MÉTODOS PARA INHIBIR ANGIOQENESIS
CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención presenta un método para inhibir eficazmente angiogénesis y realizar una regresión de los vasos sanguíneos existentes. Más particularmente, esta invención se relaciona con métodos para tratar enfermedades relacionadas con angiogénesis patogénica y con el suministro de actividad antiangiogénica en animales vivos que incluye a los humanos que presenten tales enfermedades . ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La angiogénesis es el crecimiento de vasos sanguíneos nuevos a partir de microvasos existentes previamente. El proceso angiogénico es un proceso natural y regulado en el sanado de heridas, en el desarrollo fetal y embrionario y en la formación del cuerpo lúteo, endometrio y placenta. Estos procesos son vitales para la salud y el crecimiento y están muy bien regulados por promotores e inhibidores angiogénicos . En estados de enfermedad, sin embargo, esta regulación puede omitirse y llevar a angiogénesis patogénica. La angiogénesis patogénica es angiogénesis no deseada y es el objetivo para las intervenciones terapéuticas. Muchas enfermedades humanas se caracterizan por angiogénesis no deseada. Estas incluyen cáncer, retinopatía diabética, degeneración macular REP : 151753 relacionada con la edad, formación de paño artrítico y psoriasis . En cáncer, por ejemplo, la angiogénesis juega un papel crítico en la supervivencia y metástasis de tumores. Los tumores secretan factores angiogénicos que promueven la división y migración de células endoteliales, que comienza un proceso angiogénico. Se ha hecho evidente que los tumores necesitan estar vascularizados para crecer y formar metástasis. Si se restringe el suministro de sangre de un tumor, el tumor no crecerá más allá de 0.4 mm. Las células tumorales, carentes de un suministro sanguíneo adecuado, finalmente se vuelven necróticas o apoptósicas. Por lo tanto, la vasculatura sanguínea y especialmente el crecimiento de vasos sanguíneos nuevos o angiogénesis es un aspecto importante de la biología de los tumores. Los tratamientos dirigidos contra angiogénesis deben inducir la abolición o el alivio de estas enfermedades. La patogénesis y la ceguera relacionadas con enfermedades oculares tales como retinopatía diabética y degeneración macular relacionada con la edad es el resultado directo de angiogénesis no deseada en el tejido ocular, la angiogénesis es la causa más común de ceguera. La retinopatía diabética proliferativa se caracteriza por incursión de vasos sanguíneos retínales del cristalino. La degeneración macular relacionada con la edad es una enfermedad de la mácula y se diferencia de la forma seca por los vasos sanguíneos coroidales que crecen hacia adentro y penetran en las ramas de la membrana. La patología angiogénica también se relaciona con retinopatía de la premadurez, rechazo de injertos de la córnea, glaucoma neovascular y fibroplasia retrocristalin . Las enfermedades relacionadas con neovascularización de la retina/coroides incluyen, pero no se limitan a retinopatía diabética, degeneración macular, anemia de células falciformes, sarcoidosis, sífilis, pseudoxantoma elástico y enfermedad de Paget . SUMARIO DE LA INVENCIÓN una modalidad, esta invención se relaciona con un método para inhibir la vascularización de células endoteliales , el método comprende poner en contacto una célula, tejido u órgano el cual tiene células endoteliales con una cantidad antiangiogénica de un compuesto de fórmula I. Los compuestos de fórmula I tienen la siguiente fórmula general : Fórmula I
En la fórmula I, Rl y R2 son grupos funcionales que incluyen pero que no se limitan a hidroxilo. En la fórmula I, R3 es un grupo funcional que incluye, pero que no se limita a hidrógeno, alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, alquenilo de 2 a 6 átomos de carbono, alquinilo de 2 a 6 átomos de carbono, arilo, hidroxilo, alcoxi de 1 a 6 átomos de carbono, halógeno, N02, NH3 y COOCH3. En la fórmula I, R4 es un grupo funcional que incluye pero que no se limita a hidrógeno, alcoxi de 1 a 6 átomos de carbono, glucosa, B-D-glucopiranosa, alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, alquenilo de 2 a 6 átomos de carbono, alquinilo de 2 a 6 átomos de carbono, arilo, hidroxilo, halógeno, N02, NH3, carbohidrato, aminoácido, nucleótido y lípido. En la fórmula I, R5 es un grupo funcional que incluye pero que no se limita a hidrógeno, alquilo de 1 a 6 átomos de carbono, alquenilo de 2 a 6 átomos de carbono, alquinilo de 2 a 6 átomos de carbono, arilo, hidroxilo, alcoxi de 1 a 6 átomos de carbono, halógeno, N02 , H3 y CH3. En la fórmula I, X1-X3 son grupos funcionales que incluyen, pero que no se limitan a oxígeno, azufre, -CH2- o carboxi, los cuales pueden ser diferentes pero de manera preferible son grupos funcionales idénticos. En una modalidad preferida de la invención, el compuesto de fórmula I es oleuropeína, con fórmula C25H32O13, como se describe en la décima edición de THE MERK INDEX, con la monografía número 6709, y que se muestra en la fórmula II. Fórmula II
El extracto vegetal x, el cual puede comprender cualquiera de los extractos x etanólicos, de acetona, inorgánicos y de ácido orgánico o base o bien de extracción acuosa contiene: oleuropeína, el compuesto que se muestra en la fórmula II . El extracto vegetal x se deriva de una planta que incluye, pero que no se limita a las hojas, botones, frutas, madera, corteza y raíces del árbol de olivo Olea europea L., el árbol privet Lígustrum obtusifoliu (Oleaceae) , etc . En otro aspecto, esta invención se relaciona con un método para inhibir potentemente la angiogénesis no deseada en un tejido u órgano, el método comprende poner en contacto la célula con una solución etanólica, de acetona, inorgánica y de ácido o base orgánica o una solución acuosa de un extracto vegetal x, o un derivado de la solución etanólica, de acetona, inorgánica y de ácido o base orgánico o una solución acuosa, o un componente de la misma que contenga oleuropeína, el compuesto que se muestra en la fórmula II o un derivado del mismo como se muestra en la fórmula I o productos de su hidrólisis, los cuales incluyen pero que no se limitan a oleuropeína aglicona, ácido elenólico, alcohol beta-3 , 4 -dihidroxifeniletílico y elenolato de metil-o-metilo o una composición farmacéutica del mismo, en una cantidad suficiente para inhibir la angiogénesis . En una modalidad actualmente preferida, la célula es un organismo vivo. En otro aspecto adicional, esta invención se relaciona con un método para tratar enfermedades relacionadas con angiogénesis mediadas por o relacionadas con angiogénesis no deseada y no controlada, el método comprende administrar a un animal vivo un compuesto antiangiogénico de la solución etanólica, de acetona, de un ácido o base inorgánico y orgánico o una solución acuosa del extracto X o un derivado de un componente etanólico, de cetona, de ácido o base inorgánico u orgánico o un componente acuoso, que contiene oleuropeína, el compuesto que se muestra en la fórmula II o un derivado del mismo, como se muestra en la fórmula I, o productos de su hidrólisis, los cuales incluyen pero no se limitan a oleuropeína aglicona, ácido elenólico, alcohol beta-3 , 4-dihidroxifeniletílico y elenolato de metil-o-metilo o una composición farmacéutica del mismo, solución en una dosificación suficiente para inhibir angiogénesis . Estos métodos son útiles para disminuir los efectos de condiciones que están caracterizadas por angiogénesis anormal o indeseable, o proliferación o migración de células endoteliales . Otras características, objetivos y ventajas de la invención y sus modalidades preferidas se volverán evidentes a partir de la descripción detallada que sigue. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Estas así como otras características de la presente invención se volverán más evidentes ante la referencia a los dibujos, en los que: La figura 1 son fotografías representativas que ilustran la inhibición de angiogénesis por una solución acuosa de oleuropeína. Se inyecta a embriones de pollo de tres días de edad, con 0.5 ce que contiene 9.3 ^mol/huevo de oleuropeína. Las inyecciones se realizan directamente en el saco vitelino. Se incuban los embriones durante 4 días después de la inyección. Se rompe la cascara del huevo y se realiza una fotografía de la CAM utilizando una cámara Kodak mds 100. La figura 2 son fotografías representativas que ilustran la inhibición de angiogénesis por una solución acuosa de oleuropeína. Se inyecta a embriones de pollo de tres días de edad con 0.5 ce de 0.93 ^mol/huevo de oleuropeína. Las inyecciones se realizan directamente en el saco vitelino. Se incuban los embriones durante 4 días después de la inyección. Se rompe la cáscara del huevo y se toma una fotografía de la CAM utilizando una cámara Kodak mds 100. La figura 3 son fotografías representativas que ilustran el nivel de angiogénesis en el control. Loa efectos de una solución acuosa sobre angiogénesis. Se inyecta a embriones de pollo de tres días de edad con 0.5 ce de agua destilada. Las inyecciones se realizan directamente en el saco vitelino. Los embriones se incuban durante 4 días después de la inyección. Se rompe la cáscara de huevo y se toma una fotografía de la CAM utilizando una cámara Kodak mds 100. Las figuras 4A-4C comparan los lechos capilares de las CAM control y experimental . Se muestra la desaparición de los capilares en los huevos tratados con oleuropeína. Las