KR20100015595A

KR20100015595A - 하이드록시타이로솔 및 이를 함유하는 올리브 추출물/농축물의 신규한 용도

Info

Publication number: KR20100015595A
Application number: KR1020097021511A
Authority: KR
Inventors: 지안캉 리우; 볼프강 샬흐; 잉 왕-슈미트; 카린 베르쯔
Original assignee: 디에스엠 아이피 어셋츠 비.브이.
Priority date: 2007-04-18
Filing date: 2007-04-18
Publication date: 2010-02-12
Also published as: WO2008128552A1; CN101652130A; EP2134333A1; US20100130620A1; JP2010524439A

Abstract

본 발명은, 인간의 연령-관련 황반 변성의 치료 또는 예방, 동물(바람직하게는, 인간), 특히 나이든 동물(바람직하게는, 노인)의 눈 건강 유지, 동물(바람직하게는, 인간)의 시력 향상, 동물(바람직하게는, 인간)의 고-해상도 시력 유지, 및/또는 동물(바람직하게는, 인간)의 시력 유지뿐만 아니라 동물(바람직하게는, 인간)의 시각 성능 및/또는 동물(바람직하게는, 인간)의 시각 기능 유지를 위한 하이드록시타이로솔(또는 이를 포함하는 조성물)의 용도에 관한 것이다.

Description

하이드록시타이로솔 및 이를 함유하는 올리브 추출물/농축물의 신규한 용도{NOVEL USE OF HYDROXYTYROSOL AND OLIVE EXTRACTS/CONCENTRATES CONTAINING IT}

본 발명은, 인간의 연령-관련 황반 변성의 치료 또는 예방, 동물(바람직하게는, 인간), 특히 나이든 동물(바람직하게는, 노인)의 눈 건강 유지, 동물(바람직하게는, 인간)의 시력 향상, 동물(바람직하게는, 인간)의 고-해상도 시력 유지, 및/또는 동물(바람직하게는, 인간)의 시력 유지뿐만 아니라 동물(바람직하게는, 인간)의 시각 성능 및/또는 동물(바람직하게는, 인간)의 시각 기능 유지를 위한, 하이드록시타이로솔(또는 이를 포함하는 조성물)의 용도에 관한 것이다.

연령-관련 황반 변성(AMD)이란, 그 용어가 의미하는 바와 같이, 연령과 관련되어 황반이 변성되는 증상이다. 황반은 망막의 중간 부분을 나타내며, 여기서 광수용체(광 감지 세포)의 밀도가 최대이기 때문에, 고-해상도 시력에 필수적이다. 결과적으로, 황반에 기능장애가 일어나면, 안면 인식 또는 독서와 같이 고-해상도를 요구하는 시각적 임무가 점차 더 어려워지고, 진행된 AMD의 말기에는, 이런 것들이 불가능해 진다. 사실, 이러한 증상은 미국 및 세계의 다른 선진국에서 실명 의 주된 원인이다.

대개, 55 내지 65세를 넘어서면, 황반 영역 내 및 주변에 특징적인 황색 침착물(드루젠(drugen)이라고도 칭함)의 축적과 함께 AMD가 시작된다. 이러한 초기 변화를 갖는 대부분의 사람들은 여전히 만족할만한 시력을 갖지만, 진행된 AMD로 발달할 위험이 있다. 드루젠이 크고, 많으며, 상기 광수용체에 인접한 색소 세포 층(망막 색소 상피(RPE)로도 지칭됨) 중의 장애와 관련되는 경우에는, 이러한 위험이 훨씬 더 크다. 진행된 AMD는, 심한 시력 손실의 원인이 되며, 건조형 및 습윤형의 2가지 형태를 갖는다. 중심 위치 위축증인 "건조형" 진행된 AMD는, 광수용체 및 눈의 중심 부분에서 상기 광수용체를 지지하는 세포의 손실을 통해 문제를 야기한다. 현재, 이러한 증상에 대해 이용가능한 치료법은 없다. 혈관신생 또는 삼출성 AMD인 "습윤형" 진행된 AMD는, 황반 아래 및 내부로의 비정상적인 혈관 증식(혈관 신생)으로 인한 시력 상실을 야기한다. 이렇게 새롭게 형성된 혈관은 불완전하고 이들로부터 혈액이 새어나오며, 결과적으로, 망막 아래에 혈액이 축적되어 황반의 기능성 층에 대한 비가역적인 손상이 유발된다. 최종적으로, 이러한 증상을 치료하지 않고 놔두면, 시력이 완전히 상실된다. 최근, 이러한 혈관신생 형태("습윤형")의 AMD에 대한 효과적이지만 매우 비싼 치료 요법이 이용가능해졌지만, 이상적인 선택은 여전히, 이러한 질환을 예방하거나, 적어도 이러한 증상이 발달할 위험을 감소시키는 것일 것이다.

AMD의 병인 및 이의 가능한 예방 또는 치료를 이해하기 위해서는, 광과 산소가 동시에 존재하는 것을 특징으로 하는 망막의 환경에서 광수용체가 항상 산화적 손상에 노출되어 있다는 것을 이해하는 것이 중요하다. 결과적으로, 광수용체는 손상을 받고 기능장애에 이르며, 이렇게 "소모된" 광수용체는 분해되고, 새로운 광수용체가 형성되어야 한다. 전자(the former)의 임무는 RPE 세포에 의해 달성된다. 이러한 세포는 엄청난 대사 부담 하에 작용한다. 약 10일의 기간 동안, 각각의 단일 RPE 세포는 식균작용을 하고, 소화시키고, 약 50 개의 광수용체를 혈류 내로 제거해야 한다. 따라서, 60년 동안, 임의의 단일 RPE 세포에 의해 100,000개 초과의 광수용체가 처리될 수 있다. 이렇게 심한 대사 활동 동안, 소모된 광수용체의 소화 및 제거가 항상 완전하지는 않으며, 세포 잔여물이 축적되어 점차적인 기능부전 및 결과적으로 RPE뿐만 아니라 광수용체 세포의 죽음이 유발된다는 것은 놀라운 일이 아니다.

AMD의 예방을 위한 논리적인 목표는 다음과 같이 나타난다:

1. 산화방지제에 의해, 산화적 손상의 감소,

2. 루테인 및 제아잔틴과 같이 특히 청색 광을 흡수할 수 있는 황색 물질에 의해, 대부분의 손상성 청색 광 양의 감소,

3. RPE 세포가 극도의 대사 부담을 더 잘 처리할 수 있도록 RPE 세포를 지원,

4. 혈관신생을 억제함으로써, 새로운 불완전한 혈관의 생성 감소.

크산토필 카로테노이드인 루테인 및 제아잔틴은 원래, 인체 중에서 관찰되는 모든 곳 중 망막 중심에 가장 고농도로 축적된다. 따라서 및 또한, 루테인 및 제아잔틴은, 청색광(망막에 손상을 가져올 수 있슴) 흡수성 및 산화방지 특성으로 인 해, AMD의 위험 감소에 기여할 수 있는 것으로 생각된다. 베타-카로텐 및 아연과 조합된, 식이성 산화방지제인 비타민 C 및 E의 보충은, AMD의 진행 위험을 낮추는 것으로 이미 증명되었다. 원숭이가 평생동안 카로테노이드-결핍된 음식물을 섭취하면, 카로테노이드를 섭취한 원숭이에 비해, 황반 아래의 망막 색소 상피가 훨씬 적은 세포를 함유하기 때문에 결손된다.

또한, 최근 제기된, AMD 질환 과정 중의 염증의 중요성은, 사이클로-옥시게나아제(COX) 저해제가 AMD 예방에 효과적이라는 예측과 일치하며, 이는, 특정 COX 저해제가 또한 VEGF(혈관 내피 성장 인자)를 억제한다는 발견에 의해서 지지된다. 결과적으로, 아스피린도 AMD의 위험을 낮추는 것으로 나타났다. 항-혈관형성 특성을 갖는 다른 물질은, 대두의 주요 성분인 제니스테인이다. 따라서, 제니스테인은 AMD의 위험 감소와 관련이 있으며, 이러한 개념은, 아시아의 노인들 중에서 습윤형 AMD의 유병율이 유럽의 비슷한 연령의 노인들에 비해 더 낮다는 관찰로부터 지지된다.

전술된 물질들은 주로, AMD의 발달 위험을 감소시키는 데 적합하다. 더 최근에는, 혈관신생 AMD의 치료를 위해, VEGF(혈관 내피 성장 인자)에 대한 항체가 이용가능해졌다. 하지만, 이것은 안구 내로 주입(injection)되어야 하므로, 위험하고, 환자가 수행하기 어렵다. 따라서, AMD 예방, 및 AMD를 갖고 있거나 이것이 발달할 위험이 있는 사람들에 대한 위험하지 않은 치료법에 대한 의학적 요구가 여전히 해결되지 않았다.

