KR101340675B1 - 탄제레틴을 포함하는 심혈관계 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 - Google Patents

탄제레틴을 포함하는 심혈관계 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 탄제레틴을 포함하는 심혈관계 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 상기 탄제레틴을 포함하는 심혈관계 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품에 관한 것이다. 본 발명의 탄제레틴을 포함하는 약학 조성물은 심근경색과 같이 세포자살을 수반하는 심혈관계 질환의 발병시 세포자살을 예방하여, 결과적으로 심근세포의 사멸을 방지하고 이에 따라 심혈관계 질환을 예방, 치료, 경감 또는 개선시키는 효과를 나타내므로, 심혈관계 질환의 치료제의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.

Description

탄제레틴을 포함하는 심혈관계 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물{Pharmaceutical composition comprising tangeretin for preventing or treating cardiovascular diseases}
본 발명은 탄제레틴을 포함하는 심혈관계 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 탄제레틴을 포함하는 심혈관계 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 상기 탄제레틴을 포함하는 심혈관계 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품에 관한 것이다.
심혈관질환은 세계적으로 전체 사망 원인의 30%를 차지하고 있어 사망원인 1위를 차지하고 있으며, 이 중의 75%는 심근경색이 차지하고 있는데, 상기 심근경색은 암과 더불어 가장 높은 사망원인으로 알려져 있다. 이러한 심근경색의 발병을 억제하는 방법으로는 혈관이 폐색되기 전에 고혈압과 고지혈증을 치료하여 혈관의 폐색을 예방하는 방법 또는 혈관이 폐색된 후에는 혈류의 공급부족으로 인한 심근조직의 사멸을 억제하는 방법 등이 고려되고 있다. 이중에서도 가장 바람직한 방법은 혈관의 폐색을 예방하는 것임에도 불구하고, 혈관이 폐색되고 3 내지 6시간이 경과한 후에는 심근조직이 사멸되어 돌이킬 수 없는 결과를 초래하기 때문에, 혈관이 폐색된 후에 심근조직의 사멸을 억제하는 방법을 개발하기 위한 연구가 보다 활발히 진행되고 있다. 혈관이 폐색된 후에 심근조직의 사멸을 억제하는 가장 바람직한 방법은 혈관 폐색증이 발병한 직후에 병원으로 이송되어 재관류 치료를 받는 것이지만, 모든 환자가 적절한 시점에서 재관류 치료를 받는다는 것은 현실적으로 불가능하기 때문에, 혈관폐색 이후에 발생하는 심근조직의 사멸을 지체시키는 방법을 개발하려는 방향으로 연구가 진행되고 있다. 특히, 심근조직의 사멸은 주로 세포자살에 의한 것으로 보고되었기 때문에, 세포자살을 억제하고 세포생존능을 향상시키는 방법을 개발하려는 연구가 활발히 진행되고 있다.
상기 세포자살의 작용기전에 대하여는 아직까지도 명확하게 규명되지 않고 있으나, 대체로 산소와 포도당 공급부족에 따른 ATP의 생산감소 및 부종의 발생에 의하여 진행되거나, 세포외 환경에서 과다한 글루탐산의 축적에 따른 글루탐산의 세포내 유입 및 세포내 칼슘농도의 급격한 증가에 의하여 진행되거나, 또는 폐색된 혈관의 재관류에 의한 갑작스런 산소의 공급에 따른 세포내 라디칼의 증가 및 상기 라디칼에 의한 DNA 손상에 의하여 진행된다고 보고되었다. 이들 세포자살의 작용기전은 각 조직의 종류 및 각 세포에 주어지는 외부적인 조건에 따라 개별적으로 또는 복합적으로 적용되는 것으로 알려져 있고, 상기 심근경색의 경우에는 산소와 포도당 공급부족에 따른 ATP의 생산감소 및 부종의 발생에 의하여 세포자살이 유발되는 것으로 알려져 있다.