figuras 5A y 5B muestran un montaje de embrión completo que incluye la CAM. Se ilustra el efecto de oleuropeína en el tamaño de la CAM y posteriormente en el tamaño del embrión. Las figuras 6A-6F muestran fotografías representativas que ilustran la inhibición de angiogénesis por una solución acuosa de extracto de hojas de olivo. Las fotografías de las figuras 6A, 6B y 6C representan CAM de embriones control inyectados con agua/solución salina. Las fotografías de las figuras 6D, 6E y 6F representan embriones de pollo que ae inyectan con 0.5 ce de extracto de hoja de olivo. Las inyecciones se realizan directamente en el saco vitelino. Los embriones se incuban durante 4 días después de la inyección. Los huevos se rompen y se toman fotografías de la CAM utilizando una cámara Kodak mds 100. Las figuras 7A-7D muestran fotografías comparativas que ilustran la inhibición de angiogénesis por una solución acuosa de oleuropeína. La fotografía de la figura 7A muestra el oído de un ratón adulto que no ha sido quemado o tratado de manera alguna. La vascularización representa la encontrada normalmente en el oído de ratones adultos. La fotografía de la figura 7B representa la inducción de crecimiento de vasos sanguíneos por una quemadura con hidróxido de sodio . Se produce una respuesta angiogénica muy importante en comparación con el oído no quemado. La fotografía de la figura 7C muestra una respuesta angiogénica más detallada que abarca el área quemada. Los vasos sanguíneos se pueden observar diseminándose desde los existentes y desplazándose hacia la quemadura. La fotografía de la figura 7D muestra una oreja de ratón que se ha quemado pero en el que se ha inhibido el crecimiento de vasos sanguíneos nuevos mediante inyecciones interaperitoneales de oleuropeína. Las figuras 8A-8H muestra fotografías comparativas que ilustran la inhibición de angiogénesis por una solución acuosa de oleuropeína. Las fotografías de las figuras 8A, 8B, - lo ¬
se y 8D muestran oídos de ratones adultos que se han quemado con hidróxido de sodio como se describe en lo siguiente. La vascularización representa la inducción del crecimiento de vasos sanguíneos por la quemadura con hidróxido de sodio. Se produce una respuesta angiogénica muy importante en comparación con la oreja no quemada. Las fotografías de las figuras 8E, 8F, 8G y 8H muestran orejas de ratón que se han quemado por hidróxido de sodio, pero los ratones fueron tratados con oleuropeína. El crecimiento de los vasos sanguíneos se inhibe de manera fuerte por el tratamiento con oleuropeína. La figura 9A corresponde a la gráfica que muestra la inhibición del crecimiento de vasos sanguíneos por oleuropeína basada en el número de nodos de vasos sanguíneos en membrana corioalantoidea de pollo (CAM) . La gráfica de barras representa la media y los valores de error estándar. La significancia estadística se obtiene utilizando una prueba t no pareada. La figura 9B corresponde a la gráfica que muestra la inhibición de crecimiento de vasos sanguíneos por oleuropeína en base en el número final de vasos sanguíneos en la CAM. Las gráficas de barras representan los valores medio y de error estándar. La significancia estadística se obtiene utilizando una prueba t no pareada . DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La descripción detallada que se establece en lo siguiente se pretende que sea una descripción de la modalidad preferida actualmente de la invención, y no se pretende que represente la única forma en la cual se puede llevar a la práctica o se puede utilizar la presente invención. La descripción establece las funciones y la secuencia de etapas para llevar a la práctica la invención. Sin embargo, debe entenderse que las mismas funciones o funciones equivalentes y secuencias pueden llevarse a cabo por diferentes modalidades y que las funciones y secuencias equivalentes también se pueden considerar abarcadas dentro del ámbito de la invención. A. Definiciones El término "animal" se refiere a un organismo con un sistema circulatorio cerrado de vasos sanguíneos que incluye a aves, mamíferos y cocodrilos. El término "animal" que se utiliza en la presente también incluye seres humanos. El término "angiogénesis" se refiere a la generación de vasos sanguíneos nuevos en células, tejidos, órganos o tumores . El término "metástasis" se refiere al procedimiento mediante el cual las células tumorales se diseminan a lugares alejados del cuerpo. El término también se utiliza en la presente para referirse a un tumor que se desarrolla a través de procesos metastásicos. El término "poner en contacto" se utiliza de manera intercambiable con los siguientes significados: combinarse con, agregar a, mezclar con, pasar sobre, incubar con, verter sobre, etc. Además, los compuestos de la presente invención se pueden "administrar" por cualquier método convencional tal como, por ejemplo, vía parenteral , oral, tópica o por inhalación, como se describe en la presente. El término "sal f rmacéuticamente aceptable" se refiere a aquellas sales de los compuestos que retienen la eficacia biológica y las propiedades de las bases libres y los cuales se obtienen por reacción con ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, ácido metansulfónico, ácido etansulfónico , ácido paratoluensulfónico , ácido salicílico y similares. Las sales f rmacéuticamente aceptables incluyen, por ejemplo, sales de metal alcalino tales como sodio y potasio, sales de metales alcalinotérreos y sales de amonio. Los términos "una cantidad suficiente", "una cantidad eficaz", "una cantidad terapéuticamente eficaz" o "una cantidad antiangiogénica" se refiere a una cantidad de un compuesto o composición eficaz para suprimir, abatir o inhibir angiogénesis o el resultado de una disminución de los síntomas relacionados con una enfermedad angiogénica. El resultado deseado puede ser el alivio subjetivo de uno o varios de los síntomas o bien, una mejora identificable objetivamente en el receptor de la dosificación, una disminución en la vascularización de células endoteliales o una disminución en la velocidad de angiogénesis , observada por un médico u otro observador capacitado. Los términos "tratamiento de cáncer", "terapia" y similares se refieren de manera general a cualquier mejora en el mamífero que tenga cáncer, en donde la mejora se pueda relacionar directamente con el tratamiento y con los compuestos de la presente invención. La mejora puede ser subjetiva u objetiva. Por ejemplo, si el mamífero es un humano, el paciente puede notar vigor o vitalidad aumentados o una disminución en el dolor como síntomas subjetivos o una mejora en la respuesta a la terapia o tratamiento. De manera alternativa, el médico puede observar una disminución en el tamaño del tumor o la carga tumoral en base en un examen físico, parámetros de laboratorio, marcadores de tumor o hallazgos radiográficos. Algunos signos de laboratorio que el médico puede observar para determinar respuesta al tratamiento incluyen normalización de las pruebas tales como cuenta leucocítica, cuenta eritrocítica, cuenta plaquetaria, velocidad de sedimentación de eritrocitos y diversas concentraciones de enzimas. De manera adicional, el médico puede observar una disminución en un marcador de tumor detectable. De manera alternativa se pueden utilizar otras pruebas para evaluar una prueba objetiva tales como sonogramas , pruebas de resonancia magnética nuclear y pruebas de emisión de positrones . La "inhibición del crecimiento de células tumorales" se puede evaluar por cualquier método aceptado para medir si se ha disminuido o frenado el crecimiento de las células tumorales. Esto incluye la observación directa y la evaluación indirecta tales como los síntomas subjetivos o los signos objetivos, como se discute en lo anterior. El término "alquilo" se utiliza en la presente para referirse a un radical de hidrocarburo monovalente y ramificado o sin ramificar, saturado o insaturado que tiene 1 a 12 átomos de carbono y que preferiblemente tiene 1 a 6 átomos de carbono. Cuando el grupo alquilo tiene de 1 a 6 átomos de carbono, se denomina como "alquilo inferior" . Los radicales alquilo adecuados incluyen, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, 2-propenilo (o alilo) , n-butilo, terbutilo, isobutilo (o 2-metilpropilo) , etc. Como se utiliza en la presente, el término abarca "alquilos sustituidos" . El término "alquilo sustituido" se refiere a un alquilo como se acaba de describir que incluye uno o más grupos funcionales tales como alquilo inferior, arilo, acilo, halógeno (es decir, haloalquilos , por ejemplo, CF3) , hidroxi, amino, alcoxi, alquilamina, acilamino, aciloxi, ariloxi, ariloxialquilo , mercapto, hidrocarburos cíclicos saturados e insaturados, heterociclos y similares. Estos grupos se pueden unir a cualquier carbono de la porción alquilo . El término "S-alquilo" se utiliza en la presente para referirse al grupo -SR, en donde R es alquilo inferior o alquilo inferior sustituido como se define en la presente. El término "arilo" se utiliza en la presente para referirse a un sustituyente aromático el cual puede ser un anillo aromático único o anillos aromáticos múltiples los cuales se unen por fusión, se unen covalentemente o se enlazan por un grupo común tal como una porción metileno o etileno. El grupo enlazante común puede ser un carbonilo como en la benzofenona. Uno o varios de los anillos aromáticos pueden incluir fenilo, naftilo, bifenilo, difenilmetilo y benzofenona entre otros. El término "arilo" abarca "arilalquilo" . El