최근, 배양된 RPE 세포에 대한 아크롤레인의 작용이, 본 발명자들이 알기로는 최초로, 지아(Jia) 등의 문헌[Invest Ophthalmol Vis Sci. 2007 Jan; 48(l): 339-348: Acrolein, a Toxicant in Cigarette Smoke, Causes Oxidative Damage and Mitochondrial Dysfunction in RPE Cells: Protection by (R)-α-Lipoic Acid]에 기술되었다. 상기 문헌은, 아크롤레인이 미토콘드리아의 독성물(toxicant)이며, 리포산이, 산화성 RPE를 감소시켜, 결론적으로 리포산 및 이와 유사한 작용 메커니즘을 갖는 화합물이 AMD를 치료 또는 예방할 수 있음을 기록하였다.

놀랍게도, 이제, 하이드록시타이로솔도 또한, 강한 산화성 아크롤레인에 노출되는 배양된 RPE 세포 상에서 산화성 RPE 손상을 감소시킬 수 있음이 밝혀졌다. 하이드록시타이로솔의 작용의 하나의 기초적인 메커니즘은, 산화방지 단백질 및 II 기(phase II) 효소를 코딩하는 유전자의 주요 조절자인 Nrf2를 통해, 자유 라디칼을 중화하고, 다른 독성 화합물을 덜 반응성인 분자들로 전환시키는 것일 수 있다. 이러한 과정에서, II 기 효소는, 원치 않는 물질에 "중화" 요소를 부착시켜 이들이 신체로부터 더 용이하게 배출되게 한다. II 기 효소의 예는 글루타티온 S-전이효소, NAD(P)H:퀴논 산화환원효소 1, UDP-글루쿠로노실 전이효소, 감마-글루타메이트 시스테인 라이게이스, 및 헤미옥시게나아제-1(효소체(enzymatic body)의 해독을 매개하고/하거나 산화방지 기능을 발휘함으로써, 독성 손상으로부터 세포를 보호하는 것으로 공지됨)이다. 본 발명자들의 데이터는, 하이드록시타이로솔이 ARPE19 세포 내의 Nrf2 단백질 수준을 증가시키고, 후속적으로, GSH(글루타티온의 환원 형태) 및 SOD(수퍼옥사이드 디스뮤타제)의 수준을 포지티브하게 조절한다. 또한, 하이드록시타이로솔 치료법은 미토콘드리아의 기능 저하로부터 세포를 보호하고, 세포의 생존도를 향상시킨다. 따라서, 하이드록시타이로솔은 인간의 AMD를 치료 및/또는 예방할 수 있다.

산화성 스트레스 및 이에 따른 RPE 세포의 손상은 AMD 발병기전의 일부이다. 아크롤레인은 RPE 세포에 산화성 스트레스를 유발한다. 따라서, 이러한 세포 배양 모델은, 산화성 스트레스 이후에 세포의 사멸로부터 RPE 세포를 보호하는 화합물을 확인하는 데 이바지할 수 있다. 임의의 산화방지제가, 아크롤레인-유도된 산화성 스트레스로부터 RPE 세포를 보호할 수 있음을 추측할 수 있다. 본 발명자들은, 시험된 산화방지제의 전체 배열 중에서, HT가, RPE 세포를 보호할 수 있는 유일한 것임을 발견하였다.

서두에 언급한 바와 같이, 망막의 환경은 광과 산소가 동시에 존재하는 것을 특징으로 한다. 이러한 분위기는, 수많은 반응성 산소 종 및 매우 반응성인 산소 라디칼, 예컨대 하이드록실 라디칼 및 수퍼옥사이드 라디칼의 생성을 야기한다. 놀랍게도, 제시된 예들 중에서 하이드록시타이로솔이 아크롤레인의 독성을 개선할 수 있는 것으로 나타났다.

따라서, 하이드록시타이로솔 및 이의 유도체뿐만 아니라, 이를 함유하는 임의의 올리브 쥬스/수성 제제/추출물/농축물이, 시각 성능 및/또는 시각 기능을 유지할 수 있다. 시각 기능은, 시각 성능(즉, 속도 및 정확성을 고려한 시각 임무의 수행)을 위한 필요 조건이다. 상기 시각 임무는, 한정된 폰트 크기로 기록된 본문의 해독; 상이한 조명 조건에서, 근거리뿐만 아니라 원거리 물체에 대한 시력(정확하고/초점화된 이미지를 볼 수 있는 것); 한정된 조명 조건에서 한정된 크기의 이미지의 세부사항을 식별하는 능력(이미지 해상도, 명암비 명료도(즉, 적은 광 조건(약한 명암비)에서 고-해상도로 이미지를 볼 수 있는 능력)); 및 상이한 조명 조건들 사이에서 신속하게 적응할 수 있는 능력과 같은 몇몇 능력들을 포함할 수 있다.

하이드록시타이로솔 및 이의 유도체

하이드록시타이로솔(화학식 I의 화합물; 3,4-다이하이드록시페닐 에탄올)은 합성된 것이거나, 다른 수용성 폴리페놀, 예컨대, 올리브 잎, 올리브 열매 및 올리브유 생산의 식물수의 추출물로부터의 타이로솔 및 올레유로페인을 사용하여 수득될 수 있다.

올리프 잎으로부터의 올레유로페인 및/또는 하이드록시타이로솔의 추출을 다 루는 문헌의 예는 국제특허 공개공보 제 WO 02/18310 호, 미국 특허출원 공개공보 제 2002/0198415 호, 국제특허 공개공보 제 WO 2004/005228 호, 미국 특허 제 6,416,808 호 및 미국 특허출원 공개공보 제 2002/0058078 호이며, 상기 문헌들은, 존재하는 올레유로페인의 90% 이상이 전환될 때까지, 2 내지 12개월 동안 올리브 식물수를 산 가수분해시키는 방법을 개시하고 있다. 올리브, 올리브 과육, 올리브유 및 착유 폐수(oil mill waste water)로부터의 페놀계 화합물의 추출 방법은 우사나 인코포레이티드(Usana Inc.)의 미국특허 제 6,361,803 호 및 국제특허 공개공보 제 WO 01/45514 호 및 미국 특허출원 공개공보 제 2002/0004077 호에 기술되어 있다. 유럽 특허출원 제 EP-A 1 582 515 호는 올리브 잎으로부터의 하이드록시타이로솔의 추출을 개시하고 있다. 씨를 뺀(de-pitted) 올리브의 식물수로부터 하이드록시타이로솔 및/또는 올레유로페인을 수득하는 방법은 미국 특허출원 공개공보 제 2004/0039066 A1 호의 단락 [0080] 내지 [0091]에 개시되어 있다.

유도체는 예를 들어 에스터일 수 있다. 하이드록시타이로솔의 바람직한 에스터의 예는 올레오유로페인이다.

식물수는 특히, 미국특허 제 6,416,808 호(칼럼 4, 37행 내지 칼럼 7, 27행); 국제특허 공개공보 제 WO 2004/005228 호; 미국특허 제 6,936,287 호; 미국 특허출원 공개공보 제 2005-103 711 호; 미국 특허출원 공개공보 제 2003-108 651 호; 미국 특허출원 공개공보 제 2002-198 415 호; 미국특허 제 6,165,475 호; 일본 특허출원 공개공보 제 2001-252 054 호; 일본 특허출원 공개공보 제 2000-319 161 호; 국제특허 공개공보 제 WO 01/45514 호(우사나); 미국특허 제 6,358,542 호(특히, 칼럼 4, 1행 내지 칼럼 9, 50행 및 실시예 1 내지 5 및 11 내지 13 참조); 미국특허 제6,361,803 호(특히, 칼럼 3, 64행 내지 칼럼 9, 47행 및 실시예 1 내지 5 및 11 내지 13 참조); 및 국제특허 공개공보 제2006/084 658호에 개시된 방법 중 하나에 따라 제조되었다.

상기 식물수는 바람직하게는 미국특허 제 6,416,808 호(칼럼 4, 37행 내지 칼럼 7, 27행 참조)에 개시된 바와 같이 제조되었다.

또한, 하이드록시타이로솔 대신에 식물수 농축물도 사용될 수 있다; 그러나, 순도가 1.5 중량% 이상, 바람직하게는 30 중량% 이상, 보다 바람직하게는 50 중량% 이상의 하이드록시타이로솔을 사용하는 것이 바람직하다.

특히 적합한 식물수 농축물은, 예를 들어 미국 헤이워드 소재의 크레아그리(CreAgri)에서 시판중인 하이드록스(HIDROX; 등록상표) 6%이다. "하이드록스(등록상표) 6%"는, 하이드록스(등록상표) 6%의 총 중량을 기준으로 5 내지 8 중량%의 단백질, 45 내지 68 중량%의 탄수화물, 17 내지 30 중량%의 지방, 8 내지 15 중량%의 회(ash), 및 최소 6 중량%의 수용성 단순 및 폴리페놀을 함유한다.

