PT1397105E - Composições para inibir angiogénese - Google Patents

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PT1397105E
PT1397105E PT02739332T PT02739332T PT1397105E PT 1397105 E PT1397105 E PT 1397105E PT 02739332 T PT02739332 T PT 02739332T PT 02739332 T PT02739332 T PT 02739332T PT 1397105 E PT1397105 E PT 1397105E
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oleuropein
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angiogenesis
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Hamdi K Hamdi
Jeffrey H Tavis
Raquel Castellon
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Hamdi K Hamdi
Jeffrey H Tavis
Raquel Castellon
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Description

ΕΡ 1 397 105 /PT DESCRIÇÃO "Composições para inibir angiogénese"
ANTECEDENTES DO INVENTO A angiogénese é o crescimento de novos vasos sanguíneos a partir de microvasos preexistentes. O processo angiogénico é um processo natural e regulado em cicatrização de ferimentos, desenvolvimento fetal e embrionário e na formação do corpo lúteo, endométrio e placenta. Estes processos são vitais para a saúde e crescimento e são muito bem regulados por promotores e inibidores angiogénicos. Contudo, em estados de doença esta regulação pode ser evitada e levar a angiogénese patogénica. A angiogénese patogénica é angiogénese indesejável e é o alvo de intervenções terapêuticas. Várias doenças humanas são caracterizadas por angiogénese indesejável. Tais incluem cancro, retinopatia diabética, degenerescência da mácula relacionada com a idade, formação de pano artrítico e psoríase.
No cancro, por exemplo, a angiogénese desempenha um papel crítico na sobrevivência e metástases de tumores. Os tumores excretam factores angiogénicos que promovem a divisão e migração de células endoteliais, que iniciam o processo angiogénico. Tornou-se evidente que os tumores têm de ser vascularizados para crescer e formar metástases. Caso o fornecimento de sangue ao tumor seja impedido, o tumor não crescerá além de 0,4 mm. As células de tumor, sem um fornecimento de sangue adequado, finalmente tornam-se necróticas e/ou apoptóticas. Assim, a vasculatura sanguínea e especialmente o crescimento de novos vasos sanguineos ou angiogénese é um aspecto importante de biologia de tumor. As terapias dirigidas contra angiogénese poderiam levar à cessação ou alívio destas doenças. A patogénese e cegueira associadas a doenças oculares tais como retinopatia diabética e degenerescência da mácula relacionada com a idade são um resultado directo de angiogénese indesejável. No tecido ocular, a angiogénese é a causa mais comum de cegueira. A retinopatia diabética proliferativa é caracterizada por incursão de vasos sanguíneos 2
ΕΡ 1 397 105 /PT da retina no vítreo. A degenerescência da mácula relacionada com a idade é uma doença da mácula e distingue-se da forma seca por crescimento de vasos sanguíneos coroidais que penetram na membrana de Bruch. A patologia angiogénica também se encontra associada com retinopatia da prematuridade, rejeição de enxerto da córnea, glaucoma neovascular e fibroplasia retrolental. As doenças associadas com neovascularização retiniana/coroidal incluem, entre outras, retinopatia diabética, degenerescência da mácula, anemia de células falciformes, sarcóide, sífilis, pseudoxantoma elástico e doença de Paget.
RESUMO SUCINTO DO INVENTO O presente invento refere-se a compostos para inibir a vascularização de células endoteliais, através de pôr uma célula, tecido ou órgão que apresenta células endoteliais em contacto com uma quantidade anti-angiogénica de um composto com a fórmula I. Os compostos de fórmula I tem a fórmula geral seguinte:
Fórmula I
Na fórmula I, Rl e R2 são are grupos funcionais incluindo hidroxilo.
Na fórmula I, R3 é um grupo funcional incluindo hidrogénio, Ci-C6-alquilo, C2-C6-alcenilo, C2-C6-alcinilo, arilo, hidroxilo, Ci-Ce-alcoxi, halogéneo, NO2, NH3 e COOCH3.
Na fórmula I, R4 é um grupo funcional incluindo hidrogénio, Ci-C6-alcoxi, glucose, B-D-glucopiranose, C1-C6-alquilo, C2-C6-alcenilo, C2-C6-alcinilo, arilo, hidroxilo, halogéneo, NO2, NH3, hidrato de carbono, aminoácido, nucleótido e lípido. 3
ΕΡ 1 397 105 /PT
Na fórmula I, R5 é um grupo funcional incluindo hidrogénio, Ci-C6-alquilo, C2-C6-alcenilo, C2-C6-alcinilo, arilo, hidroxilo, Ci-C6-alcoxi, halogéneo, N02, NH3 e CH3.
Na fórmula I, X1-X3 são grupos funcionais incluindo oxigénio, enxofre, -CH2- ou carboxi, que podem ser diferentes mas que de preferência são grupos funcionais idênticos.
Numa concretização preferida do invento, o composto de fórmula I é oleuropeína com fórmula C2sH320i3, tal como descrito na décima edição de THE MERK INDEX com o número monográfico 6709 e apresentada na fórmula II.
Fórmula II
0 extracto de planta x, que pode incluir qualquer dos extractos etanólico, de acetona, de ácido ou base inorgânico e orgânico e/ou aquosa de extracto de planta x contém: oleuropeína, o composto apresentado na fórmula II. O extracto de planta x é derivado de plantas incluindo as folhas, rebentos, frutos, madeira, casca e raízes da oliveira Olea europaea L., ligustro, Ligustrum obtusifolium {Oleaceae), etc. O presente invento também se refere a compostos para utilização num método para inibir potentemente angiogénese indesejável num tecido ou órgão, incluindo o método colocar a célula em contacto com uma solução etanólica, de acetona, de ácido ou base inorgânico e orgânico e/ou aquosa de extracto de planta x. ou um derivado da solução etanólica, de acetona, de ácido ou base inorgânico e orgânico e/ou aquosa ou um componente derivado contendo oleuropeína, o composto apresentado na fórmula II ou um seu derivado, tal como apresentado na fórmula I, ou produtos da sua hidrólise, que incluem entre outros oleuropeína aglícona, ácido elenólico, 4
ΕΡ 1 397 105 /PT álcool beta-3,4-di-hidroxifenietilíco e elenolato metil-o-metílico ou uma composição farmacêutica derivada numa quantidade suficiente para inibir angiogénese. Numa concretização preferida presentemente, a célula encontra-se num organismo vivo. O presente invento reivindica a utilização de uma composição para o fabrico de um medicamento para o tratamento de doenças associadas com angiogénese patogénica, seleccionadas de doenças oculares e uma doença associada a inflamação crónica seleccionada do grupo que consiste em sarcoidose e artrite reumatóide, incluindo a composição como um ingrediente activo um composto de fórmula I:
em que - Rl e R2 são grupos funcionais hidroxilo; - R3 é um grupo funcional seleccionado do grupo que consiste em hidrogénio, Ci-C6-alquilo, C2-Cg-alcenilo, C2-C6-alcinilo, arilo, hidroxilo, Ci-C6-alcoxi, halogéneo, NO2, NH3, e COOCH3; X1-X3 são grupos funcionais seleccionados do grupo que consiste em oxigénio, enxofre, -CH2- ou carboxi; - R4 é um grupo funcional seleccionado do grupo que consiste em hidrogénio, C2-C6-alcoxi, glucose, B-D-glucopiranose, Ci-C6-alquilo, C2-C6-alcenilo, C2-C6-alcinilo, arilo, hidroxilo, halogéneo NO2, NH3, hidrato de carbono, aminoácido, nucleótido e lípido; e - R5 é um grupo funcional seleccionado do grupo que consiste em hidrogénio, Ci-C6-alquilo, C2-C6-alcenilo, C2-C6-alcinilo, arilo, hidroxilo, Ci-C6-alcoxi, halogéneo, NO2, NH3 e CH3, a referida doença ocular é seleccionada do grupo que consiste 5
ΕΡ 1 397 105 /PT em retinopatia diabética, retinopatia da prematuridade, rejeição de enxerto da córnea, glaucoma neovascular e fibroplasias retrolentais, queratoconjuntivite epidémica, deficiência de vitamina A, uso excessivo de lentes de contacto, queratite atópica, queratite limbica superior, queratite seca de pterígio, sindrome de Sjogren, acne rosácea, filectenulose, sífilis, infecções por micobactérias, degenerescência lipídica, queimaduras químicas, úlceras bacterianas, úlceras fúngicas, infecções por protozoários, sarcoma de Kaposi, úlcera de Mooren, degeneração marginal de Terrien, queratólise marginal, trauma, lúpus sistémico, poliarterite, sarcoidose de Wegeners, esclerite, doença de Steven Johnson, caratotomia radial da perafigóide e rejeição de enxerto da córnea, retinopatia diabética, degenerescência da mácula, anemia de células falciformes, sarcóide, sífilis, pseudoxantoma elástico, doença de Pagets, obstrução venosa, obstrução arterial, doença obstrutiva da carótida, uveite/vitrite crónica, infecções micobacterianas, doença de Lyme, lúpus eritematoso sistémico, retinopatia da prematuridade, doença de Easles, doença de Bechets, infecções causadoras de retinite ou coroidite, histoplasmose ocular presumida, doença de Bests, miopia, picadas oculares, doença de Stargarts, pars planitis, descolamento da retina crónico, síndromes de hiperviscosidade, toxoplasmose, trauma e complicações pós-laser, rubeose e retinopatia auricular proliferativa, cuja referida utilização inclui administração a um animal vivo de um composto anti-angiogénico da solução etanólica, de acetona, de ácido ou base inorgânico e orgânico e/ou aquosa de extracto X ou um derivado da solução etanólica, de acetona, de ácido ou base inorgânico e orgânico e/ou aquosa ou um componente derivado contendo oleuropeína, o composto apresentado na fórmula II ou um seu derivado, tal como apresentado na fórmula I, ou produtos da sua hidrólise, que incluem oleuropeína aglícona, ácido elenólico, álcool beta-3,4-di-hidroxifenietilíco e elenolato metil-o-metílico ou uma composição farmacêutica derivada, solução numa dosagem suficiente para inibir angiogénese. Estes compostos são úteis para melhorar os efeitos de condições que são caracterizadas por angiogénese anómala ou indesejável ou proliferação e/ou migração de células endoteliais. 6
ΕΡ 1 397 105 /PT
Tornar-se-ão aparentes outras características, objectivos e vantagens do invento e as suas concretizações preferidas a partir da descrição detalhada que se segue.