término "arilo sustituido" se refiere a un arilo como se acaba de describir que incluye uno o más grupos funcionales tales como alquilo inferior, acilo, halógeno, haloalquilos (por ejemplo CF3) , hidroxi, amino, alcoxi, alquilamina, acilamino, aciloxi, mercapto e hidrocarburos cíclicos saturados e insaturados los cuales se fusionan a uno o varios anillos aromáticos unidos covalentemente o unidos a un grupo común tal como una porción metileno o etileno. El grupo enlazante también puede ser un carbonilo tal como ciclohexilfenilcetona . El término "arilo sustituido" abarca a "arilalquilo sustituido" . El término "halógeno" se utiliza en la presente para referirse a átomos de flúor, bromo, cloro y yodo. El término "hidroxi" se utiliza en la presente para referirse al grupo -OH. El término "amino" se utiliza para referirse al grupo -NRR' , en donde R y R1 pueden ser independientemente hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido o acilo. El término "nitro" se utiliza en la presente para referirse al grupo -NO2. El término "alcoxi" se utiliza en la presente para referirse al grupo OR, en donde R es un alquilo inferior, alquilo inferior sustituido, arilo, arilo sustituido, arilalquilo o arilalquilo sustituido en donde el alquilo, arilo, arilo sustituido, arilalquilo y los grupos arilalquilo sustituidos son como se describen en la presente. Los radicales alcoxi adecuados incluyen, por ejemplo, metoxi, etoxi , fenoxi, fenoxi sustituido, benciloxi, fenetiloxi, terbutoxi, etc. El término "alquenilo" se utiliza en la presente para referirse a un radical hidrocarburo monovalente de cadena lineal o cíclico, ramificado e insaturado que tiene por lo menos enlaces dobles carbono- carbono . El radical puede tener la conformación cis o trans alrededor de uno o varios enlaces dobles. Los radicales alquenilo adecuados incluyen, por ejemplo, etenilo, propenilo, isopropenilo, ciclopropenilo, butenilo, isobutenilo, ciclobutenilo, terbutenilo, pentenilo, hexenilo, etc. El término "alquinilo" se utiliza en la presente para referirse a un radical hidrocarburo monovalente de cadena lineal o cíclico, ramificado e ingaturado que tiene por lo menos un enlace triple carbono- carbono . Los radicales alquinilo adecuados incluyen, por ejemplo, etinilo, propinilo, butinilo, isobutinilo, pentinilo, hexinilo, etc. B. Compuestos La presente invención se relaciona con el descubrimiento de que los compuestos de fórmula I inhiben la angiogénesis y son útiles para tratar enfermedades angiogénicas . Los compuestos de fórmula I tienen la siguiente fórmula general: Fórmula I
En donde Rl, R2 , 3 , R4 , R5 y XI, X2 y X3 son como se definen en lo anterior. En una modalidad preferida de la invención, el compuesto de fórmula I es oleuropeína, como se muestra a continuación en la fórmula II : Fórmula II
La oleuropeína, el compuesto utilizado en la presente invención, se puede obtener fácilmente de plantas que incluyen pero que no se limitan al árbol de olivo Olea europea L. y el árbol privet, Ligustrum obtusifolium (Oleaceae) . Los compuestos adecuados para uso en los métodos de la presente invención se pueden identificar fácilmente mediante la utilización de ensayos de determinación sistemática in vi tro e in vivo. Tales ensayos pueden realizar un examen de la capacidad de un compuesto particular para inhibir la angiogénesis o la vascularización de células endoteliales in vitro e in vivo. Por ejemplo, se puede utilizar el ensayo de membrana corioalantoidea (CA ) de embrión de pollo, el cual se describe con mayor detalle en lo siguiente, para realizar un análisis de un compuesto dado para determinar su capacidad para inhibir vascularización. En el ensayo de membrana corioalantoidea como se realiza en esta invención, se inyecta a embriones de pollo fertilizados con un compuesto en el día 3 ó 4. Se permite que los embriones se desarrollen por 4 días después de la inyección, después de lo cual se rompe el cascarón y se toman fotografías de la membrana corioalantoidea. Se puede determinar la complejidad de la vascularización en base en el número de nodos de vasos sanguíneos y extremos presentes en la CA . Este ensayo se puede utilizar para determinar las propiedades antiangiogénicas de los compuestos en esta invención. Será evidente fácilmente para los expertos en la técnica que los compuestos en esta invención se pueden administrar solos, en forma de una sal farmacéuticamente aceptable o en forma de una composición f rmacéutica. C. Usos de los compuestos de la presente invención Como se explica en lo anterior, la presente invención se relaciona con el descubrimiento de que los compuestos de fórmula I o su modalidad preferida, oleuropeína, o sus productos de hidrólisis son útiles para inhibir angiogénesis y, a su vez, para tratar enfermedades relacionadas con angiogénesis no deseada. Como tales, en una modalidad, la presente invención proporciona un método para inhibir angiogénesis no deseada en una célula, el método comprende poner en contacto la célula con una cantidad eficaz, es decir, una cantidad antiangiogénica de un compuesto de fórmula I o su modalidad preferida, oleuropeína, o sus productos de hidrólisis, o bien sus productos de hidrólisis. En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para inhibir la vascularización de células endoteliales , el método comprende poner en contacto una célula, tejido u órgano que contiene las células endoteliales con una cantidad eficaz de un compuesto de fórmula I o su modalidad preferida oleuropeína o sus productos de hidrólisis. En una modalidad preferida actualmente, las células están en un sujeto animal. Esta invención se relaciona con un método para tratar enfermedades relacionadas con angiogénesis no deseada y no controlada, el método comprende administrar a un animal un compuesto antiangiogénico de fórmula I o su modalidad preferida oleuropeína o sus productos de hidrólisis en una cantidad, es decir, una dosificación suficiente para inhibir angiogénesis. La dosificación particular de un compuesto de fórmula I o su modalidad preferida oleuropeína o sus productos de hidrólisis necesarios para inhibir angiogénesis o enfermedades angiogénicas dependerán de la gravedad de la condición, la vía de administración y factores relacionados que se decidirán por el médico que atienda. De manera general, las dosis diarias aceptadas y eficaces serán aquellas cantidades suficientes para inhibir eficazmente la angiogénesis o las enfermedades angiogénicas.
Los métodos de tratamiento proporcionados por esta invención se llevan a la práctica al administrar a un animal en necesidad del mismo una dosis de un compuesto de fórmula I o su modalidad preferida, oleuropeína o sus productos de hidrólisis (o una sal o solvato f rmacéuticamente aceptable del mismo) que sea eficaz para inhibir la angiogénesis o las enfermedades angiogénicas . El término "inhibir" se utiliza en la presente para incluir su significado aceptado generalmente el cual incluye tratar profilácticamente a un ser humano que presente angiogénesis o enfermedades angiogénicas, y mantener una revisión o un tratamiento de angiogénesis existente de enfermedades angiogénicas. Como tal, la presente invención incluye tanto el tratamiento terapéutico médico como el profiláctico, según sea apropiado. Loe métodos de la presente invención se pueden utilizar para tratar una amplia variedad de enfermedades. Las enfermedades relacionadas con neovascularización de la córnea se pueden tratar utilizando los métodos de la presente invención e incluyen, pero no se limitan a retinopatía diabética, retinopatía de premadurez, rechazo de injerto de córnea, glaucoma neovascular y fibroplasia retrocristalina , queratocon untivitis epidérmica, deficiencia de vitamina A, uso excesivo de lentes de contacto, queratitis atópica, queratitis limbica superior, queratitis seca pterigio, sjogrens, acné rosácea, filectenulosis , sífilis, infecciones por micobacterias , degeneración por lípidos, quemaduras químicas, úlceras bacterianas, úlceras por hongos, infecciones por herpes simplex, infecciones por herpes zoster, infecciones por protozoarios , sarcoma de Kaposi, úlcera de Mooren, degeneración marginal de Terrien, queratolisis marginal, traumatismo, artritis reumatoide, lupus sistémico, poliarteritis , sarcoidosis de Wegeners , escleritis, enfermedad de Steven Johnson, queratotomía radial perifigoide y rechazo de injerto de córnea. Las enfermedades relacionadas con neovascularización de la retina/coroide que se pueden tratar utilizando los métodos de la presente invención incluyen, pero no se limitan a retinopatía diabética, degeneración macular, anemia de células falciformes, sarcoidosis, sífilis, pseudoxantoma elasticurn, enfermedad de Paget, oclusión de venas, oclusión de arterias, enfermedad obstructiva carotídea, uveítis/vitritis crónica, infecciones micobacterianas , enfermedad de Lyme, lupus eritematoso sistémico, retinopatía de premadurez, enfermedad de Bale, enfermedad de Bechet , infecciones que causan una retinitis o coroiditis, histoplasmosis ocular supuesta, enfermedad de Best, miopía, picaduras ópticas, enfermedad de Stargart, pars planitis, desprendimiento de retina crónico, síndrome de hiperviscosidad, toxoplasmosis , traumatismo y complicaciones posterior a cirugía con láser. Otras enfermedades incluyen, pero no se limitan a enfermedades relacionadas con rubeosis (neovascularización de las comisuras) y enfermedades causadas por proliferación anormal de tejido fibrovascular o fibroso, que incluyen todas