미국 헤이워드 소재의 크레아그리에서 시판중인 "하이드록스(등록상표) 2%"와 "하이드록스 9%"도 사용될 수 있을 뿐만 아니라, 글란비아(Glanbia) 및 인데나(Indena)(이탈리아 밀란)으로부터, 20 내지 35 중량%의 하이드록시타이로솔 및 4 내지 6 중량%의 타이로솔을 함유하는 올리브악티브(OLIVACTIV, 상표명); (UV에 의해 측정시) 전체 페놀의 함량이 30 중량% 이상이고, (HPLC에 의해 측정시) 하이드록시타이로솔의 양이 1.5 중량% 이상이고, (HPLC에 의해 측정시) 베르바스코사이드 의 양이 5.0 중량% 이상인 올에아셀렉트(OLEASELECT; 상표명); 및 1 kg 당 5.0 내지 6.5 g의 타이로솔 및 22 내지 24 g의 하이드록시타이로솔을 함유하는 분말인 올리브(올레아)드라이(OLIVE(OLEA)DRY)도 시판중이다.

추가로 적합한 제품은, (프롤리볼스의 g당) 35 중량%의 폴리페놀, 특히 20 mg의 하이드록시타이로솔 및 (프롤리볼스의 g 당) 3 mg의 타이로솔을 함유하는 프롤리볼스(Prolivols; 셉픽(Seppic)에서 시판됨); 및 kg 당 1.0 내지 2.2g의 하이드록시타이로솔 및 0.2 내지 0.7g의 타이로솔을 함유하는 분말인 올리브 브라운 스탠다드 500(Olive Braun Standard 500; 오비페크틴(obipektin)); kg 당 2.0 내지 3.5 g의 하이드록시타이로솔 및 0.2 내지 1.0 g의 타이로솔을 함유하는 액체인 올리벡스 올리브 폴리페놀 리퀴드 P10(Olivex olive polyphenol liquid PlO; 알버트 아이슬리커(Albert Isliker)); kg 당 22 내지 23 g의 하이드록시타이로솔 및 6.5 내지 8.0 g의 타이로솔을 함유하는 분말인 올리벡스 올리브 폴리페놀(알버트 아이스리커); 및 2.0 내지 6 중량%의 하이드록시타이로솔 및 0.7 내지 1.1 중량%의 타이로솔을 함유하는 올리브 폴리페놀스 NLT(Olive Polyphenols NLT; 랠리랩 인코포레이티드(Lalilab Inc.))이다.

적당한 시판중인 식물수 농축물 중의 하이드록시타이로솔의 양은 식물수 농축물의 전체 중량의 kg 당 1.0 내지 220 g의 범위로 변한다. 타이로솔의 양은 바람직하게는 식물수 농축물의 전체 중량의 kg 당 0.2 내지 45 g의 범위로 변한다. 하이드록시타이로솔 대 타이로솔의 중량비는 바람직하게는 100:10 내지 100:40, 가장 바람직하게는 100:18 내지 100:35이다.

본 발명의 문맥상 "노인"이란, 50 내지 120세 범위, 바람직하게는 60 내지 90세 범위의 인간을 의미한다.

본 발명의 문맥상 "치료"란, 안과 질환의 발달을 중지하거나 지연시키기 위한 경구 적용으로서 정의된다.

본 발명의 문맥상 "예방"이란, 안과 질환에 걸릴 위험을 감소시키려는 의도를 갖는 시술로서 정의된다.

본 발명의 문맥상 "눈 건강의 유지"란, 눈, 특히, 상이한 층을 갖는 망막의 완전성을 완전히, 주로 또는 부분적으로 기능적이도록 유지하는 것을 보장하는 것으로서 정의된다.

본 발명의 문맥상 "시력의 개선"이란 일반적으로, 시각적 저-해상도 차트, 예컨대, ETDRS(당뇨병 망막병증의 조기 치료 연구) 차트에 의해 측정되는 바와 같은 시각 성능의 개선을 의미한다.

본 발명의 문맥상 "고-해상도 시력의 유지"란, 판독 차트에 의해 측정되는 바와 같이 특히 판독 능력을 유지하는 것을 의미한다.

본 발명의 문맥상 "시력의 유지"란, 시력 저하를 예방하는 것을 의미한다.

"시력"이란, 시각 기능의 가장 통상적인(하지만, 유일하지는 않은) 임상 측정법이다. 시력은, 표준화된 거리에서 기호의 크기가 변할 때, 흰색 배경 상의 검은 기호를 확인하는 능력의 정량적인 척도이다. 시력은, 차트(종종, 소위, 스넬른 차트(Snellen Chart)) 상에서 신뢰할 수 있게 확인가능한 가장 작은 크기를 나타낸다.

시력은 종종 상분수(common fraction)로서 표현된다. 측정 단위로서 미터를 사용할 경우, 이때 분수 시력은 6/6에 대해 상대적인 것으로 표현된다. "6/6의 시력을 갖는다"는 것은, 6 미터부터 일반적으로 확인되어야 하는 글자 크기가 실제로 그 거리에서 확인됨을 의미한다. 이것이 가장 좋은 시력이며, 십진법으로는 100% 시력을 의미하는 1.0으로 나타낸다. 6/60의 시력이란, 정상 시력을 갖는 사람이 60 미터에서 볼 수 있는 세부사항이 6 미터부터 보이는 것을 의미하며, 이는 10% 시력을 나타낸다. 하지만, 시력은 100% 보다 높을 수도 있다.

인간(70 kg)에 대한 하이드록시타이로솔의 1일 투여량은 5 내지 500 mg, 바람직하게는 15 내지 100 mg으로 변할 수 있다.

하이드록시타이로솔의 바람직한 투여량은 하기 수학식 1에서와 같이 포유동물에 대한 대사 체중 1 kg 당 0.28 내지 1.9 mg으로 변할 수 있다:

이는, 예를 들어, 70 kg의 인간에 대해서는 바람직한 1일 투여량이 6.77 내지 45.98 mg의 범위에서 변하고, 20 kg의 개에 대해서는 바람직한 1일 투여량이 2.23 내지 15.1 mg의 범위에서 변할 것임을 의미한다.

본 발명의 문맥상 "동물"이란, 인간, 애완동물(개, 고양이, 새(예컨대, 카나리아, 앵무새, 잉꼬, 쉘 파라킷(shell parakeet)), 가축, 송골매 및 매를 포함하며, 특히 인간이 바람직하다.

본 발명은 또한, 인간의 연령-관련 황반 변성의 치료 또는 예방, 동물(바람직하게는, 인간), 특히 나이든 동물(바람직하게는, 노인)의 눈 건강 유지, 동물(바람직하게는, 인간)의 시력 향상, 동물(바람직하게는, 인간)의 고-해상도 시력 유지, 및/또는 동물(바람직하게는, 인간)의 시력 유지뿐만 아니라 동물(바람직하게는, 인간)의 시각 성능 및/또는 동물(바람직하게는, 인간)의 시각 기능 유지를 위한, 하이드록시타이로솔을 포함하는 기능식품 조성물에 관한 것이다.

본원에서 사용되는 "기능식품 조성물"이란 용어는, 식품, 식료품, 식이 보충제, 영양 보충제, 또는 식품 또는 식료품용 보충 조성물, 음료(예컨대, 비제한적으로, 스포츠 음료, 기능수, 쥬스, 스무디; 인스턴트 드링크), 유제품(예컨대, 비제한적으로, 1인 용량(single shot) 요커트 드링크), 영양 바 및 스프레드를 포함한다.

본원에서 사용되는 "식품"이란 용어는, 인간 또는 동물에 의해 소비되기 적합한 임의의 식품 또는 사료를 지칭한다. 식품은 조리 식품 및 포장 식품(예컨대, 마요네즈, 샐러드 드레싱, 빵 또는 치즈 식품) 또는 동물 사료(예컨대, 압출되고 펠릿화된 동물 사료, 조제(coarse)의 혼합 사료 또는 애완동물 식품 조성물)일 수 있다. 본원에서 사용되는 "식료품"이란 용어는, 인간 또는 동물의 소비에 적합한 임의의 물질을 지칭한다. "식이 보충제"란 용어는, 단일 또는 다중 투여 단위로 포장된, 인간 또는 동물의 식이 보충을 위한 소량의 화합물을 지칭한다. 식이 보충제는 일반적으로, 상당량의 칼로리는 제공하지 않으면서 다른 미량 영양소(예컨대, 비타민 또는 미네랄)를 함유할 수 있다. "영양 보충제"란 용어는, 식이 보충 제와 칼로리 공급원을 조합하여 포함하는 조성물을 지칭한다. 일부 실시양태에서, 영양 보충제는 식사 대용물 또는 보충제(예컨대, 영양 또는 에너지 바, 또는 영양 음료 또는 농축물)이다.

식품 또는 식료품은 예를 들어, 음료(예컨대, 비알코올성 및 알코올성 드링크뿐만 아니라, 음료수 및 액체 식품에 첨가되는 액체 제제)이며, 비알코올성 드링크는 예를 들어, 탄산 음료, 스포츠 드링크, 과일 쥬스(예컨대, 오렌지 쥬스, 애플 쥬스 및 그레이프후르츠 쥬스), 야채 쥬스(예컨대, 토마토 쥬스), 레몬에이드, 차, 니어-워터 드링크, 우유 및 다른 유제품 드링크(예컨대, 요거트 드링크) 및 다이어트 드링크이다.