DESCRIÇÃO SUCINTA DAS FIGURAS
Estas, bem como outras características do presente invento tornar-se-ão mais aparentes por referência aos esquemas nos quais:
Gráfico IA. Gráfico da inibição de crescimento de vasos sanguíneos por oleuropeína com base no número de nódulos dos vasos sanguíneos na membrana corio-alantóide de frango (CAM). As barras do gráfico representam os valores de média e o erro padrão. Obteve-se significado estatístico utilizando um teste t não emparelhado.
Gráfico 1B. Gráfico da inibição de crescimento de vasos sanguíneos por oleuropeína com base no número final de vasos sanguíneos nas CAM. As barras do gráfico representam os valores de média e o erro padrão. Obteve-se significado estatístico utilizando um teste t não emparelhado.
Figura 1. Fotografias representativas que ilustram a inibição de angiogénese por uma solução aquosa de oleuropeína. Injectaram-se embriões de frango com três dias de idade com 0,5 cm3 contendo 9,3 μιηοΐ/ονο de oleuropeína. As injecções foram efectuadas directamente para o saco vitelino. Os embriões foram incubados durante 4 dias após injecção. Partiu-se o ovo e fotografou-se a CAM utilizando uma câmara Kodak mds 100.
Figura 2. Fotografias representativas que ilustram a inibição de angiogénese por uma solução aquosa de oleuropeína. Injectaram-se embriões de frango de três dias de idade com 0,5 cm3 contendo 0,93 μιηοΐ/ονο de oleuropeína. As injecções foram efectuadas directamente para o saco vitelino. Os embriões foram incubados durante 4 dias após injecção. Partiu-se o ovo e fotografou-se a CAM utilizando uma câmara Kodak mds 100. 7
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Figura 3. Fotografias representativas que ilustram o nível de angiogénese no controlo. Os efeitos de uma solução aquosa em angiogénese. Injectaram-se embriões de frango de três dias de idade com 0,5 cm3 de água destilada. As injecções foram efectuadas directamente para o saco vitelino. Os embriões foram incubados durante 4 dias após injecção. Partiu-se o ovo e fotografou-se a CAM utilizando uma câmara Kodak mds 100.
Figura 4. Compara as camas capilares de CAM de controlo e experimentais. Apresenta o desaparecimento de capilares em ovos tratados com oleuropeína.
Figura 5. Uma montagem de embrião completo incluindo CAM. Ilustra o efeito de oleuropeína no tamanho da CAM e subsequentemente no tamanho do embrião.
Figura 6. Fotografias representativas que ilustram a inibição de angiogénese por uma solução aquosa de extracto de folha de oliveira. As fotografias (A), (B) e (C) representam CAM de embriões de controlo injectados com água/solução salina. As fotografias (D), (E) e (F) representam embriões de frango que foram injectados com 0,5 cm3 de extracto de folha de oliveira. As injecções foram feitas directamente para o saco vitelino. Os embriões foram incubados durante 4 dias após injecção. Partiram-se os ovos e fotografaram-se as CAM utilizando uma câmara Kodak mds 100.
Figura 7. Fotografias comparativas que ilustram a inibição de angiogénese por uma solução aquosa de oleuropeína. A fotografia (A) representa uma orelha de ratinho adulto que não foi queimada nem tratada de modo algum. A vascularização representa o que é normalmente verificado na orelha de ratinho adulto. A fotografia (B) representa indução de crescimento de vasos sanguíneos por uma queimadura com hidróxido de sódio. Produziu-se uma resposta angiogénica muito significativa comparativamente à orelha não queimada. A fotografia (C) apresenta uma resposta angiogénica mais detalhada abrangendo a área queimada. Podem verificar-se vasos sanguíneos crescendo de outros já existentes e dirigindo-se para a queimadura. A fotografia (D) apresenta uma orelha de ratinho que foi queimada mas o crescimento de novos vasos sanguíneos foi inibido por injecções intraperitoneais de oleuropeína. 8
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Figura 8. Fotografias comparativas que ilustram a inibição de angiogénese por uma solução aquosa de oleuropeína. As fotografias (A), (B), (C) e (D) representam orelhas de ratinho adulto que foram queimadas com hidróxido de sódio tal como descrito infra. A vascularização representa indução de crescimento de vasos sanguíneos por queimadura com hidróxido de sódio. Produziu-se uma resposta angiogénica muito significativa comparativamente à orelha não queimada. As fotografias (E), (F) , (G) e (H) apresentam orelhas de ratinho que foram queimadas com hidróxido de sódio, mas trataram-se os ratinhos com oleuropeína. O crescimento de vasos sanguíneos foi inibido potentemente pelos tratamentos com oleuropeína. DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO A. Definições A expressão "animal" refere-se a um organismo com um sistema circulatório fechado de vasos sanguíneos e inclui pássaros, mamíferos e crocodilos. A expressão "animal" utilizada no presente documento também inclui indivíduos humanos. A expressão "angiogénese" refere-se à geração de novos vasos sanguíneos para células, tecidos, órgãos ou tumores. A expressão "metástase" refere-se ao processo pelo qual as células de tumor se espalham para partes distantes do corpo. A expressão é também utilizada no presente documento para referir um tumor que se desenvolve através do processo de formação de metástases. A expressão "pôr em contacto" é utilizada indiferentemente no presente documento com as seguintes acepções: combinado com, adicionado a, misturado com, passado por, incubado com, transbordado, etc. Além disso, os compostos do presente invento podem ser "administrados" por qualquer método convencional tal como, por exemplo, via parentérica, oral, tópica e inalação, tal como descrito no presente documento. A expressão "sal farmaceuticamente aceitável" refere-se aos sais de compostos que mantêm a eficácia biológica e propriedades das bases livres e que são obtidos por reacção 9 ΕΡ 1 397 105 /PT com ácidos inorgânicos tais como ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, ácido metanossulfónico, ácido etanossulfónico, ácido p-toluenossulfónico, ácido salicílico. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem, por exemplo, sais de metais alcalinos, tais como sódio e potássio, sais de metais alcalino-terrosos e sais de amónio. "Uma quantidade suficiente", "uma quantidade eficaz", "quantidade terapeuticamente eficaz" ou quantidade "anti-angiogénica" refere-se a uma quantidade de um composto ou composição eficaz para diminuir, suprimir ou inibir angiogénese ou resultar numa melhoria dos sintomas associados com uma doença angiogénica. O resultado pretendido pode ser um alívio subjectivo de um sintoma(s) ou uma melhoria identificável objectivamente no recebedor da dosagem, uma diminuição na vascularização de células endoteliais ou uma diminuição na taxa de angiogénese tal como verificado por um médico ou por outro observador qualificado.