las formas de vitreoretínopatía proliferativa, asociadas o no con diabetes. Las enfermedades relacionadas con inflamación crónica también se pueden tratar utilizando los métodos de la presente invención. Las enfermedades con síntomas de inflamación crónica incluyen, pero no se limitan a enfermedades de intestino inflamatorio tales como enfermedad de Crohn y colitis ulcerativa, psoriasis, sarcoidosis y artritis reumatoide . La angiogénesis no deseada o no controlada es una característica importante que tienen en común estas enfermedades inflamatorias crónicas. La inflamación crónica depende de la formación continua de brotes de capilares para mantener un flujo de entrada de células inflamatorias. El flujo de entrada y la presencia de las células inflamatorias produce granulomas, que mantienen un estado inflamatorio crónico. La inhibición de angiogénesis utilizando las composiciones y métodos de la presente invención evita la formación de los granulomas por lo que alivia la enfermedad. Como se ha mencionado antes, los métodos de la presente invención se pueden utilizar para tratar a pacientes con enfermedades de intestino inflamatorio tales como enfermedad de Crohn y colitis ulcerativa. La enfermedad de Crohn se presenta como una enfermedad inflamatoria crónica transmutal que afecta más comúnmente al íleon distal y colon, pero también se puede presentar en cualquier parte del tracto gastrointestinal desde la boca hasta el ano y área perianal . Los pacientes con enfermedad de Crohn generalmente tienen diarrea crónica relacionada con dolor abdominal, fiebre, anorexia, pérdida de peso e hinchado abdominal. La prevención de angiogénesis por las composiciones y métodos de la presente invención inhibe la formación de los brotes e impide la formación de granulomas. La colitis ulcerativa también es una enfermedad crónica, inespecífica e inflamatoria y ulcerativa que aparece en la mucosa del colon y está caracterizada por la presencia de diarrea con sangre. Las enfermedades del intestino inflamatorio también afectan la piel. Las lesiones cutáneas se caracterizan por inflamación y angiogénesis y se pueden presentar en muchos sitios además del tracto gastrointestinal. Las composiciones y métodos de la presente invención también se pueden utilizar para tratar estas lesiones para evitar angiogénesis y de esta manera se reduce el flujo de entrada de células inflamatorias y la formación de una lesión. La sarcoidosis es otra enfermedad inflamatoria crónica que se caracteriza como un trastorno granulomatoso de varios sistemas. Los granulomas de esta enfermedad se pueden formar en cualquier parte en el cuerpo y de esta manera los síntomas dependen del sitio de los granulomas y de la enfermedad activa. Los granulomas se generan por brotes capilares angiogénicos que proporcionan un suministro constante de células inflamatorias. Los compuestos y métodos de esta invención se pueden utilizar para tratar sarcoidosis. Los métodos de la presente invención también se pueden utilizar para tratar condiciones inflamatorias crónicas relacionadas con psoriasis. La psoriasis, una enfermedad cutánea, es otra enfermedad crónica y recurrente que se caracteriza por pápulas y placas de diversos tamaños. La prevención de la formación de vasos sanguíneos nuevos necesarios para mantener las lesiones características induce el alivio de los síntomas. Otra enfermedad la cual puede ser tratada utilizando los métodos de la presente invención es artritis reumatoide. La artritis reumatoide es una enfermedad inflamatoria crónica caracterizada por inflamación inespecífica de las articulaciones periféricas. Se piensa que los vasos sanguíneos en el lecho sinovial de las articulaciones experimentan angiogénesis . Además de formar redes vasculares nuevas, las células endoteliales liberan factores y especies de oxígeno reactivas que llevan a crecimiento de paño y destrucción de cartílago. Los factores involucrados en angiogénesis pueden contribuir de manera activa, y ayudar a mantener el estado inflamado de manera crónica de artritis reumatoide. Otras enfermedades que pueden ser tratadas utilizando los métodos de la presente invención son hemangiomas, angiomatosis hemorrágica familiar o telangiectasia hemorrágica hereditaria, tumores sólidos o que han crecido en sangre y síndrome de inmunodeficiencia adquirida . Los métodos de esta invención también son eficaces para inhibir angiogénesis relacionada con crecimiento de tumores malignos. Estos incluyen crecimiento de tumores cancerosos sobre células, tejidos y órganos. Los métodos de la presente invención son útiles para tratar el crecimiento de muchas células tumorales y para tratar una amplia variedad de cánceres. Tales células tumorales incluyen a modo de ejemplo, y no de limitación, células tumorales de pulmón, colon, mama, ovario, próstata e hígado así como carcinomas de células escamosas. Tales cánceres incluyen, a modo de ejemplo y no de limitación, carcinomas tales como de faringe, colon, rectal, pancreático, de estómago, hígado, pulmón, mama, piel, próstata, ovario, cervical, uterino y cáncer de vejiga; leucemias; linfoma9; gliomas; retinoblastomas y sarcomas. En una modalidad particularmente preferida, la invención se relaciona con métodos para administrar compuestos de fórmula I o su modalidad preferida oleuropeína combinado con inmunoterapia activa (por ejemplo vacunación contra tumores) . Además, de acuerdo con los métodos anteriores, los sujetoB mamíferos incluyen, pero no se limitan a humanos, animales de laboratorio, mascotas domésticas y animales de gran a . D. Formulaciones Farmacéuticas/Vías de Administración En los métodos de la presente invención, los compuestos de fórmula I o au modalidad preferida, oleuropeína, o sus productos de hidrólisis se pueden suministrar o administrar a un mamífero, por ejemplo un paciente humano, solo en una forma de una sal farmacéuticamente aceptable o en forma de una composición farmacéutica en donde el compuesto se mezcla con uno o varios portadores o excipientes adecuados en una cantidad terapéuticamente eficaz, por ejemplo a dosis eficaces para abatir, suprimir o inhibir angiogénesis o como resultado en la disminución de síntomas relacionados con enfermedades angiogénicas . Los compuestos de fórmula I o su modalidad preferida, oleuropeína o sus productos de hidrólisis, los cuales se utilizan en los métodos de la presente invención se pueden incorporar en diversas formulaciones para administración terapéutica. Más particularmente, los compuestos de fórmula I o su modalidad preferida, oleuropeína o sus productos de hidrólisis se pueden formular en composiciones f rmacéuticas por combinación con portadores o diluyentes f rmacéuticamente aceptables apropiados y se pueden formular en preparaciones en forma sólida, semisólida, líquida y gaseosa tales como tabletas, cápsulas, pildoras, polvos, gránulos, grageas, geles, suspensiones, ungüentos, soluciones, supositorios, inyecciones, inhalantes y aerosoles. Como tales, la administración de los compuestos se puede llevar a cabo de diversas maneras, que incluyen la administración oral, bucal, rectal, parenteral, intraperitoneal , intradérmica, transdérmica, intraqueal, etc. Además, el compuesto se puede administrar de una manera local en vez de sistémica, por ejemplo mediante inyección del compuesto directamente dentro de un tumor sólido, con frecuencia en una formulación de deposición o deliberación sostenida. Además, los compuestos se pueden administrar en un sistema de suministro de medicamento dirigido, por ejemplo en un liposoma recubierto con anticuerpos específicos para tumor. Tales liposomas se dirigirán hacia el tumor y serán captados por el mismo selectivamente. Además, los compuestos de fórmula I o su modalidad preferida, oleuropeína o sus productos de hidrólisis se pueden formular con excipientes, diluyentes o portadores comunes y se pueden comprimir en tabletas o se pueden formular como elíxires o soluciones para administración oral conveniente o se pueden administrar por vía intramuscular o intravenosa. Los compuestos se pueden administrar transdérmicamente y se pueden formular como formas de dosificación de liberación sostenida y similares. Los compuestos de fórmula I o su modalidad preferida oleuropeína o sus productos de hidrólisis se pueden administrar solos, combinados entre si o se pueden utilizar en combinación con otros compuestos conocidos (por ejemplo otros medicamentos contra el cáncer u otros medicamentos diferentes, tales como AZT, antiinflamatorios, antibióticos, corticosteroides , vitaminas, etc.). Por ejemplo, los compuestos de fórmula I o su modalidad preferida, oleuropeína o sus productos de hidrólisis se pueden utilizar en tratamiento conjunto con otros agentes conocidos antiangiogénicos quimioterapéuticos o antineoplásicos (por ejemplo alcaloides de vinca, antibióticos, antimetabolitos , complejos de coordinación de platino, etc.). Por ejemplo, los compuestos de fórmula I o su modalidad preferida, oleuropeína o sus productos de hidrólisis se pueden utilizar en tratamiento conjunto con compuestos alcaloides de vinca tales como vinblastina, vincristina, taxol; un antibiótico tal como adriamicina (doxorrubicina) , dactinomicina (actinomicina D) , daunorrubicina (daunomicina, rubidomicina) , bleomicina, plicamicina (mitramicina) y mitomicina (mitomicina C) , etc.; un antimetabolito tal como metotrexato, citarabina (AraC) , azauridina, azaribina, fluorodesoxiuridina, desoxicoformicina, mercaptopurina, etc.; o un complejo de