다른 실시양태에서, 식품 또는 식료품은, 본 발명에 따른 조성물을 포함하는 고형 또는 반-고형 식품을 지칭한다. 이러한 형태는 비제한적으로, 구운 제품(예컨대, 케이크 및 쿠키), 푸딩, 유제품, 과자, 스넥류, 또는 냉동 과자(confection) 또는 유제품(novelty)(예컨대, 아이스크림, 밀크 쉐이크), 냉동 조리 식품, 사탕, 스넥 제품(예컨대, 칩), 액상 제품(예컨대, 스프), 스프레드, 소스, 샐러드 드레싱, 육류 조리 식품, 치즈, 요거트 및 임의의 다른 지방 또는 오일 함유 식품, 및 식품 재료(예컨대, 밀가루)를 포함할 수 있다.

식품 또는 식료품이란 용어는 또한, 기능성 식품 및 조리 식품을 포함하며, 이때 후자는, 인간의 소비를 위해 승인된 임의의 미리-포장된 식품을 지칭한다.

애완동물의 식품 조성물을 비롯한 동물 사료는 유리하게는, 필요한 식이 요구량을 공급하도록 의도된 식품뿐만 아니라, 트리트(treat)(예컨대, 개 비스킷) 또 는 다른 식품 보충제를 포함한다. 본 발명에 따른 조성물을 포함하는 동물 사료는 건조 조성물(예컨대, 키블(kibble)), 반습 조성물, 습식 조성물, 또는 이들의 임의의 혼합물일 수 있다. 다르게는 또는 추가로, 동물 사료는 보충제, 예컨대, 그레이비(gravy), 음료수, 요거트, 분말, 현탁액, 츄, 트리트(예컨대, 비스킷) 또는 임의의 다른 전달 형태이다.

본 발명의 식이 보충제는, 경구 전달에 적합한 임의의 적합한 형태로 전달될 수 있다. 본 발명의 식이 보충제의 성분은, 경구 소비용 허용가능한 부형제 및/또는 담체를 함유한다. 상기 담체 및 이에 따른 식이 보충제 자체의 실제 형태는 중요하지 않다. 상기 담체는 액체, 겔, 겔켑, 캡슐, 분말, 고체 정제(코팅되거나 비코팅됨), 차 등일 수 있다. 상기 식이 보충제는 바람직하게는, 정제 또는 캡슐의 형태이며, 가장 바람직하게는 경질(외피) 젤라틴 캡슐의 형태이다. 적합한 부형제 및/또는 담체는 말토덱스트린, 칼슘 카보네이트, 이칼슘 포스페이트, 삼칼슘 포스페이트, 미정질 셀룰로스, 덱스트로스, 쌀가루, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산, 크로스카멜로스 나트륨, 나트륨 전분 글라이콜레이트, 크로스포비돈, 수크로스, 식물성 검, 락토스, 메틸셀룰로스, 포비돈, 카복시메틸셀룰로스, 옥수수 전분(이들의 혼합물 포함) 등을 포함한다. 바람직한 담체는 칼슘 카보네이트, 마그네슘 스테아레이트, 말토덱스트린 및 이들의 혼합물을 포함한다. 다양한 성분 및 부형제 및/또는 담체는 통상적인 기술을 사용하여 혼합되고, 목적하는 형태로 형성된다. 본 발명의 정제 또는 캡슐은, 약 6.0 내지 7.0의 pH에서 용해되는 장용성 코팅으로 코팅될 수 있다. 소장에서 용해되지만 위에서는 용해되지 않는 적합한 장 용성 코팅은 셀룰로스 아세테이트 프탈레이트이다. 제형 및 투여 기술에 대한 추가의 세부사항은 문헌[the latest edition of Remington's Pharmaceutical Sciences(Maack Publishing Co., Easton, PA)]에서 발견할 수 있다.

다른 실시양태에서, 상기 식이 보충제는, 소비자가 식품 또는 음료에 첨가하기 적합한 분말 또는 액체로서 제공된다. 예를 들어, 일부 실시양태에서, 상기 식이 보충제는, 예컨대, 음료에 혼합되거나, 반고체 식품(예를 들면, 푸딩, 토핑, 소스, 퓨레, 조리된 시리얼, 또는 샐러드 드레싱)에 교반도입되거나, 다르게는 식품(예를 들면, 소비 직전에 방출되도록 식품 또는 음료 용기의 캡 내에 밀봉된 것)에 첨가됨으로써 이용되도록 분말 형태로 개체에게 투여될 수 있다. 특히, 식이 보충제에 의해 음식물에 첨가되는 칼로리 수를 제한하는 것이 바람직한 경우, 상기 식이 보충제는 하나 이상의 비활성 성분을 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 식이 보충제는 또한, 예컨대 허브, 비타민, 미네랄, 증강제, 착색제, 감미제, 향미료, 비활성 성분 등을 비롯한 임의의 성분을 함유할 수 있다.

일부 실시양태에서, 상기 식이 보충제는 추가로, 비타민 및 미네랄, 예컨대 비제한적으로, 칼슘 포스페이트 또는 아세테이트, 삼염기성; 칼륨 포스페이트, 이염기성; 마그네슘 설페이트 또는 옥사이드; 염(나트륨 클로라이드); 칼륨 클로라이드 또는 아세테이트; 아스코르브산; 철 오르쏘포스페이트; 니아신아마이드; 아연 설페이트 또는 옥사이드; 칼슘 팬토테네이트; 구리 글루코네이트; 리보플라빈; 베타-카로텐; 피리독신 하이드로클로라이드; 티아민 모노나이트레이트; 엽산; 비오틴; 크롬 클로라이드 또는 피콜로네이트; 칼륨 요오다이드; 나트륨 셀레네이트; 나 트륨 몰리브데이트; 필로퀴논; 비타민 D3; 시아노코발아민; 나트륨 셀레나이트; 구리 설페이트; 비타민 A; 비타민 C; 이노시톨; 칼륨 요오다이드를 포함한다. 비타민 및 미네랄에 대한 적합한 투여량은, 예를 들어 미국 RDA 지침을 참고함으로써 수득될 수 있다.

다른 실시양태에서, 본 발명은, 본 발명에 따른 조성물을 포함하는 영양 보충제(예컨대, 에너지 바 또는 식사 대용 바 또는 음료)를 제공한다. 상기 영양 보충제는 식사 또는 스낵 대용물로서 역할을 할 수 있으며, 일반적으로 영양 칼로리를 제공한다. 바람직하게는, 상기 영양 보충제가 탄수화물, 단백질 및 지방을 균형잡힌 양으로 제공한다. 상기 영양 보충제는 추가로, 탄수화물, 단순, 중간 쇄 길이 또는 다당류, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 단순 당은, 바람직한 관능 특성을 위해 선택될 수 있다. 비조리된 옥수수 전분은 복합 탄수화물의 하나의 예이다. 고분자량 구조를 유지해야 하는 것이 바람직한 경우, 이는, 조리되지 않거나 열 가공되지 않은 식품 제형 또는 이의 일부에 포함되어야 하는데, 그 이유는 열이 복합 탄수화물을 단순 탄수화물(이는, 단당류 또는 이당류임)로 분해시킬 것이기 때문이다. 하나의 실시양태에서, 영양 보충제는, 3가지 수준의 쇄 길이의 탄수화물 공급원(단순, 중간 및 복합; 예컨대, 수크로스, 말토덱스트린 및 비조리된 옥수수 전분)의 조합을 함유한다.

본 발명의 영양 보충제에 혼입되는 단백질의 공급원은, 영양 제형에 이용되는 임의의 적합한 단백질일 수 있으며, 유장 단백질, 유장 단백질 농축물, 유장 분말, 계란, 대두 분말, 두유 대두 단백질, 대두 단백질 단리물, 카제이네이트(예컨 대, 나트륨 카제이네이트, 나트륨 칼슘 카제이네이트, 칼슘 카제이네이트, 칼륨 카제이네이트), 동물성 및 식물성 단백질 및 가수분해물 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 단백질 공급원은 선택하는 경우, 단백질의 생물가를 제일 먼저 고려해야 하며, 가장 높은 생물가는 카제이네이트, 유장, 락트알부민, 계란 알부민 및 전란 단백질에서 발견된다. 바람직한 실시양태에서, 상기 단백질은 유장 단백질 농축물 및 칼슘 카제이네이트의 조합이다. 이러한 단백질은 높은 생물가를 가지며, 즉, 이는 높은 비율의 필수 아미노산을 갖는다. 문헌[Modern Nutrition in Health and Disease, eighth edition, Lea & Febiger, publishers, 1986, especially Volume 1, pages 30-32]을 참고한다. 상기 영양 보충제는 또한, 다른 성분, 예컨대 다른 비타민, 미네랄, 산화방지제, 섬유질 및 다른 식이 보충제(예를 들면, 단백질, 아미노산, 콜린, 레시틴, 오메가-3 지방산) 중 하나 또는 이들의 조합을 함유할 수 있다. 이들 성분들 중 하나 또는 몇몇을 선택하는 것은, 제형, 설계, 소비자 기호 및 최종 사용자의 문제이다. 본 발명의 식이 보충제에 첨가되는 이러한 성분들의 양은 당업자에게 용이하게 공지되어 있다. 이러한 양에 대한 지침은, 아이 및 어른에 대한 미국 RDA 투여량에 의해 제공될 수 있다. 첨가될 수 있는 추가의 비타민 및 미네랄은 비제한적으로, 칼슘 포스페이트 또는 아세테이트, 삼염기성; 칼륨 포스페이트, 이염기성; 마그네슘 설페이트 또는 옥사이드; 염(나트륨 클로라이드); 칼륨 클로라이드 또는 아세테이트; 아스코르브산; 철 오르쏘포스페이트; 니아신아마이드; 아연 설페이트 또는 옥사이드; 칼슘 판토테네이트; 구리 글루코네이트; 리보플라빈; 베타-카로텐; 피리독신 하이드로클로라이드; 티아민 모 노나이트레이트; 엽산; 비오틴; 크롬 클로라이드 또는 피콜로네이트; 칼륨 요오다이드; 나트륨 셀레네이트; 나트륨 몰리브데이트; 필로퀴논; 비타민 D3; 시아노코발아민; 나트륨 셀레나이트; 구리 설페이트; 비타민 A; 비타민 C; 이노시톨; 칼륨 요오다이드를 포함한다.

상기 영양 보충제는 다양한 형태로, 다양한 생산 방법에 의해 제공될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 식품 바를 제조하기 위해, 액체 성분들을 조리하고, 건조 성분들을 상기 액체 성분과 함께 혼합기 내에 첨가하고, 도우 상에 도달할 때까지 혼합하고, 상기 도우를 압출기에 넣고, 압출하고, 압출된 도우를 적절한 길이로 절단하고, 생성물을 냉각시킨다. 상기 바는, 본원에 특히 열거된 성분들 외에, 다른 영양분 및 맛을 증진시키기 위한 충전제를 함유할 수 있다.

당업자는, 영양 보충제의 가공 또는 제조를 위해, 본원에 기술된 것들에 다른 성분들, 예컨대, 충전제, 유화제, 보존제 등을 첨가될 수 있음을 이해할 것이다.

또한, 향료, 착색제, 향신료, 견과류 등을 상기 기능식품 조성물에 혼입할 수 있다. 향료는, 향미를 지닌 추출물, 휘발성 오일, 초콜릿 향료, 땅콩 버터 향료, 쿠키 크럼(crumb), 크리스피 라이스, 바닐라 또는 임의의 시판되는 향료의 형태일 수 있다. 유용한 향료의 예는 비제한적으로, 순수한 아니스 추출물, 인공 바나나 추출물, 인공 체리 추출물, 초콜릿 추출물, 순수한 레몬 추출물, 순수한 오렌지 추출물, 순수한 페퍼민트 추출물, 인공 파인애플 추출물, 인공 럼 추출물, 인공 스트로베리 추출물, 또는 순수한 바닐라 추출물; 또는 휘발성 오일, 예컨대, 밤 오 일, 월계수 오일, 버가못 오일, 삼나무 오일, 호두 오일, 체리 오일, 시나몬 오일, 클로브 오일 또는 페퍼민트 오일; 땅콩 버터, 초콜릿 향료, 바닐라 쿠키 크럼, 버터스카치 또는 토피(toffee)를 포함한다. 하나의 실시양태에서, 상기 식이 보충물은 코코아 또는 초콜릿을 함유한다.

상기 기능식품 조성물의 안정성을 위해 유화제를 첨가할 수 있다. 적합한 유화제의 예는 비제한적으로, 레시틴(예컨대, 계란 또는 대두로부터) 및/또는 모노- 및 다이-글리세라이드를 포함한다. 다른 유화제는 당업자에게 용이하게 명백하며, 적합한 유화제(들)의 선택은, 부분적으로는, 제형 및 최종 제품에 좌우될 것이다. 또한, 제품 수명을 연장시키기 위해, 상기 영양 보조제에 보존제도 첨가할 수 있다. 바람직하게는, 보존제, 예컨대, 칼륨 소르베이트, 나트륨 소르베이트, 칼륨 벤조에이트, 나트륨 벤조에이트 또는 칼슘 이나트륨 EDTA가 사용된다.

전술된 탄수화물 외에, 상기 기능식품 조성물은 천연 또는 인공(바람직하게는, 저 칼로리) 감미제, 예컨대, 당류, 사이클라메이트, 아스파트아민, 아스파탐, 아세술팜 K, 및/또는 소르비톨을 함유할 수 있다. 과체중 또는 비만인 개체, 또는 고혈당증인 것으로 판명되고 유형 II 당뇨를 갖는 개체가 상기 영양 보충제를 소비하도록 의도되는 경우, 상기 인조 감미제가 바람직할 수 있다.

또한, 일부 음식물에 빠져있는 적당량의 필수 영양분을 수득하기 위해, 멀티-비타민 및 미네랄 보충제가 본 발명의 기능식품 조성물에 첨가될 수 있다. 상기 멀티-비타민 및 미네랄 보충물은 또한, 질병 예방 및 생활 방식으로 인한 영양 손실 및 결핍의 방지 및 보호에 유용할 수 있다.

물론, 기능식품 조성물을 통해 투여되는 하이드록시타이로솔의 투여량 및 비는, 공지된 인자, 예컨대, 특정 조성물의 생리학적 특성; 수용자의 연령, 건강 및 체중; 증상의 특성 및 정도; 동시 치료의 종류; 치료의 빈도; 및 해당 분야의 전문가가 일반적인 시험에 의해 결정할 수 있거나, 기능식품 조성물의 제형에 관한 일반적인 고려에 의한 목적하는 효과에 따라 다를 것이다.

식품 또는 음료는 적합하게는, 1회 투여 당 약 0.5 mg 내지 약 1000 mg의 하이드록시타이로솔을 함유한다. 조성물이 약학적 조성물인 경우, 이러한 조성물은 예를 들어, 투여 단위 당(예컨대, 캡슐 또는 정제 당) 약 1 mg 내지 약 2000 mg, 또는 액체 제형의 일일 복용량 당 약 1 mg 내지 약 3000 mg의 양으로 하이드록시타이로솔을 함유할 수 있다.

본 발명은 또한, 인간의 연령-관련 황반 변성의 치료 또는 예방, 동물(바람직하게는, 인간), 특히, 나이든 동물(바람직하게는, 노인)의 눈 건강의 유지, 동물(바람직하게는, 인간)의 시력 향상, 동물(바람직하게는, 인간)의 고-해상도 시력 유지, 및/또는 동물(바람직하게는, 인간)의 시력 유지뿐만 아니라, 동물(바람직하게는, 인간)의 시각 성능 및/또는 동물(바람직하게는, 인간)의 시각 기능의 유지를 위한, 하이드록시타이로솔을 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 약학적 조성물은 바람직하게는, 약학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함한다. 적합한 약학적 담체는, 예를 들어, 당 분야의 표준 참조 문헌인 문헌[the latest edition of Remington's Pharmaceutical Sciences(Maack Publishing Co., Easton, PA)]에 기술되어 있다. 이러한 약학적으로 허용가능한 담체의 예는 무기 및 유기 담체 물질 모두이며, 경구 투여에 적합하고, 물, 젤라틴, 아라비아 검, 락토스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 활석, 식물성 오일 등을 포함한다.

상기 약학적 조성물은, 통상적인 약학적 첨가제 및 보조제, 부형제 또는 희석제, 예컨대 비제한적으로, 물, 임의의 기원의 젤라틴, 식물성 검, 리그닌설포네이트, 활석, 당, 전분, 아라비아 검, 식물성 오일, 폴리알킬렌 글라이콜, 향미제, 보존제, 안정화제, 유화제, 완충제, 윤활제, 착색제, 습윤제, 충전제 등을 추가로 포함할 수 있다.

약학적 조성물 중의 개별적인 성분들의 투여량 및 비는, 당업자가 일반적인 전임상 및 임상 시험을 통해 결정하거나, 약학적 조성물의 제형에 관한 일반적인 고려를 통해 결정할 수 있다.

바람직한 실시양태에서, 하이드록시타이로솔은 약학적 조성물을 통해 단일 투여 또는 다중 투여 형태로 0.3 mg/kg 체중/일 이상의 양, 바람직하게는 1 내지 450 mg/kg 체중/일의 양, 가장 바람직하게는 4 내지 140 mg/kg 체중/일의 양으로 투여된다.

본 발명에 따른 조성물은, 인간 신체를 비롯한 동물 신체에 경구 투여하기 적합한 임의의 생약 형태, 예를 들어, 고체 형태, 예컨대 식품 또는 사료(를 위한 첨가제/보충제) 또는 식품 또는 사료 프리믹스, 강화 식품 또는 사료, 정제, 알약, 과립, 당의정, 캡슐 및 발포 제형(예를 들면, 분말 및 정제); 액체 형태, 예컨대 용액, 에멀젼 또는 현탁액의 형태(예를 들면, 음료, 페이스트 및 유성 현탁액)일 수 있다. 상기 페이스트는 경질 또는 연질 외피 캡슐 내에 충전될 수 있으며, 이때, 상기 캡슐은 예를 들어, (어류, 돼지, 가금류, 소) 젤라틴, 식물성 단백질 또는 리그닌설포네이트의 매트릭스를 특징으로 한다. 상기 기능식품 조성물 및 약학적 조성물은 제어된(지연된) 방출 제형 형태일 수 있다.