As expressões "tratamento de cancro", "terapia" e semelhantes referem-se geralmente a qualquer melhoria no mamífero com cancro, em que a melhoria pode ser atribuída a tratamento com os compostos do presente invento. A melhoria pode ser subjectiva ou objectiva. Por exemplo, caso o mamífero seja humano, o doente pode notar maior vigor ou vitalidade ou menor dor como sintomas subjectivos de melhoria ou resposta a terapia. Alternativamente, o médico pode notar diminuição do tamanho do tumor ou carga de tumor com base em exame físico, parâmetros analíticos, marcadores tumorais ou detecção radiológica. Constituem alguns sinais laboratoriais que o médico pode verificar como resposta a terapia, entre outros, ensaios de normalização, tais como contagem de glóbulos brancos, contagem de eritrócitos, contagem de plaquetas, taxa de sedimentação de eritrócitos e vários níveis de enzimas. Adicionalmente, o médico pode verificar uma diminuição num marcador tumoral detectável. Alternativamente, podem ser utilizados outros ensaios para avaliar uma melhoria objectiva, tais como ecografias, ensaios de ressonância magnética nuclear e ensaios de emissão de positrões. 10
ΕΡ 1 397 105 /PT "Inibição do crescimento das células tumorais" pode ser avaliada por qualquer método aceite de medição se o crescimento das células tumorais abrandou ou diminuiu. Tal inclui observação directa e avaliação indirecta, tal como avaliação de sintomas subjectivos ou sinais objectivos, tal como discutido supra. A expressão "alquilo" é utilizada no presente documento para referir um radical de hidrocarboneto monovalente, linear ou ramificado, saturado ou insaturado com 1-12 carbonos e de preferência, com 1-6 carbonos. Quando o grupo alquilo tem 1- 6 átomos de carbono denomina-se "alquilo de baixo peso molecular". Constituem radicais alquilo adequados, entre outros, por exemplo, metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, 2- propenilo (ou alilo), n-butilo, t-butilo, i-butilo (ou 2-metilpropilo) . Tal como utilizada no presente documento, a expressão abrange "alquilos substituídos". "Alquilo substituído" refere-se a alquilo tal como descrito supra incluindo um ou mais grupos funcionais, tais como alquilo de baixo peso molecular, arilo, acilo, halogéneo (ou seja, halo-alquilos, por exemplo, CF3) , hidroxi, amino, alcoxi, alquilamina, acilamino, aciloxi, ariloxi, ariloxialquilo, mercapto, hidrocarbonetos cíclicos, tanto saturados como insaturados e heterociclos. Estes grupos podem ser ligados a qualquer carbono da parte alquilo. A expressão "S-alquilo" é utilizada no presente documento para referir o grupo —SR, em que R é um alquilo de baixo peso molecular ou um alquilo de baixo peso molecular substituído tal como definido no presente documento. A expressão "arilo" é utilizada no presente documento para referir um substituinte aromático que pode ser um anel aromático simples ou anéis aromáticos múltiplos que se encontram fundidos conjuntamente, ligados covalentemente ou ligados a um grupo comum, tal como uma parte metileno ou etileno. O grupo de ligação comum pode também ser um carbonilo tal como em benzofenona. 0(s) anel(is) aromático(s) pode(m) incluir fenilo, naftilo, bifenilo, bifenilmetilo e benzofenona, entre outros. A expressão "arilo" abrange "arilalquilo". 11
ΕΡ 1 397 105 /PT "Arilo substituído" refere-se a arilo tal como descrito supra incluindo um ou mais grupos funcionais, tal como alquilo de baixo peso molecular, acilo, halogéneo, haloalquilos (por exemplo, CF3) , hidroxi, amino, alcoxi, alquilamina, acilamino, aciloxi, mercapto e hidrocarbonetos cíclicos, tanto saturados como insaturados que se encontram fundidos ao(s) anel (is) aromático(s), ligados covalentemente ou ligados a um grupo comum, tal como uma parte metileno ou etileno. O grupo de ligação pode também ser um carbonilo, tal como em ciclo-hexilfenilcetona. A expressão "arilo substituído" abrange "arilalquilo substituído". A expressão "halogéneo" é utilizada no presente documento para referir átomos de flúor, bromo, cloro e iodo. A expressão "hidroxi" é utilizada no presente documento para referir o grupo —OH. A expressão "amino" é utilizada para referir o grupo —NRR', em que R e R' podem ser independentemente hidrogénio, alquilo, alquilo substituído, arilo, arilo substituído ou acilo. A expressão "nitro" é utilizada no presente documento para referir o grupo -NO2. A expressão "alcoxi" é utilizada no presente documento para referir o grupo --OR, em que R é um alquilo de baixo peso molecular, alquilo de baixo peso molecular substituído, arilo, arilo substituído, arilalquilo ou arilalquilo substituído em que os grupos alquilo, arilo, arilo substituído, arilalquilo e arilalquilo substituído são como descritos no presente documento. Constituem radicais alcoxi adequados, entre outros, por exemplo, metoxi, etoxi, fenoxi, fenoxi substituído, benziloxi, fenetiloxi, t-butoxi. A expressão "alcenilo" é utilizada no presente documento para referir um radical monovalente insaturado ramificado, linear ou cíclico com pelo menos uma ligação dupla carbono-carbono. O radical pode estar na conformação cis ou trans na ligação(ões) dupla(s). Constituem radicais alcenilo adequados, entre outros, por exemplo, etenilo, propenilo, isopropenilo, 12 ΕΡ 1 397 105 /PT ciclopropenilo, butenilo, isobutenilo, ciclobutenilo, terc-butenilo, pentenilo, hexenilo. A expressão "alcinilo" é utilizada no presente documento para referir um radical hidrocarboneto monovalente insaturado ramificado, linear ou cíclico com pelo menos uma ligação tripla carbono-carbono. Constituem radicais alcinilo adequados, entre outros, por exemplo, etinilo, propinilo, butinilo, isobutinilo, pentinilo, hexinilo. B. Compostos O presente invento refere-se à revelação que os compostos de fórmula I inibem angiogénese e são úteis para tratar doenças angiogénicas. Os compostos de fórmula I apresentam a seguinte fórmula geral:
Fórmula I
Em que Rl, R2, R3, R4, R5 e XI, X2 e X3 são tal como definidos supra. Numa concretização preferida do invento, o composto de fórmula I é oleUrope£na^ tal como apresentada na fórmula II infra:
Fórmula II
OH 13
ΕΡ 1 397 105 /PT A oleuropeína, o composto utilizado no presente invento, pode ser facilmente obtida de plantas incluindo a oliveira Olea europaea L. e o ligustro, Ligustrum obtusifolium (Oleaceae).
Podem identificar-se facilmente compostos adequados para utilização nos métodos do presente invento utilizando ensaios de rastreio in vitro e in vivo. Tais ensaios podem rastrear a capacidade de um determinado composto inibir angiogénese ou a vascularização de células endoteliais in vitro e in vivo. Por exemplo, o ensaio de membrana corio-alantóide de frango (CAM), que é descrito mais detalhadamente infra, pode ser utilizado para rastrear um determinado composto relativamente à sua capacidade para inibir vascularização. No ensaio de membrana corio-alantóide tal como efectuado no presente invento, injectam-se embriões de frango fertilizados com um composto no dia 3 ou 4. Deixam-se então os embriões desenvolver durante 4 dias após injecção, depois dos quais se parte a casca e se fotografa a membrana corio-alantóide. Com base no número de nódulos e extremidades de vasos sanguíneos presentes na CAM pode avaliar-se a complexidade de vascularização. Este ensaio pode ser utilizado para avaliar as propriedades anti-angiogénicas dos compostos do presente invento. Será evidente para os peritos na arte que os compostos do presente invento podem ser administrados sozinhos, na forma de um sal farmaceuticamente aceitável e/ou sob a forma de uma composição farmacêutica. C. Utilizações para os compostos do presente invento
Tal como explicado supra, o presente invento refere-se à revelação que os compostos de fórmula I ou a sua concretização preferida oleuropeína ou os seus produtos de hidrólise são úteis para inibir angiogénese e, por seu lado, para tratar doenças associadas com angiogénese indesejável. Assim, o presente invento refere-se ao método de inibir angiogénese indesejável numa célula, incluindo o método pôr em contacto a célula com uma quantidade eficaz, ou seja, uma quantidade anti-angiogénica, de um composto de fórmula I ou da sua concretização preferida oleuropeína ou dos seus produtos de hidrólise. O presente também se refere a um método de inibir a vascularização de células endoteliais, em que o método inclui 14 ΕΡ 1 397 105 /PT pôr em contacto uma célula, tecido ou órgão contendo as células endoteliais com uma quantidade eficaz de um composto de fórmula I ou da sua concretização preferida oleuropeina ou dos seus produtos de hidrólise. Numa concretização preferida actualmente, as células encontram-se num indivíduo animal.