coordinación con platino tal como cisplatino (cis-DDP) , carboplatino, etc. Además, los expertos en la técnica apreciarán que los compuestos de la presente invención se pueden utilizar en tratamiento conjunto con otros compuestos conocidos antiangiogénicos quimioterapéuticos o antineoplásicos . En formas de dosificación farmacéutica los compuestos se pueden administrar en forma de sus sales farmacéuticamente aceptables o también se pueden utilizar solos o en una relación apropiada, así como combinados con otros compuestos farmacéuticamente activos. Las composiciones farmacéuticas que se describen en la presente se pueden elaborar de una manera que es conocida por los expertos en la técnica, es decir, por medio de los procesos convencionales de mezclado, disolución, granulado, elaboración de grageas, levigating, emulsificación, encapsulación, atrapado o liofilizado. Los siguientes métodos y excipientes son únicamente ejemplares y de ninguna manera 1 imitantes . Para inyección, los compuestos se pueden formular en preparaciones por su disolución, suspensión o emulsificación en un solvente acuoso o no acuoso, tal como aceite vegetal u otros aceites similares, glicéridos sintéticos de ácidos alifáticos, ésteree de ácidos alifáticos superiores o propilenglicol y si se desea con aditivos convencionales tales como solubilizantes , agentes isotónicos, agentes que mejoren la suspensión, agentes emulsificantes , estabilizantes y conservadores. Preferiblemente, los compuestos de la invención se pueden formular en soluciones acuosas que preferiblemente se encuentran en amortiguadores fisiológicamente compatibles tales como solución de Hanks, solución de Ringer o solución salina fisiológica amortiguada. Para administración a través de la mucosa, se utilizan en la formulación sustancias para penetrar apropiadamente alguna barrera. Tales penetrantes generalmente son conocidos en la técnica . Para administración oral, los compuestos de fórmula I o su modalidad preferida, oleuropeína o sus productos de hidrólisis se pueden formular con facilidad al combinarlos con portadores f rmacéuticamente aceptables que son bien conocidos en la técnica. Tales portadores permiten que los compuestos se formulen como tabletas, pildoras, grageas, cápsulas, emulsiones, suspensiones lipofílicas e hidrofílicas, líquidos, geles, jarabes, slurries, suspensiones y similares para ingestión oral por un paciente que va a ser tratado. Las preparaciones farmacéuticas para uso oral se pueden obtener al mezclar los compuestos con un excipiente sólido, opcionalmente moler una mezcla resultante y procesar la mezcla de gránulos, después de agregar los auxiliares adecuados, si se desea, para obtener tabletas o núcleos de grageas. Los excipientes adecuados son, en particular, materiales de relleno tales como azúcares, que incluyen lactosa, sacarosa, manitol o sorbitol; preparaciones de celulosa tales como, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de papa, gelatina, goma de tragacanto, metilcelulos , hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio o polivinilpirrolidona (PVP) . Si se desea, se pueden agregar agentes desintegrantes tales como polivinilpirrolidona reticulada, agar o ácido algíníco o una sal de los mismos tal como alginato de sodio. Los núcleos de grageas se proporcionan con recubrimientos adecuados. Para este propósito, se pueden utilizar soluciones concentradas de azúcar las cuales opcionalmente pueden contener goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, gel de carbopol , polietilenglicol o dióxido de titanio, soluciones de laca y solventes orgánicos adecuados o mezclas de solventes. Se pueden agregar a las tabletas o recubrimientos de grageas colorantes o pigmentos para identificación o para caracterizar combinaciones diferentes de dosis de compuesto activo. Las preparaciones farmacéuticas que pueden ser utilizadas oralmente incluyen cápsulas que se colocan empujando, elaboradas de gelatina así como cápsulas selladas a suaves elaboradas de gelatina y un plastificante tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas que se colocan empujando pueden contener los ingredientes activos en mezcla con materiales de relleno tales como lactosa, aglutinantes tales como almidones o lubricantes tales como talco o estearato de magnesio y opcionalmente , estabilizantes. En cápsulas suaves, los compuestos activos se pueden disolver o suspender en líquidos adecuados tales como aceites grados, parafina líquida o polietilenglicoles líquidos. Además, se pueden agregar estabilizantes. Todas las formulaciones para administración oral pueden estar en dosificaciones adecuadas para tal administración. Para administración bucal, las composiciones pueden tomar la forma de tabletas o grageas formuladas de manera convencional . Para su administración por inhalación, los compuestos para uso de acuerdo con la presente invención se suministra covalentemente en forma de una presentación de aspersión en aerosol a partir de envases presurizados o un nebulizador con el uso de un propelente adecuado, por ejemplo diclorodifluorometano , triclorofluorometano , diclorotetrafluoroetano , dióxido de carbono u otro gas adecuado, o a partir de inhaladores de polvo seco, sin propelente. En el caso de un aerosol presurizado, la unidad de dosificación se puede determinar al proporcionar una válvula para suministrar una cantidad medida. Las cápsulas y cartuchos por ejemplo de gelatina para uso en un inhalador o insuflador se puede formular para contener una mezcla de polvo del compuesto y una base de polvo adecuada tal como lactosa y almidón. Los compuestos se pueden formular para administración parenteral por inyección, por ejemplo mediante inyección en bolo o infusión continua. Las formulaciones para inyección se pueden presentar en una forma de dosificación unitaria, por ejemplo en ampolletas o en recipientes de dosis múltiples con un conservador agregado. Las composiciones pueden tomar muchas formas como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos y pueden contener agentes formuladores tales como agentes que mejoren la suspensión, estabilizantes o dispersantes. Las formulaciones farmacéuticas para administración parenteral incluyen soluciones acuosas de los compuestos activos en forma hidrosoluble . Adicionalmente , se pueden preparar suspensiones de los compuestos activos como suspensiones para inyección oleosas apropiadas. Los solventes o vehículos lipofílicos adecuados incluyen aceites grasos tales como aceite de ajonjolí o ésteres sintéticos de ácidos grados tales como oleato de etilo o triglicéridos, o liposomas. Las suspensiones de inyección acuosa pueden contener sustancias que incremente la viscosidad de la suspensión tales como carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol o dextrano. Opcionalmente , la suspensión también pueden contener estabilizantes adecuados o agentes que incrementen la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas. De manera alternativa, el ingrediente activo puede estar en forma de polvo para constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo agua sin pirógenos estéril, antes de su uso. Los compuestos también se pueden formular en composiciones rectales tales como supositorios o enemas de retención, que por ejemplo contengan las bases convencionales del supositorio tales como manteca de cacao, carboceras, polietilenglicoles u otros glicéridos, todos los cuales funden a temperatura corporal aunque solidifican a temperatura ambiente. Además de las formulaciones descritas previamente, los compuestos también se pueden formular como una preparación de deposición. Tales formulaciones de acción prolongada se pueden administrar por implantación (por ejemplo, por vía subcutánea o intramuscular) o bien por inyección intramuscular. Así, por ejemplo, los compuestos se pueden formular con materiales adecuados poliméricos o hidrofóbleos (por ejemplo como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico o como derivados escasamente solubles, por ejemplo, como una sal escasamente soluble. De manera alternativa se pueden utilizar otros sistemas de suministro para compuestos farmacéuticos hidrofóbicos . Los liposomas y las emulsiones son ejemplos bien conocidos de vehículos de suministro o portadores para medicamentos hidrofóbicos . Además, se puede utilizar el direccionamiento de un marcador sobre vasculatura tubular anormal. La porción con dirección, cuando se acopla a un medicamento tóxico o radioisótopo, actuará concentrando el medicamento donde se necesita. También se pueden utilizar ligandos para marcadores de vasos asociados a tumor. Por ejemplo, se puede utilizar una molécula de adhesión celular que se una al marcador de superficie del elemento vascular tumoral . También se pueden utilizar liposomas y otros sistemas de suministro de medicamentos, especialmente si su superficie contiene un ligando para dirigir el portador de manera preferencial a la vasculatura del tumor. Los liposomas proporcionan la ventaja adicional de proteger al medicamento de la mayor parte de los tejidos normales, por lo que reducen la toxicidad inherente de muchos compuestos. Cuando se recubren con polietilenglicol (PEG) (es decir, liposomas blindados) para minimizar la captación por fagocitos y con una porción dirigida específica a la vasculatura del tumor, los liposomas proporcionan vidas medias plasmáticas más prolongadas, menor toxicidad en tejido que no es el objetivo y una eficacia aumentada con respecto a los medicamentos que no están