이제, 본 발명은 하기 비제한적인 실시예에 의해 추가로 설명된다.

실시예 1: 연질 젤라틴 캡슐

1개의 캡슐당 50 mg의 하이드록시타이로솔의 투여량을 제공하는 통상적인 절차에 의해 연질 젤라틴 캡슐을 제조한다. 적합한 1일 투여량은 1 내지 5개의 캡슐이다.

기타 성분: 글라이세롤, 물, 젤라틴, 식물성 오일

실시예 2: 경질 젤라틴 캡슐

1개의 캡슐당 75 mg의 하이드록시타이로솔의 투여량을 제공하는 통상적인 절차에 의해 경질 젤라틴 캡슐을 제조한다. 적당한 1일 투여량은 1 내지 5개의 캡슐이다.

기타 성분:

충전물: 락토스, 또는 셀룰로스 또는 셀룰로스 유도체 충분량

윤활제: 필요한 경우 마그네슘 스테아레이트(0.5%)

실시예 3: 정제

1개의 정제 당 활성 성분으로서 100 mg의 하이드록시타이로솔 및 부형제로서 미정질 셀룰로스, 이산화규소(SiO₂), 마그네슘 스테아레이트, 크로스카멜로스 나트륨(500 mg이 되도록)을 제공하는 통상적인 절차에 의해 정제를 제조한다.

실시예 4: 탄산 음료

하이드록시타이로솔을 함유하는 탄산 음료를 하기와 같이 제조할 수 있다:

성분	[g]
A. 쥬스 농축물 및 수용성 향미료
60.3°브릭스, 5.15% 산도	657.99
43.5°브릭스, 32.7% 산도	95.96
오렌지 향미료, 수용성	3.43
살구 향미료, 수용성	6.71
물	26.46
B. 착색제
β-카로틴 10% CWS	0.89
물	67.65
C. 산 및 산화방지제
아스코브산	4.11
시트르산 무수물	0.69
물	43.18
D. 안정화제
펙틴	0.20
나트륨 벤조에이트	2.74
물	65.60
E. 유용성 향미료
오렌지 향미료, 유용성	0.34
증류된 오렌지 오일	0.34
F. 활성 성분
하이드록시타이로솔	15 mg을 제공하는 양

공기의 혼입 없이, 과일 쥬스 농축물 및 수용성 향미료를 혼합한다. 착색제는 탈이온수에 용해시킨다. 아스코브산 및 시트르산을 물에 용해시킨다. 나트륨 벤조에이트는 물에 용해시킨다. 펙틴은 교반하에 첨가하고 비등시키면서 용해시킨다. 용액을 냉각시킨다. 오렌지 오일 및 수용성 향미료를 미리 혼합한다. 항목 F에서 언급된 활성 성분을 항목 A의 과일 쥬스 농축물 혼합물에 교반도입한다.

청량 음료를 제조하기 위해 항목 A 내지 F의 모든 성분들을 함께 혼합하고, 튜랙스(Turrax) 및 이어서 고압 균질화기(p₁=200바, p₂=50바)를 사용하여 균질화한다.

실시예 5: 인간 ARPE-19 세포를 사용한 세포 배양 시험

10% 소 태아 혈청, 0.348% 중탄산 나트륨, 2 mM L-글루타민, 100 U/mL 페니실린 및 100 μg/mL 스트렙토마이신을 보충한 DMEM-F12 매질(Dulbecco's modified Eales medium) 내에 인간 ARPE-19 세포(인간 망막 색소 상피 세포)를 유지하였다. 37℃, 95% 공기 및 5% CO₂의 가습 분위기 내에서 세포 배양을 유지하였다. 상기 매질을 3 내지 4일 마다 교환하였다. 10 세대 이내에서 ARPE-19 세포를 이용하였다.

시약

시노팜 케미칼 리에이전트 캄파니 리미티드(Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd)(중국, 상하이)로부터 아크롤레인을 구매하였다. 달리 기재하지 않는 한, 모든 시약은 시그마-알드리치 케미칼 캄파니(Sigma-Aldrich Chemical Co.)(미국, 미주리주 세인트 루이스)로부터 구매하였다. 하이드록시타이로솔은 화학적으로 합성하였다.

아크롤레인 노출 및 HTS 보충

96-웰 플레이트 또는 6-웰 플레이트에서 배양된 80% 융합상태의 단층을 사용하여 모든 시험을 수행하였다. 하이드록시타이로솔(HTS)을 DMSO(다이메틸 설폭사이드)에 용해시켰다. 각각의 경우, 시험 직전에 아크롤레인을 PBS(포스페이트 완충액 염)에 녹였다. 급성 독성 연구를 위해, 세포를 24시간 동안 아크롤레인에 노출시켰다. 세포를 HTS로 48시간 또는 7일 동안 처리함으로써, 급성 독성 모델을 사용하여 HTS(하이드록시타이로솔)의 보호 효과를 연구하였다.

세포 생존도에 대한 MTT 분석

세포 생존도의 정성적인 지표로서 MTT 분석 감소 분석을 사용하였다. 마이크로플레이트 분광광도계(스펙트라 맥스(Spectra Max) 340, 몰레큘라 다비시스(Molecular Dabices), 미국 캘리포니아주 써니베이트)를 사용하여 555 nm에서 광학 밀도를 판독하였다. 세포 생존도의 변화를 계산하기 위해, 미처리된 세포와 함께 흡광도 값을 표준화하였다.

미토콘드리아 막 전위에 대한 JC-1 분석

친유성 양이온성 프로브인 5,5'-6,6'-테트라클로로-1,1',3,3'-테트라에틸벤즈이미다졸-카보시아닌 요오딘(JC-1)을 사용하여, 살아있는 ARPE-19 세포 중에서 미토콘드리아 전위 변화(△ψ)를 평가하였다. 정량적인 형광성 측정을 위해, 세포를 JC-1 염색 후 1회 세척하고, 485 nm 여기 및 535 nm 및 590 nm 방출에서, 다중- 표지 계수기(왈락(Wallac 1420; 퍼킨엘머 라이프 사이언스(PerkinElmer Life Science, 미국 메사추세츠주 웰레슬리)를 사용하여 스캐닝하여, 녹색 및 적색 JC-1 형광성을 각각 측정하였다. 1 mm 간격 및 1 mm²의 대략적인 빔 영역의 5×5 패턴으로 직사각형으로 배열된 25개의 영역에서, 각각의 웰을 스캐닝하였다(하부 스캐닝). JC-1 염색된 ARPE-19의 현미경 관찰의 경우, 전하-결합 소자(CCD) 디지털 카메라(다이애그노스틱 인스트루먼츠(Diagnostic Instruments), 미국 미시간주 스털링 하이츠)를 구비한 현미경(악시오버(Axiover) 25; 칼 제이스 메디텍 인코포레이티드(Carl Zeiss Meditec, Inc.), 미국 뉴욕주 톤우드) 상에서, FITC 및 TRITC 형광 필터 입방체를 사용하여 이미지를 수집하고, 이미지-처리 소프트웨어(포토샵(Photoshop) 버전 7.0; 아도베 시스템스(Adobe Systems), 미국 캘리포니아주 마운틴 뷰)를 이용하여 처리하였다.

총 산화방지력

시판되는 분석 키트(토탈 안시옥시던트 파워(Total antioxidant power), 지안청 바이오케미칼 인코포레이티드(Jiancheng Biochemical Inc., 중국 난징)를 사용하여, 키트의 지시에 따라, ARPE-19 세포의 세포내 총 산화방지력을 분석하였다.

수퍼옥사이드 디스뮤타제(SOD) 측정

수퍼옥사이드 디스뮤타제 분석 키트(Superoxide Dismutase Assay Kit; 지안 청 바이오케미칼 인코포레이티드, 중국 난징)를 사용하여, 키트의 지시에 따라, 세포내 SOD 활성을 측정하였다.

GSH 수준에 대한 분석

시판되는 분석 키트(지안청 바이오케미칼 인코포레이티드, 중국 난징)를 사용하여, 티올-특이적 시약인 다이티오나이트로벤조산(DTNB)을 기준으로 GSH 수준을 분석하고, 412 nm에서 부가물을 분광학적으로 측정하였다.

단백질 카보닐의 검출

단백질 카보닐(단백질 산화의 척도)을 측정하기 위해, 세포를 100 mm 플레이트 상에서 생장시켰다. 옥시블롯(Oxyblot) 단백질 산화 검출 키트(Cell BioHTSbs, 미국 캘리포니아주 샌 디에고)를 사용하여, 수용성 단백질 중의 단백질 카보닐을 분석하였다.

핵 인자(nuclear factor)-E2-reHTSed 인자 2(Nrf2)의 총 수준

세포를 100 mm 플레이트 상에서 생장시키고, RIPA 완충액[1%(부피/부피) Igepal CA630, 0.5%(중량/부피) 나트륨 디옥시콜레이트, 0.1%(중량/부피) SDS 및 5 μg/μL 프로테아제 억제제 혼합물을 함유하는 150 mM PBS] 중에서 균질화(1:10)시키고, 총 Nrf2 수준의 웨스턴(Western) 분석에 50 μg의 단백질을 사용하고, 항-Nrf2 항체(산타 크루즈(Santa Cruz))를 사용하여 1:500의 역가(titer)에서 탐색하였다. 아머샴 파마시아(Amersham Pharmacia)로부터의 ECL 웨스턴 블로팅 검출 키 트(Western Blotting Detection kit)를 사용하여, 화학발광 검출을 수행하였다.

세포 내 칼슘 분석

시판되는 분석 키트(C004, 지안청 바이오케미칼 인코포레이티드, 중국 난징)을 사용하여 키트의 지시에 따라 세포 내 Ca²⁺ 수준을 결정하였다.

미토콘드리아 복합체 I, II 및 III의 활성 분석

ARPE-10 세포를 100 mm 플레이트 내에서 배양하고, PBS 중에서 세척하고, 적절한 등장성 완충액(0.25 M 수크로스, 5 mM 트리스-HCl, pH 7.5, 및 0.1 mM 페닐메틸설폰일 플루오라이드) 중에 재현탁시키고, 균질화하였다. 세포 균질액의 차등적 원심분리에 의해 미토콘드리아를 단리하였다. 약간의 변형을 가한 통상적인 분석을 사용하여, NADH-CoQ 산화환원효소(복합체 I), 석시네이트-CoQ 산화환원효소(복합체 II), CoQ-사이토크롬 c 환원효소(복합체 III)를 분광학적으로 분석하였다.

통계적 분석

도면의 범례에 제시된 바와 같이, 2개 또는 3개의 개별적인 실험의 평균±표준편차로서 데이터를 제시하였다. 일원 분산분석(one-way ANOVA)을 사용하는 프리즘(Prism) 소프트웨어(버전 4.0a)를 이용하여 통계적 유의성을 계산하였으며, 0.05 미만의 p 값을 유의한 것으로 간주하였다.

결과

도면에서 하기 약자가 사용된다:

"C" = 대조구;

"A" = 아크롤레인;

"H" = 하이드록시타이로솔;

"H + A" = 하이드록시타이로솔 + 아크롤레인;

"C + H" = 대조구 + 하이드록시타이로솔;

"HTS×-A" = 상이한 농도의 하이드록시타이로솔 및 아크롤레인.

ARPE-19 세포에서, 세포 생존도의 아크롤레인-유도된 감소에 대한 HTS의 보호 효과

96 웰 플레이트 중에서, 웰 당 4×10⁴으로 ARPE-19 세포를 시딩(seeding)하였다. 세포가 80% 융합 상태가 되었을 때, 상이한 수준의 HTS로 세포를 48시간 동안 전처리하고, 이어서, 75 μM의 아크롤레인으로 24시간 동안 처리하였다. 사용된 농도에서(ARPE-19 중 10 내지 100 μM HTS), HTS 자체는 세포 생존도에 아무런 외견상의 효과를 갖지 않았다(도 1). ARPE-19 세포를 HTS로 전처리한 것은, 75 μM의 아크롤레인-유도된 독성에 대해 상당한 보호를 가져왔다. HTS는, 10 내지 20 μM 범위에서, 세포 생존도의 급성 아크롤레인-유도된 감소에 대해 세포를 보호할 수 있었다. ARPE-19 세포를 7일 동안 전처리한 경우, 20 μM의 HTS는 아크롤레인 독성을 완전히 파괴하였다(도 3).

도 1은, MTT 분석에 의해 측정된 세포 생존도의 아크롤레인-유도된 감소에 대한 HTS의 보호 효과를 나타낸다. ARPE-19 세포는 48시간 동안 HTS로 전처리하였다. 값들은, 4개의 개별적인 시험으로부터의 데이터의 평균±표준편차이며, 각각의 시험은 3번씩 수행하였다.

##: P<0.01 대 대조구(HTS 0 μM).

*: P<0.05 대 [HTS 없는 75 μM의 아크롤레인].

도 3은, MTT 분석에 의해 측정된 세포 생존도의 아크롤레인-유도된 감소에 대한 HTS의 보호 효과를 나타낸다. ARPE-19 세포는 7일 동안 HTS로 전처리하였다. 값들은, 4개의 개별적인 시험으로부터의 데이터의 평균±표준편차이며, 각각의 시험은 3번씩 수행하였다.

##: P<0.01 대 [HTS 0].

*: P<0.05 대 [HTS 없는 아크롤레인].

**: P<0.01 대 [HTS 없는 아크롤레인].

ARPE-19 세포에서, 미토콘드리아 막 전위의 아크롤레인-유도된 감소에 대한 HTS의 보호 효과

세포 생존도에 대한 결과와 유사하게, HTS 자체는, 사용된 농도들(ARPE-19 세포 중 10 내지 100 μM HTS)에서의 모든 ARPE-19 세포의 미토콘드리아 막 전위에 아무런 외견상의 효과를 갖지 않았다. 세포 생존도에 대한 보호와 유사하게, 7일 기간의 전처리가 HTS의 보호 효과를 증가시켰다. 도 2, 4 및 9에 도시한 바와 같이, HTS는, 미토콘드리아 막 전위의 급성 아크롤레인-유도된 감소를 상당히 보호하였다. 10 μM보다 낮은 농도의 HTS는, ARPE-19에서 아크롤레인 유도된 세포 독성에 대한 보호 효과를 나타내지 않았다.

도 2는, JC-1 분석에 의해 측정된, 미토콘드리아 막 전위의 아크롤레인-유도된 감소에 대한 HTS의 보호 효과를 나타낸다. ARPE-19 세포는 48시간 동안 HTS로 전처리하였다. 값들은, 3개의 개별적인 시험으로부터의 데이터의 평균±표준편차이며, 각각의 시험은 3번씩 수행하였다.

#: P<0.05 대 [HTS 0].

##: P<0.01 대 [HTS 0].

*: P<0.05 대 [HTS 0 + 75 μM의 아크롤레인].

도 4는, JC-1 분석에 의해 측정된, 미토콘드리아 막 전위의 아크롤레인-유도된 감소에 대한 HTS의 보호 효과를 나타낸다. ARPE-19 세포는 7일동안 HTS로 전처리하였다. 값들은, 3개의 개별적인 시험으로부터의 데이터의 평균±표준편차이며, 각각의 시험은 3번씩 수행하였다.

##: P<0.01 대 대조구.

*: P<0.05 대 [HTS 없는 아크롤레인].

**: P<0.01 대 [HTS 없는 아크롤레인].

HTS가, ARPE-19 세포에서 세포 내 SOD의 아크롤레인-유도된 감소를 조절함

75 μM의 아크롤레인으로 처리하면, ARPE-19 세포의 세포 내 SOD 활성이 상당히 감소된다(도 5A). 100 μM의 HTS로 전처리하면, SOD 활성의 감소가 방지된다(도 5A). 아크롤레인 없이 100 μM의 HTS로 전처리하면, 미처리된 일반적인 ARPE-19 세포 중의 세포 내 SOD 활성이 증가된다(도 5A).

HTS가, ARPE-19 세포에서 세포 내 총 산화방지력의 아크롤레인-유도된 감소를 조절함

75 μM의 아크롤레인으로 처리하면, ARPE-19 세포에서 세포내 산화방지력이 감소된다. 100 μM의 HTS로 전처리하면, 세포에서 아크롤레인-유도된 감소가 방지된다(도 5B). 다시, SOD 활성에서와 같이, 이러한 보호는 HTS 자체의 산화방지 활성에 기인할 수 있으며, 그 이유는, 아크롤레인 없이 100 μM의 HTS가 세포 내의 총 산화방지력을 증가시키기 때문이다(도 5B).

도 5는, ARPE-19 세포에서 세포 내 SOD, 산화방지력, 및 HTS에 의한 Ca² ⁺ 수준 및 조절의 급성 아크롤레인 노출(24시간)-유도된 변화를 도시한다. 값들은, 3개의 개별적인 시험으로부터의 데이터의 평균±표준편차이며, 각각의 시험은 3번씩 수행하였다.

#: P<0.05 대 대조구.

##: P<0.01 대 대조구.

*: P<0.05 대 [HTS 없이 75 μM의 아크롤레인].

**: P<0.01 대 [HTS 없이 75 μM의 아크롤레인].

HTS 가, ARPE -19 세포에서 아크롤레인에 의해 유발된 세포 내 Ca ² ⁺ 증가를 조절함

미토콘드리아 기능 장애는 일반적으로 세포질의 Ca²⁺ 수준의 증가를 가져오며, 이는 산화적 스트레스 및 미토콘드리아 기능 장애의 생체지표(biomaker)이다. ARPE-19 세포를 75 μM 아크롤레인으로 처리하면, 세포내 Ca²⁺ 수준이 상당히 증가한다(도 5C). 75 μM 아크롤레인으로 처리하기 전에 100 μM HTS로 전처리하면, Ca²⁺의 증가가 상당히 억제된다. 아크롤레인이 없는 100 μM의 HTS는 ARPE-19 세포에서 세포 내 Ca²⁺ 수준을 그다지 변화시키지 않는다.

HTS가, ARPE-19 세포에서 GSH 수준의 아크롤레인-유도된 감소를 억제함

ARPE-19 세포를 HTS로 48시간 동안 전처리하면, GSH 수준이 증가되는 경향을 나타냈다(도 6). 75 μM의 아크롤레인을 24시간 동안 처리하면, GSH 수준이 상당히 감소하였고, 100 μM의 HTS로 48시간 동안 처리하면, GSH 수준에 대한 완전한 보호를 제공하였다(도 6).

도 6은, ARPE 세포에서 GSH 수준의 아크롤레인-유도된 변화 및 HTS의 보호 효과를 도시한다. 48시간 동안 HTS 전처리하고, 24시간 동안 아크롤레인에 노출시켰다. 값들은, 4개의 개별적인 시험으로부터의 데이터의 평균±표준편차이며, 각 각의 시험은 3번씩 수행하였다.

##: P<0.01 대 대조구.

*: P<0.05 대 [HTS 없이 75 μM의 아크롤레인].

**: P<0.01 대 [HTS 없이 75 μM의 아크롤레인].

HTS가, ARPE-19 세포에서 단백질 카보닐의 아크롤레인-유도된 증가를 억제함

75 μM의 아크롤레인으로 24시간 동안 처리하면, 단백질 산화의 지표인 단백질 카보닐이 상당히 증가되었다(도 7). 100 μM의 HTS로 48시간 동안 전처리하면, 단백질 카보닐의 아크롤레인-유도된 증가에 대한 상당한 억제를 나타냈다(도 7).

도 7은, 웨스턴 블로팅에 의해 분석된 ARPE 세포에서 단백질 카보닐의 아크롤레인-유도된 변화 및 HTS의 보호 효과를 도시한다. 48시간 동안 HTS로 전처리하고, 24시간 동안 아크롤레인에 노출시켰다. 4개의 개별적인 유사한 시험으로부터 단백질 카보닐의 대표적인 정량 데이터를 수득하였다.

HTS가, ARPE-19 세포에서 총 Nrf2 발현의 아크롤레인-유도된 감소를 조절함

75 μM의 아크롤레인으로 24시간 동안 처리하면, ARPE-19 세포에서 모든 총 Nrf2 발현이 상당히 감소되었으며, 100 μM의 HTS로 48시간 동안 전처리하면, 총 Nrf2의 아크롤레인-유도된 증가로부터 세포가 상당히 보호되었다(도 8).

도 8은, 웨스턴 블로팅에 의해 분석된 ARPE 세포에서 총 Nrf2 발현에서의 아크롤레인-유도된 변화 및 HTS의 보호 효과를 도시한다. 48시간 동안 HTS로 전처리 하고, 24시간 동안 아크롤레인에 노출시켰다.

HTS 가, ARPE -19 세포에서 미토콘드리아 복합체 I, II 및 III 활성의 아크롤레인-유도된 감소를 조절함

75 μm의 아크롤레인으로 24시간 동안 처리하면, ARPE-19 세포에서 미토콘드리아 복합체 I, II 및 III의 활성이 상당히 감소되었다(도 9A, 9B 및 9C). 100 μM의 HTS로 전처리하면, 복합체 I(도 9A), 복합체 II(도 9B) 및 복합체 III(도 9C)에 대한 상당한 보호가 나타났다.

도 9는, ARPE-19 세포에서 미토콘드리아 복합체의 아크롤레인-유도된 감소에 대한 HTS의 보호를 도시한다. (A) 복합체 I, (B) 복합체 II, 및 (C) 복합체 III. ARPE-19 세포를 상이한 농도의 HTS로 전처리하고, 이어서, 75 μM의 아크롤레인으로 처리하였다. 값들은, 3개의 개별적인 시험으로부터의 데이터의 평균±표준편차이며, 각각의 시험은 2번씩 수행하였다.

#: P<0.05 대 대조구.

##: P<0.01 대 대조구.

**: P<0.01 대 [HTS 없이 75 μM의 아크롤레인].

Claims

인간의 연령-관련 황반 변성의 치료 또는 예방, 동물의 눈 건강 유지, 동물의 시력(vision) 향상, 동물의 고-해상도 시력 유지, 동물의 시력(visual acuity) 유지, 동물의 시각 성능의 유지 및/또는 동물의 시각 기능의 유지를 위한, 하이드록시타이로솔을 포함하는 기능식품(nutraceutical) 조성물.
제 1 항에 있어서,

상기 동물이 인간인, 기능식품 조성물.
인간의 연령-관련 황반 변성의 치료 또는 예방, 동물의 눈 건강 유지, 동물의 시력 향상, 동물의 고-해상도 시력 유지, 동물의 시력 유지, 동물의 시각 성능의 유지 및/또는 동물의 시각 기능 유지를 위한(또는 이를 위한 조성물의 제조를 위한), 하이드록시타이로솔(또는 이를 포함하는 조성물)의 용도.
제 3 항에 있어서,

상기 동물이 인간인, 용도.
인간의 연령-관련 황반 변성을 치료 또는 예방하기 위한, 하이드록시타이로솔을 포함하는 기능식품 조성물.
인간의 연령-관련 황반 변성을 치료 또는 예방하기 위한(또는 이를 위한 조성물의 제조를 위한), 하이드록시타이로솔(또는 이를 포함하는 조성물)의 용도.
동물, 특히 인간(노인)의 눈 건강을 유지하기 위한, 하이드록시타이로솔을 포함하는 기능식품 조성물.
동물, 특히 인간(노인)의 눈 건강을 유지하기 위한(또는 이를 위한 조성물의 제조를 위한), 하이드록시타이로솔(또는 이를 포함하는 조성물)의 용도.
동물, 특히 인간의 시력을 향상시키기 위한, 하이드록시타이로솔을 포함하는 기능식품 조성물.
동물, 특히 인간의 시력을 향상시키기 위한(또는 이를 위한 조성물의 제조를 위한), 하이드록시타이로솔(또는 이를 포함하는 조성물)의 용도.
동물, 특히 인간의 고-해상도 시력을 유지하기 위한, 하이드록시타이로솔을 포함하는 기능식품 조성물.
동물, 특히 인간의 고-해상도 시력을 유지하기 위한(또는 이를 위한 조성물 의 제조를 위한), 하이드록시타이로솔(또는 이를 포함하는 조성물)의 용도.
동물, 특히 인간의 시각 성능을 유지하기 위한, 하이드록시타이로솔을 포함하는 기능식품 조성물.
동물, 특히 인간의 시각 성능을 유지하기 위한(또는 이를 위한 조성물의 제조를 위한), 하이드록시타이로솔(또는 이를 포함하는 조성물)의 용도.
동물, 특히 인간의 시력을 유지하기 위한, 하이드록시타이로솔을 포함하는 기능식품 조성물.
동물, 특히 인간의 시력을 유지하기 위한(또는 이를 위한 조성물의 제조를 위한), 하이드록시타이로솔(또는 이를 포함하는 조성물)의 용도.
동물, 특히 인간의 시각 기능을 유지하기 위한, 하이드록시타이로솔을 포함하는 기능식품 조성물.
동물, 특히 인간의 시각 기능을 유지하기 위한(또는 이를 위한 조성물의 제조를 위한), 하이드록시타이로솔(또는 이를 포함하는 조성물)의 용도.
효과량의 하이드록시타이로솔(또는 이를 포함하는 조성물)을 인간에게 투여하여, 인간의 연령-관련 황반 변성을 치료하거나 예방하는 방법.
효과량의 하이드록시타이로솔(또는 이를 포함하는 조성물)을 동물에게 투여함으로써, 동물의 눈 건강을 유지하거나, 동물의 시력을 향상시키거나, 동물의 고-해상도 시력을 유지하거나, 동물의 시력을 유지하거나, 동물의 시각 성능을 유지하고/하거나 동물의 시각 기능을 유지하는 방법.
제 20 항에 있어서,

상기 동물이 인간인, 방법.
효과량의 하이드록시타이로솔(또는 이를 포함하는 조성물)을 동물/인간(노인)에게 투여함으로써, 동물, 특히 인간(노인)의 눈 건강을 유지하는 방법.
효과량의 하이드록시타이로솔(또는 이를 포함하는 조성물)을 동물/인간에게 투여함으로써, 동물, 특히 인간의 시력을 향상시키는 방법.
효과량의 하이드록시타이로솔(또는 이를 포함하는 조성물)을 동물/인간에게 투여함으로써, 동물, 특히 인간의 고-해상도 시력을 유지하는 방법.
효과량의 하이드록시타이로솔(또는 이를 포함하는 조성물)을 동물/인간에게 투여함으로써, 동물, 특히 인간의 시각 성능을 유지하는 방법.
효과량의 하이드록시타이로솔(또는 이를 포함하는 조성물)을 동물/인간에게 투여함으로써, 동물, 특히 인간의 시력을 유지하는 방법.
효과량의 하이드록시타이로솔(또는 이를 포함하는 조성물)을 동물/인간에게 투여함으로써, 동물, 특히 인간의 시각 기능을 유지하는 방법.