超声仪上回放MCE录像，用描迹方法分别测量AMI 3小时的左心室室壁心肌面积(LVWA)和无心肌显影的灌注缺损区面积即结扎区心肌面积(Ligation area，LA)，两者之比为结扎区心肌范围(％LA)。同样，测量再灌注60min的无心肌显影灌注缺损区面积，即无再流区面积(Area of no-reflow，ANR)，ANR与LA之比为无再流范围(％ANR)。

病理下无再流及心梗面积的测定

再灌注60min后，从左心室注入1ml/kg 4％的硫磺素(thioflavin-S)，使再灌注区着色，无再流区不着色；再于原位重新结扎前降支，从左心室再注入Evan’s蓝，使结扎区外着蓝色，结扎区不着蓝色。立即取出心脏，并沿心脏长轴分为5～6心肌短轴切片，结果非结扎区心肌呈蓝色，结扎区在荧光下无再流区不显色，有再流处显色。计算出左心室室壁心肌面积(LVWA)、结扎区(无蓝色)心肌面积(Ligation area，LA)及无再流区(荧光下不显色)面积(ANR)；同样依LA/LVWA计算出结扎区心肌范围(％LA)，依ANR/LA计算出心肌无再流心肌范围(％ANR)。最后，将整个心肌切片放入1％的四氮唑红(triphenyltetrazoliumchloride，TTC)溶液(PH7.4)中，37℃孵箱中孵化15分钟，梗死心肌不着色，非梗死部位心肌呈砖红色，立即对切片进行拍照，计算出梗死心肌面积(necrosis area，NA)，以NR与LA之比作为坏死心肌范围(％NA)。

统计学分析：

本研究所有资料均用SPSS 10.0统计学软件进行统计学处理。资料以均数±标准差(X±S)表示，组间比较用方差分析。

实验结果：

通心络超微粉对猪AMI再灌注后心肌无再流和梗死范围的影响

结果如下表所示，与模型组相比，大、中和小剂量通心络超微粉组％LA均无显著差异，但两方法所测％ANR在小、中和大剂量组均显著降低(P＜0.01)，且超微粉通心络中、大剂量比普通通心络组也显著降低(P＜0.05)；％NA在小、中和大剂量组也显著降低(P＜0.05或P＜0.01)，且超微粉通心络中、大剂量比普通通心络组也显著降低(P＜0.05或P＜0.01)，提示通心络超微粉能显著缩小AMI再灌注后无再流面积和梗死范围，且作用优于普通通心络。

表1通心络超微粉各组对猪AMI再灌注后心肌无再流范围和坏死范围的影响

注：与对照组相比：▲P＜0.05；▲▲P＜0.01；与普通通心络组相比：#P＜0.05，##P＜0.01。

LA％、ANR％和％NA分别代表结扎区心肌范围(％)、无再流心肌范围(％)和坏死心肌范围(％)。

分析：通过以上实验发现，超微粉通心络对猪AMI再灌注后心肌无再流范围和坏死范围有明显的减少，而且超微粉通心络较普通通心络作用明显增强。

实施例药理实验3

通心络超微粉抑制IL-1β介导的小型家猪冠状动脉痉挛的作用

实验目的：在体观察超微粉通心络抑制猪冠状动脉痉挛的作用。

分组与给药：将成功建立冠状动脉痉挛模型的动物随机分成：模型对照组和处理组(分别包括采用超微粉通心络胶囊剂S1，其给药量分别为0.05g生药/Kg、0.2g生药/Kg和0.5g生药/Kg；采用普通通心络胶囊剂D1，其给药量为0.2g生药/Kg)共5组，连续喂养4周后停药1周，进行第二次造影。

冠状动脉痉挛模型的建立：动物适应性饲养一周，均喂养专用颗粒饲料。

给予安定(1mg/kg)，盐酸氯氨酮镇静(1.5mg/kg I.m.)，苯巴比妥钠麻醉(30mg/kg i.v.)。耳缘静脉建立静脉通路，气管插管，呼吸机辅助呼吸。在无菌条件下，进行左侧开胸手术。选

择左前降支及回旋支近端管腔外径近似相同的两处节段进行仔细分离，在血管外膜包裹吸附白细胞介素-1(IL-1β，2.5ug)的纸巾，然后关胸。术后，给予抗生素(青霉素80万单位bid im)。

指标检测

观察局部冠状动脉粥样硬化情况及诱发痉挛情况：手术后2周用上述同样方法麻醉动物，选择右颈动脉，在肝素化(10000U/头)后，经颈动脉插入6F鞘管，然后在X光下插入6F Judkins导管至冠脉开口处，取左前斜位(左前斜30°+头位20°)，注入造影剂进行冠状动脉造影，观察局部冠状动脉粥样硬化及狭窄情况，然后经造影导管注入五羟色胺(10ug/kg)诱发冠状动脉痉挛，并同时用电影血管造影系统连续记录造影图像。

观察通心络超微粉对冠状动脉痉挛的作用：模型对照组及通心络超微粉组1动物进行第二次造影，观察通心络超微粉对冠状动脉粥样硬化及痉挛的作用，记录结果。

病理标本采集：造影结束后用致死剂量苯巴比妥(1500-2000mg)处死动物，放血摘除心脏。截取包裹纸巾的冠脉节段，分为三段，分别置于4％多聚甲醛中固定(用于光镜检测)。

病理检查：光镜：HE染色，观察血管形态学变化，并采用计算机图像分析系统计算管腔面积，内弹力板包裹面积，外弹力板包裹面积。

数据统计学处理：使用SPSS11.5软件进行分析处理，所有数据采用均数±标准差(X±SD)，组间比较计数资料采用t检验，计量资料采用X²检验。

实验结果

冠状动脉痉挛模型建立成功：开胸手术后2周，冠状动脉造影显示，小型猪冠状动脉局部血管发生动脉粥样硬化性改变和不同程度的管腔狭窄(10-30％)，5-羟色胺能诱发其痉挛；

各组诱发冠状动脉痉挛情况：模型对照组5(83％)血管段，5-羟色胺诱发痉挛阳性，1(17％)血管段，5-羟色胺诱发痉挛阴性；普通通心络组3(50％)血管段，5-羟色胺诱发痉挛阳性；通心络超微粉组高、中、低剂量组阳性率分别为1(17％)、2(33％)、3(50％)，结果表明通心络各治疗组阳性率显著下降，表明通心络有明显解除5-羟色胺诱发冠脉痉挛的作用，而且超微粉通心络活性显著优于普通通心络。

病理学检测：模型对照组包裹吸附IL-1β纸巾处冠脉血管段管壁不光滑，内膜增厚，管腔狭窄。通心络超微粉组包裹吸附IL-1β纸巾处冠脉血管段内膜增厚及管腔狭窄程度较对照组明显减轻，超微粉大剂量与普通通心络比较冠脉血管内膜面积明显减小。

表1超微粉通心络对猪冠脉管腔狭窄程度的影响(X±SD)

注：与模型对照组比较^*P＜0.05，^**P＜0.05；与普通通心络组比较#P＜0.05

分析：根据以上实验结果表明超微粉通心络对5-HT诱导的猪冠脉痉挛有明显的解痉作用，同时对IL-1包裹部位血管管腔狭窄也有明显的抑制作用，而且作用较普通通心络更强。

实施例药理实验4

超微粉通心络胶囊稳定易损斑块的实验研究

实验目的：采用主动脉内皮损伤联合高脂饮食喂养建立动脉粥样硬化模型，观察超微粉通心络胶囊在稳定实验兔易损斑块中的作用。

分组与给药：采用超微粉通心络胶囊剂S1，其给药量分别为1.2g生药/Kg、0.6g生药/Kg和0.3g生药/Kg；采用普通通心络胶囊剂D1，其给药量为0.6g生药/Kg；另设普通饮食喂养自然消退组，继续高脂喂养对照组。

实验动物：雄性纯种日本大耳白兔60只，体重2.0～2.5kg，购自北京科宇动物养殖中心，许可证号SCXK(京)2002-2005。

造模方法：采用球囊损伤腹主动脉+高胆固醇饲料(1％胆固醇，每只喂养饲料120～140g.d^-1)喂养8周的方法，建立稳定动脉粥样硬化斑块模型，12周后分别给予中国斑点蝰蛇毒(ChineseRussell’s viper venom，CRVV)以及组胺进行药物触发(中国斑点蝰蛇毒(CRVV)0.15mg/kg腹膜下注射，30分钟后耳缘静脉注射组胺0.02mg/kg，处死动物前24h、48h两次药物触发)，以促使斑块发生实验性破裂，触发后处死。

指标检测

血脂及纤维蛋白原(Fib)：实验前兔禁食12h，耳缘静脉取血，血清检测血清总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)。

ELISA检查：药物触发前抽取兔耳缘静脉血4ml，分离血清-80℃冰箱冻存，测定血清高敏C反应蛋白(hs-CRP)的浓度。

血管内超声显像检查(IVUS)

药物触发后进行腹主动脉血管内超声检查。实验兔仰卧位固定，3％戊巴比妥钠麻醉后，穿刺左股动脉，插入鞘管，固定，立即静脉给予肝素抗凝，插入血管内超声探头导管，通过狭窄病变至血管远端，然后缓慢回撤探头导管，标记斑块远端、近端图像，测量斑块破裂率。病理检查：分别测量三组动物斑块破裂的发生率、斑块纤维帽厚度、内-中膜厚度(IMT)。

数据处理

数据以均数±标准差(X±S)表示，资料均用SPSS 10.0统计学软件进行统计学处理，组间比较采用方差分析。

实验结果

血脂

结果如表1所示，与高脂对照组比较，普通通心络胶囊TC、TG和LDL明显降低(P＜0.05或P＜0.01)，超微粉通心络胶囊TC、TG和LDL亦均明显降低(P＜0.05或P＜0.01)，但作用明显强于普通通心络组，且高剂量对HDL有明显升高作用(P＜0.05)。

表1超微粉通心络对兔血脂水平的影响(X±SD)

注：与高脂对照组比较^*P＜0.05，^**P＜0.05；与普通通心络组比较#P＜0.05

血清高敏C反应蛋白(hs-CRP)

结果如表2所示，与高脂对照组比较，普通通心络胶囊hs-CRP明显降低(P＜0.01)，超微粉通心络胶囊hs-CRP亦均明显降低(P＜0.01)，但与普通通心络组比较，超微粉通心络高剂量组明显降低，表明超微粉通心络作用趋势更强。

表2超微粉通心络对兔Hs-CRP的影响(X±SD)

注：与高脂对照组比较^*P＜0.05，^**P＜0.05；与普通通心络组比较#P＜0.05

腹主动脉斑块的破裂率：

药物触发后、高脂对照组死亡2只、斑块破裂2只；普通通心络破裂一只，余各组未见斑块破裂。表明超微粉通心络组对斑块有明显的稳定作用。

病理检查

各项指标的染色阳性信号均为细胞浆内的棕褐色颗粒。与高脂对照组比较，油红0染色阳性显著降低显著降低，各组无显著性差异。与高脂对照组比较，通心络各组腹主动脉斑块纤维帽的厚度显著增加(P＜0.05或P＜0.01)，且超微粉通心络与普通通心络比较腹主动脉斑块纤维帽显著增厚，各组内-中膜厚度(IMT)厚度显著减低(P＜0.05)，组间无显著性差异(表3)。

表3超微粉通心络对兔腹主动脉斑块厚度的影响(X±SD)

分析：综合以上实验分析通心络可通过抑制血清高敏C反应蛋白(hs-CRP)等途径抑制高脂血症及动脉粥样硬化的发生，同时对已形成的动脉粥样硬化有明显的稳定作用，而且超微粉通心络作用明显强于普通通心络。

实施例药理实验5

超微粉通心络对血管成形术后MAPK表达的影响

实验目的：观察超微粉通心络对血管成形术后内膜增殖中MAPK表达的影响。

给药与分组：采用高胆固醇喂养加两次动脉拉伤的方法。日本大耳白兔60只，体重2.5±0.5kg，月龄6-8个月，由中国医科大学实验动物部提供，单笼、恒温、恒湿度饲养，在适应性饲养1周后，随机分为3组：单纯拉伤组，高脂拉伤组，普通通心络0.2g/kg组，超微粉通心络高、中、低剂量组(1、0.5、0.2g/kg)，每组各10只。单纯拉伤组只喂普通饲料；高脂拉伤组喂普通饲料加胆固醇(1.5g/kg/d)8周，于血管成形术后停用胆固醇，只喂普通饲料；通心络干预组喂普通饲料加胆固醇(1.5g/kg/d)8周，于血管成形术后停用胆固醇，加用通心络4周。

造模方法：所有动物于喂养4周时经1侧腹动脉用3.5-4.0mm的球囊进行腹主动脉内皮剥脱，至喂养8周时经另1侧腹主动脉在X光下行腹主动脉造影，对造影显示狭窄超过30％的部位用3.5-4.0mm的带导丝球囊进行球囊扩张，压力为8-12kPa，扩张3次，每次30秒间隔1分钟。

标本采集和检测

血生化标本的采集与测定：在高胆固醇喂养前(0周)，动脉拉伤术前(4周)，血管成形术前(8周)及处死前(12周)，分别从耳缘静脉采血测定血脂(TG、TC、HDL-C、LDL-C)及内皮素(ET)和一氧化氮(NO)。血脂测定使用北京中山生物技术有限公司试剂盒，日立7060型全自动生化仪检测；ET使用北京东亚免疫研究所试剂盒，由中国医科大学同位素中心实验室测定；NO使用南京建成生物有限公司试剂盒，采用分光光度法，由中国医科大学第一临床学院中心实验室测定。

动物处死及标本采集：动物气栓处死，4％多聚甲醛原位血管内膜灌流固定，根据X光照片留取血管成形术部位血管做标本进行相应检测。

血管形态学检测：病变血管标本固定后经梯度酒精脱水，透明，石蜡包埋，制成蜡块，切片5μm厚。HE染色后分组行计算机图像分析，测定管腔面积(LA)、内弹力极包绕面积(IEA)、外弹力极包绕面(EEA)，再计算出内膜面积(NIA)＝IEA-LA，中膜面积(MA)＝EEA-IEA。

MAPK(ERK1，ERK2)的免疫组化染色：石蜡切片，采用标准SABC法，DAB显色，抗体购自SantaCruz USA，试剂盒为北京中山生物技术有限公司生产，染色后利用计算机图像分析系统测定阳性细胞面积的百分比。

数据处理：所有数据采用均值±标准差(X±SD)表示，组间比较采用方差分析。

实验结果

血脂水平的变化：与单纯拉伤相比，高脂拉伤组和通心络超微粉组TC、LDL-C、TG明显升高；8周时超微粉大剂量组比高脂拉伤组LDL-C明显降低；12周时，通心络各组TC、LDL-C较高脂拉伤组明显下降(P＜0.05)，且超微粉高剂量较普通通心络有显著差异(P＜0.05)。见表1。

表1各组血脂水平变化(X±SD，mmol/L)

注：*与单纯拉伤组相比P＜0.05；△与高脂拉伤组相比P＜0.05；#与普通通心络组比P＜0.05ET和NO水平的变化：与单纯拉伤组相比，高脂拉伤组和通心络组ET水平0周、4周、8周呈逐渐升高趋势，两组间无明显差异；到12周时通心络组ET水平下降与高脂拉伤组相比差异显著(P＜0.05)；而NO水平，与单纯拉伤组相比，高脂拉伤组和通心络超微粉组NO水平均呈下降趋势，8周时超微粉组与高脂拉伤组和普通通心络比较均出现显著性差异，至12周时通心络组NO水平则明显升高过高脂拉伤组差异显著(P＜0.05)，超微粉组增加趋势稍显明显，但无统计学差异。见表2。

表2各组ET和NO水平变化(X±SD)

注：*与单纯拉伤组相比P＜0.05；△与高脂拉伤组相比P＜0.05；#与普通通心络组比P＜0.05血管形态学测定结果

与高脂拉伤组比较，通心络各组管腔面积(LA)均增大，中膜面积减小，且超微粉高剂量组较普通通心络组减小更明显(P＜0.05)。

表3血管形态学测量结果(X±SD，mm2)

注：*与单纯拉伤组相比P＜0.05；△与高脂拉伤组相比P＜0.05；#与普通通心络组比P＜0.05MAPK(ERK1、ERK2)的免疫组化结果

ERK₁及ERK₂主要为胞浆阳性，阳性细胞主要集中在内膜和内弹力板区域，单纯拉伤组阳性细胞很少，散布于内膜，阳性细胞面积为20.67±1.38mm²(ERK₁)和19.55±1.19mm²(ERK₂)而高脂拉伤组阳性细胞密度较高，密布于内膜和内弹力板周围区域，阳性细胞面积为35.93±2.99mm²(ERK₁)和38.553.57mm²(ERK₂)；通心络超微粉各组阳性细胞多于单纯拉伤组但明显少于高脂拉伤组，阳性细胞主要分布在内弹力板区域，阳性细胞面积为明显减小，与高脂拉伤组相比差异显著(P＜0.05)。

分析：从以上结果可以发现，超微粉通心络对高脂饮食合并血管成形术后血脂和血管管腔狭窄有明显的改善作用，且作用明显由于普通通心络，其机制可能与保护血管内皮，降低血清ET升高内皮NO分泌，及抑制血管MAPK表达有关。

实施例药理实验6

超微粉通心络对缺血心肌NO的影响研究

实验目的：观察超微粉通心络对缺血心肌NO的水平和eNOS的表达，进一步探讨通心络超微粉抗心肌缺血的机制。

分组与给药：正常对照组、单纯心肌缺血组(模型组)、普通通心络0.30g/kg组、超微粉通心络高、中、低剂量组(0.15、0.30、0.60g/kg)。各剂量组每天灌胃1次，正常对照组及单纯心肌缺血组每日给予相同体积蒸馏水，连续5天。

实验动物：普通级昆明种小鼠，体重22±2g，雄性，由北京维通利华实验动物中心提供。检测指标及方法：模型及各用药组小鼠在第五天灌胃30分钟后腹腔注射垂体后叶素(剂量0.6u/20g体重)，正常对照组第五日腹腔注射等体积生理盐水，30min后五组动物处死取血浆及心肌组织检测以下指标：用酶法检测心肌组织及血浆NO含量(检测试剂盒购于深圳晶美生物工程有限公司)，使用免疫组化的方法检测心肌组织eNOS活性(博士德公司试剂盒)。

免疫组织化学染色：

实验终止时，取心肌放入4％多聚甲醛中固定，常规脱水.石蜡包埋，切片，然后按SABC免疫组化试剂盒进行操作，最后封片于光镜下观察，并随机选取5个视野进行灰度测定。

实验数据统计处理：计量资料以均数±标准差(X±SD)表示。组间比较运用单因素方差分析检验，各统计资料均用SPSS8.0统计软件处理。

实验结果

超微粉通心络对心肌缺血小鼠血浆、心肌组织NO(一氧化氮)水平的影响：

与正常组相比，心肌缺血模型组血浆、心肌组织NO水平显著下降(P＜0.01)，普通通心络组和超微粉通心络高、中、低三个剂量组均可以显著提高血浆及心肌组织中NO水平(P＜0.01或P＜0.05)，对心肌组织中NO的升高作用，超微粉高剂量明显强于普通通心络(P＜0.05)。

表1各组小鼠血浆、心肌组织NO(一氧化氮)水平

注：与正常组相比*P＜0.05；与模型组相比△P＜0.05；与普通通心络组比#P＜0.05超微粉通心络对心肌组织eNOS(内皮型一氧化氮合酶)水平的影响：

表2结果显示，模型组小鼠在腹腔注射Pit 30分钟后，心肌细胞中eNOS的阳性单位有所下降，超微粉通心络随着剂量的升高，可明显升高心肌细胞中eNOS的阳性单位。说明超微粉通心络可以升高心肌细胞中的eNOS的活性。

表2：小鼠心肌组织eNOS免疫组化染色结果灰度分析

分析：以上实验证实超微粉通心络可明显升高垂体后叶素致小鼠心肌合血浆NO下降和eNOS表达下降，且作用由于普通通心络，进一步证实超微粉可能通过改善内皮功能、减轻内皮损伤，保护缺血后心肌损伤。

实施例药理实验7

通心络超微粉对心梗后心室重构大鼠心肌间质胶原重构影响的实验研究

目的  探讨心肌梗死后心室重构过程中心肌间质胶原的变化及其中药通心络超微粉对重构的影响。

方法  制备大鼠心肌梗死后心室重构模型，随机分成心室重构组、培多普利组、通心络超微粉组和通心络组，6周后分别检测血清I型胶原羧基末端肽(PICP)、血清III型胶原氨基末端肽(PIIINP)，梗死区与非梗死区胶原含量、血浆与心肌组织血管紧张素II(AngII)含量；透射电镜和扫描电镜观察超微组织结构的变化。

结果  在心肌梗死的心室重构过程中，血清PIIINP和PICP明显增高，经中药通心络超微粉治疗后，两者均有所改善。中药通心络超微粉可不同程度地降低梗死区与非梗死区胶原含量，降低心肌局部的Ang II水平，改善超微结构的病理变化。

结论  通心络超微粉可在一定程度上抑制大鼠心肌梗死后的心室重构。

心室重构(ventricular remodeling)是心肌受损后发生的一系列结构变化，它包括了心室大小、形态、室壁厚度和构成成份的改变⁽¹⁾。心室重构在细胞水平分成两部分，即心肌细胞的重构和心肌间质的重构。研究表明，心脏的功能不仅取决于心肌本身的舒缩功能，同时与心肌细胞外间质成份(extracellular matrix ECM)密切相关。心肌ECM的主要成份为心肌胶原网络，它不仅有支撑和连接作用，而且在协调力的传递，信息传递，营养传递等方面均能发挥十分重要的作用⁽²⁾。本研究观察了大鼠心肌梗死后心肌胶原的重构情况，并分别用培多普利(perindopril)、通心络和通心络超微粉作为干预药物，探讨中药通心络超微粉对胶原重构的干预作用。

材料与方法

一、模型制备

选用10周龄雄性SD大鼠，体重250-300克，由上海中医药大学实验动物中心提供。参照Pfeffer⁽³⁾和Fishein⁽⁴⁾报导的方法略加改进，制备心梗后心室重构大鼠动物模型。即氯氨酮80mg/kg腹腔注射麻醉，于胸骨左缘3-4肋间开胸，切开心包，迅速弹出心脏，在左心耳与肺动脉圆椎之间找到左冠状动脉，在动脉起始点下方2-3mm处，用6-0号丝线结扎左冠状动脉前降支后，将心脏送回胸腔，逐层关闭胸腔。术中经肉眼观察，梗死区呈苍白色；手术前后记录体表心电图，以术后II导联ST段弓背向上抬高为结扎成功的标志；假手术组不结扎前降支，余步骤与手术组相同。饲养6周后处死动物。

二、动物分组、饲养与给药

实验动物分成心室重构(VR)组，培多普利(PDP)组，通心络超微粉(TXLC)组，通心络(TXL)组，假手术(Sham)组共五组。模型制备后随机分入心室重构组，培多普利组，通心络超微粉组和通心络组，心室重构组与假手术组以生理盐水灌胃，每日三次，每次3ml；通心络组以通心络1g/kg/d灌胃，每日三次。通心络超微粉组以通心络超微粉0.6g/kg/d灌胃，每日三次。培多普利组以培多普利2mg/kg灌胃，每日一次。

所有动物均单笼饲养，饲养条件相同，药物与生理盐水均以编号表示，灌胃由动物中心专人按单盲法进行。

通心络超微粉由河北以岭药业有限公司提供，主要由人参、水蛭、全蝎等组成。卫药准字(97)Z-001号。

三、方法

1.血清I型胶原羧基末端肽(PICP)、血清III型胶原氨基末端肽(PIIINP)含量测定

采用放免法测定，PICP和PIIINP放免试剂盒购自Orion Diagnostica公司。血清标本采自于大鼠腹主动脉，按放免试剂盒说明书进行测定。PICP批内CV：8.5％，批间CV：3.1％；PIIINP批内CV：4.3.％，批间CV：4.0％。

2.梗死区(IZ)和非梗死区(NIZ)胶原含量测定

参考文献⁽⁵⁾的方法，分别取左室IZ和NIZ心肌组织100mg，匀浆后将组织粉末置于3mol/L的HCL液，125℃酸解5小时，加氯胺T氧化变色，722型分光光度计于560nm处测得样本光密度值，对照标准曲线，求得羟脯氨酸含量，按公式换算成心肌胶原含量。

3.血浆、心肌组织AngII含量测定

参考文献⁽⁶⁾的方法，用放免法分别测定血浆、心肌组织Ang II的含量。组织Ang II试剂盒购自中国北方生物技术研究所，血清标本采自于大鼠腹主动脉，心肌取自大鼠左室非梗死区，操作按试剂说明书进行。

4.电镜标本制备及观察

透射电镜：取梗死交界区、室间隔各1mm大小的心肌，4％PBS戊二醛灌注固定，灌注压17.3-18.7Kpa，PH7.3。灌注30min后，由上海第二医科大学电镜室包埋切片，透射电镜观察。

扫描电镜：灌注过程同上，加2.5％戊二醛磷酸缓冲液，4℃固定1周，系列乙醇脱水，醋酸异戊酯过渡，HCP-2临界干燥仪干燥，HUS-5GB真空喷镀仪镀金，Philips--XL30扫描电镜观察。

5.统计学处理  所有数据均用SPSS统计软件进行t检验统计处理。

结果

通心络超微粉对心梗大鼠血清I型胶原羧基末端肽(PICP)、血清III型胶原氨基末端肽(PIIINP)的影响：

表1.大鼠血清PICP、PIIINP及心肌胶原含量测定

说明：**P＜0.01vs假手术组；△P＜0.05，△△P＜0.01vs心肌梗死组。

2.通心络超微粉对心梗大鼠梗死区和非梗死区胶原含量、血浆、心肌组织AngII水平的影响：

表2大鼠梗死区和非梗死区胶原含量、血浆、心肌组织Ang II水平

说明：**P＜0.01vs假手术组；△P＜0.05，△△P＜0.01vs心肌梗死组。

3.通心络超微粉对心梗大鼠心肌间质胶原形态结构的影响：

透射电镜显示：心室重构组间质纤维母细胞增生明显，呈高合成状态，间质胶原蛋白沉着明显，见典型的间质胶原纤维的沉积。培多普利组、通心络、通心络超微粉组上述病理改变程度较轻。假手术组病理改变不明显。

扫描电镜显示：心室重构组心肌间质胶原增生明显，部分过度增生而呈束状或网状分布。培多普利组、通心络、通心络超微粉组上述病理改变程度较轻。假手术组病理改变不明显。

讨论

心室重构是心肌梗死后导致心力衰竭的病理过程，重构的过程包括了梗死区膨展(infarct expansion，IE)和心室整体扩张(global ventricular dilatation GVD)两部分。IE源于梗死区不成比例地变薄与拉长，其结果使得局部室壁变形和内腔增大。GVD则为IE、非梗死区牵拉、室腔几何构形改变的共同结果。心肌梗死后6周内，IE、GVD共同构成了早期重构。本研究观察了通心络超微粉干预早期重构的情况。

心室重构从细胞水平上包括了心肌细胞的重构和心肌间质的重构。其中心肌间质的主要成分是心肌胶原网络，后者的重构是导致心肌间质重构主要的决定因素⁽⁷⁾。本研究观察了通心络超微粉对心肌间质胶原重构的影响。

PICP、PIIINP是I、III型胶原合成过程中的产物⁽⁸⁾。国外对终末期心力衰竭患者进行研究发现，血清PIIINP浓度与心肌III型胶原容积百分比的相关系数可达0.784⁽⁹⁾。对自发性高血压大鼠(SHR)血清PICP含量的检测则发现，血清PICP浓度与心肌胶原容积百分比呈正相关⁽¹⁰⁾。本研究发现在心肌梗死的心室重构过程中，血清PIIINP浓度和血清PICP浓度明显增高，经中药通心络超微粉治疗后，两者均有所改善。通心络超微粉可通过抑制心肌胶原的合成达到干预重构的目的。

心肌梗死后，心肌胶原基质在IZ和NIZ的伸展对愈合、构型改变、心电及传导异常、功能改变等至关重要。羟脯氨酸是构成胶原蛋白的主要成份，本研究表明，在心肌梗死后的早期重构过程中，IZ和NIZ的胶原含量均有所增高，尤以IZ为明显。中药通心络超微粉可不同程度地抑制心肌梗死后的胶原纤维的增生和/或减少胶原蛋白的沉积，从而改善心室顺应性，改善心脏的舒张功能。

在病理性的心肌肥厚中，心肌胶原的重构起着主要的和决定性作用⁽⁷⁾。心肌胶原的重构与RAAS密切相关⁽¹¹⁾。国外研究表明，RAAS在胶原基质的生化改建中发挥着重要的作用，ACEI可改善心肌梗死后胶原的代谢异常⁽¹²⁾。我们的相关研究表明，心梗后心梗组心肌组织中AngII的含量明显高于对照组，通心络超微粉均可不同程度地降低心肌局部的AngII水平，提示通心络超微粉均可通过抑制心肌自分泌和旁分泌的方式起到拮抗心肌重构的作用(全文另发)。本研究表明，通心络超微粉可以通过抑制心肌胶原异常代谢，达到抑制心肌胶原重构的目的。然而，通心络超微粉作用的确切途经和机制则有待进一步研究与探讨。

实施例药理实验8

通心络超微粉胶囊对大脑中动脉梗塞模型大鼠兴奋性氨基酸及内皮素基因表达的影响

通心络超微粉有较强的益气活血通络作用。我们在通心络超微粉治疗急性脑梗塞取得较好疗效的基础上观察通心络超微粉对大鼠大脑中动脉梗塞模型兴奋性氨基酸、内皮素及其基因表达的影响，旨在阐明通心络超微粉治疗急性脑血管病的确切疗效及其可能作用机理。

1.材料与方法

1.1大鼠大脑中动脉梗塞模型研制  大鼠大脑中动脉梗塞模型研制：雄性9周Wistar大鼠40只，体重205±15g，购自上海医科大学实验动物部。随机分为对照组、模型组、通心络、通心络超微粉组，每组各10只。大鼠可逆性大脑中动脉梗塞模型研制参照文献^[1]。大鼠以戊巴比妥钠50mg/kg ip麻醉，右侧股动脉插管监测血压，红外线灯保持动物肛温38℃。颈正中切口，依次暴露右侧颈总动脉、颈外动脉、颈内动脉，结扎颈外动脉远端及翼腭突动脉。在颈外动脉远心端分支处插入4-0聚丙烯手术缝线(线端预先加热成球形，直径0.3-0.35mm)，缓慢向颈内动脉推进插线，当进线约17-20mm时可感到明显的阻力，同时可见颈内动脉颅外段明显的屈曲、紧张，提示尼龙线已阻塞大脑中动脉，大鼠清醒后灌胃给通心络胶囊超微粉(0.6g/kg)。模型组以等体积生理盐水代替通心络超微粉，余同通心络超微粉组；对照组(假手术组)尼龙线只插到颅底没有阻塞大脑中动脉。

1.2动物神经功能评分  MCAO后3小时观察动物神经功能缺损状况。方法参照文献^[2]：大鼠无任何不对称活动为0分，提起尾巴时左前爪不能完全伸展为1分，在1分的基础上左前肢活动障碍为2分，左前肢紧贴胸壁为3分，大鼠自由活动时向左侧转弯为4分，4分伴有明显的左前爪后推动作为5分，只能围绕原点向左旋转为6分，左侧肢体完全不能支撑身体重量，只能躺向左侧为7分。

1.3兴奋性氨基酸检测  用高效液相色谱法(HPLC)测定兴奋性氨基酸含量。谷氨酸(Glu)麦门冬氨酸(MNDA)标准品购自Sigma公司。实验动物断头取海马秤重，加入10％磺基水杨酸钠冰浴，组织匀浆器4000转/分匀浆20秒，1000离心10min，取上清定溶量为2ml，移入Eppendorf管，-70℃保存待测。用磷苯二甲醛等柱前衍生。色谱条件：流动相A为甲醇∶PBS等于3∶7；流动相B为0.05mol/L的NaAc-HAC缓冲液，流速为2ml/min，柱温30℃检测波长为UV-360nm，色谱柱为Altex(4.6mm ID×25cmL)。

1.4内皮素含量测定及其基因表达  内皮素RIA检测药盒购自中国人民解放军总医院放射免疫研究所。实验大鼠断头取海马秤重，加入1mol/L预冷醋酸(W/V＝1.5)，组织匀浆器4000转/分匀浆20秒，4000rpm离心10min(4℃)，取上清-70℃保存待测。ET-1mRNA表达采有半定量逆转录-多聚酶链反应(sqRT-PCR)方法。根据ET-1的核酸序列，自行设计与合成PCR引物，上下游引物序列为：5’-CGT TGC TCC TGC TCC TCC TTG ATG G-3’；5’-AAG ATG CCA GCC ATG GAG AGC G-3’。经RT-PCR扩增的ET-1 cDNA序列，长度为546bp。取各组总mRNA1.0ug，按常规程序逆转录，42℃反应30min，95℃加热5min。再分别取5.0ul逆转录产物进行PCR扩增、变性、退火及延伸，温度分别为94℃、50℃、72℃，时间40s、30s、1min，循环30个周期。对DNA扩增带进行图象分析，测出IOD值进行比较。

1.4医学统计方法spss11.5软件进行卡方检验及t检验。

2.结果

2.1通心络起微粉时MCAO大鼠神经功能缺损的影响

大鼠MCAO3小时几乎所有动物都有程度不同的神经功能缺损。通心络、通心络超微粉组神经功能缺损评分明显低于模型组，P＜0.01。提示通心络超微粉能有效改善大鼠MCAO3小时的神经功能缺损。

表1通心络超微粉对MCAO大鼠神经功能缺损的影响(X±SD)

与模型组比较**P＜0.01

2.2通心络超微粉对MCAO大鼠模型中枢兴奋性氨基酸的影响 如表2所示，大鼠MCAO3小时海马谷氨酸、麦门冬氨酸等兴奋性氨基酸含量明显升高，与模型组比较，通心络、通心络超微粉组谷氨酸与麦门冬氨酸含量明显低于模型组(P＜0.01)。

表2通心络超微粉对MCAO大鼠海马兴奋性氨基酸的影响(X±SD)

注：与对照组比较**P＜0.05；与模型组比较##P＜0.01.

2.3通心络超微粉时MCAO大鼠内皮素含量的影响 如表3所示，大鼠MCAO3小时海马内皮素含量明显升高，与对照组比较P＜0.01；通心络、通心络超微粉组内皮素含量明显低于模型组(P＜0.05)。

表3通心络超微粉对MCAO大鼠海马内皮素含量的影响

注：与对照组比较**P＜0.01；#与模型组比较P＜0.05.

2.4通心络超微粉对MCAO大鼠内皮素基因表达的影响

ET-1mRNA研究发现，各组均可见一条546bp特异带，经图象分析检测表明，大鼠MCAO3小时，中枢ET-1mRNA表达明显增强；通心络、通心络超微粉能降低MCAO大鼠的中枢ET-1mRNA表达。提示通心络超微粉能有效改善MCAO大鼠的缺血损伤。

3.讨论

中枢兴奋性氨基酸对急性缺血性中风神经细胞的毒性作用越来越引起国内外学者的重视。谷氨酸与麦门冬氨酸是中枢主要的兴奋性氨基酸，谷氨酸在中枢含量最高、分布最广、作用最强。在发生脑缺血的数分钟至数小时内，中枢兴奋性氨基酸即大量增高^[3]。本研究表明大鼠MCAO3小时，伴随着神经功能缺损，海马谷氨酸与麦门冬氨酸含量上升，与对照组比较P＜0.01。通心络、通心络超微粉可降低MCAO大鼠海马谷氨酸与麦门冬氨酸含量，降低神经功能缺损积分。

内皮素(endothelin ET)是1988年日本学者Yanagisawa从培养的猪主动脉内皮细胞分离纯化的一种多肽，是目前已知的最强血管收缩物质。ET由21个氨基酸组成其分子量约为2.4kD，分子内有两对由半胱氨酸残基构成的二硫键。人ET-1基因全长12464BP，基因结构有5个外显子与4个内含子组成。大量研究表明，急性脑缺血时，循环及脑组织内ET的合成与释放增加，进而促进Ca++内流，使缺血区域神经细胞内Ca++超载，加重脑细胞的损害。本研究资料表明，本研究表明大鼠MCAO3小时海马ET-1含量及ET-1mRNA表达显著增加，与文献报道一致^[4]。通心络、通心络超微粉可降低MCAO大鼠海马ET-1含量，抑制ET-1mRNA表达。

通心络超微粉胶囊为石家庄以岭药业有限公司生产，由蜈蚣、全蝎、水蛭、土蹩虫、蝉蜕、人参、赤芍、冰片等组成，是国家新药基金资助项目，功能益气活血通络解痉。本研究结果表明通心络超微粉胶囊对大脑中动脉梗塞大鼠模型神经功能缺损有改善作用，这可能与降低中枢兴奋性氨基酸、抑制内皮素含量及内皮素基因表达有关。为活血通络药治疗缺血性中风提供了现代科学依据。

实施例药理实验9

通心络超微粉促脑缺血后血管内皮生长因子表达的实验研究

摘要

目的：探讨通心络超微粉对大脑中动脉梗塞后血管内皮生长因子表达的影响。方法：以线栓法制成大鼠右侧大脑中动脉梗塞模型(MCAO)，大鼠随机分为假手术对照组、MCAO组、通心络超微粉干预组。以免疫组织化学法及HE染色法分别检测脑组织病理学变化、VEGF阳性表达。结果：大脑中动脉梗塞后，缺血区神经元变性、坏死、VEGF在半暗带有少量表达，经通心络超微粉干预后，VEGF大量表达。结论：通心络超微粉可通过促VEGF表达上调，内皮细胞增殖，从而保护脑毛细血管内皮细胞，促进毛细血管新生。

正文

目前，缺血性脑血管病的治疗以溶栓和神经保护治疗为主，无论是溶栓，还是神经保护治疗，目的为恢复缺血区脑组织的血液供应，保护微血管、神经元，促进毛细血管新生，侧枝循环重建，神经结构重塑，使神经功能尽快尽可能恢复^[1]。现已证实VEGF是血管内皮细胞特异性的促有丝分裂源，在病理情况下能促进内皮细胞分裂、增殖，使毛细血管新生^[2]。因此，如何促进血管内皮细胞生长因子表达上调、促脑毛细血管新生，是当前脑缺血研究的热点^[3]。迄今，在众多中药制剂中，尚无一种药物进行过这一方面的研究，通心络超微粉^[4]是根据中医理论研制而成的含多种虫类中药的复方制剂，具有益气活血的功效，在脑血管病治疗中具有良好的效果，因此本文选择通心络超微粉进行研究，观察通心络超微粉对脑梗塞后VEGF表达的作用。

1、材料与方法

1.1主要仪器和试剂

-70℃冰箱(Sharp，日本)

微量移液器(Gilson，法国)

BH-2型Olympus显微镜(日本)

彩色病理图像分析仪(日本)

VEGF兔多克隆抗体(Santa，美国)

SABC免疫组化试剂盒(武汉博士德公司)

1.2实验动物模型：雄性健康的Wistar大鼠(250±20g)，采用右侧大脑中动脉线栓法梗塞模型(MCAO)。3.5％的水合氯醛腹腔麻醉(10ml/kg)，大鼠仰卧位固定，经颈部切开暴露左侧颈总动脉(CA)、颈外动脉(ECA)、颈内动脉颅外段(ICA)，在颈外动脉近颈总动脉分叉处剪一切口，将栓子(尼龙绳线，直径0.24mm，长20mm)向颈内动脉颅内方向插入17.5-18mm遇阻力而停止，栓子头端即达大脑中动脉(MCA)起始部.将MCA起始部和ICA末端同时堵塞，同时用Zin氏夹，夹闭颈外动脉切口近端，缝合皮肤，栓塞即告完成。术后1小时，大鼠清醒，置单笼饲养观察，根据Berderson氏检查评级方法观察记录，大鼠术后爬行，不能走直线，而呈弯向栓塞血管对侧的环状爬行评为III级。

1.2实验分组：，实验随机分成3组，每组6只，假手术对照组，即手术过程及时间同其它组但不阻断血供，MCAO组：每日0.05ml/kg生理盐水连续灌胃7天后行右侧大脑中动脉梗塞术，术后III级大鼠入选，术后连续生理盐水灌胃7天，TXLC干预组：每日2.5g/kgTXLC连续灌胃7天后行MCAO手术，术后连续灌胃7天。

1.3组织学观察

大鼠处死后取脑置10％福尔马林液固定，常规切片，HE染色，进行组织学观察。

1.4VEGF蛋白表达的免疫组化染色

大鼠术后7天麻醉，左心室灌注固定后取脑，4％PFA(多聚甲醛)外固定，10％蔗糖浸泡后，液氮连冻1分钟，恒冷切片机上在大脑中部作冠状切片，切片冷风吹干，纯丙酮室温固定20-30分钟。SABC法检测VEGF蛋白表达。蒸镏水洗，纯甲醇加H₂O₂至0.5％，室温浸泡30分钟，以灭活内源性过氧化物酶，蒸馏水洗3次，滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟.甩去多余液体，不洗。滴加适当稀释的-抗，4℃过液。0.1MPBS冼2分钟×3次，滴加生物素化山羊抗免IgG，37℃，20分钟，0.1MPBS洗2分钟×3次，滴加试剂SABC，20-37℃，20分钟，0.1MPBS洗5分钟×4次，DAB显色，镜下控制反应时间，蒸馏水洗涤，脱水，透明，封片。显微镜观察。

1.5统计学分析：

所有资料以X±SD表示，两组间比较用t检验，P＜0.05为有统计学差异，P＜0.05为有统计学差异，P＜0.01认为具有显著性差异。

2、结果

2.1脑组织病理学改变

假手术对照组大鼠皮层组织，细胞排列有序，细胞结构完整，细胞内可见NiSS小体，核清楚，组织间隙无异常。MCAO组：神经细胞呈缺血性改变，核消失，胞体增大，染色变淡，边缘不规则，核固缩，细胞周围水肿明显，组织结构疏松，水肿明显，呈海棉状。TXLC干预组：缺血神经元数目减少，组织结构水肿减轻。

2.2VEGF免疫组化及图像分析

假手术对照组无VEGF阳性神经元表达，MCAO组在缺血中心及周边区神经元、缺血侧软脑膜细胞、海马神经元均有VEGF弱表达；TXLC干预组：较MCAO组，上述部位有VEGF强阳性表达。

3讨论

3.1脑缺血后VEGF的表达与新血管生成

血管新生，即原有的血管又产生新的血管。在成年器官，生理性的血管新生是很少见的。在月经期和怀孕期，女性生殖器官可以有血管新生。血管新生还可以发生在病理的情况下，例如缺血、炎症、伤口愈合等。血管新生是一个复杂的过程，包括一系列衔接非常准确的过程。脑血管闭塞以后，24小时内内皮细胞开始大量增殖，72小时缺血区有新生的毛细血管。毛细血管新生的范围与程度直接关系到缺血边缘区血流的改善，影响神经元生理功能的恢复，从而决定了患者的预后。新血管的形成来源于先前存在的血管的内皮细胞增殖，而内皮细胞增殖，有赖于VEGF的刺激^[7]。VEGF是一种内皮细胞的特异性有丝分裂源，在体外可促进内皮细胞的生长，在体内可诱导血管生成^[1]。这种作用主要是由于VEGF对血管内皮细胞的生长刺激作用和趋化作用，VEGF对内皮细胞的直接作用可能是通过激活细胞上的磷脂酶短暂地诱导Ca²⁺释放而发生的。VEGF为分泌性蛋白，作用于特异性受体，从而保护脑毛细血管内皮细胞，防止毛细血管消失，同时刺激内皮细胞增殖，血管新生，神经功能迅速恢复。

3.2通心络超微粉对缺血后VEGF表达及新血管生成的作用

既往的研究发现，脑缺血后血流增加可诱导VEGF的大量表达^[12]，通心络超微粉既往的试验表明它具有降低脑缺血后液粘度，降低脑血管阻力，增加脑缺血后脑血流量的作用^[4]，因此从理论上讲，具有诱导VEGF表达的可行性，本实验进一步证实了上述观点。在对MCAO大鼠进行通心络超微粉预防性和治疗性给药后，大鼠脑组织缺血半暗带神经元、海马神经元及软脑膜、室管膜等有大量的VEGF表达，结果表明：通心络超微粉能够通过促进VEGF大量表达而保护脑毛细血管内皮细胞，防止毛细血管消失，促毛细血管新生，从而具有脑保护功能。

实施例临床试验10

超微通心络胶囊治疗痔疮临床试验

摘要：目的：观察超微通心络胶囊依据络病理论治疗痔疮的临床疗效。方法：用通心络超微粉胶囊内服，并与强力脉痔灵片对照。结果：对II期内痔、混合痔两种类型痔疮的临床疗效治疗组与对照组比较，差异统计学意义(p＜0.05)；对便血、疼痛、坠胀等症状的改善，治疗组明显优于对照组，具有统计学意义。结论：通心络胶囊具有益气活血，通络止痛等功效，是一种安全、有效的中药制剂。

超微通心络胶囊系石家庄以岭药业股份有限公司生产的络病治疗药物，临床用于各个系统的疾病属于中医脉络瘀阻的治疗多年。为了评价该药治疗痔疮的临床疗效，我们于2003年7月起对超微通心络胶囊内服治疗痔疮进行临床疗效观察，并与内服强力脉痔灵片治疗作比较，共收治病人300例，其中起微通心络胶囊治疗组200例，强力脉痔灵片对照组100例，现总结如下。

1临床资料

1.1病例选择  观察病例共300例，均是2003年7月-2004年12月在河北医科大学附属以岭医院肛肠科门诊就诊的患者。诊断符合2000年4月中华医学会外科学会肛肠外科学组成都会议达成的“暂行标准”及2002年试行版《中药新药治疗痔疮的临床研究指导原则》的诊断标准，辨证分型属气虚血瘀络阻者。入选病例按随机双盲方法分成两组，其中超微通心络胶囊治疗组(以下简称治疗组)200例，男88例，女112例；年龄25-70岁，平均32岁；强力脉痔灵片对照组(以下简称对照组)100例，男38例，女62例；年龄21-69岁，平均31岁。两组病例在性别、年龄及病种方面差异无显著性意义(p＞0.05)。

1.2排除标准  炎性外痔及结缔组织外痔(前哨痔)；痔合并肛瘘、肛周脓肿、直肠息肉、肛乳头瘤及结缔组织外痔和静脉曲张性外痔；合并有严重心、肝、肾和造血系统等严重原发性疾病；妊娠及哺乳期妇女；过敏体质及对多种药物过敏者；不符合上述纳入标准，不按规定用药或无法判定疗效者。

2治疗方法

2.1治疗组  内服超微通心络胶囊(石家庄以岭药业股份有限公司生产)，每次4粒，每日3次。

2.2对照组  内服强力脉痔灵片(德国礼达大药厂生产)，每日2次，每次2片。

2.3疗程：内痔、外痔、混合痔治疗均以20天为1疗程。观察期间停用其他中西药物。治疗3个疗程统计疗效。

3疗效标准与治疗结果

3.1疗效标准  参照2002年试行版《中药新药治疗痔疮的临床研究指导原则》及1975年全国肛肠学术会议制订的标准。痊愈：症状、体征消失或基本消失，积分值减少≥95％，相关理化指标正常或基本正常。显效：症状、体征明显改善，积分值减少≥70％，相关理化指标明显改善。有效：症状、体征消失或基本消失，积分值减少≥30％，相关理化指标有相应好转。无效：症状、体征未见好转，积分值减少＜30％，相关理化指标无改善。主要症状的疗效则分为痊愈、显效、有效、无效4级。症状完全消失为痊愈，明显减轻为显效，有所改善为有效，无变化或加重为无效。

3.2治疗结果

3.2.1不同病种的治疗比较  见表1。

统计分析采用SPSS10.0软件进行统计分析，两组疗效比较采用Wilcox on秩和检验。

由表1可知，两组对II期内痔、混合痔两种痔疮疗效的比较，经Wilcox on秩和检验，有统计学意义(p＜0.05)。对I期内痔、外痔两种痔疮疗效，经Wilcox on秩和检验，无统计学意义(p＞0.05)，说明超微通心络胶囊对各种类型痔疮均有较好疗效，尤对治疗II期内痔、混合痔两种痔疮有良好疗效，优于对照组强力脉痔灵片。

3.2.2各组不同症状的疗效比较  见表2。

统计分析采用SPSS10.0软件进行统计分析，两组疗效比较采用Wilcox on秩和检验。

由表2可知，两组对便血、疼痛、坠胀的疗效比较，经Wilcox on秩和检验，有统计学意义(p＜0.05或p＜0.01)。说明超微通心络胶囊对上述症状的改善优于对照组强力脉痔灵片。

4讨论

中医学认为痔疮的发病原因复杂。“夫痔者，乃素积湿热，过食炙烻，或因久坐而血脉不行，又因七情而过伤生冷，以及担轻负重，竭力远行，气血纵横，经络交错；又或酒色过度，肠胃受伤，以致浊气瘀血，流注肛门，俱能发痔。”(《外科大成》)临床上常见疼痛、便血、坠胀、水肿、瘙痒等症状。络病学认为痔疮发病主要由于局部脉络瘀阻日久，阻碍脉络正常的功能，从而形成痔；治疗上应以活血通络为主，兼以补气以行血，从而达到血行络通，痔瘀消失的目的。石家庄以岭药业股份有限公司生产的超微通心络胶囊以活血通络见长，临床研究表明其对I期内痔、II期内痔、混合痔、外痔的总有效率分别为93.2％、89.7％、84.0％、87.5％，在II期内痔、混合痔的疗效优于对照组强力脉痔灵片(p＜0.05)。对便血、疼痛、水肿、坠胀、瘙痒等主要症状的疗效，亦均有良好疗效；尤其长于缓解便血、疼痛、坠胀症状，与强力脉痔灵片疗效有统计学意义。说明超微通心络胶囊具有迅速止血、止痛、止痒、消肿的作用，且疗效确切，是治疗各种痔疮的有效药物。

实施例药理实验11

超微粉通心络对月桂酸引起血栓闭塞性脉管炎的影响

实验目的：观察超微粉通心络对月桂酸引起血栓闭塞性脉管炎的预防及治疗作用。分组与给药：采用实施例所制备的超微粉通心络胶囊剂S1，其给药量分别为1.2g生药/Kg、0.6g生药/Kg和0.3g生药/Kg；采用对比例所制备的普通粉胶囊剂D1，其给药量为0.6g生药/Kg，样品给药3天后手术，术后再给药5天；模型组给予1％西黄蓍胶，另假手术组正常饮水饲养。

实验动物：Wistar大鼠，雄性，体重230～250g，60只(每组10只)，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号：SCXK 11-00-0008。

造模方法：大鼠连续给药3天，于第3次给药后1小时腹腔注射3％的戊巴比妥钠30mg/kg麻醉，仰卧固定，右下肢股内侧剪毛，75％的酒精消毒皮肤，纵行切开约1.5cm长的切口，游离股动脉，用动脉夹阻断血液，在动脉夹的下方向股动脉远心端注入0.2ml月桂酸溶液，ZT快速医用胶封闭针孔，1min后打开动脉夹，缝合皮肤。假手术组由股动脉注入0.2ml生理盐水。术后按上述方法连续给药5天。

观察指标：观察患肢皮肤温度、颜色、动脉搏动，患肢肿胀、坏疽和木乃伊化的病变程度和范围，并进行分级(0级：正常；I级：病变局限于趾甲部；II级：病变局限于趾部；III级：病变局限于足爪部；IV级：病变限于膝关节以下；V级：病变发展到膝关节以上)。病理学检查：截取大鼠整个右下肢，用10％的福尔马林固定，3天后用10％的硝酸脱钙，在足趾、踝关节上、下及股部4个部位横断切片，HE染色，每个标本分别取4张四部位切片放在一个盖玻片上，对动脉血栓进行分级(0级：无血栓形成；I级：一个血栓；II级：2-3个血栓；III级4个以上血栓)，同时分别对动脉壁炎性细胞浸润、纤维增生及血栓机化与再通等情况进行观察。

统计学方法

数据处理：数据资料均用秩和检验统计学处理，组间比较采用方差分析。

实验结果

大体观察

大鼠股动脉注入月桂酸后约5min，患侧足爪部变苍白继而青紫，皮肤温度降低，动脉搏动减弱或消失，次日受累的患肢出现水肿、糜烂等炎症反应，且足趾变黑，所有大鼠均有患肢疼痛、跛行和曳行现象，随着时间的推移逐渐向上发展，形成坏疽和木乃伊化。模型组的病变最为严重，少数动物术后表现为患肢水肿，糜烂及炎症反应，超微粉通心络高剂量组病变最轻，而假手术组均不出现病变，见表1。

病理学检查

病理结果表明，模型组大鼠患肢动脉内均有不同程度的血栓形成，阴性对照组的血栓形成分级全部为II和III级，超微粉通心络3个剂量组和复方丹参片组大鼠的血栓数明显减少，且随剂量增加其血栓分级降低，超微粉通心络高剂量组与模型组比较，在统计学上具有显著性差异(P＜0.05)。超微粉通心络中高剂量组及普通通心络血栓再通数增多，但除超微粉通心络高剂量组有一例发生血栓机化现象外，其余各组均未发现血栓机化(见表1)。

分析：本实验通过对血栓闭塞性脉管炎模型大鼠大体病变观察和病理学检查，显示超微粉通心络口服可通过抗血栓形成及溶栓等途径实现对TAO的预防及治疗作用，而且超微粉高剂量作用最为明显。

超微粉通心络对TAO大鼠肢体病变及动脉血栓的影响

实施例药理实验12

超微粉通心络胶囊对家兔髂股动脉粥样硬化闭塞症的影响

实验目的：观察超微粉通心络胶囊对家兔髂股动脉粥样硬化闭塞症的影响，研究该药的药理作用，为增加该药防治动脉硬化闭塞症提供实验依据。

实验动物：日本大耳白家兔，雄性，体重2.0-2.5kg，由北京通利实验动物养殖场提供。

仪器和试剂：超微粉通心络胶囊：试验用该药提取干粉，1.4g生药/g粉；胆固醇：北京双旋微生物培养基制品厂生产。复方泛影葡胺注射液(76％，X-线造影剂)：上海旭东海普药业有限公司生产；。RM-6100型四导生理记录仪，日本光电。TC2000型彩色超声多普勒，德国EM公司产品。

试验方法

一.动物分组和造模型

试验前称体重，测定右侧后肢远端皮肤温度，同时禁食过夜，然后将家兔随机分为：①假手术组(12只)，②造模组(68只)。造模组家兔采用机械损伤、免疫损伤、高脂饲料喂养等方法造模^[1-3]。造模组家兔每只每天给予50g高脂颗粒饲料(在普通饲料中加2％胆固醇和2％花生油)，再添加普通基础饲料100g，直至试验结束，假手术组家兔仅饲予普通基础饲料。高脂喂养3天后，用戊巴比妥钠麻醉(30mg/kg)，于右侧后肢膝关节下方逐层钝性分离股浅动脉，用20G穿刺针穿刺动脉，经穿刺针逆行插入导引钢丝(直径0.014)，撤出穿刺针，沿导引钢丝插入球囊导管(Cordis公司产品，球囊直径2.5mm，长20mm)至髂总动脉上端，连接手推式压力推注泵，向球囊内注入生理盐水使球囊内压力维持在8个大气压，缓慢回拉至入口处，回抽球囊内液体，减压至零，再将球囊送入，重复上述过程3次，撤出导管和导引钢丝，压迫止血，缝合伤口。假手术组家兔仅麻醉，于右侧后肢膝关节下方逐层钝性分离股浅动脉，但不穿刺动脉不进行内皮剥脱术。手术过程均为无菌操作，术后肌注青霉素80万单位/只，每日一次，连续5日。术后第7天，造模组家兔经耳缘静脉注射牛血清白蛋白250mg/kg，假手术组注射等体积生理盐水。术后2周，测定术侧(右侧，下同)后肢远端皮肤温度，并进行行为学观察。行为学观察每二周一次，直至试验结束。术后8周，称体重，测定术侧后肢远端皮肤温度，同时禁食过夜，耳中动脉取血，测定血脂(TC、TG、HDL-C、LDL-C)；然后随机取假手术组家兔1只，造模组家兔3只进行造影，并取其髂股动脉进行组织病理学检查。根据所测指标水平，挑选符合要求的家兔随机分组(每组8只)：假手术组、模型组、超微粉通心络胶囊0.8、0.4、0.2g生药g/kg剂量组，普通通心络0.4g/kg剂量组。并按所述剂量开始给各组家兔灌胃给药，假手术组和模型组家兔分别灌胃等体积蒸馏水，直至试验结束(术后20周)。给药期间，除假手术组外，其余各组家兔均继续喂饲高脂饲料。给药4周(即术后12周)、给药8周(即术后16周)、给药12周(即术后20周)均测定血液中血脂(TC、TG、HDL-C、LDL-C)，并称体重，测定术侧后肢远端皮肤温度，试验结束时即给药12周(术后20周)每组随机取2只家兔进行造影，并取髂股动脉进行组织病理学检查；其余家兔均采用气栓法处死，解剖取髂股动脉进行组织病理学检查。

二.检测指标和方法

1.行为学观察^[4]：放行20米，观察其行为变化，跛行程度分级如下：0级：静止时，重心居中，术侧后足静止屈度与健侧后足比较无异常；跑动时，术侧后足和健侧后足同时向后蹬，蹬幅和蹬力大小一样，无异常。1级：静止时，重心偏向健侧后足，术侧后足静止屈度欠佳，正向支撑；跑动时，健侧后足用力向后蹬，术侧后足侧向后蹬，蹬力尚可，但蹬幅小。2级：静止时，重心偏向健侧后足，术侧后足静止屈度欠佳，侧向支撑；跑动时，健侧后足用力向后蹬，术侧后足侧向后蹬，蹬幅和蹬力小。3级：静止时，重心偏向健侧后足，术侧后足静止屈度欠佳，侧向支撑；跑动时，健侧后足用力向后蹬，术侧后足侧向着地，偶见后蹬，且蹬幅和蹬力小，或术侧后足拖行。

2.术侧后肢远端皮肤温度测定：术侧后肢胫骨髁上方1cm处为测点，剃毛，将温度测定探头置其上，测试时环境保持安静，避免外界应激干扰，室温22-24℃，每次测定应待生理记录仪的计数恒定后准确记录其读数。

3.髂股动脉粥样硬化闭塞程度检查

(1)影像学观察：麻醉动物，分离腹主动脉，用动脉夹夹住近远端，用眼科小剪剪一小口，顺向插入5F鞘管，连接注射器，松开动脉夹，直接快速推注造影剂，造影机摄像。

(2)组织病理学观察：分离术侧后肢髂股动脉段(从术侧大腿内侧下1/4处向上至髂总动脉上端)，自髂总动脉上端向下，每1cm为一段，共取其5段髂股动脉，进行常规石蜡包埋、切片，行HE染色，用显微图像分析系统测量内膜厚度(从内皮细胞膜的腔面至内弹力膜波峰)、中膜厚度(从内弹力膜波峰至最外层弹力膜波峰)、内膜横截面积及管腔面积，计算内膜横截面积比率^[5](内膜横截面积比率＝内膜横截面积/(内膜横截面积+管腔面积)×100％)。

数据处理：数据以均数±标准差(X±S)表示，资料均用SPSS 10.0统计学软件进行统计学处理，组间比较采用方差分析。

试验结果

一.行为学观察(结果见表1)

表1.超微粉通心络胶囊对家兔行为学的影响(n＝8)

注：与模型组比较(采用参比差值法)^[7]

术后2周开始进行行为学观察，每2周观察一次，术后13周前未见各组家兔行为有明显异常。假手术组家兔直至试验结束时(术后20周)均未见术侧后肢行为异常，其它各组家兔从14周起术侧后肢开始有异常行为出现。术后18周、20周模型组家兔术侧后肢行为异常加重，术后18周(给药10周)超微粉通心络胶囊0.8g生药/kg剂量组及普通通心络家兔术侧后肢行为异常明显轻于模型组(p＜0.05)，超微粉通心络胶囊0.4g生药/kg剂量组及普通通心络组家兔术侧后肢行为异常程度与模型组比较有减轻趋势；术后20周(给药12周)超微粉通心络胶囊0.8g生药/kg、0.4g生药/kg剂量组、普通通心络组家兔术侧后肢行为异常明显轻于模型组(p＜0.05)。

二.对家兔术侧后肢远端皮肤温度的影响(结果见表2)

表3.超微粉通心络胶囊对家兔术侧后肢远端皮肤温度的影响(℃，)

注：与假手术组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较^△P＜0.05，^△△P＜0.01

由表2可见，试验前(0周)、术后2周、给药前(术后8周)、给药4周(术后12周)模型组术侧后肢远端皮肤温度与假手术组比较均无明显差异，各给药组与模型组比较亦均无明显差异；给药8周(术后16周)模型组术侧后肢远端皮肤温度明显低于假手术组(p＜0.05)，来适可组术侧后肢远端皮肤温度明显高于模型组(p＜0.05)，超微粉通心络胶囊0.8、0.4g生药/kg剂量组及普通通心络组术侧后肢远端皮肤温度与模型组比较有升高趋势；给药12周(术后20周)，模型组术侧后肢远端皮肤温度明显低于假手术组(p＜0.05)，超微粉通心络0.8g、0.4g生药/kg剂量组、普通通心络组术侧后肢远端皮肤温度均明显高于模型组(p＜0.05或p＜0.01)

三.对家兔髂股动脉粥样硬化闭塞程度的影响

1.影像学观察：术后8周血管造影可见，术侧后肢髂股动脉通畅，管壁光滑，无狭窄，远端血管显影良好，侧枝循环显影良好且通畅，假手术组与造模组比较无明显差异。术后20周血管造影可见，假手术组家兔术侧后肢髂股动脉通畅，管壁光滑，无狭窄，远端血管显影良好，侧枝循环显影良好且通畅，模型组家兔术侧后肢髂股动脉明显狭窄，欠通畅，远端血管显影欠佳，侧枝循环少。超微粉通心络胶囊0.8g、0.4g生药/kg剂量组、普通通心络组家兔术侧后肢髂股动脉狭窄程度均明显轻于模型组，远端血管显影明显较模型组清楚，侧枝循环较模型组多；超微粉通心络胶囊0.2g生药/kg剂量组家兔术侧后肢髂股动脉病变造影结果与模型组基本相似。

2.组织病理学观察：镜下可见，术后8周及术后20周，假手术组家兔术侧后肢髂股动脉内膜仅覆盖一层内皮细胞，内膜弹力板完整，中膜平滑肌细胞排列整齐，管壁厚薄均匀，细胞层次清楚，无形态结构的异常；术后8周造模组家兔术侧后肢髂股动脉内膜有轻度增厚，内含泡沫细胞，管腔无明显狭窄；术后20周，模型组家兔术侧后肢髂股动脉内膜明显增厚，内含大量泡沫细胞，中膜处可见平滑肌细胞增生入内膜，管腔明显狭窄，其内膜厚度、内膜横截面积比率均显著大于假手术组(P＜0.001)，中膜厚度与假手术组比较无明显差异；超微粉通心络胶囊0.8、0.4g生药/kg剂量组、通塞脉片组及来适可组术侧后肢髂股动脉内膜增厚及管腔狭窄程度明显减轻，其内膜厚度、内膜横截面积比率均明显小于模型组(P＜0.05或P＜0.01)，中膜厚度与模型组比较均无明显差异；超微粉通心络胶囊0.2g生药/kg剂量组术侧后肢髂股动脉内膜增厚及管腔狭窄程度略有减轻趋势，其内膜厚度、内膜横截面积比率、中膜厚度与模型组比较均无明显差异(见表3)。

表3.超微粉通心络胶囊对家兔髂股动脉病变的影响(n＝8)

注：与假手术组比较*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较^△P＜0.05，^△△P＜0.01；

分析：超微粉通心络胶囊明显改善术侧后肢跛行程度，增加术侧后肢远端皮温；减少术侧后肢髂股动脉内膜厚度和内膜横截面积比率，减轻术侧后肢髂股动脉管腔狭窄程度。提示超微粉通心络胶囊具有调节血脂、防治ASO的作用。

实施例药理实验13

超微通心络对血液大鼠血液系统及纤溶活性的影响

一超微粉通心络对正常大鼠凝血时间的影响

实验目的：观察超微粉通心络对正常大鼠凝血时间的影响，进一步分析通心络的抗心肌和脑缺血的机制。

分组与给药：采用制备的超微粉通心络胶囊剂S1，其给药量分别为1.2g生药/Kg、0.6g生药/Kg和0.3g生药/Kg；采用通心络制备的普通粉胶囊剂D1，其给药量为0.6g生药/Kg，连续给药7天；另正常对照组，正常饮水饲养。

实验动物：Wistar大鼠，雄性，体重230～250g，60只，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号：SCXK 11-00-0008。

试剂：PT、TT、APTT为Diagnostica Stago的产品。

3.凝血因子测定

于末次给药后1h颈总动脉放血，以3.8％构橼酸钠(V/V为1∶9)抗凝，以1500g离心10min，上清为贫血小板血浆(PPP)，取PPP血浆100μl放于比浊管中，按试剂说明分别加入TT、PT和APTT试剂，在血小板聚集/凝集仪上分别测定凝血酶时间(TT)、凝血酶原时间(PT)和部分凝血活酶时间(APTT)值。。

实验结果

对正常大鼠凝血因子作用

由表1可知，同空白组相比较，通心络各组TT、PT、APTT虽有一定延长趋势，但无显著性差异，表明通心络对大鼠正常凝血功能无明显影响。

表1.超微粉通心络对MCAT大鼠凝血因子的影响

二超微粉通心络对正常大鼠血小板聚集性的影响

实验目的：观察超微粉通心络对正常大鼠血小板聚集的影响，进一步分析通心络的抗心肌和脑缺血的机制。

分组与给药：采用制备的超微粉通心络胶囊剂S1，其给药量分别为1.2g生药/Kg、0.6g生药/Kg和0.3g生药/Kg；采用通心络所制备的普通粉胶囊剂D1，其给药量为0.6g生药/Kg，连续给药7天；另正常对照组，正常饮水饲养。

实验动物：Wistar大鼠，雄性，体重230～250g，60只，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号：SCXK 11-00-0008。

试剂和仪器：ADP，德国sigma公司产品；LG-PABER-1型血小板聚集/凝集仪，北京市世帝科学仪器公司产品。

胶原制备：取大鼠尾一条，剥下外度，刮除鳞片及内部脂肪，并剪碎。称重，按1∶9加入生理盐水后在4℃下研磨，至乳白色，4℃1500g离心10min，取上清即10％胶原。

及ADP和胶原诱导的血小板聚集的测定(Born比浊法)

末次给药后，颈总动脉放血，以3.8％枸橼酸钠(V/V为1∶9)抗凝，150g离心10min，上清为富血小板血浆(PRP)，剩余血浆继续以1500g离心10min，上清为贫血小板血浆(PPP)，以PPP调零，取PRP 300μl加入比浊管，37℃温育5min，分别加入诱导剂20μmol/L的ADP5μl和10％的胶原6μl，分别聚集5min、10min，记录最大聚集率。

数据处理：数据以均数±标准差(X±S)表示，资料均用SPSS 10.0统计学软件进行统计学处理，组间比较采用方差分析。

实验结果

对正常大鼠血小板聚集率的影响：连续给予通心络7天后，胶原、ADP诱导的大鼠血小板聚集均有不同程度的降低，表明通心络抗心肌缺血等作用可能与抑制血小板聚集有关。

表1超微粉通心络对ADP和胶原诱导的血小板聚集的影响

注：各组与模型组相比，*P＜0.05；**P＜0.01

三超微粉通心络体内溶栓作用及机制

实验目的：观察超微粉通心络的体内溶检及机制，进一步分析通心络的抗心肌和脑缺血的机制。

分组与给药：采用制备的超微粉通心络胶囊剂S1，其给药量分别为1.2g生药/Kg、0.6g生药/Kg和0.3g生药/Kg；采用通心络制备的普通粉胶囊剂D1，其给药量为0.6g生药/Kg，连续给药7天；另设模型组，正常饮水饲养。

实验动物：Wistar大鼠，雄性，体重230～250g，60只，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号：SCXK 11-00-0008。

试剂和仪器：组织型纤溶酶原激活剂(t-Pa)、纤溶酶原激活剂抑制剂(PAI)，由福建太阳生物技术公司提供；BT87-2型实验性血栓形成测定仪，包头医学院制造。

造模方法：实验大鼠以1.5％戊巴比妥钠35mg/kg体重腹腔注射麻醉，分离左侧颈总动脉，将血栓形成测定仪刺激电极放于颈总动脉近心端，热敏温度计放于远心端，以1.5mA电流刺激7min。取下刺激电极和测温器，然后消毒缝合，按上述方法灌胃给药。末次给药后1h，将大鼠麻醉，手术，完整剪下含血栓的颈总动脉段，并放入50％甲醛溶液中固定，测量其长度及湿重，60℃烘干后测血栓干重，实验以血栓长度、血栓干重为指标。血栓重量＝血栓与血管总重-血管重量

血浆t-pA、PAI活性测定：除模型组为正常组外其它分组给药同上，正常大鼠连续给药7天后颈总动脉采血1.8mL，置入含0.2ml 3.28％枸椽酸钠的塑料管内，在低温(4℃)下离心10分钟(3000r/min)。分离20μl血浆加等量酸化液混匀，酸化液血浆样本分别置于-20℃冰箱保存。t-pA、PAI活性测定采用发色底物法，均按药盒说明书上的要求操作。

数据处理：数据以均数±标准差(X±S)表示，资料均用SPSS 10.0统计学软件进行统计学处理，组间比较采用方差分析。

实验结果

超微粉通心络体内血栓溶解作用：结果显示如表1所示，大鼠颈总动脉经电刺激后局部形成血栓，5mm血栓干重约为2.4mg。通心络各剂量组血栓重量与模型组相比明显减轻(P＜0.05或p＜0.01)。而超微粉通心络高剂量作用明显优于普通通心络组(P＜0.05)。

表1起微粉通心络体内血栓溶解作用

注：与模型组相比，**P＜0.01，*P＜0.05；与普通通心络组比较，^#P＜0.05，^**P＜0.01

超微粉通心络对t-PA和PAI的作用：正常大鼠连续灌胃给药7天，通心络各组均可升高t-PA活性、降低PAI活性，表明超微粉通心络和普通通心络对正常大鼠纤溶活性均有一定程度提高。

表2超微粉通心络体内血栓溶解作用

注：与正常对照组相比，**P＜0.01，*P＜0.05

四超微粉通心络对急性血瘀大鼠血液流变学的影响

实验目的：观察超微粉通心络对急性血瘀大鼠血液流变学的影响，进一步分析通心络的抗心肌和脑缺血的机制。

分组与给药：采用制备的超微粉通心络胶囊剂S1，其给药量分别为1.2g生药/Kg、0.6g生药/Kg和0.3g生药/Kg；采用对比例所制备通心络的普通粉胶囊剂D1，其给药量为0.6g生药/Kg，连续给药7天；另设模型组和假手术组，正常饮水饲养，。

实验动物：Wistar大鼠，雄性，体重230～250g，60只，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号：SCXK 11-00-0008。

试剂和器材：红细胞变形试剂，北京市世帝科学仪器公司提供；RBC变形/聚集测试仪，型号LG-B-190，北京市世帝科学仪器公司产品；血粘度仪，型号R-80，北京市世帝科学仪器公司产品；

造模方法：大鼠于首次给药后1h，皮下注射肾上腺素0.1ml/100g体重(0.1mg/kg)2次，间隔4h，中间将大鼠浸入冰水(4℃)内5min，当天继续给药。次日晨末次给药后1h，将大鼠以乌拉坦1.5g/kg 腹腔注射麻醉，颈总动脉插管采血，肝素(20u/ml血)抗凝。

红细胞变形性和聚集性的测定：取抗凝血40μl加红细胞变形液1ml，混匀，取样0.8ml用红细胞变形/聚集测试仪测试，以红细胞最大变形指数(MAXDI)和曲线下面积(SSS)表示红细胞变形性；另取抗凝血0.8ml用红细胞变形/聚集测试仪进行测试，以红细胞最大聚集指数(MAXD)和曲线下面积(SS)表示红细胞聚集性。

血液粘度的测定：取抗凝血0.8ml用血液粘度仪进行检测，以200、100、30S^-1、1S^-1时血液粘度表示全血粘度；另取抗凝血以2000转离心8min，其上清液即为血浆，取0.8ml血浆用血液粘度仪测试100S^-1时的血浆粘度。

数据处理：数据以均数±标准差(X±S)表示，资料均用SPSS 10.0统计学软件进行统计学处理，组间比较采用方差分析。

实验结果：结果显示：模型组与对照组比较，各切变率下的全血粘度与血浆粘度均明显增高，红细胞聚集性增高，变形性下降(P＜0.05或p＜0.01)。通心络各组均可明显降低血瘀症大鼠血浆粘度，增高其红细胞变形能力(P＜0.05或P＜0.01)；其中超微粉高剂量组对红细胞变形性等指标作用更明显(P＜0.05)。

表1超微粉通心络对急性血瘀大鼠全血粘度的影响

注：与正常组相比，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组相比，^△P＜0.05，^△△P＜0.01；与普通通心络组比较，^#P＜0.05，^**P＜0.01

表2超微粉通心络对急性血瘀大鼠红细胞变形性和聚集性的影响

注：与正常组相比，^*P＜0.05，^**P＜0.01；与模型组相比，^△P＜0.05，^△△P＜0.01；与普通通心络组比较，^#P＜0.05，^**P＜0.01

实施例药理实验14

两种工艺处理的通心络在诱导CD1敲除和野生型血管平滑肌细胞动脉粥样硬化调控基因应答的比较研究

动脉粥样硬化是一个伴有脂质代谢紊乱和炎症的慢性动脉疾病。动脉粥样硬化促进或抑制基因表达在动脉粥样硬发展过程中扮演站中心角色，在动脉粥样硬化发展过程中，许多参与脂质代谢和炎症的基因产物在动脉壁处于较高或较低的表达。通心络胶囊是由多种中药成份组成的传统中药，已证实在动脉粥样硬化和心衰中发挥着心血管保护作用。进行了两种不同工艺处理的通心络胶囊对鼠平滑肌细胞和CD-1d蛋白缺失的巨噬细胞动脉粥样硬化调控基因表达的作用比较。我们的数据表明超微粉碎通心络在促进脂质调控基因PPAR表达，尤其是在缺失CD1d蛋白的细胞中该基因的表达表现出比普通通心络更强的生物学活性。

引言

通心络是传统中药，已经被证实在冠心病和缺血性心脏衰竭病人中发挥着抗动脉粥样硬化作用。在动物研究中，通心络已经表现出促进内皮细胞一氧化氮合酶活力和改善介入治疗后心肌灌流的作用。通心络胶囊治疗后还可以降低胆固醇沉积，稳定动脉粥样硬化斑块。

动脉粥样硬化是一个伴有脂质代谢紊乱和炎症的慢性动脉疾病，动脉粥样硬化促进或抑制基因表达在动脉粥样硬发展过程中扮演站中心角色，在动脉粥样硬化发展过程中，许多参与脂质代谢和炎症的基因产物在动脉壁处于较高或较低的表达。

在这项研究中，两种工艺通心络被用于实验，对比它们在调节血管平滑肌细胞和腹膜巨噬细胞动脉继样硬化调控基因表达的能力。两种通心络治疗后可诱导PPAR的表达。

材料与方法

试剂和抗体

细胞培养液和试剂，包括DMEM(Cat.No.D5796)，台牛血清(FBS Cat.No.D5796)和磷酸盐溶液(PBS Cat.No.79378)购自美国Sigma公司.小鼠单克隆抗体抗PPAR和小鼠单克隆抗体抗beta-actin分别购自Santa Cruz公司(Cat.No.SC-7273)和美国Sigma公司，(Cat.No.A5316).通心络(TXL)粗制粉和超微粉有中国石家庄以岭制药有限公司提供。

原代平滑肌细胞分离

原代平滑肌细胞分离自野生型小鼠(BALB/C)和CD1d基因敲除小鼠主动脉分离获取并培养(参照方法见：Jenna Lynn Ray，Rebecca Leach，Jean-Marc Herbert and Mark Benson，Isolation of vascular smooth muscle cells from a single murine aorta.Methods CellSci.2001；23(4)；185-8).简要介绍如下：小鼠经麻醉处死，用70％酒精溶液漂洗小鼠胸部和腹部，用手术外科剪打开胸腔充分暴露心脏和胸，腹主动脉。自左心室至腹主动脉分叉分离动脉并用消毒PBS溶液漂洗，将游离的主动脉放到消毒培养皿中并用1到2滴Fungizone溶液覆盖固定.在显微镜下分离动脉壁外层组织，将动脉从Fungizone溶液中取出并放入一个新的培养皿中，并用一到两滴DMEM培养液加10％FBS和1％抗菌素(Sigma)覆盖.将动脉切割成细小的碎片，在组织培养箱内把动脉碎片放入含有7.5毫克胶原酶的组织培养试管中，静置于37℃，5％C02培养箱内。6个小时后取出培养试管并轻轻摇动使馆使细胞悬浮于3毫升细胞培养液中，再转入一个15毫升试管中室温下300g离心5分钟。取出上清夜后，用5毫升新鲜培养液重悬并转入25cm²细胞培养皿中，置于培养箱中静置5天。5天后细胞可以传代，用特异性抗体如α-smooth muscle actin(Sigma)证实平滑肌细胞。CD1基因敲除的平滑肌细胞由RT-PCR技术证实。

小鼠腹腔巨嗜细胞分离。野生型小鼠和CD1d基因敲除小鼠在CO₂麻醉下腹腔内注射矿物油3毫升。3到4天后小鼠经海拉坦吸入麻醉处死。腹腔内注射10毫升消毒用PBS液，收集腹腔灌洗液，离心后用RPMI 1640培养液加10％FBS and 1％抗菌素接种于细胞培养皿中。

CD1d基因转染平滑肌细胞系的建立

mCD1d cDNA克隆及平滑肌细胞SM22促进子的构建：小鼠mCD1d自小鼠肝脏提取。小鼠肝脏总RNA用美国Qiagen公司的RNA提取试剂和提取，用以构建初始链cDNA。mCD1d引物：有意义链，5’-3’AACCCCAGAGCCTTTGTGTA，反意义链，5’-3’GAGGCCCTTGGAGTTATCATTA.LATaq多聚酶用以产生钝端PCR产物。平滑肌细胞特异性促进子SM22从含有SM22的pECFP-1vector中用Taq polymerase提取，引物序列：前向引物序列：Forward，5’-3’CACCGGATCCCATGTCCCAATCAGA，反向引物序列：5’-3’GGGGCGCTGGCTGGGTGAGG1.

表达质粒的建立：小鼠mCD1d基因构建子连接到TOPO-4-Blunt-end克隆vector(Invitrogen)，EcoRI消化后克隆入pCMV/pIRES/dsRed表达vector中(Invitrogen)，pIRES/SM22表达质粒的建立：应用PCR技术将SM22克隆出pECFP vector，引物序列：正向引物序列，5’-3’CACCGGATCCCATGTCCCAATCAGA，反向引物序列，5’-3’GGGGCGCTGGCTGGGTGAGG1.然后将SM22 PCR产物接入含有pIRES的vector中。新的目的基因产物SM22/mCD1d/pIRES用以转染小鼠平滑肌细胞。

Lipofectamine 2000细胞转染：SM22/mCD1d/pIRES转染细胞系由Lipofectamine2000转染建立.将10微升lipofectamine稀释到250微升无血清OptiMEM-1中线搁置一边。然后，将4微克DNA质粒稀释到总量为250ul的无血清OptiMEM-1中室温下孵育5分钟。然后将250微升的lipofectamine和250微升的DNA质粒稀释液混合在一起。将此混合液常温下孵育20分钟后加入事先预备好的6扎培养皿中(7-8.0×105cells/孔).正常条件下孵育4到6个小时后，换新鲜的含有10％FBS和1％抗菌素的培养液中担不除去lipofectamine混合液。24到48小时后可用荧光显微镜观察，48小时后换用含有G418抗菌素的新鲜培养液以移除非转染的细胞。直到只有阳性细胞存活并且开始增殖。目的基因的表达可用反转录PCR技术和定量PCR技术证实。

Western蛋白免疫标记分析：细胞经过24小时通心络剂量依赖处理(50，100，250，500 and1000ug/ml)。细胞总蛋白由RIPA细胞裂解液加蛋白酶抑制剂裂解细胞获得。蛋白电泳在12％SDS-PAGE(BioRad)上分离蛋白后转到PVDF膜上(Millipore)，小鼠单克隆抗体PPARγ孵育并显色。

Electrophoretic Mobility Gel Shift分析：核蛋白自处理和非处理的野生型，CD1基因敲除以及CD1d转染的血管平滑肌细胞中提取。细胞收集并用Ultra-Turrax T25-tissuehomogenizer(Janke and Kunkel)裂解细胞在低盐溶液中(0.6％Nonidet P-40，150mM氯化钠，10mM HEPES，pH 7.9，1mM EDTA，0.5mM phenylmethylsulfonyl fluoride)，2000rpm离心30秒。取上清夜放置冰上，5000rpm离心5分钟。将沉淀物用高盐溶液(25％glycerol；20mM HEPES，pH 7.9；420mM NaCl；1.2mM MgCl2；0.2mM EDTA；0.5mM dithiothreitol；0.5mM phenylmethylsulfonyl fluoride；2mM benzamidine；5g/ml each aprotinin，leupeptin，and pepstatin)重悬。蛋白浓度测定采用Bio-Rad公司蛋白浓度测定盒测定。人工合成的双联多肤链PPARγ motif(5’-GATCTGTGACCTTTGTCCTAGTAAG-3’and 5’-CTTACTAGGACAAAGGTCACAGATC-3’.)用[gamma-³²P]ATP标记，蛋白电泳根据Promega公司提供的试剂盒说明书进行。

结果

图1.粗制粉和超微粉TXL处理野生型小鼠腹腔巨嗜细胞24小时后PPAR gamma蛋白表达。小鼠腹腔巨嗜细胞收集及培养见方法上述。接种于6孔培养板，70-80％融合后换用无血清PRMI1640培养液隔夜培养，分别用通心络粗制粉和超微粉剂量依赖式处理(50，100，250，500和1000ug/ml)，24小时后收集细胞并用RIPA细胞裂解液裂解细胞提取细胞总蛋白。Western蛋白电泳常规，蛋白转膜后用小鼠单克隆抗体抗PPARγ抗体隔夜孵育，ECL免疫标记曝光冲洗照片。结果显示：超微粉通心络均可剂量依赖式促进小鼠腹腔巨嗜细胞PPARγ表达，但是粗制粉通心络没有明显的剂量依赖式促进小鼠腹腔巨嗜细胞PPARγ表达。用β-actin作为内参照证实各样本总蛋白一致。经过计算机条带密度扫描并用β-actin标准化后证实超微粉通心络比粗制粉通心络可以明显的剂量依赖式促进小鼠小鼠腹腔巨嗜细胞PPARγ表达。

图2.粗制粉和超微粉TXL处理CD1d基因敲除小鼠腹腔巨嗜细胞24小时后PPAR gamma蛋白表达。CD1d基因敲除小鼠腹腔巨嗜细胞收集及培养见方法上述。接种于6孔培养板，70-80％融合后换用无血清PRMI 1640培养液隔夜培养，分别用通心络粗制粉和超微粉剂量依赖式处理(50，100，250，500和1000ug/ml)，24小时后收集细胞并用RIPA细胞裂解液裂解细胞提取细胞总蛋白。Western蛋白电泳常规，蛋白转膜后用小鼠单克隆抗体抗PPARγ抗体隔夜孵育，ECL免疫标记曝光冲洗照片。结果显示：超微粉通心络均可剂量依赖式促进小鼠腹腔巨嗜细胞PPARγ表达，但是粗制粉通心络没有明显的剂量依赖式促进小鼠腹腔巨嗜细胞PPARγ表达。用β-actin作为内参照证实各样本总蛋白一致。经过计算机条带密度扫描并用β-actin标准化后证实超微粉通心络比粗制粉通心络可以明显地剂量依赖式促进小鼠腹腔巨嗜细胞PPARγ表达。

图3.粗制粉TXL处理CD1d基因转染的平滑肌细胞24小时后PPAR gamma蛋白表达。CD1d转染的小鼠动脉平滑肌细胞分离后传代至6-9代，接种于6扎培养板，70-80％融合后换用无血清DMEM培养液隔夜培养，分别用通心络粗制粉剂量依赖式处理(50，100，250，500和1000ug/ml)，24小时后收集细胞并用RIPA细胞裂解液裂解细胞提取细胞总蛋白。Western蛋白电泳常规，蛋白转膜后用小鼠单克隆抗体抗PPARγ抗体隔夜孵育，ECL免疫标记曝光冲洗照片。结果显示：粗制粉通心络在野生型动脉平滑肌细胞和CD1d基因转染的小鼠动脉平滑肌细胞中均没有明显的剂量依赖式促进平滑肌细胞PPARγ表达。用β-actin作为内参照证实各样本总蛋白一致。经过计算机条带密度扫描并用β-actin标准化后证实粗制粉通心络没有明显的剂量依赖式促进小鼠血管平滑肌细胞PPARγ表达。

图4.超微粉TXL处理CD1d基因转染的平滑肌细胞24小时后PPAR gamma蛋白表达。CD1d转染的小鼠动脉平滑肌细胞分离后传代至6-9代，接种于6孔培养板，70-80％融合后换用无血清DMEM培养液隔夜培养，分别用通心络超微粉剂量依赖式处理(50，100，250，500和1000ug/ml)，24小时后收集细胞并用RIPA细胞裂解液裂解细胞提取细胞总蛋白。Western蛋白电泳常规，蛋白转膜后用小鼠单克隆抗体抗PPARγ抗体隔夜孵育，ECL免疫标记曝光冲洗照片。结果显示：超微粉通心络均可剂量依赖式促进小鼠野生型和CD1d基因转染的动脉平滑肌细胞PPARγ蛋白表达，用β-actin作为内参照证实各样本总蛋白一致。经过计算机条带密度扫描并用β-actin标准化后证实超微粉通心络比粗制粉通心络可以明显的剂量依赖式促进小鼠血管平滑肌细胞PPARγ表达，而粗制粉通心络则没有明显的剂量依赖式促进平骨肌细胞PPARγ表达。

图5.粗制粉和超微粉TXL处理野生型小鼠动脉平滑肌细胞24小时后PPAR gamma蛋白表达。野生型小鼠动脉平滑肌细胞分离后传代至6-9代，接种于6孔培养板，70-80％融合后换用元血清DMEM培养液隔夜培养，分别用通心络粗制粉和超微粉剂量依赖式处理(50，100，250，500和1000ug/ml)，24小时后收集细胞并用RIPA细胞裂解液裂解细胞提取细胞总蛋白。Western蛋白电泳常规，蛋白转膜后用小鼠单克隆抗体抗PPARγ抗体隔夜孵育，ECL免疫标记曝光冲洗照片。结果显示：超微粉通心络可剂量依赖式促进小鼠动脉平滑肌细胞PPARγ表达β-aetin作为内参照表明通心络对骨架蛋白表达无影响，且各样本总蛋白一致。经过计算机条带密度扫描并用β-actin标准化后证实粗制粉通心络可以促进小鼠动脉平滑肌细胞PPARγ蛋白表达，但其剂量依赖性没有统计学显著意义；而超微粉通心络比粗制粉通心络明显(＞2folds)有更强促进小鼠血管平滑肌细胞PPARγ表达的作用。

图6.粗制粉和超微粉TXL处理CD1d基因敲除小鼠动脉血管平滑肌细胞24小时后PPARγ蛋白表达。CD1d基因敲除小鼠动脉平滑肌细胞分离后传代至6-9代，接种于6孔培养板，70-80％融合后换用无血清DMEM培养液隔夜培养，分别用通心络粗制粉和超微粉剂量依赖式处理(50，100，250，500和1000ug/ml)，24小时后收集细胞并用RIPA细胞裂解液裂解细胞提取细胞总蛋白。Western蛋白电泳常规，蛋白转膜后用小鼠单克隆抗体抗PPARγ抗体隔夜孵育，ECL免疫标记曝光冲洗照片。结果显示：超微粉通心络可剂量依赖式促进CD1d基因小鼠动脉平滑肌细胞PPARγ表达β-actin作为内参照表明通心络对骨架蛋白表达无影响，且各样本总蛋白一致。经过计算机条带密度扫描并用β-actin标准化后证实粗制粉通心络可以促进CD1d基因小鼠动脉平滑肌细胞PPARγ蛋白表达，但其剂量依赖性没有统计学显著意义；而超微粉通心络比粗制粉通心络明显(＞3folds)有更强促进CD1d基因小鼠血管平滑肌细胞PPARγ表达的作用。

图7.CD1d基因敲除小鼠动脉平滑肌细胞经过通心络(1000ug/ml)处理后提取核蛋白电泳试验。野生型小鼠动脉平滑肌细胞和CD1d基因敲除小鼠动脉平滑肌细胞分离后传代至6-9代，接种与250mm细胞培养皿中培养，等到80％-90％融合后用无血清培养液隔夜培养。超微粉通心络(1000ug/ml)处理细胞24小时后用Panomics公司提供的细胞核蛋白提取试剂盒提取核蛋白。并用美国Promega公司提供的Gel shift assay试剂盒用³²P-ATP标记工合成的双链PPARγ多肽链。³²P-ATP标记的双链PPARγ多肽链与核蛋白的结合反应也根据Promega公司提供的Gel shift assay试剂盒进行。蛋白与多肽链的电泳实验在4℃条件下在TBE胶中进行。结果显示：CD1d基因敲除小鼠动脉平滑肌细胞核蛋白中有较明显的PPARγ蛋白表达，尤其是经过超微粉通心络处理后的血管平滑肌细胞。结果提示经过超微粉通心络处理后的CD1d基因敲除小鼠动脉血管平滑肌细胞核内比野生型小鼠动脉平滑肌细胞有更多的PPARγ蛋白自核外转移至核内并结合与DNA上PPRE从而激活更多的下游基因，从而发挥其药理特性。

图8.CD1d基因转染的小鼠动脉平滑肌细胞经过通心络(1000ug/ml)处理后提取核蛋白电泳试验。野生型小鼠动脉平滑肌细胞和CD1d基因转染的小鼠动脉平滑肌细胞分离后传代至6-9代，接种与250mm细胞培养皿中培养，等到80％-90％融合后用无血清培养液隔夜培养。超微粉通心络(1000ug/ml)处理细胞24小时后用Panomics公司提供的细胞核蛋白提取试剂盒提取核蛋白。并用美国Promega公司提供的Gel shift assay试剂盒用³²P-ATP标记工合成的双链PPARγ多肽链。³²P-ATP标记的双链PPARγ多肽链与核蛋白的结合反应也根据Promega公司提供的Gel shift assay试剂盒进行。蛋白与多肽链的电泳实验在4℃条件下在TBE胶中进行。结果显示：CD1d基因转染的小鼠动脉平滑肌细胞核蛋白中有较明显的PPARγ蛋白表达，尤其是经过超微粉通心络处理后的血管平滑肌细胞。结果提示经过超微粉通心络处理后的CD1d基因转染的小鼠动脉血管平滑肌细胞核内比野生型小鼠动脉平滑肌细胞有更多的PPARγ蛋白自核外转移至核内并结合与DNA上PPRE从而激活更多的下游基因，从而发挥其药理特性。

Claims (15)

1.一种超微通心络中药组合物，其特征在于它是由5-30um药粉细度的全蝎、水蛭、蜈蚣、土鳖虫和蝉蜕五味虫类药粉，冰片和乳香药粉，降香和檀香提取挥发油的药材的挥发油；将降香和檀香的药渣再用水提取；赤芍和酸枣仁用水提取的药材加水煎煮，水提液过滤后，待浓缩成浸膏；人参用乙醇先提后，再用水提取，醇提液回收乙醇后，浓缩成醇提浸膏；水提液过滤与所有的水提液混匀后浓缩成水提浸膏组成。

2.按权利要求1所述中药组合物在制备通过降低家兔实验性动脉粥样硬化血清胆固醇，抗氧化途径，减轻动脉粥样硬化后血管内皮损伤药物中的应用。

3.按权利要求1所述中药组合物在制备显著缩小AMI再灌注后无再流面积和梗死范围的药物中的应用。

4.按权利要求1所述中药组合物在制备对5-HT诱导的猪冠脉痉挛有明显解痉作用，同时对IL-1包裹部位血管管腔狭窄有明显抑制作用的药物中的应用。

5.按权利要求1所述中药组合物在制备通过抑制血清高敏C反应蛋白途径抑制高脂血症及动脉粥样硬化的发生，并对已形成的动脉粥样硬化具有明显稳定作用的药物中的应用。

6.按权利要求1所述中药组合物在制备对高脂饮食合并血管成形术后血脂和血管管腔狭窄有明显改善作用的药物中的应用。

7.按权利要求1所述中药组合物在制备明显升高垂体后叶素致小鼠心肌和血浆一氧化氮水平下降和内皮型一氧化氮合酶表达水平下降的药物中的应用。

8.按权利要求1所述中药组合物在制备通过抑制心肌胶原的合成，达到干预重构的目的的药物中的应用。

9.按权利要求1所述中药组合物在制备有效改善持久性大脑中动脉阻断大鼠的缺血损伤药物中的应用。

10.按权利要求1所述中药组合物在制备通过促进血管内皮生长因子表达上调，内皮细胞增殖从而保护脑毛细血管内皮细胞，促进毛细血管新生的药物中的应用。

11.按权利要求1所述中药组合物在制备对II期内痔、混合痔两种类型痔疮有很好临床疗效的药物中的应用。

12.按权利要求1所述中药组合物在制备对月桂酸引起血栓闭塞性脉管炎有良好的预防及治疗作用的药物中的应用。

13.按权利要求1所述中药组合物在制备对家兔髂骨动脉粥样硬化闭塞症有良好的治疗作用的药物中的应用。

14.按权利要求1所述中药组合物在制备抑制血小板聚集、明显降低血瘀症大鼠血浆粘度，增高其红细胞变形能力的药物中的应用。

15.按权利要求1所述中药组合物在制备促进脂质调控基因过氧化物酶体增殖激活受体γ表达药物中的应用。

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