dirigidos . Otras estrategias de direccionamiento incluyen, pero no se limitan a ADEPT (tratamiento con precursor enzimático dirigido a anticuerpos) GDEPT (EPT dirigido a gen) y VDEPT (EPT dirigido a virus) . En ADEPT, el direccionamiento de un precursor inactivo a una masa tumoral se lleva a cabo por un anticuerpo contra el marcador asociado a tumor. El medio enzimático dentro o alrededor del tumor transforma al precursor en un agente tóxico activo que actúa después sobre el tejido tumoral. De manera similar, se utiliza la expresión diferencial de genes o direccionamiento viral al sitio del tumor para activar el precursor a su forma tóxica activa en GDEPT y VDEPT, respectivamente. Otras estrategias incluyen el direccionamiento de genes expresados de manera diferencial, enzimas o marcadores de superficie que aparecen sobre la vasculatura relacionada con el tumor, para llevar a cabo el control del crecimiento del tumor. Utilizando los métodos anteriores, los compuestos de fórmula I o su modalidad preferida, oleuropeína o sus productos de hidrólisis se pueden dirigir a la vasculatura del tumor para llevar a cabo el control del progreso del tumor o a otros sitios de interés (por ejemplo células endoteliales) . También se pueden utilizar ciertos solventes orgánicos tales como sulfóxido de dimetilo. De manera adicional, los compuestos se pueden suministrar utilizando un sistema de liberación sostenida, tales como matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el agente terapéutico. Se han establecido diversos tipos de materiales de liberación sostenida y son bien conocidos por los expertos en la técnica. En base en su naturaleza química, las cápsulas de liberación sostenida pueden liberar los compuestos durante algunas semanas hasta más de 100 días. Las composiciones farmacéuticas también comprenden portadores o excipientes adecuados sólidos o en fase de gel . Los ejemplos de tales portadores o excipientes incluyen, pero no se limitan a carbonatos de calcio, fosfato de calcio, diversos azúcares, almidones, derivados de celulosa, gelatina y polímeros tales como polietilenglicoles . Las composiciones f rmacéuticas adecuadas para uso en la presente invención incluyen composiciones en las que los ingredientes activos están contenidos en una cantidad terapéuticamente eficaz. Por supuesto, la cantidad de la composición administrada dependerá del sujeto que sea tratado, del peso del sujeto, la gravedad de la enfermedad, la vía de administración y el juicio del médico que haga la prescripción. La determinación de una cantidad eficaz está dentro de las capacidades de los expertos en la técnica, especialmente en base en la descripción detallada que se proporciona en la presente. Actualmente, se contempla que las cantidades terapéuticamente eficaces de los compuestos utilizados en la práctica de la presente invención pueden comprender cualquier punto entre aproximadamente 0.030 g a 20,000 g de tal compuesto por masa de kilogramo de peso corporal del sujeto. F. Ejemplos La invención se describirá con mayor detalle por medio de los ejemplos específicos. El siguiente ejemplo se proporciona con propósitos ilustrativos y no se pretende que limite la invención de manera alguna. Los expertos en la técnica reconocerán fácilmente una diversidad de parámetros no críticos los cuales pueden cambiar o modificarse para proporcionar esencialmente los mismos resultados. EJEMPLO 1 Este ejemplo ilustra las propiedades angiogénicas de oleuropeína en el ensayo en membrana corioalantoidea (CAM) de pollo. El criterio de valoración del ensayo con CAM es una determinación cuantitativa del número de puntos de ramificación y terminales o extremos de vasos sanguíneos en la membrana corioalantoidea. Dicha cuantificación ilustrará la complejidad de la vasculatura sanguínea en el desarrollo de membrana corioalantoidea. Una disminución en la complejidad de la vasculatura sanguínea de la membrana corioalantoidea como resultado de la aplicación de oleuropeína indica sus propiedades antiangiogénicas . A. Enfogue La CAM en embrión de pollo en desarrollo es un excelente sistema in vivo para estudiar angiogénesis , debido a que existen crecimiento de vasos sanguíneos nuevos en desarrollo. El ensayo con CA involucra rnonitoreo de la vasculatura sanguínea de la membrana corioalantoidea en desarrollo de embriones de pollo vivos . Se han desarrollado varios enfoques para el ensayo de CAM. Estos incluyen el cultivo de embriones de pollo vivos en cajas de petri bajo condiciones estériles especiales. Otra solución ha sido cortar una ventana en el cascarón de huevos fertilizados y aplicar directamente el compuesto que se va a estudiar en la ventana utilizando un papel filtro. Utilizamos una solución modificada para el ensayo CAM, que incluye un método menos invasivo para introducir el compuesto oleuropeína. Se observan a contraluz huevos de pollo fertilizados al tercer día de desarrollo. Se identifica la vasculatura sanguínea y la yema. Se realiza un orificio pequeño de 1 mm en el cascarón. Se inyecta directamente en el saco vitelino, por medio de una aguja de calibre pequeño que transporta 0.4 mi de oleuropeína diluido en solución salina-agua. Se tapa el orificio y los huevos se regresan a la incubadora para desarrollo posterior. Después de 3 días, se extraen los huevos y se rompe el cascarón en un recipiente blanco y se toman fotografías de la membrana corioalantoidea. El grupo control de huevos se inyecta con solución salina/agua.
B. Materiales Los huevos fertilizados se suministran por Country Farm Eggs, Los Angeles, CA. PBS se obtiene de Sigma-Aldrich Chemical Co., St . Louis, Mo. La oleuropeína se obtiene de Indofine Chemical Company, Inc., Somerville, NJ. Las aguj s y lancetas se obtienen de Express Pharmacy Services, Pittsburgh, Pa. El microscopio de disección se adquiere de Microscope World, Encinitas, CA. Se obtiene un incubador de gabinete TX7 de Lyons Electric Company Inc. Chula Vista, CA. Se compra una cámara Kodak MDS-100 de Eastman Kodak Company, New Haven, CT. C. Desarrollo de la CAM para Medir la Inhibición de Angiogénesis Se incuban huevos fértiles frescos durante tres días en un incubador convencional para huevos. La temperatura y humedad se mantienen constantes a 100°C y 65%, respectivamente. En el día 3, se observa a contraluz a los huevos utilizando una lámpara de policía. Se identifican los embriones y las yemas. Se limpia la superficie del cascarón con un hisopo con alcohol. Se perfora el cascaron del huevo con una lanceta realizando un orificio de 1 milímetro. Se utiliza una aguja para extraer 0.5 mi de yema. Se administra directamente en el saco vitelino una inyección de 0.5 mi. Los experimentos previos muestran que la inyección de tinta, con la misma consistencia utilizada en nuestras inyecciones experimentales y control, se difunde en el saco vitelino a los pocos segundos después de la inyección. A los huevos experimentales se les inyecta con una concentración 0.1% y 1.0% de oleuropeína. A los huevos control se les inyecta con una cantidad equivalente de agua. Posteriormente el orificio de inyección se cubre con una pieza pequeña de cinta scotch y los huevos se regresan al incubador para desarrollo adicional . A los 3 días posteriores a la inyección se retiran los huevos de la incubadora y se observan a contraluz. Se rompe el cascarón suavemente utilizando un cuchillo de mantequilla, sobre un recipiente blanco. El embrión y la CAM se colocan cuidadosamente para su observación y fotografía. Se registra la frecuencia cardíaca del embrión utilizando un video de alimentación en vivo con una cámara Kodak mds-100 unida a un microscopio estereoscópico. Se anota la morfología del embrión y se toman fotografías de los embriones utilizando una cámara Canon. La vasculatura sanguínea en la CAM también se fotografía utilizando una cámara Kodak mds 100 montada en un microscopio estereoscópico. E. Resultados La tabla 1 muestra el efecto antiangiogénico de oleuropeína sobre la CAM de embrión de pollo. Los resultados resumen dos experimentos diferentes con un total de 17 huevos con 102 campos fotografiados para el análisis. La oleuropeína muestra efectos inhibidores estadísticamente significativos sobre la angiogénesis de la CA . Una inyección de 0.93 µp??? /huevo de oleuropeína provoca la inhibición del crecimiento de vasos sanguíneos en 73% en comparación con el control. Una inyección de 9.3 ¿¿mol/huevo de oleuropeína provoca la inhibición del crecimiento de vasos sanguíneos en 84% en comparación con el control. Los resultados de estos dos experimentos sugieren que la oleuropeína es un inhibidor angiogénico potente. Debe entenderse que las concentraciones utilizadas en lo anterior están diseñadas para ser ilustrativas y no limitantes. TABLA 1
Significativamente menor que el control, P < 0.0001 bSignificativamente menor que el control, P < 0.0001