As reivindicações do presente invento utilizam uma composição para o fabrico de um medicamento para o tratamento de doenças associadas com angiogénese patogénica seleccionadas de doenças oculares e uma doença associada com inflamação crónica seleccionada do grupo que consiste em sarcoidose e artrite reumatóide, em que a composição inclui como um ingrediente activo um composto de fórmula I:
X3H4 em que - RI e R2 são grupos funcionais hidroxilo; - R3 é um grupo funcional seleccionado do grupo que consiste em hidrogénio, Cl-C6-alquilo, C2-C6-alcenilo, C2-C6-alcinilo, arilo, hidroxilo, Ci-C6-alcoxi, halogéneo, NO2, NH3, e COOCH3; X1-X3 são grupos funcionais seleccionados do grupo que consiste em oxigénio, enxofre, -CH2- ou carboxi; - R4 é um grupo funcional seleccionado do grupo que consiste em hidrogénio, C2-C6-alcoxi, glucose, B-D-glucopiranose, Ci-C6-alquilo, C2-C6-alcenilo, C2-C6-alcinilo, arilo, hidroxilo, halogéneo, NO2, NH3, hidrato de carbono, aminoácido, nucleótido e lípido; e - R5 é um grupo funcional seleccionado do grupo que consiste em hidrogénio, Ci-C6-alquilo, C2-C6-alcenilo, C2-C6-alcinilo, arilo, hidroxilo, Ci-C6-alcoxi, halogéneo, NO2, NH3 e CH3, a referida doença ocular é seleccionada do grupo que consiste 15
ΕΡ 1 397 105 /PT em retinopatia diabética, retinopatia da prematuridade, rejeição de enxerto da córnea, glaucoma neovascular e fibroplasias retrolentais, queratoconjuntivite epidémica, deficiência de vitamina A, uso excessivo de lentes de contacto, queratite atópica, queratite limbica superior, queratite seca de pterígio, síndrome de Sjogren, acne rosácea, filectenulose, sífilis, infecções por micobactérias, degenerescência lipídica, queimaduras químicas, úlceras bacterianas, úlceras fúngicas, infecções por protozoários, sarcoma de Kaposi, úlcera de Mooren, degeneração marginal de Terrien, queratólise marginal, trauma, lúpus sistémico, poliarterite, sarcoidose de Wegeners, esclerite, doença de Steven Johnson, caratotomia radial da perafigóide e rejeição de enxerto da córnea, retinopatia diabética, degenerescência da mácula, anemia de células falciformes, sarcóide, sífilis, pseudoxantoma elástico, doença de Pagets, obstrução venosa, obstrução arterial, doença obstrutiva da carótida, uveite/vitrite crónica, infecções micobacterianas, doença de Lyme, lúpus eritematoso sistémico, retinopatia da prematuridade, doença de Easles, doença de Bechets, infecções causadoras de retinite ou coroidite, histoplasmose ocular presumida, doença de Bests, miopia, picadas oculares, doença de Stargarts, pars planitis, descolamento da retina crónico, síndromes de hiperviscosidade, toxoplasmose, trauma e complicações pós-laser, rubeose e retinopatia auricular proliferativa, em que a referida utilização inclui administração a um animal de um composto anti-angiogénico de fórmula I ou da sua concretização preferida oleuropeína ou dos seus produtos de hidrólise, numa quantidade, ou seja, uma dosagem, suficiente para inibir angiogénese. A dosagem específica de um composto de fórmula I ou da sua concretização preferida oleuropeína ou dos seus produtos de hidrólise necessária para inibir angiogénese e/ou doenças angiogénicas dependerá da gravidade da doença, da via de administração e factores relacionados que serão decididos pelo médico assistente. Em geral, as doses diárias aceites e eficazes serão a quantidade suficiente para inibir eficazmente angiogénese e/ou doenças angiogénicas.
Os compostos proporcionados no presente invento podem ser administrados a um animal com necessidade destes numa dosagem 16
ΕΡ 1 397 105 /PT de um composto de fórmula I ou da sua concretização preferida oleuropeína ou dos seus produtos de hidrólise (ou um sal farmaceuticamente aceitável ou espécie solvatada derivada) que é eficaz para inibir angiogénese e/ou doenças angiogénicas. A expressão "inibir" é utilizada no presente documento para incluir o seu significado vulgarmente aceite, que inclui tratamento profilático de um indivíduo humano que sofre de angiogénese e/ou doenças angiogénicas e mantendo com acompanhamento e/ou tratando angiogénese e/ou doença angiogénica existente. Assim, o presente invento inclui tanto tratamento médico terapêutico e/ou tratamento profilático, como adequado.
As composições do presente invento podem ser utilizadas para tratar as doenças de acordo com a reivindicação 1. A sarcoidose constitui outra doença inflamatória crónica que é caracterizada como uma doença granulomatosa multi-sistema. Os granulomas desta doença podem-se formar em qualquer local do corpo e, portanto, os sintomas dependem do local dos granulomas e se a doença se encontra activa. Os granulomas são criados por ramificações capilares angiogénicas que proporcionam um fornecimento constante de células inflamatórias. Os compostos e método do presente invento podem ser utilizados para tratar sarcoidose.
Outra doença que pode ser tratada de acordo com o presente invento é artrite reumatóide. A artrite reumatóide é uma doença inflamatória crónica caracterizada por inflamação não específica das articulações periféricas. Pensa-se que os vasos sanguíneos do revestimento sinovial das articulações sofrem angiogénese. Além de formar novas redes vasculares, as células endoteliais libertam factores e espécies de oxigénio reactivas que levam a crescimento de pano e destruição da cartilagem. Os factores envolvidos em angiogénese podem contribuir activamente e ajudar a manter o estado de inflamação crónica da artrite reumatóide.
Numa concretização especialmente preferida, os compostos de fórmula I ou a sua concretização preferida oleuropeína podem ser utilizados em combinação com imunoterapia activa. 17
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Além disso, de acordo com o supracitado, os indivíduos mamíferos incluem, entre outros, humanos, animais de laboratório, animais de companhia e animais de quinta. D. Formulações farmacêuticas/Vias de administração
No presente invento, os compostos de fórmula I ou a sua concretização preferida oleuropeína ou os seus produtos de hidrólise podem ser entregues ou administrados a um mamífero, por exemplo, um doente humano, sozinhos, sob a forma de um sal farmaceuticamente aceitável ou sob a forma de uma composição farmacêutica em que o composto é misturado com transportadores ou excipiente(s) adequado(s) numa quantidade terapeuticamente eficaz, por exemplo, em doses eficazes para diminuir, suprimir ou inibir angiogénese ou resultar numa melhoria de sintomas associados com doenças angiogénicas.
Os compostos de fórmula I ou a sua concretização preferida oleuropeína ou os seus produtos de hidrólise, que são utilizados no presente invento, podem ser incorporados numa variedade de formulações para administração terapêutica. Mais particularmente, os compostos de fórmula I ou a sua concretização preferida oleuropeína ou os seus produtos de hidrólise podem ser formulados em composições farmacêuticas por combinação com transportadores ou diluentes farmaceuticamente aceitáveis adequados e podem ser formulados em preparações em formas sólidas, semi-sólidas, líquidas ou gasosas, tais como comprimidos, cápsulas, pílulas, pós, grânulos, drageias, géis, pastas, pomadas, soluções, supositórios, injecções, inaladores e aerossóis. Como tal, a administração dos compostos pode ser efectuada por várias vias, incluindo administração oral, bucal, rectal, parentérica, intraperitoneal, intradérmica, transdérmica, intratraqueal, etc. Além disso, o composto pode ser administrado num local sem ser de uma forma sistémica, frequentemente numa formulação de depósito ou numa formulação de libertação controlada. Além disso, os compostos podem ser administrados num sistema de entrega de fármaco dirigido ao alvo.
Além disso, os compostos de fórmula I ou a sua concretização preferida oleuropeína ou os seus produtos de 18
ΕΡ 1 397 105 /PT hidrólise podem ser formulados com excipientes, diluentes ou transportadores comuns e comprimidos para comprimidos ou formulados como elixires ou soluções para administração oral conveniente, ou administrados por vias intramuscular ou intravenosa. Os compostos podem ser administrados transdermicamente e podem ser formulados como formas de dosagem de libertação controlada e semelhantes.
Os compostos de fórmula I ou a sua concretização preferida oleuropeina ou os seus produtos de hidrólise podem ser administrados sozinhos, em combinação uns com os outros ou podem ser utilizados em combinação com outros compostos conhecidos (por exemplo, outros fármacos anticancerosos ou outros fármacos, tais como AZT, anti-inflamatórios, antibióticos, corticosteróides, vitaminas, etc.). Por exemplo, o composto de fórmula I ou a sua concretização preferida oleuropeina ou os seus produtos de hidrólise podem ser utilizados em terapia conjunta com outros agentes quimioterapêuticos anti-angiogénicos ou agentes antineoplásicos conhecidos (por exemplo, alcaloides da vinca, antibióticos, antimetabolitos, complexos de coordenação de platina, etc.). Por exemplo, os compostos de fórmula I ou a sua concretização preferida oleuropeina ou os seus produtos de hidrólise podem ser utilizados em terapia conjunta com um composto alcaloide da vinca, tal como vinblastina, vincristina, taxol, etc.; um antibiótico, tal como adriamicina (doxorrubicina), dactinomicina (actinomicina D), daunorrubicina (daunomicina, rubidomicina), bleomicina, plicamicina (mitramicina) e mitomicina (mitomicina C) , etc.; um antimetabolito, tal como metotrexato, citarabina (AraC), azauridina, azaribina, fluorodesoxiuridina, desoxicoformicina, mercaptopurina, etc.; ou um complexo de coordenação de platina, tal como cisplatina (cis-DDP), carboplatina, etc. Além disso, os peritos na arte considerarão que os compostos do presente invento podem ser utilizados em terapia conjunta com outros compostos anti-angiogénicos quimioterapêuticos ou antineoplásicos conhecidos. Em formas de dosagem farmacêutica, os compostos podem ser administrados sob a forma dos seus sais farmaceuticamente aceitáveis ou podem também ser utilizados sozinhos ou em associação adequada, bem como em combinação com outros compostos farmaceuticamente activos. 19
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As composições farmacêuticas descritas no presente documento podem ser fabricadas de uma forma conhecida dos peritos na arte, ou seja, por qualquer meio de mistura, dissolução, granulação, fabrico de drageias, levigação, emulsão, encapsulação, sequestração ou processos de liofilização convencionais. Os seguintes métodos e excipientes são meramente exemplificativos.
Para injecção, os compostos podem ser formulados em preparações para os dissolver, suspender ou emulsionar num solvente aquoso ou não aquoso, tal como óleo vegetal ou óleos semelhantes, glicéridos ácidos alifáticos sintéticos, ésteres de ácidos alifáticos de elevado peso molecular ou propilenoglicol; e caso pretendido, com aditivos convencionais, tais como solubilizantes, agentes isotónicos, agentes de suspensão, agentes emulsionantes, estabilizantes e conservantes. De preferência, os compostos do invento podem ser formulados em soluções aquosas, de preferência em tampões compatíveis fisiologicamente, tal como solução de Hanks, solução de Ringer ou tampão salino fisiológico. Para administração transmucosa, utilizam-se na formulação penetrantes adequados à barreira a ser penetrada. Tais penetrantes são em geral conhecidos na arte.
Para administração oral, os compostos de fórmula I ou a sua concretização preferida oleuropeína ou os seus produtos de hidrólise podem ser formulados facilmente por combinação com transportadores farmaceuticamente aceitáveis que são bem conhecidos na arte. Tais transportadores permitem a formulação dos compostos em comprimidos, pílulas, drageias, cápsulas, emulsões, suspensões lipófilas e hidrófilas, líquidos, géis, xaropes, pastas, suspensões e semelhantes, para ingestão oral por um doente a ser tratado. As preparações farmacêuticas para utilização oral podem ser obtidas por mistura dos compostos com um excipiente sólido, opcionalmente moendo uma mistura resultante e processamento da mistura de grânulos, após adição de auxiliares adequados, caso pretendido, para obter comprimidos ou núcleos de drageias. Constituem especificamente excipientes adequados agentes de enchimento tais como açúcares, incluindo lactose, sacarose, manitol ou sorbitol; preparações de celulose tais como, por exemplo, amido de milho, amido de trigo, amido de arroz, amido de batata, 20
ΕΡ 1 397 105 /PT gelatina, goma adragante, metilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, carboximetilcelulose de sódio e/ou polivinilpirrolidona (PVP). Caso pretendido, podem adicionar-se agentes desintegrantes, tal como a polivinilpirrolidona reticulada, ágar-ágar ou ácido alginico ou um sal derivado, tal como alginato de sódio.
Os núcleos de drageia são proporcionados com revestimentos adequados. Com esse objectivo podem utilizar-se soluções de açúcar concentradas, que podem conter opcionalmente goma-arábica, talco, polivinilpirrolidona, gel carbopol, polietilenoglicol, e/ou dióxido de titânio, soluções de lacagem e solventes orgânicos adequados ou misturas de solventes. Podem adicionar-se corantes ou pigmentos aos comprimidos ou revestimentos de drageias para identificação ou para caracterizar combinações diferentes de doses de composto activo.
Constituem preparações farmacêuticas que podem ser utilizadas oralmente, entre outras, cápsulas de encaixe ("push-f it") feitas de gelatina, bem como cápsulas seladas macias feitas de gelatina e um plastificante, tal como glicerol ou sorbitol. As cápsulas de encaixe podem conter os ingredientes activos em mistura com agente de enchimento tal como lactose, agentes de ligação tal como amidos e/ou lubrificantes tal como talco ou estearato de magnésio e, opcionalmente, estabilizantes. Em cápsulas macias, os compostos activos podem ser dissolvidos ou suspensos em liquidos adequados, tais como óleos gordos, parafina liquida ou polietilenoglicóis liquidos. Além disso, podem adicionar-se estabilizantes. Todas as formulações para administração oral devem ser em dosagens adequadas para tal administração. Para administração bucal, as composições podem ter a forma de comprimidos ou rebuçados formulados de forma convencional.
Para administração por inalação, os compostos para utilização de acordo com o presente invento são entregues convenientemente sob a forma de uma apresentação de aerossol em recipientes pressurizados ou um nebulizador, com a utilização de um propulsor adequado, por exemplo, diclorodifluorornetano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono ou outro gás 21
ΕΡ 1 397 105 /PT adequado, ou de inaladores de pó seco isento de propulsor. No caso de um aerossol pressurizado, a unidade de dosagem pode ser determinada proporcionando uma válvula para entregar uma quantidade doseada. As cápsulas e cartuchos de, por exemplo, gelatina para utilização num inalador ou insuflador podem ser formulados contendo uma mistura de pó do composto e uma base de pó adequado, tal como lactose ou amido.
Os compostos podem ser formulados para administração parentérica por injecção, por exemplo, por injecção de bolus ou infusão continua. As formulações para injecção podem ser apresentadas numa forma de dosagem unitária, por exemplo, em ampolas ou em recipientes de dose múltipla, com um conservante adicionado. As composições podem ter tais formas como suspensões, soluções ou emulsões em veiculos oleosos ou aquosos e podem conter agentes de formulação, tais como agentes de suspensão, de estabilização e/ou dispersão.
As formulações farmacêuticas para administração parentérica incluem soluções aquosas dos compostos activos em forma solúvel em água. Adicionalmente, as suspensões dos compostos activos podem ser preparadas como suspensões de injecção oleosas adequadas. Constituem solventes ou veículos lipófilos adequados, entre outros, óleos gordos, tais como óleo de sésamo, ou ésteres de ácidos gordos sintéticos, tal como etiloleato ou triglicéridos ou lipossomas. As suspensões de injecção aquosas podem conter substâncias para aumentar a viscosidade da suspensão, tal como carboximetilcelulose de sódio, sorbitol ou dextrano. Opcionalmente, a suspensão pode também conter estabilizantes ou agentes adequados que aumentam a solubilidade dos compostos de modo a permitir a preparação de soluções altamente concentradas. Alternativamente, o ingrediente activo pode encontrar-se sob a forma de pó para reconstituição com um veículo adequado, por exemplo, água estéril isenta de pirogénios, antes de utilização.
Os compostos podem também ser formulados em composições rectais, tais como supositórios ou clisteres de retenção, por exemplo, contendo bases de supositório convencionais, tais como manteiga de cacau, Carbowax, polietilenoglicóis ou outros glicéridos, sendo que todos fundem à temperatura corporal mas solidificam à temperatura ambiente. 22
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Além das formulações descritas previamente, os compostos podem também ser formulados como uma preparação de depósito. Tais formulações de acção prolongada podem ser administradas por implante (por exemplo, subcutânea ou intramuscularmente) ou por injecção intramuscular. Assim, por exemplo, os compostos podem ser formulados com materiais poliméricos ou hidrófobos adequados (por exemplo, como uma emulsão num óleo aceitável) ou resinas permutadoras iónicas ou como derivados fracamente solúveis, por exemplo, como um sal fracamente solúvel. Alternativamente, podem ser utilizados outros sistemas de entrega para compostos farmacêuticos hidrófobos. Os lipossomas e emulsões são exemplos bem conhecidos de veículos de entrega ou transportadores para fármacos hidrófobos.
Podem também ser utilizados determinados solventes orgânicos, tal como dimetilsulfóxido. Adicionalmente, os compostos podem ser entregues utilizando um sistema de libertação controlada, tais como matrizes semi-permeáveis de polímeros hidrófobos sólidos contendo o agente terapêutico. Foram estabelecidos vários tipos de materiais de libertação controlada e são bem conhecidos dos peritos na arte. As cápsulas de libertação controlada, dependendo da sua natureza química, podem libertar os compostos durante algumas semanas até mais de 100 dias.
As composições farmacêuticas podem também incluir transportadores ou excipientes sólidos ou em fase gel adequados. Constituem exemplos de tais transportadores ou excipientes, entre outros, carbonato de cálcio, fosfato de cálcio, vários açúcares, amidos, derivados de celulose, gelatina e polímeros, tal como polietilenoglicóis.
Constituem composições farmacêuticas adequadas para utilização no presente invento, entre outras, composições em que os ingredientes activos estão contidos numa quantidade terapeuticamente eficaz. A quantidade de composição administrada dependerá obviamente do indivíduo a ser tratado, do peso do indivíduo, da gravidade da doença, da forma de administração e da opinião do médico assistente. A determinação de uma quantidade eficaz encontra-se na capacidade dos peritos na arte, especialmente tendo em 23
ΕΡ 1 397 105 /PT consideração a revelação detalhada proporcionada no presente documento.