이러한 세포자살의 작용기전에 근거한 세포자살을 효과적으로 억제함으로써, 세포자살을 유발하는 질환을 치료할 수 있는 치료제를 개발하려는 노력이 계속되고 있다. 예를 들어, 테트라사이클린 계열의 항생제인 미노사이클린은 세포자살을 억제함으로써 세포의 생존성을 향상시켜, 뇌경색, 심근경색 및 허혈성급성신부전증 등의 허혈성질환 뿐만 아니라 알츠하이머병, 파킨슨병, 근위축성 측상 경화증(amyotrophic lateral sclerosis), 헌팅턴병 및 척수손상 등의 신경세포자살에 의해 발생하는 퇴행성 뇌질환의 치료에도 효과가 있다는 것이 알려져 있다(한국특허등록 제0404134호, 미국특허등록 제6,716,822호 및 제6,818,625호). 뿐만 아니라, 아미노글리코사이드 계열, 퀴놀론 계열의 항생제들도 미노사이클린과 마찬가지로 허혈조건에서 세포의 생존을 개선시켰으며, 이 중에서 특히 아미노글리코사이드 계열의 G418(제네티신)은 심근경색 치료 효과가 관찰되었다(미국특허등록 제6,716,822호). 이 후의 실험에서 G418은 허혈조건에서 세포자살을 억제하며 심근경색뿐만 아니라 뇌경색에도 치료효과를 나타내는 것을 확인하였다. 상기의 결과로, 허혈조건에서 G418과 동일한 세포 생존 개선 효과를 나타내는 시료들이 궁극적으로 심근경색 등의 허혈성질환의 치료에 효과를 나타내고 아울러 퇴행성뇌질환 등 세포자살에 의해 발생하는 질환의 예방 및 치료에도 효과를 나타낼 것으로 예상되어 탐색을 한 결과 소맥을 포함한 벼과식물 추출물이 세포생존을 개선효과를 나타내는 것을 확인하였으며, 이를 근거로 소맥추출물을 허혈성 질환 및 퇴행성 뇌질환 동물모델에 적용하여 실험을 실시한 결과 뇌경색 및 심근경색 등의 허혈성질환과 알츠하이머병 등의 퇴행성뇌질환에 대한 치료에도 효과를 나타내는 것을 확인한 바 있다(대한민국 특허등록 제0723950호 및 국제특허공개 WO/2006/073265).
한편, 탄제레틴은 대표적인 감귤류 과일의 폴리메톡실 플라본(Polymethoxylated flavones; PMFs)으로서, 감귤류의 암 예방효과를 나타내는 성분 중의 하나로 알려져 있으며, PMFs의 주요 효과인 혈소판 응집억제 효과, 임파구 증식억제 효과, 항 궤양 효과 및 항염증 효과 뿐만 아니라, 백혈병 세포의 성장억제 효과, 파킨슨 동물모델의 신경보호 효과 등이 알려져 있으나, 현재까지는 심근경색 모델에서 세포자살을 방지하는 효과에 대하여는 전혀 알려지지 않았다.
이러한 배경하에서, 본 발명자들은 탄제레틴이 심근경색에 수반되는 세포자살을 예방하여 심근조직의 사멸을 방지할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 탄제레틴을 포함하는 심혈관계 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 탄제레틴을 포함하는 심혈관계 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 일 실시양태로서, 본 발명은 탄제레틴을 포함하는 심혈관계 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명의 용어 "탄제레틴(tangeretin)"이란, 감귤류 과일의 폴리메톡실 플라본(Polymethoxylated flavones; PMFs)의 일종인 O-polymethoxylated flavone에 속하고, 화학식으로는 5,6,7,8-tetramethoxy-2-(4-methoxyphenyl)-4H-1-benzopyran-4-one으로 표시되며, 약 372.37의 분자량을 가지는 화합물을 의미한다. 상기 탄제레틴은 체내에서 콜레스테롤 수준을 저하시키고, 항암활성을 증대시키며, 신경세포를 보호하고, 알레르기 반응에 따른 히스타민의 과다 분비를 억제하는 효과를 나타낸다.
본 발명의 용어 "심혈관계 질환(cardiovascular disease)"이란, 심장과 주요 동맥에 발생하는 질환을 의미하는데, 심근장애, 원발성 심장정지, 허혈성 심부전, 고혈압, 허혈성 심장 질환, 관상동맥질환, 협심증, 심근경색증, 죽상경화증, 부정맥 등의 질환을 포괄한다. 본 발명의 목적상 상기 심혈관계 질환은 심장과 주요 동맥에 발생하는 질환이 될 수도 있고, 바람직하게는 세포자살을 수반하면서 심장과 주요 동맥에 발생하는 질환이 될 수 있으며, 보다 바람직하게는 탄제레틴에 의하여 세포자살이 예방됨으로써 그 결과로 증상이 치료, 완화, 개선 또는 예방될 수 있는 심장과 주요 동맥에 발생하는 질환이 될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 탄제레틴이 심근경색을 예방하는데 탁월한 효과를 나타내고(도 1), TUNEL 방법에 의한 Area At Risk(AAR/LV%)에서 자살하는 세포의 비율을 감소시키며(도 2a 및 도 2b), cleaved caspase-3의 발현수준이 감소시키는 방식(도 3a 및 도 3b)으로 세포자살을 방지하는 효과를 나타내지만, 적어도 미토콘드리아에 기인한 내인성 신호 경로에 관여하지는 않음(도 4a 및 도 4b)을 확인하였다.
본 발명의 조성물은 심혈관계 질환이 발병할 가능성이 높거나 또는 앓고 있는 개체에게 투여함으로써 심혈관계 질환을 예방 또는 치료하는데 활용될 수 있다.
본 발명의 용어, "개체"란 심혈관계 질환이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미한다.
이때, 상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 목적하는 바에 따라 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 심혈관계 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 탄제레틴을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 본 발명에서, 탄제레틴을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 탄제레틴에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
상기 본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 본 발명의 용어 "약학적으로 유효한 양"이란, 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 탄제레틴의 투여량은 특별히 이에 제한되지 않고, 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으나, 0.1 내지 1000 mg/㎏의 양을 1일 1회 내지 수회로 분할하여 투여할 수 있다.
본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.
아울러, 본 발명의 조성물은 심혈관계 질환의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
상기 목적을 달성하기 위한 다른 실시양태로서, 본 발명은 탄제레틴을 포함하는 심혈관계 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 용어 "건강기능식품"이란, 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.
본 발명의 탄제레틴을 심혈관계 질환의 예방 또는 개선을 목적으로 식품첨가하여 건강기능식품을 제조할 수 있는데, 상기 건강기능식품은 특별히 이에 제한되지 않으나, 건강 기능성 식품, 영양 보조제, 영양제, 파머푸드(pharmafood), 건강 식품, 뉴트라슈티칼(nutraceutical), 디자이너 푸드, 식품 첨가제 등의 모든 형태의 식품이 될 수 있는데, 바람직하게는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 될 수 있다. 이때, 첨가하는 방법은 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용되고, 첨가량은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
상기 본 발명의 건강기능식품은 탄제레틴 이외의 다양한 성분을 추가로 포함할 수도 있는데, 이들 다양한 성분은 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등이 될 수 있다. 뿐만 아니라, 기호성 및/또는 기능성을 부가하기 위하여 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있으며, 이들 성분들은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 탄제레틴은 심혈관계 질환을 예방 또는 개선하기 위한 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이때, 상기 건강기능식품에 포함되는 탄제레틴의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 전체 식품 중량의 0.01 내지 95 중량%로 가할 수 있고, 상기 건강 음료 조성물에 포함되는 탄제레틴의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 음료 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.
본 발명의 탄제레틴을 포함하는 약학 조성물은 심근경색과 같이 세포자살을 수반하는 심혈관계 질환의 발병시 세포자살을 예방하여, 결과적으로 심근세포의 사멸을 방지하고 이에 따라 심혈관계 질환을 예방, 치료, 경감 또는 개선시키는 효과를 나타내므로, 심혈관계 질환의 치료제의 개발에 널리 활용될 수 있을 것이다.
도 1은 심근경색 동물모델에 경구투여시 탄제레틴의 농도별 경색 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 2a는 심근경색 동물모델에 경구투여시 탄제레틴의 세포자살 억제 효과를 TUNEL 어세이 한 결과를 나타낸다.
도 2b는 심근경색 동물모델에 경구투여시 탄제레틴의 세포자살 억제 효과를 TUNEL 어세이 한 결과 세포를 세어 생존율 개선을 나타낸 그래프이다.
도 3a는 심근경색 동물모델에 경구투여시 탄제레틴의 세포자살 억제 효과를 Cleaved Caspase-3 의 면역염색화법으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 3b는 심근경색 동물모델에 경구투여시 탄제레틴의 세포자살 억제 효과를 Cleaved Caspase-3 의 면역염색화법으로 확인 후 정량화한 그래프이다.
도 4a는 심근경색 동물모델에 경구투여시 탄제레틴의 세포자살 억제 효과를 Bcl-2/Bax의 면역염색화법으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 4b는 심근경색 동물모델에 경구투여시 탄제레틴의 Bcl-2/Bax 의 면역염색화법으로 확인 후 세포자살을 억제하는 효과를 정량화한 그래프이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 심근경색에 대한 탄제레틴의 효과
심근경색에 대한 탄제레틴의 치료 효과를 검증하기 위해서 선행기술에 따라 심근경색모델을 제조하고(Haisong J et al., Circulation, 97, pp892-899, 1998), 상기 심근경색 모델을 이용하여 탄제레틴의 효과를 확인하였다.
대구카톨릭의대 동물사육실에서 일정한 조건(온도: 21± 2 ℃, 명암: 12시간 명암주기)에서, 사료와 음수의 자유로운 섭취가 가능하도록 하였으며, 실험시작 전까지 물과 먹이를 충분히 제공하며 실험시작 전에 실험동물을 10분 동안 사전취급(handling)한 체중 250-300 g의 스프라그-다우리(Sprague-Dawley)계 수컷 랫트(샘타코바이오코리아)에 1 또는 10 ㎎/㎏/day의 탄제레틴을 사료에 혼합하여 섭식시키고, 3일이 경과된 후, 심근경색을 유도하였다. 구체적으로, 상기 랫트에 10 ㎎/㎏의 케타민(ketamine, 유한, 대한민국)과 5 ㎎/㎏의 자이라진(xylazine, Sigma, 미국)을 투여하여 마취를 유도하고 기도에 삽관한 후 전신마취 시켰다. 그런 다음, 흉골을 절제하여 심장을 노출시키고 5-0 prolene 봉합실을 좌관상동맥(LAD)의 윗부분을 통과시켜서 미세관(PE 50)을 이용하여 올가미 모양으로 만들어 혈관을 폐색시켜 허혈상태를 30분 동안 유지하고 다시 죄었던 PE 50을 느슨하게 함으로써 3시간동안 재관류를 실시하였다.
한편, 심근경색 부위의 조사는 EVANS blue dye(Sigma, 미국)와 TTC(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride, Sigma, 미국) 염색을 통하여 일정군의 경색 부위 크기를 측정하여 탄제레틴의 효과를 다음과 같이 관찰하였다. 먼저, 허혈-재관류가 끝난 후 바로 다시 PE 50 을 죄어서 허혈상태와 동일한 상태로 만들어 준 후 1% EVANS blue dye 용액을 2 mL 정맥투여 하였다. 이어, 심장을 적출하여 우심실 및 우심방을 제거하고 2-3 mm 의 두께로 자른 뒤 단면적의 사진을 찍어 영상분석시스템(ImageJ, 미국)으로 dye가 염색된 곳과 염색되지 않은 곳의 면적을 측정하여 Area At Risk(AAR/LV%), 즉 혈액이 지나가지 않은 지역의 면적을 산출하였다. 그런 다음, 다시 상기 심장조각들을 37 ℃에서 1% TTC 용액으로 15분 동안 염색시키고, 10% formalin 용액에 고정시킨 다음, 단면적을 측정하여 전체 면적에 대한 조직이 죽은 흰 지역의 면적, Infarcted Area(IA/LV%) 즉 경색부위의 면적을 산출하였다. 끝으로, AAR에 대한 IA의 비율을 이용하여 대조군과 실험군을 비교하였다(도 1).
도 1은 심근경색 동물모델에 경구투여시 탄제레틴의 농도별 경색 억제 효과를 나타낸 그래프이다.
도 1에서 보듯이, 탄제레틴을 투여하지 않은 랫트(8 마리, 대조군, Control)는 IA(%AAR)가 50.7%인데 반하여, 탄제레틴을 10 ㎎/㎏/day의 용량으로 투여한 랫트(6 마리, 실험군, Tangeretin 10 mg/kg)는 44.5%이였지만, 탄제레틴을 1 ㎎/㎏/day로 투여한 랫트(5 마리, 실험군, Tangeretin 1 mg/kg)는 38.8% 임을 확인하였다. 이러한 결과는 탄제레틴을 경구투여 했을 경우, 괴사부위의 부피를 23.5% 정도(p<0.05) 감소시킬 수 있음을 나타낸 것으로써, 탄제레틴이 심근경색을 예방하는데 탁월한 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.
실시예 2: 세포자살에 대한 탄제레틴의 효과
실시예 2-1: TUNEL 방법을 이용한 확인
공지된 방법에 따라, Apop-Taq(In situ cell death detection kit, POD Roche Mannheim, Germany)을 이용한 TUNEL 방법으로 조직을 염색하여 세포자살에 대한 탄제레틴의 효과를 확인하였다(Chen YF, et al., J. Mol. Cell. Cardiol., 44:180-187, 2008).
구체적으로, 상기 실시예 1에서 수득한 심장조각을 파라핀 포매과정을 통하여 5 ㎛ 두께의 절편을 형성하고, 파라핀의 제거과정 및 함수과정을 수행한 다음, PBS 완충용액(phosphate-buffered saline, pH 7.4)에 침지한 후, 수분을 제거하였다. 세포 내에 존재하는 peroxidase를 제거하기 위하여 proteinase K를 처리하고, PBS로 세척한 다음, 발색을 위하여 Apop-Taq kit의 enzyme solution과 label solution을 1:9의 비율로 혼합하여 분주한 후, 37 ℃에서 1시간 동안 방치하였다. 이후, PBS 완충용액에 3분씩 3회 세척하고, DAB 기질용액을 가하여 반응시키며, methyl green을 이용하여 대조 염색을 실시하였다. 염색이 끝난 후, 탈수과정과 xylene 투명과정을 거친 후, 봉입(mounting) 하고 그 과정 까지 마친 조직은 IA, AAR 지역을 구분하여 400배율로 현미경 사진을 촬영하고, 촬영을 마친 슬라이드 사진을 이용하여 세포자살의 정도를 분석하였다(도 2a 및 도 2b). 이때, 세포자살의 정량은 IA, AAR 각각의 지역에서 사진 전체 근육세포 수를 세고, 세포자살이 진행된 근육세포수를 센 후, 전체 세포에 대한 백분율도 환산하여 비교하였다.
도 2a는 심근경색 동물모델에 경구투여시 탄제레틴의 세포자살 억제 효과를 TUNEL 어세이 한 결과를 나타내고, 도 2b는 심근경색 동물모델에 경구투여시 탄제레틴의 세포자살 억제 효과를 TUNEL 어세이 한 결과 세포를 세어 생존율 개선을 나타낸 그래프이다.
도 2a 및 도 2b에서 보듯이, 시료를 투여하지 않은 랫트(4마리, 대조군, Control)는 세포자살이 일어난 세포가 AAR 지역에서는 전체 세포에 대해 23.6% 및 IA 지역에서는 21.1%를 차지하는데 반하여, 탄제레틴을 1 ㎎/㎏/day의 용량으로 투여한 랫트(3마리, 실험군, Tangeretin)는 AAR 지역에서는 7.8% 및 IA 지역에서는 22.0%를 차지함을 확인하였다. 이러한 결과는 탄제레틴이 세포자살을 AAR 지역에서는 66.9%(p<0.05)정도 감소된 것을 나타내므로, AAR 지역에서 세포자살을 막는데 탄제레틴이 현저한 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 2-2: cleaved Capsase -3의 발현수준을 이용한 확인
세포자살을 확인할 수 있는 마커인 cleaved Capsase-3의 발현수준을 이용하여 세포자살에 대한 탄제레틴의 효과를 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 1에서 수득한 심장조각을 파라핀 포매과정을 통하여 5 ㎛ 두께의 절편을 형성하고, 파라핀의 제거과정 및 함수과정을 거친 후 PBS 완충용액에 침지한 후 슬라이드 상의 조직이외 물기를 제거하였다. 포르말린 고정으로 인한 단백질끼리의 cross-link를 끊어 숨겨진 antigen 및 epitope를 드러내기 위해 10mM citric acid buffer를 이용한 antigen retrieval step을 진행하였다. 이는 buffer 에 슬라이드를 담그고 전자레인지로 5분간 끓이고 상온에서 약 30분간 식혀 두는 과정에 의해 수행되었다. 그런 다음, 세포 내에 존재하는 peroxidase를 제거하기 위하여 3% 과산화수소에 30분간 침지하였다. BSA(Bovine serum albumin)로 blocking을 1시간 동안 하고 cleaved caspase-3(Asp175)(Cell Signaling. Messachusetts, USA )항체를 1:50의 비율로 희석하여 4 ℃에서 하룻밤 동안 반응시키고 HRP 가 결합된 2차 항체와 1시간 동안 반응시킨 후 ABC kit(Vector., UK)를 이용하고 DAB 기질 반응을 실시하였다. 일정 시간 발색이 진행되면 슬라이드를 봉입하고 현미경 사진을 200배율로 촬영하여 Image J 프로그램을 이용하여 intergral density를 측정하여 발현정도를 비교하였다(도 3a 및 도 3b).
도 3a는 심근경색 동물모델에 경구투여시 탄제레틴의 세포자살 억제 효과를 Cleaved Caspase-3 의 면역염색화법으로 확인한 결과를 나타내고, 도 3b는 심근경색 동물모델에 경구투여시 탄제레틴의 세포자살 억제 효과를 Cleaved Caspase-3 의 면역염색화법으로 확인 후 정량화한 그래프이다.
도 3a 및 도 3b에서 보듯이, 시료를 투여하지 않은 랫트(4마리, 대조군, Control)의 intergral density를 기준으로 탄제레틴을 1 ㎎/㎏/day의 용량으로 투여한 랫트(3마리, 실험군, Tangeretin)의 interal density를 산출한 결과, control 대비 탄제레틴을 투여한 랫트는 0.48로 대조군에 비해 cleaved caspase-3의 발현이 감소됨을 확인하였다(p<0.05). 이는 탄제레틴의 투여에 의하여, cleaved caspase-3의 발현수준이 감소됨을 의미하므로, 탄제레틴이 세포자살을 방지하는 효과를 나타냄을 알 수 있었다.
실시예 2-3: Bcl -2 및 Bax 의 발현수준을 이용한 확인
탄제레틴이 세포자살에 관여하는 경로가 미토콘드리아에 기인한 내인성 신호 경로인지를 확인하기 위하여 Bcl-2 및 Bax의 발현수준을 이용하여 세포자살에 대한 탄제레틴의 효과를 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 1에서 수득한 심장조각을 파라핀 포매과정을 통하여 5 ㎛ 두께의 절편을 형성하고, 파라핀의 제거과정 및 함수과정을 거친 후 PBS 완충용액에 침지한 후 슬라이드 상의 조직이외 물기를 제거하였다. 포르말린 고정으로 인한 단백질끼리의 cross-link를 끊어 숨겨진 antigen 및 epitope를 드러내기 위해 10mM citric acid buffer를 이용한 antigen retrieval step을 진행하였다. 이는 buffer 에 슬라이드를 담그고 전자레인지로 5분간 끓이고 상온에서 약 30분간 식혀 두는 과정에 의해 수행되었다. 그런 다음, 세포 내에 존재하는 peroxidase를 제거하기 위하여 3% 과산화수소에 30분간 침지하였다. BSA로 blocking을 1시간 동안 하고 Bcl-2 및 Bax(Santa Cruz. USA)항체를 1:50의 비율로 각각 희석하여 4 ℃에서 하룻밤 동안 반응시키고 HRP가 결합된 2차 항체와 1시간 동안 반응시킨 후 ABC kit를 이용하고 DAB 기질 반응을 실시하였다. 일정 시간 발색이 진행되면 슬라이드를 봉입하고 현미경 사진을 200배율로 촬영하여 Image J 프로그램을 이용하여 intergral density를 측정하여 Bcl-2/Bax의 비유를 산출하여 발현정도를 비교하였다(도 4a 및 도 4b).
도 4a는 심근경색 동물모델에 경구투여시 탄제레틴의 세포자살 억제 효과를 Bcl-2/Bax의 면역염색화법으로 확인한 결과를 나타내고, 도 4b는 심근경색 동물모델에 경구투여시 탄제레틴의 Bcl-2/Bax 의 면역염색화법으로 확인 후 세포자살을 억제하는 효과를 정량화한 그래프이다.
도 4a 및 도 4b에서 보듯이, 아무것도 투여하지 않고 심근경색도 일으시키 않은 랫트(4마리, sham군, Sham)의 Bcl-2/Bax의 비율은 1.15이고, 시료를 투여하지 않고 심근경색을 일으킨 랫트(4 마리, 대조군, Control)의 Bcl-2/Bax의 비율은 0.84이며, 탄제레틴을 1 ㎎/㎏/day의 용량으로 투여한 랫트(3 마리, 실험군, Tangeretin)의 Bcl-2/Bax의 비율은 대조군과 유사한 0.76임을 확인하였다. 상기 결과는 평상시에는 Bcl-2 와 Bax의 양이 비슷하여 거의 동등한 수준을 유지하고 있다가 심근경색시에는 Bax의 수준이 증가하여 Bcl-2/Bax의 비율이 1보다 감소하는데, 탄제레틴을 처리하면 대조군과 유사하거나 상대적으로 낮은 수준을 나타냄을 의미하며, 이는 탄제레틴이 세포자살에 관여하는 경로가 적어도 미토콘드리아에 기인한 내인성 신호 경로는 아님을 시사하는 것으로 분석되었다.
이하에서는, 본 발명의 탄제레틴을 포함하는 약학조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
제제예 1: 산제의 제조
탄제레틴 300 mg
유당 100 mg
탈크 10 mg
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.
제제예 2: 정제의 제조
탄제레틴 50 mg
옥수수전분 100 mg
유당 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 mg
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
제제예 3: 캅셀제의 제조
탄제레틴 50 mg
옥수수전분 100 mg
유당 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 mg
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.
제제예 4: 주사제의 제조
탄제레틴 50 mg
주사용 멸균 증류수 적량
pH 조절제 적량
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2 ㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.
제제예 5: 액제의 제조
탄제레틴 100 mg
이성화당 10 g
만니톨 5 g
정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조하였다.
제제예 6: 건강 식품의 제조
탄제레틴 1000 ㎎
비타민 혼합물
비타민 A 아세테이트 70 ㎍
비타민 E 1.0 ㎎
비타민 B1 0.13 ㎎
비타민 B2 0.15 ㎎
비타민 B6 0.5 ㎎
비타민 B12 0.2 ㎍
비타민 C 10 ㎎
비오틴 10 ㎍
니코틴산아미드 1.7 ㎎
엽산 50 ㎍
판토텐산 칼슘 0.5 ㎎
무기질 혼합물
황산제1철 1.75 ㎎
산화아연 0.82 ㎎
탄산마그네슘 25.3 ㎎
제1인산칼륨 15 ㎎
제2인산칼슘 55 ㎎
구연산칼륨 90 ㎎
탄산칼슘 100 ㎎
염화마그네슘 24.8 ㎎
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 제제예 6으로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
제제예 7: 건강 음료의 제조
탄제레틴 1000 ㎎
구연산 1000 ㎎
올리고당 100 g
매실농축액 2 g
타우린 1 g
정제수를 가하여 전체 900 ㎖
통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85 ℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용하였다.
상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims (5)

  1. 탄제레틴을 포함하는 심근경색의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 탄제레틴은 심근조직의 세포자살을 억제하는 것인 조성물.
  3. 삭제
  4. 탄제레틴을 포함하는 심근경색의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 탄제레틴은 심근조직의 세포자살을 억제하는 것인 건강기능식품.
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KR20080081807A (ko) * 2005-06-28 2008-09-10 케이지케이 시너자이즈 인코포레이티드 심혈관 질환의 치료를 위한 폴리메톡시플라본 및토코트리에놀의 생체이용율을 개선시키기 위한 조성물

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