Un ejemplo de la inhibición de angiogénesis por oleuropeína se ilustra claramente por fotografías representativas tomadas de la CAM al finalizar el experimento. La figura 1 muestra las fotografías representativas de la CAM de huevos tratados con 9.3 í/moles/huevo de oleuropeína. En estas CAM, disminuye en gran medida el número de vasos sanguíneos y las ramificaciones son menos complejas que en los controles los cuales se muestran en la figura 3. No únicamente los lechos capilares obliterados sino también los vasos de tamaño medio e incluso los grandes se han roto o están en proceso de romperse. Incluso a 0.93 µG???/huevo de oleuropeína se inhibe en gran medida la vasculatura de la CAM (figura 2) en comparación con redes de vasos sanguíneos extensas en las CAM control (figura 3) . Una observación más cercana del lecho capilar, en donde tiene lugar la mayor parte del intercambio gaseoso cerca del borde de la CAM ilustra una desaparición de las redes capilares y extensas en los huevos tratados con oleuropeína, en comparación con los huevos control (figura 4) . También se observa en el ensayo CAM como resultado del tratamiento con oleuropeína un encogimiento de la CAM y el embrión (figura 5) . El ensayo de CAM se ha utilizado tradicionalmente para determinar la propiedad antiangiogénica de diversos compuestos. Estos compuestos se han aplicado habitualmente a una ventana pequeña abierta en la superficie del huevo y se han llevado a cabo en la CAM o en el embrión en su totalidad. En este ejemplo hemos utilizado una modificación del ensayo de CAM para determinar el efecto de la oleuropeína en la CAM completa y posteriormente en el tamaño del embrión. En el desarrollo animal, el embrión experimenta divisiones celulares rápidas así como una diferenciación celular y morfogénesis. Se puede extraer una analogía entre la división celular rápida y el crecimiento de los embriones de pollo en desarrollo con una división celular rápida y crecimiento de células tumorales . El crecimiento en ambos ejemplos depende del suministro de sangre. El embrión de pollo necesita una CAM muy vascularizada para poder sostener la división celular y el crecimiento. De una manera muy similar, un tumor necesitan vascularizarse en gran medida para sostener la división celular y el crecimiento. La limitación del suministro de sangre encogerá al embrión y por inferencia se puede decir que también sucederá lo mismo con los tumores. En el ensayo de CAM modificado, la oleuropeína disminuye de manera significativa el crecimiento de vasos sanguíneos y se observa encogimiento subsecuente del embrión (figura 5) . El ejemplo ilustrativo que se muestra en el ejemplo 5 indica que existe una correlación directa entre el tamaño de la CAM y el tamaño del embrión. La CAM tratada con oleuropeína es aproximadamente 50% de diámetro más pequeño en comparación con CAM control . Los embriones tratados con oleuropeína son correspondientemente más pequeños en aproximadamente 60% el tamaño de los embriones control no tratados. Las dosis más altas de oleuropeína, aunque llevan a cabo de manera notable cambios en el tamaño de la CAM y el tamaño del embrión, no afecta la viabilidad del embrión. EJEMPLO 2 Este ejemplo ilustra las propiedades antiangiogénicas del extracto de hojas de olivo en el ensayo en membrana corioalantoidea (CAM) de pollo. El criterio de valoración del ensayo CAM es la visualización directa del número de puntos de ramificación y extremos o puntas de vasos sanguíneos en la membrana corioalantoidea. Tal visualización ilustrará la complejidad de la vasculatura sanguínea en una membrana corioalantoidea en desarrollo. La disminución en la complejidad de la vasculatura sanguínea de la membrana corioalantoidea como resultado de la aplicación del extracto de hoja de olivo indica sus propiedades antiangiogénicas. A. Enfoque Como se describe en el ejemplo 1, se utiliza el ensayo de CAM para determinar las propiedades antiangiogénicas del extracto de hojas de olivo. B. Materiales Los huevos fertilizados se suministran por Country Farm Eggs, Los Angeles, CA. PBS se obtiene de Sigma-Aldrich Chemical Co . , St . Louis, Mo. El extracto de hojas de olivo se obtiene de hojas de olivo. Las agujas y lancetas se obtienen de Express Pharmacy Services, Pittsburgh, Pa . El microscopio de disección se adquiere de Microscope World, Encínitas, CA. Se obtiene un incubador de gabinete TX de Lyons Electric Company Inc. Chula Vista, CA. Se adquiere una cámara Kodak
MDS-100 de Eastman Kodak Company, New Haven, CT. C. Desarrollo de la CAM para Medir la Inhibición de
AnglogénsBÍs Se incuban huevos fértiles frescos durante tres días en un incubador estándar para huevos. La temperatura y humedad se mantienen constantes a 37.7°C (100°F) y 65%, respectivamente. En el día 3, se observa a contraluz los huevos utilizando una lámpara de policía. Se identifican los embriones y las yemas. Se limpia la superficie del cascarón con un hisopo con alcohol. Se perfora el cascarón con una lanceta realizando un orificio de 1 milímetro. Se utiliza una aguja para extraer 0.5 mi de yema. Se administra directamente en el saco vitelino una inyección de 0.5 mi. Los experimentos previos muestran que la inyección de tinta, con la misma consistencia utilizada en nuestras inyecciones experimentales y control, se difunde en el saco vitelino a los pocos segundos después de la inyección. A los huevos experimentales se les inyecta con agua que contiene extracto de hojas de olivo. A los huevos control se les inyecta con una cantidad equivalente de agua. Se agregan 10 mililitros de agua en ebullición a media cucharada de hojas de oliva secas y molidas y la extracción se lleva a cabo durante 2 horas antes del uso del extracto en el experimento. Después de la inyección, el orificio se cubre con una pieza pequeña de cinta scotch y los huevos se regresan al incubador para desarrollo posterior. A los 4 días posteriores a la inyección se extraen los huevos de la incubadora y se rompe suavemente utilizando una cuchilla de mantequilla, sobre un recipiente blanco. El embrión y la CAM se colocan cuidadosamente para su observación y fotografía. Se registra la frecuencia cardíaca del embrión utilizando un video de alimentación en vivo con una cámara Kodak mds-100 unida a un microscopio estereoscópico. Se observa la morfología de los embriones y se toman fotografías de los embriones utilizando una cámara Canon. La vasculatura sanguínea en la CAM también se fotografía utilizando una cámara Kodak mds 100 montada en un microscopio estereoscópico. C . Resultados Los resultados de tres experimentos sugieren que el extracto de hojas de olivo es un inhibidor angiogénico potente. Debe entenderse que las concentraciones utilizadas en lo anterior se pretende que sean ilustrativas y no limitantes. Un ejemplo de la inhibición de angiogénesis por extracto de hojas de olivo se ilustra con claridad por las fotografías representativas tomadas de la CAM al concluir los experimentos. La figura 1 muestra fotografías representativas de la CAM de los huevos control (figuras 6a, b y c) y huevos tratados con extractos de hojas de olivo (figura 6d, e y f) . En las CAM tratadas, el número de vasos sanguíneos disminuye en gran medida y la ramificación es menos compleja que en los controles . Debe entenderse que la descripción anterior se pretende que sea ilustrativa y no limitante. Muchas modalidades serán evidentes para aquellos f miliarizados en la técnica ante la lectura de la descripción anterior. Por lo tanto, el alcance de la invención debe determinarse no con referencia a la descripción anterior sino que debe determinarse con referencia a las reivindicaciones anexas junto con el alcance completo de equivalentes para los cuales están capacitadas tales reivindicaciones. Las descripciones de todos los artículos y referencias, incluyendo solicitudes de patente y publicaciones, se incorporan en la presente como referencia para todo propósito. EJEMPLO 3 Este ejemplo ilustra las propiedades antiangiogénicas de oleuropeina en un modelo de oreja de ratón adulto. El criterio de valoración del ensayo de modelo de oreja de ratón adulto es la visualización directa del número de puntos de ramificación y extremos o puntas de vasos sanguíneos. Tal visualización ilustra la complejidad de la vasculatura sanguínea en la oreja de ratón adulto. Una disminución en la complejidad de la vasculatura sanguínea inducida de la oreja de ratón adulto como resultado de la aplicación de oleuropeina puede indicar sus propiedades antiangiogénicas . A. Enfoque En el modelo anterior (la CAM en embrión de pollo en desarrollo) , aunque es un excelente sistema in vivo para estudiar angiogénesis , debido a que existe crecimiento de vasos sanguíneos nuevos en desarrollo en el embrión en crecimiento, probamos otro modelo para determinar si la oleuropeína puede inhibir el crecimiento de vasos sanguíneos inducidos en un mamífero adulto. El modelo que seleccionamos para uso es la oreja de ratón adulto. La oreja de ratón está vascularizada y es lo suficientemente delgada para ser visualizada directamente por un microscopio óptico. Si se aplica un estímulo a la oreja de ratón adulto, los vasos sanguíneos existentes son capaces de dispersarse en nuevos (angiogénesis) . Utilizando este modelo, se pueden probar compuestos antiangiogénicos para determinar sus efectos. Se aplica una quemadura con hidróxido de sodio, lo que estimula a los vasos sanguíneos existentes en la oreja de ratón adulto para que se diseminen en vasos sanguíneos nuevos. Antes de la aplicación de la quemadura de hidróxido de sodio a los ratones experimentales se les inyectó intraperitonealmente con solución salina amortiguada con fosfato que contiene oleuropeína. Los ratones control fueron inyectados intraperitonealmente con solución salina amortiguada con fosfato sola. Las quemaduras de hidróxido de sodio se aplican a los oídos de ambos grupos. Un tercer grupo de ratones no fueron inyectados ni quemados . Este tercer grupo de ratones muestra el estado de los vasos sanguíneos no inducidos en la oreja de ratón adulto. El ensayo en oreja de ratón adulto involucra el monitoreo de la vasculatura sanguínea de la