Actualmente, considera-se que as quantidades terapeuticamente eficazes dos compostos utilizados na prática do presente invento podem incluir qualquer quantidade entre aproximadamente 0,030 g a 20,000 g de tal composto por quilograma de massa de peso corporal do indivíduo. F. Exemplos O invento será descrito mais detalhadamente através de exemplos específicos. EXEMPLO 1 O presente exemplo ilustra as propriedades anti- angiogénicas de oleuropeína no ensaio de membrana corio-alantóide de frango (CAM). O objectivo final do ensaio CAM foi uma determinação quantitativa do número de pontos de ramificação e extremidades de vasos sanguíneos na membrana corio-alantóide. Tal quantificação ilustraria a complexidade da vasculatura sanguínea no desenvolvimento da membrana corio-alantóide. A diminuição de complexidade da vasculatura sanguínea da membrana corio-alantóide como resultado da aplicação de oleuropeína é indicativa das suas propriedades anti-angiogénicas. A. Abordagem A CAM no embrião de frango em desenvolvimento é um excelente sistema in vivo para estudar angiogénese, porque está a decorrer crescimento de novos vasos sanguíneos. O ensaio CAM envolve a monitorização da vasculatura sanguínea da membrana corio-alantóide em desenvolvimento de embriões de frango vivos. Foram desenvolvidas várias abordagens de ensaio CAM. Tais incluem cultura de embriões de frango vivos em placas de Petri em condições estéreis especiais. Outra abordagem foi cortar uma janela na casca de ovos fertilizados e aplicar directamente o composto a ser estudado na janela utilizando um papel de filtro. Utilizamos uma abordagem modificada do ensaio CAM, que inclui um método menos invasivo 24
ΕΡ 1 397 105 /PT para introduzir o composto oleuropeína. Iluminaram-se os ovos de frango fertilizados no terceiro dia de desenvolvimento. Identificou-se a vasculatura sanguínea e a gema. Fez-se um pequeno orifício de 1 mm na casca. Injectou-se directamente no saco vitelino uma agulha de pequena espessura contendo 0,4 ml de oleuropeína diluída em solução salina/água. Tapou-se o orifício e colocaram-se os ovos novamente na incubadora para desenvolvimento adicional. Após 3 dias, removeram-se os ovos e partiram-se num prato branco e fotografou-se a membrana corio-alantóide. Os ovos de controlo foram injectados com solução salina/água. B. Materiais
Obtiveram-se os ovos fertilizados de Country Farm Eggs, Los Angeles, Califórnia, EUA. Obteve-se PBS de Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, Missouri, EUA. A oleuropeína foi obtida de Indofine Chemical company, Inc., Somerville, Nova Jérsia, EUA. As agulhas e lancetas foram obtidas de Express Pharmacy Services, Pittsburgh, Pensilvania, EUA. O microscópio de dissecção foi comprado a Microscope World, Encinitas, Califórnia, EUA. Obteve-se uma incubadora de bancada TX7 de Lyons Electric Company Inc. Chula Vista, Califórnia, EUA. Comprou-se uma câmara Kodak MDS100 a Eastman Kodak company, New Haven, Connecticut, EUA. C. Desenvolvimento da CAM para medir inibição de angiogénese
Incubaram-se ovos férteis frescos durante três dias numa incubadora de ovos padrão. Mantiveram-se a temperatura e humidade constantes a 100°F e 65%, respectivamente. No dia 3, iluminaram-se os ovos utilizando uma lanterna de polícia. Identificaram-se o embrião e a gema. Limpou-se a superfície da casca com uma cotonete com álcool. Perfurou-se a casca de ovo com uma lanceta fazendo um orifício de 1 milímetro. Utilizou-se uma agulha para retirar 0,5 ml de gema.
Administrou-se directamente uma injecção de 0,5 ml para o saco vitelino. As experiências anteriores demonstraram que a injecção de tinta, com a mesma consistência utilizada nas injecções experimentais e de controlo, resultou em difusão para o saco vitelino no intervalo de segundos após a injecção. Injectaram-se ovos experimentais com uma concentração de 0,1% 25
ΕΡ 1 397 105 /PT e 1,0% de oleuropeína. Os ovos de controlo foram injectados com uma quantidade equivalente de água. Após injecção, tapou-se o orifício com uma pequena tira de fita-cola e colocaram-se os ovos de novo na incubadora para desenvolvimento adicional. No dia 3 após injecção, removeram-se os ovos da incubadora e iluminaram-se. Partiram-se cuidadosamente utilizando uma faca de manteiga por cima de um prato branco. Colocaram-se os embriões e CAM cuidadosamente para observação e fotografia. Registou-se o batimento cardíaco do embrião utilizando um vídeo em directo com uma câmara Kodak mds-100 ligada a um estéreo-microscópio. Registou-se a morfologia do embrião e fotografaram-se os embriões utilizando uma câmara Canon. Também se fotografou a vasculatura sanguínea na CAM utilizando uma câmara Kodak mds 100 montada num estéreo-microscópio. E. Resultados A tabela 1 apresenta o efeito anti-angiogénico de oleuropeína na CAM de embrião de frango. Os resultados resumem duas experiências diferentes com um total de 17 ovos com 102 campos fotografados para a análise. A oleuropeína apresentou efeitos de inibição em angiogénese de CAM estatisticamente significativos. Uma injecção de oleuropeína de 0,93 μιηοΐ/ονο causou inibição do crescimento de vasos sanguíneos de 73% comparativamente ao controlo. Uma injecção de oleuropeína de 9,3 μιηοΐ/ονο causou inibição do crescimento de vasos sanguíneos de 84% comparativamente ao controlo. Os resultados destas duas experiências sugerem que a oleuropeína é um inibidor angiogénico potente. Deve entender-se que as concentrações utilizadas supra são meramente ilustrativas e não restritivas. TABELA 1 EFEITO INIBIDOR DE OLEUROPEÍNA SOBRE A ANGIOGÉNESE NO ENSAIO DE EMBRIÃO DE FRANGO Compostos Dose (μιηοΐ/ονο) Número de nódulos + extremidades (média± E.P.) % de inibição Oleuropeína 9,3 0,93 44 ± 5,3a 72 ± llb 84 73 Controlo - 271 ± 25 - â Significativamente menor b Significativamente menor do que o controlo, P <0,0001 do que o controlo, P <0,0001 26
ΕΡ 1 397 105 /PT
Ilustra-se claramente um exemplo de inibição de angiogénese por oleuropeina através de fotografias representativas obtidas da CAM no final da experiência. A figura 1 apresenta fotografias representativas das CAM de ovos tratados com oleuropeina a 9,3 μιηοΐ/ονο. Nestas CAM, o número de vasos sanguíneos diminui fortemente e a ramificação é menos complexa do que nos controlos, que se apresentam na figura 3. Não só os leitos capilares se encontram obliterados, como os vasos médios e mesmo os grandes quebraram ou encontram-se em processo de quebra. Mesmo oleuropeina a 0,93 μηιοΐ/ονο inibiu potentemente a vasculatura de CAM (figura 2) comparativamente com redes extensas de vasos sanguíneos nas CAM de controlo (figura 3). Uma inspecção mais detalhada do leito capilar, onde ocorre a maior parte das trocas de gás perto do limiar da CAM, ilustra o desaparecimento das redes extensas de capilares nos ovos tratados com oleuropeina comparativamente a ovos de controlo (figura 4).
Também se observou no ensaio CAM, como um resultado de tratamento com oleuropeina, uma diminuição do tamanho da CAM e do embrião (figura 5). O ensaio CAM tem sido utilizado tradicionalmente para avaliar as propriedades anti-angiogénicas de vários compostos. Estes compostos têm sido normalmente aplicados a uma pequena janela aberta na superfície do ovo e não afectava a CAM ou embrião como um todo. No presente exemplo, utilizamos uma modificação do ensaio CAM para avaliar o efeito de oleuropeina na totalidade da CAM e subsequentemente no tamanho do embrião. No desenvolvimento do animal, o embrião encontra-se a sofrer divisões celulares rápidas, bem como diferenciação celular e morfogénese. Pode estabelecer-se uma analogia entre a divisão celular rápida e crescimento no embrião de frango em desenvolvimento com a divisão celular rápida e crescimento de células tumorais. Em ambos os exemplos, o crescimento depende do fornecimento de sangue. O embrião de frango necessita de uma CAM altamente vascularizada para manter divisão celular e crescimento. De uma forma muito semelhante, é necessário que um tumor se torne altamente vascularizado para manter divisão celular e crescimento. A limitação do fornecimento sanguíneo diminuirá o tamanho do embrião e por inferência o mesmo pode dizer-se sobre os tumores. Neste ensaio CAM modificado, a oleuropeina diminuiu significativamente o crescimento de vasos 27
ΕΡ 1 397 105 /PT sanguíneos e verificou-se uma diminuição subsequente do tamanho do embrião (figura 5) . O exemplo ilustrativo apresentado na figura 5 indica que existe uma correlação directa entre o tamanho da CAM e o tamanho do embrião. As CAM tratadas com oleuropeína apresentaram um diâmetro 50% inferior às CAM de controlo. Os embriões tratados com oleuropeína foram mais pequenos de uma forma correspondente de cerca de 60% do tamanho de embriões de controlo não tratados. A dose maior de oleuropeína apesar de afectar grandemente o tamanho da CAM e o tamanho do embrião, não afectou a viabilidade do embrião. EXEMPLO 2 O presente exemplo ilustra as propriedades anti-angiogénicas do extracto de folha de oliveira no ensaio da membrana corio-alantóide de frango (CAM). O objectivo final do ensaio CAM foi uma visualização directa do número pontos de ramificação e extremidades de vasos sanguíneos na membrana corio-alantóide. Tal visualização ilustraria a complexidade da vasculatura sanguínea na membrana corio-alantóide em desenvolvimento. A diminuição da complexidade da vasculatura sanguínea da membrana corio-alantóide como resultado da aplicação de extracto de folha de oliveira é indicativa das suas propriedades anti-angiogénicas. À. Abordagem
Tal como descrito no exemplo 1, o ensaio CAM foi utilizado para avaliar as propriedades anti-angiogénicas do extracto de folha de oliveira. B. Materiais
Obtiveram-se ovos fertilizados de Country Farm Eggs, Los Angeles, Califórnia, EUA. Obteve-se PBS de Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, Missouri, EUA. O extracto de folha de oliveira foi obtido de folhas de oliveira. As agulhas e lancetas foram obtidas de Express Pharmacy Services, Pittsburgh, Pensilvania, EUA. O microscópio de dissecção foi obtido de Microscope World, Encinitas, Califórnia, EUA. Obteve-se uma incubadora de bancada TX de Lyons Electric Company Inc. Chula Vista, Califórnia, EUA. Comprou-se uma 28 ΕΡ 1 397 105 /PT câmara Kodak MDS-100 a Eastman Kodak Company, New Haven, Connecticut, EUA. C. Desenvolvimento da CAM para medir inibição de anglogénese
Incubaram-se ovos férteis frescos durante três dias numa incubadora de ovos comum. Mantiveram-se a temperatura e a humidade constantes a 100°F e 65%, respectivamente. No dia 3, iluminaram-se os ovos utilizando uma lanterna de policia. Identificaram-se o embrião e a gema. Limpou-se a superfície da casca com uma cotonete com álcool. Perfurou-se a casca do ovo com uma lanceta fazendo um orifício de 1 milímetro.
Utilizou-se uma agulha para retirar 0,5 ml de gema. Administrou-se uma injecção de 0,5 ml directamente para o saco vitelino. As experiências anteriores demonstraram que a injecção de tinta, com a mesma consistência utilizada nas nossas injecções experimentais e de controlo, resultou em difusão para o saco vitelino no intervalo de segundos após a injecção. Injectaram-se ovos experimentais com água contendo extracto de folha de oliveira. Os ovos de controlo foram injectados com uma quantidade equivalente de água. Adicionaram-se dez mililitros de água a ferver a meia colher de chá de folhas de oliveira secas esmagadas e efectuou-se extracção durante 2 horas antes de utilização do extracto na experiência. Após injecção, tapou-se o orifício com uma pequena tira de fita-cola e colocaram-se os ovos de novo na incubadora para desenvolvimento adicional. No dia 4 após injecção, removeram-se os ovos da incubadora e partiram-se cuidadosamente utilizando uma faca de manteiga por cima de um prato branco. Colocaram-se os embriões e CAM cuidadosamente para observação e fotografia. Registou-se o batimento cardíaco do embrião utilizando um vídeo em directo com uma câmara Kodak mds-100 ligada a um estéreo-microscópio. Registou-se a morfologia do embrião e fotografaram-se os embriões utilizando uma câmara Canon. Também se fotografou a vasculatura sanguínea na CAM utilizando uma câmara Kodak mds 100 montada num estéreo-microscópio. C. Resultados
Os resultados das três experiências sugerem que o extracto de folha de oliveira é um inibidor angiogénico potente. Deve entender-se que as concentrações utilizadas supra são 29
ΕΡ 1 397 105 /PT ilustrativas e não restritivas. Ilustra-se claramente um exemplo de inibição de angiogénese por extracto de folha de oliveira através de fotografias representativas obtidas da CAM no final das experiências. A figura 1 apresenta fotografias representativas das CAM de ovos de controlo (figura 6a, b e c) e ovos tratados com extracto de folha de oliveira (figura 6d, e e f). Nas CAM tratadas, o número de vasos sanguíneos diminui grandemente e a ramificação é menos complexa do que nos controlos. EXEMPLO 3 O presente exemplo ilustra as propriedades anti-angiogénicas de oleuropeína no modelo de orelha de ratinho adulto. O objectivo final do ensaio de modelo de ratinho adulto foi uma visualização directa do número de pontos de ramificação e extremidades de vasos sanguíneos. Tal visualização ilustraria a complexidade da vasculatura sanguínea na orelha de ratinho adulto. A diminuição de complexidade da vasculatura sanguínea induzida na orelha de ratinho adulto como resultado da aplicação de oleuropeína indicaria as suas propriedades anti-angiogénicas. A. Abordagem
No modelo anterior (a CAM em embrião de frango em desenvolvimento), embora seja um excelente sistema in vivo para estudar angiogénese, dado que ocorre crescimento de novos vasos sanguíneos no embrião em crescimento, ensaiamos outro modelo para avaliar se a oleuropeína pode inibir o crescimento de vasos sanguíneos induzidos num mamífero adulto. O modelo que seleccionamos para utilização foi a orelha de ratinho adulto. A orelha de ratinho é vascularizada e é suficientemente fina para ser visualizada directamente por um microscópio óptico. Caso se aplique um estímulo à orelha de ratinho adulto, os vasos sanguíneos existentes são capazes de ramificar com formação de novos vasos (angiogénese) . Utilizando este modelo, podem ensaiar-se compostos anti-angiogénicos relativamente aos seus efeitos, aplicamos uma queimadura de hidróxido de sódio, que estimulou os vasos sanguíneos existentes na orelha de ratinho adulto a ramificaram para formarem novos vasos sanguíneos. Antes da aplicação da queimadura de hidróxido de sódio, injectaram-se 30
ΕΡ 1 397 105 /PT os ratinhos experimentais intraperitonealmente com solução salina tamponada de fosfato contendo oleuropeína. Injectaram-se ratinhos de controlo intraperitonealmente com solução salina tamponada de fosfato sozinha. Aplicou-se a queimadura de hidróxido de sódio às orelhas de ambos os grupos. Um terceiro grupo de ratinhos não foi injectado, nem queimado. Este terceiro grupo de ratinhos demonstra o estado de vasos sanguíneos não induzidos na orelha de ratinhos adultos. O ensaio de orelha de ratinho adulto envolveu a monitorização da vasculatura sanguínea da orelha em ratinhos adultos três dias após aplicação da queimadura de hidróxido de sódio. B. Materiais
Os inventores criaram ratinhos num ambiente limpo e saudável. Obteve-se PBS de Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, Missouri, EUA. A oleuropeína foi obtida de Indofine Chemical company, Inc., Somerville, Nova Jérsia, EUA. O hidróxido de sódio foi obtido de Sammy's Camera em Los Angeles, EUA. As agulhas e Nair foram obtidas de Thrifty's Drugs em Los Angeles, Califórnia, EUA. O microscópio de dissecção foi obtido de Microscope World, Encinitas,
Califórnia, EUA. Comprou-se uma câmara Kodak MDS-100 a Eastman Kodak Company, New Haven, Connecticut, EUA. C. Desenvolvimento do modelo de orelha de ratinho adulto para medir inibição de angiogénese
Utilizaram-se ratinhos que estavam completamente crescidos aos 2-3 meses. Os ratinhos experimentais foram injectados intraperitonealmente com 0,25 ml de solução salina tamponada de fosfato contendo 0,025 grama de oleuropeína. Os ratinhos de controlo foram injectados com 0,25 ml de solução salina tamponada de fosfato sozinha. Os grupos experimental e de controlo foram injectados intraperitonealmente uma vez por dia durante três dias antes da queimadura de hidróxido de sódio. No quarto dia, aplicou-se uma cotonete humedecida com uma solução de hidróxido de sódio a 2% durante um intervalo de tempo total de um minuto nas orelhas de ambos os grupos de ratinhos. Estas orelhas foram subsequentemente lavadas com quantidades abundantes de água. Colocaram-se novamente os ratinhos nas gaiolas durante 3 dias adicionais, durante os quais se administraram injecções intraperitoneais uma vez por 31
ΕΡ 1 397 105 /PT dia. No dia 4, sacrificaram-se sem crueldade os ratinhos por deslocação cervical. Trataram-se as orelhas com Nair para remover o pêlo excessivo e fotografou-se a vasculatura sanguínea utilizando uma câmara digital MDS-100 ligada a um estéreo-microscópio. E. Resultados
Utilizaram-se um total de cinco ratinhos de controlo (queimados), cinco ratinhos experimentais (queimados e tratados com oleuropeína) e cinco ratinhos de controlo (não queimados e não tratados) na experiência supra com um total de 30 orelhas. Os resultados da experiência supra demonstraram que a oleuropeína é um inibidor angiogénico potente. Ilustra-se claramente um exemplo da inibição de angiogénese por oleuropeína por fotografias representativas obtidas das orelhas de ratinhos no final da experiência. A figura 7 apresenta uma comparação das orelhas de todos os três grupos de ratinhos. As orelhas de ratinho que não foram queimadas ou tratadas de qualquer forma mostram claramente alguma vascularização (figura 7a). As orelhas de ratinhos no grupo de controlo que foram queimadas com hidróxido de sódio apresentam uma quantidade de vascularização aumentada, que indica que fomos bem sucedidos a induzir o crescimento de vasos sanguíneos (figura 7b). Pode observar-se um exemplo surpreendente de crescimento de vasos sanguíneos induzidos na figura 7c, em que se podem observar novos vasos que se ramificam de vasos sanguíneos existentes e que se dirigem para a área da queimadura. Apresenta-se o efeito anti-angiogénico potente de oleuropeína na figura 7d. Nesta figura, as orelhas foram tratadas com hidróxido de sódio e os ratinhos também receberam doses diárias de oleuropeína. Pode verificar-se que a oleuropeína inibiu potentemente a ramificação dos vasos sanguíneos existentes. A área queimada está de facto isenta de vasos sanguíneos. Este resultado foi consistente para todos os ratinhos a que foram dadas diariamente injecções de oleuropeína. EXEMPLO 4 O presente exemplo ilustra as propriedades anti-angiogénicas de extracto de folha de oliveira no modelo de orelha de ratinho adulto. O objectivo final do ensaio de 32
ΕΡ 1 397 105 /PT modelo de orelha de ratinho adulto foi uma visualização directa do número de pontos de ramificação e extremidades de vasos sanguíneos. Tal visualização ilustraria a complexidade da vasculatura sanguínea na orelha de ratinho adulto. A diminuição na complexidade da vasculatura sanguínea induzida da orelha de ratinho adulto como resultado da aplicação de extracto de folha de oliveira indicaria as suas propriedades anti-angiogénicas. A. Abordagem
Tal como descrito no exemplo 3, utilizou-se o modelo de orelha de ratinho adulto para avaliar as propriedades anti-angiogénicas do extracto de folha de oliveira. B. Materiais
Os inventores criaram ratinhos num ambiente limpo e saudável. Obteve-se PBS de Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, Missouri, EUA. O extracto de folha de oliveira foi obtido de folhas de oliveira. O hidróxido de sódio foi obtido de Sammy's Camera em Los Angeles, EUA As agulhas e Nair foram obtidas de Thrifty's Drugs em Los Angeles, Califórnia, EUA. O microscópio de dissecção foi obtido de Microscope World, Encinitas, Califórnia, EUA. Comprou-se uma câmara Kodak MDS-100 a Eastman Kodak Company, New Haven, Connecticut, EUA. C. Desenvolvimento do modelo de orelha de ratinho adulto para medir inibição de angiogénese
Utilizaram-se ratinhos que estavam completamente crescidos aos 2-3 meses. Os ratinhos experimentais foram injectados intraperitonealmente com 0,25 ml de solução salina tamponada de fosfato contendo extracto de folha de oliveira. O extracto de folha de oliveira foi preparado por moagem de folhas de oliveira secas num moinho de café até as folhas ficaram sob a forma de um pó. Misturaram-se dez mililitros de folhas em pó compactadas com 45 mililitros de água quente. Adicionou-se solução salina tamponada de fosfato à mistura. Os grupos experimental e de controlo foram injectados intraperitonealmente uma vez por dia durante três dias antes da queimadura de hidróxido de sódio. Cada ratinho recebeu uma injecção de 0,25 ml. O grupo experimental recebeu uma injecção 33
ΕΡ 1 397 105 /PT de solução salina tamponada de fosfato contendo o extracto de folha de oliveira. O grupo de controlo recebeu uma injecção de solução salina tamponada de fosfato sozinha. No quarto dia, aplicou-se uma cotonete humedecida com uma solução de hidróxido de sódio a 2% durante um intervalo de tempo total de um minuto nas orelhas de ambos os grupos de ratinhos. Estas orelhas foram subsequentemente lavadas com quantidades abundantes de água. Colocaram-se novamente os ratinhos nas gaiolas durante 3 dias adicionais, durante os quais se administraram injecções intraperitoneais uma vez por dia. No dia 4, sacrificaram-se sem crueldade os ratinhos por deslocação cervical. Trataram-se as orelhas com Nair para remover o pêlo excessivo e fotografou-se a vasculatura sanguínea utilizando uma câmara digital MDS-100 ligada a um estéreo-microscópio. E. Resultados
Utilizaram-se um total de sete ratinhos de controlo e sete ratinhos experimentais na experiência supra com um total de 28 orelhas. Os resultados da experiência supra demonstraram que o extracto de folha de oliveira é um inibidor angiogénico potente. Ilustra-se claramente um exemplo da inibição de angiogénese por extracto de folha de oliveira por fotografias representativas obtidas das orelhas de ratinhos no final da experiência. A figura 8 apresenta fotografias representativas de oito orelhas independentes de ratinhos de controlo (figura 8a, b, c e d) e ratinhos tratados com o extracto de folha de oliveira (figura 8e, f, g e h) . As orelhas dos ratinhos de controlo encontravam-se altamente vascularizadas indicando uma indução do crescimento de novos vasos sanguíneos. Os ratinhos tratados com o extracto de folha de oliveira apresentavam vascularização diminuída, indicando o efeito potente do extracto de folha de oliveira na inibição de crescimento de novos vasos sanguíneos.
Lisboa,

Claims (6)

  1. ΕΡ 1 397 105 /PT 1/3 REIVINDICAÇÕES 1. Utilização de uma composição para o fabrico de um medicamento para o tratamento de doenças associadas com angiogénese patogénica seleccionadas entre doenças oculares e uma doença associada com inflamação crónica seleccionada do grupo que consiste em sarcoidose e artrite reumatóide, incluindo a composição, como ingrediente activo, um composto de fórmula I:
    X3R4 em que - Rl e R2 são grupos funcionais hidroxilo; - R3 é um grupo funcional seleccionado do grupo que consiste em hidrogénio, Ci-Cg-alquilo, C2-C6-alcenilo, C2-C6-alcinilo, arilo, hidroxilo, Ci-C6-alcoxi, halogéneo, N02, NH3 e COOCH3; X1-X3 são grupos funcionais seleccionados do grupo que consiste em oxigénio, enxofre, -CH2- ou carboxi; - R4 é um grupo funcional seleccionado do grupo que consiste em hidrogénio, C2-C6-alcoxi, glucose, B-D-glucopiranose, Ci-C6-alquilo, C2-C6-alcenilo, C2-C6-alcinilo, arilo, hidroxilo, halogéneo, N02, NH3, hidrato de carbono, aminoácido, nucleótido e lípido; e - R5 é um grupo funcional seleccionado do grupo que consiste em hidrogénio, Ci-Cõ-alquilo, C2-C6-alcenilo, C2-C6-alcinilo, arilo, hidroxilo, Ci-C6-alcoxi, halogéneo, N02, NH3 e CH3, a referida doença ocular é seleccionada do grupo que consiste em retinopatia diabética, retinopatia da prematuridade, rejeição de enxerto da córnea, glaucoma neovascular e fibroplasias retrolentais, queratoconjuntivite epidémica, deficiência de vitamina A, uso excessivo de lentes de ΕΡ 1 397 105 /PT 2/3 contacto, queratite atópica, queratite límbica superior, queratite seca de pterígio, síndrome de Sjogren, acne rosácea, filectenulose, sífilis, infecções por micobactérias, degenerescência lipídica, queimaduras químicas, úlceras bacterianas, úlceras fúngicas, infecções por protozoários, sarcoma de Kaposi, úlcera de Mooren, degeneração marginal de Terrien, queratólise marginal, trauma, lúpus sistémico, poliarterite, sarcoidose de Wegeners, esclerite, doença de Steven Johnson, caratotomia radial da perafigóide e rejeição de enxerto da córnea, retinopatia diabética, degenerescência da mácula, anemia de células falciformes, sarcóide, sífilis, pseudoxantoma elástico, doença de Pagets, obstrução venosa, obstrução arterial, doença obstrutiva da carótida, uveite/vitrite crónica, infecções micobacterianas, doença de Lyme, lúpus eritematoso sistémico, retinopatia da prematuridade, doença de Easles, doença de Bechets, infecções causadoras de retinite ou coroidite, histoplasmose ocular presumida, doença de Bests, miopia, picadas oculares, doença de Stargarts, pars planitis, descolamento da retina crónico, síndromes de hiperviscosidade, toxoplasmose, trauma e complicações pós-laser, rubeose e retinopatia auricular proliferativa.
  2. 2. Utilização de acordo com a reivindicação 1, em que a referida composição inclui um composto de fórmula II:
  3. 3. Utilização de acordo com a reivindicação 1 ou 2, incluindo um transportador ou diluente farmaceuticamente aceitáveis.
  4. 4. Utilização de acordo com uma das reivindicações 1 a 3, incluindo pelo menos um produto de hidrólise do composto de ΕΡ 1 397 105 /PT 3/3 fórmula I, em que o referido produto é seleccionado do grupo que consiste em oleuropeína aglícona, ácido elenólico, álcool beta-3,4-di-hidroxifeniletílico e elenolato metil-o-metílico.
  5. 5. Utilização de acordo com as reivindicações 1 a 4, em que a referida composição se encontra sob a forma de comprimidos ou elixir para administração oral.
  6. 6. Utilização de acordo com as reivindicações 1 a 5, em que o referido medicamento é para administração oral, bucal, rectal parentérica, intraperitoneal, intradérmica, transdérmica, intratraqueal, intramuscular ou intravenosa ou para inalação. Lisboa,
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