oreja en los ratones adultos tres días después de la aplicación de la quemadura con hidróxido de sodio. B. Materiales Se hace crecer a los ratones en bioterios en un ambiente limpio y sano. Se obtiene PBS de Sigma-Aldrich Chemical Co.; S . Louis, Mo . Se obtiene oleuropeína de Indofine Chemical Company, Inc., Somerville, NJ. Se obtiene hidróxido de sodio de Sammy's Camera en Los Angeles. Las agujas y Nair se obtienen de Thrifty's drugs en Los Angeles CA. El microscopio de disección se adquiere de Microscope World, Encinitas, CA. Se adquiere una cámara Kodak MDS-100 de Eastman Kodak Company, New Haven, CT. C. Desarrollo del Modelo de Oreja de Ratón Adulto para Medir la Inhibición de Anglogénesia Se utilizaron los ratones cuando habían crecido completamente a 1?9 2-3 meses. A los ratones experimentales se les inyecta intraperitonealmente 0.25 mi de solución salina amortiguada con fosfato que contiene 0.025 g de oleuropeína. Los ratones control se inyectan con 0.25 mi de solución salina amortiguada con fosfato, sola. Los grupos experimental y control se inyectan intraperitonealmente una vez al día durante 3 días antes de la quemadura con hidróxido de sodio. En el cuarto día, se aplica un hisopo Q-tip humedecido con una solución de hidróxido de sodio 2%, por un período total de un minuto a las orejas de ambos grupos de ratones. Posteriormente las orejas se lavan con cantidades abundantes de agua. Los ratones regresaron a sus jaulas durante otros tres días, tiempo durante el cual se les administro inyecciones intraperitoneales una vez al día. En el cuarto día, los ratones fueron sacrificados por dislocación cervical. Las orejas se trataron con Nair para eliminar el exceso de pelo y se fotografío la vasculatura sanguínea utilizando una cámara digital MDS-100 unida a un microscopio estereoscópico. E. Resultados Se utilizaron en el experimento anterior un total de cinco ratones control (quemados) , cinco experimentales (quemados y tratados con oleuropeína) y cinco controles (no quemados y no tratados), totalizando 30 orejas. Los resultados del experimento anterior muestran que la oleuropeína es un inhibidor angiogénico potente. Un ejemplo de la inhibición de angiogénesis por oleuropeína se ilustra claramente por las fotografías representativas tomadas de las orejas de ratón al finalizar el experimento. La figura 7 muestra la comparación de las orejas de la totalidad de los tres grupos de ratones. Las orejas de loa ratones que no fueron quemadas o tratadas de manera alguna muestran claramente cierta vascularización (figura 7a) . Las orejas de los ratones en el grupo control que fueron quemadas con hidróxido de sodio muestran una cantidad aumentada de vascularización, lo que indica que se tuvo éxito en la inducción de crecimiento de vasos sanguíneos (figura 7b) . Un ejemplo sorprendente del crecimiento inducido de los vasos sanguíneos se puede ver en la figura 7c, en donde los vasos nuevos se han dispersado a partir de vasos sanguíneos existentes y se han desplazado hacia el área de la quemadura. En la figura 7d se muestra el poderoso efecto antiangiogénico de oleuropeína. En esta figura las orejas se tratan con hidróxido de sodio y los ratones también reciben dosis diarias de oleuropeína. Se puede ver que la oleuropeína inhibe de manera potente impidiendo que se diseminen los vasos sanguíneos existentes. De hecho, el área quemada carece de vasos sanguíneos. Esto es un resultado consistente a todos los ratones a los que se les administró diariamente inyecciones de oleuropeína. También debe entenderse que la descripción anterior y la cantidad de oleuropeína utilizada se pretende que sea ilustrativa y no limitante. Serán evidentes muchas modalidades para aquellos expertos en la técnica ante la lectura de la descripción anterior. El alcance de la invención, por lo tanto, debe determinarse no con referencia a la descripción anterior sino que debe determinarse con referencia a las reivindicaciones anexas junto con el alcance completo de equivalentes a los cuales se capacitan tales reivindicaciones. Las descripciones de todos los artículos y referencias, incluyendo solicitudes de patentes y publicaciones se incorporan en la presente como referencia para todo propósito. EJEMPLO 4 Este ejemplo ilustra las propiedades antiangiogénicas del extracto de hojas de olivo en el modelo de oreja de ratón adulto. El criterio de valoración del ensayo de modelo de oreja de ratón adulto es una visualización directa del número de puntos de ramificación y puntas o extremos de vasos sanguíneos. Tal visualización es ilustrativa de la complejidad de la vasculatura sanguínea en orejas de ratones adultos. La disminución en la complejidad de la vasculatura de vasos inducidos de las orejas de ratones adultos como un resultado de la aplicación del extracto de hojas de olivo puede indicar sus propiedades antiangiogénicas . A. Enfoque Como se describe en el ejemplo 3, se utiliza el modelo de oreja de ratón adulto para determinar las propiedades antiangiogénicas del extracto de hojas de olivo.
B. Materiales Se cría a ratones por los inventores en ambiente limpio y sano. Se obtiene PBS de Sigma-Aldrich Chemical Co . ; St . Louis, Mo. El extracto de hojas de olivo se obtiene de las hojas de olivo. Se obtiene hidróxido de sodio de Sammy's Camera en Los Angeles. Las agujas y Nair se obtienen de Thrifty's drugs en Los Angeles CA. El microscopio de disección se adquiere de Microscope World, Encinitas, CA. Se adquiere una cámara Kodak MDS-100 de Eastman Kodak Company, New Haven, CT. C. Desarrollo del Modelo de Oreja de Ratón Adulto para Medir la Inhibición de Angiogéneais Se utilizaron los ratones cuando habían crecido completamente a los 2-3 meses. A los ratones experimentales se les inyecta intraperitonealmente 0.25 mi de solución salina amortiguada con fosfato que contiene extractos de hoja de olivo. El extracto de hojas de olivo se prepara al moler hojas de olivo secas en un molino de café hasta que las hojas se encuentran en forma pulverizada. Se mezclan 10 mililitros de las hojas pulverizadas empacadas con 45 mililitros de agua caliente. Se agrega a la mezcla solución salina amortiguada con fosfato. A los grupos experimental y control se les inyecta intraperitonealmente una vez al día durante tres días antes de la quemadura con hidróxido de sodio. Cada ratón recibe una inyección de 0.25 mi. El grupo experimental recibe una inyección salina amortiguada con fosfato que contiene el extracto de hoja de olivo. El grupo control recibe únicamente inyección de solución salina amortiguada con fosfato. En el cuarto día se aplica un hisopo Q-tip humedecido con una solución de hidróxido de sodio 2% por un tiempo total de un minuto a las orejas de ambos grupos de ratones. Posteriormente, las orejas se lavan con cantidades abundantes de agua. Los ratones se regresan a las jaulas durante otros 3 días, tiempo durante el cual se les administra inyecciones intraperitonealmente una vez al día. En el cuarto día los ratones fueron sacrificados por dislocación cervical . Las orejas se tratan con Nair para eliminar el exceso de pelo y se fotografío la vasculatura sanguínea utilizando una cámara digital MDS-100 unida a un microscopio estereoscópico. E. Resultados Se utilizan un total de siete ratones control y siete ratones experimentales en el experimento anterior, totalizando 28 orejas. Los resultados del experimento anterior muestran que el extracto de hojas de olivo es un potente inhibidor angiogénico. Un ejemplo de la inhibición de angiogénesis por el extracto de hojas de olivo se ilustra claramente por las fotografías representativas tomadas de las orejas de ratón en la conclusión del experimento. La figura 8 muestra fotografías representativas de ocho orejas independientes de ratones control (figuras 8a, b, c y d) y ratones tratados con extracto de hojas de olivo (figuras 8e, f , g y h) . Las orejas de los ratones control están altamente vascularizadas lo que indica una inducción de crecimiento de vasos sanguíneos nuevos . Los ratones tratados con extracto de hojas de olivo presentan vascularización disminuida lo que indica un potente efecto del extracto de hojas de olivo para inhibir el crecimiento de vasos sanguíneos nuevos. Debe entenderse que las cantidades utilizadas en lo anterior de extracto de hojas de olivo se pretende que sean ilustrativas y no limitantes. Debe entenderse que la descripción anterior se pretende que sea ilustrativa y no limitante. Muchas modalidades serán evidentes para aquellos expertos en la técnica ante la lectura de la descripción anterior. Por lo tanto, el alcance de la invención debe determinarse no con referencia a la descripción anterior sino en vez de esto se debe determinar con referencia a las reivindicaciones anexas, junto con el alcance completo de equivalentes para los cuales están capacitadas las reivindicaciones. Las descripciones de todos los artículos y referencias incluyendo solicitudes de patente y publicaciones se incorporan en la presente como referencia para todo propósito . Las modificaciones y mejoras adicionales de la presente invención también serán evidentes para aquellos habitualmente expertos en la técnica. Por lo tanto, la combinación particular de partes descritas e ilustradas en la presente se pretende que representen únicamente cierta modalidad de la presente invención y no se pretende que sirvan como una limitación de los dispositivos alternativos dentro del espíritu y alcance de la invención. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención