RO115498B1

RO115498B1 - Metoda de tratament a neoplasmului

Info

Publication number: RO115498B1
Application number: RO96-00889A
Authority: RO
Inventors: Douglas V Faller
Original assignee: Univ Boston
Priority date: 1993-10-29
Filing date: 1994-10-13
Publication date: 2000-03-30
Also published as: JP2007145865A; EP0731712A1; EP1736152A2; AU7976794A; EP1736152A3; JPH09507050A; EP0731712A4; US5858365A; JP3971454B2; CA2174737C; WO1995011699A1; CA2174737A1; US20090082444A1; AU696167B2

Description

Prezenta invenție se referă la o metodă de tratament a neoplasmului, utilizând compoziții care conțin compuși stabili din punct de vedere fiziologic ai acidului butiric, sărurile acidului butiric sau derivații acestuia, precum și combinațiile acestora. Aceste compoziții inițiază sau accelerează diferențierea celulelor neoplasmice și intensifică expresia de suprafață atât a antigenelor MHC, cât și antigenelor ne-MHC pe celulele transformate, ajutând identificarea și îndepărtarea lor de către sistemul imunitar. Suplimentar, aceleași compoziții reduc activitatea proteinelor asociată cu dezvoltarea fenomenului de rezistență multidrog, mărind în acest fel concentrațiile intracelulare și eficacitatea agenților chemoterapeutici convenționali.

Boala cea mai îngrijorătoare,în toată lumea, în momentul de față este cancerul. Termenul popular de cancer, a devenit pentru toate formele de neoplasm, incluzând carcinomul, leucemia, tumorile și practic toate formele de malignizare. Cancerele adevărate pot fi definite mai bine ca boli care posedă caracteristicile biologice ale neoplaziei maligne. Un neoplasm este o creștere relativ autonomă a țesutului, autonomă prin faptul că creșterea nu se face în conformitate cu “legile și regulile” care definesc creșterea celulelor individulale ale unui organism. Cu alte cuvinte, creșterea este într-un anume fel mărită. Un neoplasm poate fi benign sau malign. Neoplasmul benign indică creșterea celulară, care este într-un anumit fel limitată, adică celulele individuale nu sunt invazive și/sau puternic diferențiate, și prezintă puțin sau deloc anaplasia. Prin contrast, neoplasia malignă nu este încapsulată, adică este invazivă și sărac diferențiată, crește foarte rapid, este anaplastică la grade diferite și metastazează în alte zone ale corpului. In teorie, diferite neoplasme benigne pot reprezenta forme premature ale unei malignizări sau cel puțin o etapă în procesul care duce la malignizare.

Orice țesut al unui corp multicelular, care este capabil de o diviziune celulară, este capabil să devină canceros. Celulele canceroase sau neoplasmice acționează într-o mare măsură ca și celulele normale, în sensul că acestea se divid, se multiplică, au proces nutritiv, execută funcțiile caracteristice ale originei lor ne-neoplasmice și totodată mor. Neoplasia afectează sănătatea, în sensul că îndeplinirea proceselor la un nivel ridicat afectează funcționarea normală a corpului. De exemplu, celulele neoplasmice vătămează și/sau distrug organele și țesuturile din vecinătate. Țesutul sănătos poate fi întrecut ca spațiu și/sau ca asigurare a hranei de către neoplasm sau de către celulele neoplasmice care au metastazat regiunile apropiate ale corpului. Neoplasmele pot avea, de asemenea, consecințe mai sistemiceîn sensul că afectează reglarea țesuturilor specifice cum ar fi de exemplu cele ale sistemului imunitar.

Tratamentul de bază al bolilor neoplasmice a rămas, în mod surprinzător, consistent. Pentru tumorile limitate, cum ar fi de exemplu hiperplazia benignă se sugerează adesea intervenția chirurgicală pentru îndepărtarea țesutului bolnav. Această rezolvare este preferabilă în general pentru persoanele care sunt sănătoase. In situația când pacientul nu se consideră capabil de a suporta o intervenție chirurgicală și/sau când neoplasmul nu este limitat la un singur organ sau zonă, de exemplu s-a ajuns la faza de metastază, singura scăpare este terapia cu medicamente sau terapia cu radiații. Ideea de principiu, care stă la baza acestor terapii, este faptul că toate formele de neoplasm implică un anumit grad de proliferare celulară crescută. Terapia cu radiații sau chemoterapia, sunt aplicate cu mare succes, deoarece omoară în mod simplu și indiscriminatoriu celulele care se multiplică. Problema este că nu toate celulele care se multiplică sunt neoplasmice. Majoritatea celulelor se multiplică până la un anumit grad,

RO 115498 Bl iar variațiile în ceea ce privește viteza de creștere în întregul corp sunt enorme. Celulele neoplasmice, cu toate că se divid relativ rapid, în mod obișnuit cad undeva în interiorul acestui domeniu. De aceea, cu toate că fiecare dintre aceste terapii a fost încununată de succes, în anumite împrejurări ele nu reprezintă o vindecare a bolii. 50

O teorie comună, în ceea ce privește biologia cancerului este aceea că acesta reprezintă o împiedicare în dezvoltarea celulelor. Este știut că celulele canceroase rămân într-un stadiu relativ imatur și continuă să fie capabile de creștere și reproducere în întreaga lor viață. Prin contrast, o celulă normală se va maturiza complet, de exemplu într-o celulă funcțională a intestinelor, celulă sanguină sau celulă pulmonară, care nu ar 55 fi capabile de o ulterioară proliferare. Procesul normal este numit diferențiere, și o celulă canceroasă ar putea fi de exemplu, o celulă care nu s-a diferențiat complet, foarte posibil ca fiind drept rezultat al activării oncogene. Teoretic, toți agenții care pot forța celula canceroasă să-și completeze diferențierea o vor face incapabilă pentru o creștere ulterioară și lezarea pacientului. Pe de altă parte, agenții care pot forța diferențierea 60 celulelor de leucemie “ in vitro”, cum ar fi citozina, arabinozida și acidul retinoic, au fost utilizate recent cu o bună eficiență în ceea ce privește modificarea celulelor de leucemie în celule normale, în această situație celulele arătând mature și deci s-a încetinit evoluția bolii. Diesterul forbal 12-o-tetradecanoil-forbal 13-acetat (TPA), s-a dovedit a fi un inductor eficient al diferențierii celulelor T în leucemia limfoblastică acută și a diferențierii 65 celulelor B în leucemia limfocitică cronică. Un promotor al tumorii care există pe cale naturală, teleocidina B sau un alcaliod indolic izolat din miceliul de Streptomyces, a fost găsit că are efecte similare asupra fibroblastelor. Din păcate, se ridică un număr de probleme în ceea ce privește natura toxică a acestor inductori, în sensul că dozele necesare sunt mari precum și eventualele efecte secundare nedorite și care sunt 70 periculoase au compromis utilizarea acestora. Așa cum se cunoaște din literatura de specialitate, la oameni s-a administrat un inductor de diferențiere, ca o terapie împotriva diferitelor forme de cancer. Astfel, preparate brute de acid butiric și butirat de guanină (kieselgur și cretă) au fost utilizate pentru a trata pacienții care sufereau de carcinom al colului uterin, cancer rectal, cancer al stomacului sau papilloma ovarelor. In fiecare 75 caz tratat, rezultatele definitive au fost nedeterminabile. Tratamentul în sine, a constat în tratarea rănilor prin pansare, după intervenția chirurgicală, utilizând capsule de gelatină care conțin aceste substanțe sau prin simpla lor aplicare locală. Totuși, în fiecare caz, aplicațiile au fost însoțite cu intervenția chirurgicală, uneori cu terapia cu radiații, fiecare dintre ele având un efect substanțial asupra tumorilor canceroase. 8o Luând în considerare terapia combinată, substanțele totuși nu au avut un efect benefic. In plus, nu au existat informații că se utilizează în anumite doze și nivele care se realizează in vivo, care în mod normal sunt necesare pentru orice determinare a eficacității. Unele efecte pozitive care au fost observate, se pot atribui mai degrabă abilității acidului butiric de a cauteriza țesutul care este în suferință, decât orice efect 85 asupra malignității. Prin urmare, este imposibil să se determine că acidul butiric joacă un anumit rol, și în realitare rezultatul ar sugera că el nu a avut nici un efect pozitiv în cursul tratamentului aplicat.

Mai recent, s-a dovedit că preparatele care conțin acid butiric, ar reprima in vitro transformarea neoplasmică a celulelor de hamster Syrian, așa cum s-a arătat în 90 literatura de specialitate. Aceste studii au demonstrat că morfologia aberantă, creșterea

RO 115498 Bl independentă de ancorare și activitatea proteolitică sporită, ceea ce se corelează cu abilitatea de a produce tumori, acestea toate au fost reprimate după tratamentul cu acid butiric. Totuși, utilizarea acidului butiric ca agent anti-cancer nu s-a practicat în mod curent în clinicile de specialitate. Este știut că acidul butiric este fiziologic nestabil. El are timpul de înjumătățire al serului foarte scurt, fiind de aproximativ două minute, și ceea ce este mai important, orice efect biologic reclamă o prezență detectabilă. Cu alte cuvinte, terminarea tratamentului trebuie să conducă la un efect bilogic observabil, ceea ce face ca aplicarea lui practică să fie justificată.

Butiratul de sodiu, este o formă relativ netoxică a acidului butiric, dar are același timp de înjumătățire al serului și același efect specific, și s-a dovedit că forțează diferențierea in vitro a celulelor umane de eritroleucemie, a celulelor de leucemie mielogenă cronică, a celulelor de cancer intestinal, celulelor adenocarcinomului salivar, celulelor adenocarcinomului pancreatic, celulelor melanomei, celulelor adenocarcinomului ovarian, celulelor carcinomului tiroidic medular, celulelor limfoma Burkitt, celulelor astrocitomei și celulelor neuroblaste, așa cum este descris în literatura de specialitate. Diferențierea este legată de expresia sau represia unui număr de gene diferite și a unui număr de activități biologice diferite. S-a dovedit că butiratul de sodiu poate cauza o creștere în activitatea unui număr de enzime mamare, în cultura de țesuturi incluzând tirosina hidroxilată, acetilcolintransferază, aceticolinesterază, adenilatciclază în celulele NB, adenozinchinaza și deaminaza, guanosin și adenosinmonofosfatchinaza, adenin și hipoxantin fosforibosiltransferază în celulele carcinomului de colon uman, și sialiltransferaza în celulele heLa. Alternativ, alte enzime sunt inhibate de butirat de sodiu. Enzimele a căror activitate este inhibată, includ tirosin transaminază în celulele hepatoma, hexochinază și glucochinază în celulele ficatului normal, și lactat de dehidrogenază și piruvatchinază în celulele neuroblaste. De asemenea, alte proprietăți ale butiratului de sodiu, care au fost demonstrate in vitro includ stimularea sintezei glangliosid GM1, inducerea expresiei receptorilor faeta-adrenergici și a receptorilor coleratoxin pe celulele heLa, o producție crescută de gonadotropină, și o sinteză crescută a prostaglandinei. Cu toate că mecanismul, prin care butiratul de sodiu forțează diferențierea tumorilor și împiedică creșterea, nu este înțeles pe deplin, totuși butiratul de sodiu duce la creșterea nivelelor intracelulare a cAMP, inhibă histon acetilarea și inhibă metilarea ADN genomic. In multe cazuri, această diferențiere este însoțită de reglarea în jos a oncogenelor activate din tumori, dar trebuie stabilită o relație între cauza specifică singulară și efectul produs. Multe studii, care au utilizat acid butiric, au fost efectuate pe celule hL-60 linie celulară umană derivată din leucemie și o linie progenitor mieloidă care este frecvent utilizată. Aceste celule se diferențiază rapid în prezența a aproximativ 0,5 mM de acid butiric, și sunt studiate pentru a studia diferențierea reglată a granulocitelor și a metabolismului celular, date care au fost arătate în literatura de specialitate. Este un lucru cunoscut că, celulele tratate au arătat schimbări fenotipice, cum ar fi acumularea de numeroase granule și condensarea nucleelor. In plus, transcripția genei myb este în mod remarcabil scăzută în celulele granulocite hL-60. Butiratul de sodiu precum și acidul retinoic și alte retinoide, anumite lectine din plante, esteri forbali și citozin arabinoze, cu toate că sunt aparent eficiente in vitro, nu au avut succes sau nu au dezvoltat posibilitățile de utilizare a lor in vivo, având în vedere un număr de motive. Cantități foarte mari de substanțe, au fost necesare pentru a produce un anumit efect neînsemnat. Aceste nivele sunt greu de atins

RO 115498 Bl in vivo, sau ar fi cu efecte toxice și alte efecte secundare. In plus, cu toate că anumiți agenți, cum ar fi acidul butiric, sunt foarte bine tolerați ei înșiși, sărurile lor de sodiu nu sunt tolerate. Sunt necesare cantități mari de săruri, pentru o vătămare majoră a organului respectiv, așa cum rezultă din studiile făcute pe animale, care să fie atribuite încărcării cu sodiu.

Studii recente au indicat că acțiunea inductorilor diferențierii poate fi întrucâtva definită. Dimetilsulfoxidul (DMSO) sau tratamentele cu hipoxantin a celulelor de leucemie Friend, s-a dovedit a stimula diferențierea și a regla în jos expresia c-myc, așa cum rezultă din sutdiile făcute în domeniul de specialitate. Utilizarea c-myc produsă recombinat pentru a inhiba reducerea nivelelor de c-myc, diferențierea acestor celule a fost complet sau parțial inhibată, indicând că cel puțin un control parțial al diferențierii poate fi stabilit în expresia anumitor oncogene. In plus, așa cum s-a determinat de specialiști, butiratul afectează expresia unui număr de gene celulare. Acidul butiric poate stimula doar indirect diferențierea prin reglarea în jos sau în sus a expresiei enzimelor celulare, care reprezintă un control direct. întrucât există numeroase speculații, un mecanism definitiv al acțiunii nu a fost încă determinat.

Modalitățile recente pentru tratamentul cancerului, au fost până înprezent limitate la intervențiile chirurgicale, radioterapia sau chemoterapia, fiecare dintre acestea nefiind specifice. Sunt, deci necesare și alte demersuri mai recente care să acționeze direct asupra celulei tumorale. Sistemul celular imunitar, cu abilitatea sa remarcabilă de a discrimina celulele tumorale de celulele normale, este în mod ideal de potrivit pentru o aplicare terapeutică. Există o evidență numeroasă, care arată că sistemul imunitar celular permite animalelor imuno-componente să respingă tumorile transplantate sau virușii tumorali care au fost inoculați. înțelegerea, în ceea ce privește mecanismul imunitar cerut, este limitată de manipularea direcționată a răspunsului imunitar la tumori prin administrarea vaccinurilor de cancer sau a limfochinelor este sezabilă. Totuși, multe tumori pot ușor evita protecția imuno-celulară. Un mecanism major, prin care celulele tumorale pot scăpa de supraveghere de către sistemul imunitar celular în animalul-gazdă, este mecanismul prin alterarea expresiei antigen a MHCfMajor histocompatibility Compex). Reglarea în jos a expresiei MHC este extrem de obișnuită în tumorile din intestine, neuroblastoma și tumorile pulmonare ale celulei mici. Aceste tumori exprimă în general o formă mutabilă a unei oncogene care s-a dovedit a regla în jos expresia MHC. Reglarea, în jos, cu toate că este un termen utilizat în general, ar putea să nu fie corect. Tumorile celulare ar putea să nu fie capabile să exprime antigenele MHC, precum și părțile lor normale, mature datorită stării lor imature, nediferențiate.

Brațul efector al sistemului imunitar celular compus din celulele citotoxice T (CTL) și celulele ucigașe naturale (NK), joacă un rol pivot în eliminarea din corp a tumorilor. Abilitatea de a genera un răspuns CTL, față de o tumoare, este legată în mod clar de abilitatea unui animal de a respinge această tumoară. CTL este îndreptat împotriva tumorilor, este MHC limitat la norma antigen sau la fragmente antigen. Norma antigen trebuie să fie recunoscută pe suprafața celulelor tumorale în asociere cu antigenele MHC identice, sau singeneice, față de cele găsite pe CTL însăși. Antigenel hLA și h-2 sunt glicoproteine de suprafață celulară care au codul complexelor de gene MHC umane și murine. Această cerință pentru antigen singeneic MHC Clasa I, în asociere cu un antigen tumoral sau viral, este cunoscută ca restricție duală.

140

145

150

155

160

165

170

175

180

RO 115498 Bl

Expresia MHC este, de asemenea, în mod probabil un regulator al recunoașterii tumorii de către brațul ucigaș natural al sistemului imunitar celular, cu toate că rolul lui exact este subiectul unor mari dezbateri. Datorită rolului lor important, ca elemente restrictive pentru recunoașterea celulei CTL-țintă, antigenele MHC Clasa I au fost supuse unor analize biochimice extensive. Aceste antigene, cu referire la hLA-A, -B și -C la oameni și h-2K, D și L la șoareci, sunt glicoproteine celulare de suprafață, fiecare cuprinzând un lanț polimorfic și un lanț nepolimorfic ușor, legat ne-covalent care este denumit beta-microglubulin.

Specificitatea duală remarcabilă pe partea CTL pentru identitate (MHC singeneic) plus antigen tumoral, o face potrivită în mod ideal pentru a identifica și elimina celulele transformate dintr-un animal. Reglarea aberantă a expresiei MHC este, totuși, o apariție frecventă în tumorile umane, permițând celulelor tumorale de a se sustrage supravegherii imune celulare prin eliminarea unuia din aceste două elemente esențiale de recunoaștere. Modificări majore în expresia celulară MHC, induse de expresia oncogenelor și virușilor tumorali, au arătat că aceste alterații rezultă în rezistența semnificativă biologic față de citotoxicitatea imună celulară.

Recunoașterea antigenelor tumorale cu viruși induși de către sistemul imun celular a fost examinată în mod extensiv, așa cum se cunoaște din literatura de specialitate. CTL îndreptat împotriva antigenelor tumorale cu virus sarcoma indus, sunt limitate la Clasa I. Recunoașterea antigenelor de normă tumorală trebuie să fie în asociere cu produsele de gene MHC singeneice adecvate. In mod semnificativ, tumorile induse de acești viruși, controlează recunoașterea imunității lor proprii prin reglarea directă a expresiei MHC Clasa I a celulelor infectate, fenomen cunoscut, de asemenea din literatura de specialitate. Experimente recente au arătat că în multe celule tumorale, incluzând celulele transformate oncogen, nivelul expresiei protein MHC este reglat în jos atât de dramatic de către virusul tumoral de infecție încât antigenele nu pot fi recunoscute de CTL, care reclamă atât antigene MHC singeneice cât și antigene virale pe suprafața celulei pentru recunoaștere sau de liniile CTL. Nivelul lizei mediate de CTL a celulelor tumorale, atât cele limitate de MHC cât și virusul specific CTL și cele îndreptate împotriva determinanților MHC alogeneici, este direct influențat de nivelul expresiei antigenei MHC Clasa I pe suprafața celulelor tumorale, făcându-se încă odată capabile să fie recunoscute și distruse de sistemul imunitar al animalelor.

Linia de celule K 562 de eritroleucemie umană, care exprimă puțin sau deloc MHC Clasa I, nu este recunoscută de limfocitele T citotoxice umane. Prin inducerea expresiei antigenelor MHC Clasa I pe aceste celule tumorale folosind interferon, virus, butirat de sodiu sau transfecția, expresia de suprafață nouă a antigenelor specifice MHC Clasa I în K 562 a conferit pe aceste celule tumorale o susceptibilitate atât pentru recunoașterea imună tumorală cât și pentru recunoașterea imună celulară, așa cum este descris și în literatura de specialitate. Aceasta demonstrează importanța represiei antigenelor MHC endogene în raport cu avantajul supraviețuirii selective a unor asemenea tumori.

Suplimentar față de MHC Clasa I, alte antigene sunt de asemenea îndreptate asupra expresiei lor crescute în prezența acidului butiric. Datele din literatura de specialitate demonstrează că acidul butiric orientează sinteza gamei-globulinei în celula seceră și eritrocitele fetale thalasemice. Alte antigene orientate de acidul butiric, care sunt în mod normal prezente pe suprafața celulelor mature, sunt de multe ori lipsă din

RO 115498 Bl

230 celulele tumorale. Unele dintre acestea, ca receptorul IL-2, receptorul EGF sau antigena CEA, au fost în mod curent studiate pentru utilizare ca fiind drept ținte pentru imunoterapia cancerului. De exemplu, anticorpii monoclonali cuplați la toxina difterică și orientați împotriva IL-2R sau EGF-R au fost descoperiți, și în momentul de față sunt testați. Nivelul expresiei IL-2R arată dacă tumorile sunt susceptibile la aceste terapii de imunotoxină. Celulele care nu exprimă IL-2R sunt rezistente. Un vaccin și un anticorp toxic împotriva CEA a fost de asemenea descoperit, și este supus investigațiilor.

Receptorul IL-2 (IL-2R) și ligandul său sunt instrumente utilizate pentru abordarea bioterapeutică a unui număr de malignizări hematopoietice. IL-2R a fost prima dată identificată ca fiind o peptidă de suprafață 55kd, p55, la care este legat anticorpul monoclonal anti-Tac (“antiactivarea celulelor T”). Mai târziu, au fost identificate peptidă 75 kd și 64 kd, în complexul funcțional IL-2R și s-a demonstrat că sunt componente de mare afinitate IL-2R.

Analiza funcțională cea mai recentă a IL-2R a relevat faptul că receptorul există în trei izoforme diferite: de mare afinitate pentru IL-2R (constanta de disociere K_d de 10' ¹¹ M); de afinitate intermediară (Kd de 1CT⁹ M) și de mică afinitate (Kd de 1CT⁸ M). Receptorii de afinitate scăzută constau din p55 singur și sunt ineficienți în transducția cu semnal mediatizat IL-2R datorită absenței internalizării ligandului legat. Receptorii de mare afinitate sunt heterotrimeri (p55, p75, p64] capabili de internalizare eficientă a ligandului. Receptorii de afinitate intermediară pot consta din heterodimeri p55/p75 sau p55/p64. Primii sunt capabili de legare, dar neinternalizând ligandul, indică prin aceasta că componentul p64 este esențial pentru internalizarea mediată de receptor a IL-2.

Receptorii de mare afinitate sunt detectați prin analiza Scatchard utilizând l¹²⁵-IL-2 pe hTLV-1 celule asociate adulte T cu celule de leucemie, iar în unele leucemii limfocitice cronice leucolimfoblastice acute, și celule cutanate T cu limfoma celule, datorită capacității de internalizare a IL-2R de mare afinitate pentru ligandul său, conceptul de factor de creștere a legăturii receptor-ligand a fost dezvăluit ca punct de intrare pentru furnizarea de toxine intercelulare. O toxină de fuziune orientată IL-2R a fost construită genetic și constă din fuziunea domeniilor de translocare a membranei și inhibarea sintezei proteinei ale genei toxin-difterice într-o genă IL de lungime completă care produce proteină recombinată DAB 486 IL-2 capabilă să țintească în mod selectiv și să ucidă celulele purtătoare IL-2R de mare afinitate. Atunci când sunt prezentați receptorii IL-2 celulelor cu mare afinitate, proteina recombinată este supusă unei legări IL-2R specifice și internalizării prin intermediul endocitozei mediate de receptor. Procesul decurge în interiorul endosomului acidic, iar fragmentul A al toxinei trece în citosol, unde inhibă sinteza proteinei prin ribosilarea-ADP a factorului -2 de elongație, finalul constând în moartea celulei. Efectele toxinei pot fi blocate cu exces de IL-2, cu exces de anticorpi la IL-2R sau cu clorochină care previn acidificarea endosomală.

□ a doua generație de toxine de fuziune IL-2, referindu-se la unele ca DAB389-IL-2 a fost creată, în care aminoacizii 97 carboxi-terminali ai DAB486 sunt eliminați, rezultând o proteină mai scurtă cu o mare afinitate pentru IL-2R.

Bazat pe experimentele de ucidere a toxinei a liniilor celulare stabilite, folosind atât DAB486-IL-2 cât și DAB389-IL-2, celulele neoplasmice de la pacienți cu receptori de mare afinitate sunt în mod uniform intoxicate (concentrația ₅₀ inhibitoare minimă sau MIC₅₀ mai mic de 2,5x10'¹⁰ M), întrucât acele celule tumorale fără receptori cu mare afinitate IL-2 nu sunt afectate. Studiile anterioare implicând tratamentul celulelor negative

235

240

245

250

255

260

265

270

RO 115498 Bl

IL-2 care sunt insenzitive la toxine cu agenți de inducere au demonstrat în cazul PHA (fitohemaglutin; 10 pg/ml) și briostatin (1 χ 1D⁷ M), că inducerea de IL-2R, măsurată de anticorpi TAC, este asociată de intoxicarea de către toxine de fuziune la MIC₅₀ similară cu cea raportată pentru celulele ATL sensitive la toxine. Studiile clinice, care au utilizat aceste toxine, au fost efectuate și s-au raportat răspunsuri semnificative din punct de vedere clinic la 44% la pacienții cu limfoma celulei T cutanate, 28% din cei cu grad scăzut și grad intermediar de limfoma non-Hodkin și 15% din cei cu maladia hodkin refractară. Toți pacienții cu răspuns au avut tumori cu expresia receptor IL-2 așa cum este măsurată de colorarea CD25(TAC).

întrucât peptidă p55(TAC] este epxrimată în multe malignizări hematopoietice diferite, puțin alte decât hTLV-1 celule adulte T asociate cu celule de leucemie exprimă în mod uniform izoforma receptorului de mare afinitate. întrucât toxina de fuziune de țintă IL-2R este specific citotoxică numai pentru celule exprimând afinitatea mare IL-2R, potențialul ei terapeutic este limitat la aceste maladii în care se găsește izoforma de receptor de mare afinitate. Ar fi deosebit de util a se extinde potențialul terapeutic al toxinei de fuziune cu receptor țintă IL-2 din proteine, prin dezvoltarea inductorilor din punct de vedere fiziologic a IL-2R de mare afinitate pentru a converti tumorile care nu exprimă sau exprimă slab față de IL-2R într-o stare senzitivă la toxine, pozitivă la afinitatea mare IL-2R.

Glicoproteina-P (Pgp) codificată de gena mdr-1, este proteina responsabilă pentru cea mai mare parte a rezistenței multi-drog (multi-medicamentoase) față de agenți chemoterapeutici din tumori. Aceste molecule par să funcționeze ca o pompă în membrana celulei, care pompează printre alte substanțe și anumiți agenți chemoterapeutici în afara celulei, coborând concentrația lor intracelulară și limitând activitatea lor.

Tratamentul liniei de celule SW620 care sunt rezistente multi-drog cu expresia Pgp cu butirat de sodiu a condus la interferența activă cu funcția Pgp. După tratamentul cu butirat de sodiu în celulele carcinomului de colon uman SW620, acumularea intracelulară a agenților chemoterapeutici vinblastin, adriamicin și actinomicin D a crescut de zece ori. Butiratul de sodiu, prin creșterea nivelelor Pgp, a inhibat fosforilarea Pgp și a blocat funcția aceste proteine care este rezistentă la medicamente.

O stare cunoscută drept colită de diversiune apare frecvent în segmentele colorectu-lui, după o abatere prin intervenție chirurgicală a tractului fecal. El persistă în mod nedefinit până când segmentul exclus este reanastomozat. Maladia este caracterizată prin sângerarea mucoasei cronic inflamate care imită sângerarea în maladia inflamatorie idiopatică a intestinelor, și ea poate culmina prin formarea structurii. Ea poate reprezenta o stare inflamatoare, rezultând din deficiențe de nutriție în lumenul epiteliului colonului și, posibil, poate fi tratată eficient folosind acizi grași cu lanț scurt, reprezentând nutrienți, care lipsesc. Acest lucru este reprezentat în datele din literatura de specialitate din domeniu.

Acidul butiric intra-rectal produce o colită consistentă și reproductibilă la șoareci.

Severitatea răspunsului observat a fost proporțională cu concentrația acidului butiric utilizat. Acțiunea colitogenică a acidului butiric nu poate fi reprodusă numai de un pH scăzut, sau de prezența anionului butirat la pH neutru sau alcalin. Totuși, la concentrații mai scăzute, acidul butiric poate avea unele efecte benefice. Compoziții care conțin 80 mM acetat, 30 mM butirat au fost utilizate, de două ori pe zi, pentru irigații locale.

RO 115498 Bl

325

Compozițiile acestea folosite au arătat îmbunătățiri la nouă dintre zece pacienți cu colită distil. Studiul efectuat pe alți zece pacienți, la care s-au făcut irigații cu acizi grași cu lanț scurt, a arătat din nouă o ameliorare a inflamării în diversele colite la pacienții care nu au prezentat un răspuns față de alte forme tradiționale de tratament. Gradul histologic al inflamării a scăzut, a încetat sângerarea iar fisurile endoscopice au lipsit. Pe placebo, toți acești parametri au rămas neschimbați.

Se cunoaște tratamentul unor afecțiuni maligne și virale, prin creșterea imunității cu suport celular utilizând compoziții medicamentoase ce conțin butirat de sodiu, pirimidină, cu sau fără asociere de indometacin, retinamida, tocoferol, acid salicilic, care sunt condiționate sub formă de pulbere, soluție sau unguent.

Se mai cunoaște, de asemenea, tratarea în scop terapeutic și profilactic, la șoareci, prin utilizarea de Corynebacterium paryum, interferon și butirat de arginină.

Metoda de tratament a neoplasmului care utilizează derivați de acid butiric, constă în aceea că se administrează unui pacient o cantitate de 5OO ... 2000 mg de un derivat stabil de acid butiric care are mai puțin de 8 atomi de carbon și o stabilitate mai mare de 4 h, cum ar fi butirat de arginină sau izobutiramidă, pe o perioadă de 14 zile, într-un purtător acceptabil din punct de vedere farmaceutic care să nu conțină în mod substanțial sodiu, și suplimentar, se administrează substanțe chemoterapeutice. Purtătorul acceptabil din punct de vedere farmaceutic este selectat dintr-un grup constând din apă, etanol, ser fiziologic, glicerină, polizaharide și ulei. Administrarea se face parenteral, sublingual, rectal, enteral, prin absorbție pulmonară sau aplicație topică; iar administrarea perenterală se efectuează prin injecții intravenoase, injecții subcutanate, injecții intramusculare, injecții intraarteriale, injecții intratraheale, injecții intraperitoneale sau injecții directe pe locul neoplasmului. Efectul biologic constă în ameliorarea simptomelor, reducerea dimensiunilor, reducerea volumului și numărul celulelor neoplasmice, inducerea diferențierii sau o modificare în expresia genei. Expresia modificată a genei codifică o proteină rezitentă la multi-medicamente, un receptor interleukin, un receptor al factorului de creștere, un antigen specific-tumoral sau un antigen de histocompatibilitate majoră. Inducerea diferențierii celulelor neoplasmice se face prin reducerea în ceea ce privește dimensiunile sau volumul neoplasmului, creșterea sau descreșterea expresiei unei histocompatibilități majore sau a diferenței antigenului, replica ADN scăzută sau diviziunea celulară coborâtă. Antigenul de diferențiere este selectat dintr-un grup constând din receptori ai factorului de creștere, receptori ai interleukinei sau a altor citochine și antigeni ai histocompatibilității majore, de exemplu cum ar fi receptorul interleukin-2 și receptorul factorului de creștere epidermal. Se induce expresia unui antigen a celulei neoplazice care este selectată dintr-un grup constând din antigeni specifici tumorali, proteine rezistente la multi-medicamente, receptori de suprafață celulari și antigeni de histocompatibilitate majoră. Receptorul de suprafață celular este un receptor interleukin-2 sau un receptor al factorului de creștere epidermal. Agentul chemoterapeutic este selectat dintr-un grup constând din agenți de achilare, analogi ai purinei și pirimidinei, alcaloizi vinca, antibiotice, corticosteroide, nitrozuree, antimetaboliți, medicamente citotoxice bazate pe platin, antagoniști hormonali, anti-androgeni și anti-estrogeni. Antibioticul este un agent antibacterial, antifungic sau antiviral. Agentul chemoterapeutic este selectat dintr-un grup constând din tamoxifen, doxorubicin, L-asparaginaza, dacarbazin, amsacrin, procarbazine, hexametilmelamine și mitoxantrone. Tulburare neoplazică este selectată dintr-un grup

330

335

340

345

350

355

360

365

RO 115498 Bl constând din leucemii, limfoame, sarcom, carcinom, tumori ale celulei neurale, carcinom al celulei scuamoase, tumori ale celulei embrionare, tumori nediferențiate, seminom, melanom, neuroblast, neoplasme metastazice ale tumorilor celulei mixte, neoplasme datorate infecțiilor patogenice și ale malignizării.

Avantajul invenției constă în aceea că prezintă o nouă metodă pentru profilaxia și tratamentul maladiilor neoplazice și a altor boli și tulburări generate de neoplasm.

Astfel, un aspect al prezentei invenții este orientat către compoziții ce conțin compuși stabili din punct de vedere fiziologic și acestea cuprind acid butiric sub formă de săruri, derivați ai acidulu butiric și combinații ale acestora. Derivații acidulu butiric sunt compuși bazați pe o porțiune a miezului de acid butiric și includ analogi ai acidului butiric, homologi și homologi adiacenți următori precum și compuși bazați pe oricare dintre cei amintiți mai înainte. Aceste compoziții sunt utile pentru tratamentul tulburărilor neoplasmice umane cum ar fi leucemia, limfomul, sarcomul, tumorile celulei neurale, carcinoamele, seminomul, melanomul, neuroblastomul, tumorile celulei mixte, tumorile celulei germ, tumorile nediferențiate, neoplasia metastazică, neoplasia datorată infecției și alte malignizări.

Un alt aspect al invenției este orientat spre metodele de inducere a diferențierii celulelor neoplasmice la pacienți, prin administrarea compozițiilor medicamentoase. Celulele diferențiate au viteze de creștere scăzute, nu metastazează și eventual mor eliminând în acest mod neoplasmul. Compozițiile medicamentoase pot fi administrate sistemic sau local pentru a produce efectul dorit.

Metoda, conform invenției, este orientată pentru prevenirea dezvoltării stării neoplazice. Compozițiile medicamentoase se pot administra pacienților care sunt predispuși genetic sau celor care au fost expuși unor evenimente care măresc posibilitatea dezvoltării unui neoplasm. De asemenea, metoda conform invenției, este orientată către metodele de intensificare a expresiei moleculelor imuno-reactive MHC asupra celulelor neoplasmice. Celulele exprimând antigene MHC întărite sunt mai bine identificate și recunoscute de către sistemul imunitar al gazdei și eliminate în mod eficient. Expresia întărită a acestor antigene depășește o cale majoră, prin care celulele neoplasmice scapă de sub supravegherea sistemului imunitar.

Metoda conform invenției este orientată și către inducerea expresiei antigenelor non-MHC a celulelor de suprafață cum ar fi antigenele specifice tumorilor și antigenelor receptori incluzând receptorul interleukin-2 pe celulele neoplasmice care permite o țintire selectivă a celulelor bolnave prin tehnici convenționale de ucidere a celulei, și intensifică abilitatea sistemului imunitar al gazdei în vederea îndepărtării celulelor bolnave din corp.

Un alt aspect al invenției, este orientat către utilizarea compozițiilor medicamentoase pentru inhibarea procesului de rezistență anti-medicamentoasă care apare adeseori în tratamentul tulburărilor neoplasmice folosind chimoterapii convenționale. Compozițiile farmaceutice acționează pentru blocarea mecanismului prin care agenții chemoterapeutici sunt pompați în afara celulelor individuale, permițând o creștere a acumulărilor și o mai mare eficiență.

Metoda conform invenției este orientată și către compoziții farmaceutice și metode cuprinzând compuși stabili din punct de vedere fiziologic, și în același timp siguri, ai sărurilor acidului butiric și derivaților, sau combinații ale acestora care sunt utile în vindecarea rănilor. Acești compuși și compzițiile respective stimulează diferențierea celulară, regenerarea țesutului și, posibil, angiogeneza în jurul zonelor țesutului afectat.

RO 115498 Bl încă un alt aspect al prezentei invenții, este orientat către compoziții farmaceutice și metode conținând compuși, pentru tratamentul sau prevenirea tulburărilor gastrointestinale incluzând colitele, colite ulceroase, boli inflamatoare ale intestinelor și maladia Crohn.

Un alt obiect al invenției este orientat către diagnosticarea grupelor și metodelor, pentru utilizarea acestora în vederea caracterizării potențialului carcinogenic și malignizant a celulelor transformate a pacientului.

Așa cum este realizată și descrisă pe larg, prezenta invenție cuprinde compuși, compoziții și ansamble de diagnostic conținând compuși stabili din punct de vedere fiziologic ai acidului butiric, sărurile acidului butiric sau derivaților acidului butiric sau combinațiilor acestora. Invenția de față cuprinde, de asemenea, metode pentru utilizarea acestor compuși pentru profilaxia și/sau tratamentul tulburărilor neoplasmice și gastrointestinale la pacienți, precum și pentru utilizarea legată de vindecarea rănilor și diagnoza celulelor carcinogene sau a potențialului de malignizare a celulelor transformate. Deci, un mod de realizare a prezentei invenții este orientat către compoziții conținând compuși stabili din punct de vedere fiziologic, și în același timp siguri ai acidului butiric, sărurilor acidului butiric, derivaților acidulu butiric și combinațiilor acestora. Derivații cuprind compuși care se bazează pe o porțiune a miezului acidului butiric și include analogi, homologi, inclusiv homologi adiacenți următori, precum și compuși bazați pe oricare din cele de mai sus. Formele stabile din punct de vedere fiziologic ale acestor compuși nu se descompun sau nu devin ineficiente într-o formă oarecare, după introducerea lor la un pacient înainte de a prezenta efectul dorit. Compușii siguri sunt compușii care nu sunt toxici la dozele utilizate, nu provoacă reacții adverse sau efecte secundare și sunt bine tolerați de organism.

Acidul butiric, denumit de asemenea și acid butanoic, este un acid gras cu patru atomi de carbon. Stabilitatea sa fiziologică poate fi măsurată cu ajutorul unui număr de parametri, cum ar fi timpul de înjumătățire al compusului sau a produselor metabolice ce derivă de la compusul respectiv sau prin durata efectelor observate la pacient. De exemplu, butiratul de sodiu, sarea de sodiu a acidului butiric, are o stabilitate fiziologică efectivă, așa cum este ea măsurată cu ajutorul timpului de înjumătățire a serului, de aproximativ două minute. Acesta este prea scurt pentru a fi practicabil din punct de vedere farmaceutic. Acidul butiric, sărurile acidulu butiric și derivații ai acidului butiric stabile din punct de vedere fiziologic prezintă in vivo un timp de înjumătățire mai mare de cincisprezece minute, preferabil mai mare de o oră, mai preferabil mai mare de două h și chiar și mai preferabil mai mare de patru h. Cu toate că un compus este stabil folosind acest criteriu, stabilitatea sa din punct de vedere fiziologic poate fi de asemenea măsurată prin observarea efectelor (a duratei acestor efecte], măsurată din punct de vedere biologic, cum ar fi ameliorarea simptomelor pacientului, reducerea în ceea ce privește dimensiunile, volumul sau numărul de celule neoplasmice sau alterarea privind expresia genei. Simpomele pot include dureri, oboseală, sângerare, scăderea greutății, transpirație în timpul nopții, emesis, schimbări în deprinderile intestinale, inflamații sau dezorientări mentale. Genele a căror expresie poate fi alterată includ genele receptor cum ar fi receptorul interleukin-2 și receptorul factorului de creștere epidermal, precum și genele care codifică enzime, factori de transcripție și replicare, proteine rezistente la multi-medicamente cum ar fi complexul de proteină Pgp, antigene specific tumorale sau

415

420

425

430

435

440

445

450

455

RO 115498 Bl antigene MHC. Este preferabil ca stabilitatea compușilor din prezenta invenție să fie determinată ca un timp de înjumătățire in vivo mai mare decât aproximativ 15 min, timpul de înjumătățire a serului mai mare decât aproximativ 15 min, sau un efect biologic care să continue să existe mai mult de 15 min după ce tratamentul a fost terminat, sau nivelul serului compusului respectiv a scăzut mai mult decât la jumătate. De exemplu, butiratul de arginină are un timp de înjumătățire a serului de aproximativ 15 min și produce efecte biologice cum ar fi expresia crescută a genelor cu răspuns față de butirat timp de o oră după administrare și, adeseori, depinde de parametrul care trebuie observat, mai mare decât 4 h. Izobutiramida apare în plasmă după administrare orală și prezintă un timp de înjumătățire a serului cuprins între 6,5 până la 10,5 h, în funcție de doza administrată, Efectele biologice pot continua timp de încă 24 h.

Compușii stabili din punct de vedere fiziologic pot fi compușii nou obținuți sau compușii care sunt cunoscuți anterior, și care în general nu au fost considerați a avea activitățile descrise sau care nu au fost testați în aceea ce privește aceste activități. Compușii noi, sunt compușii sintetizați pe cale organică sau compușii obținuți utilizând dezvăluirile prezentate în prezenta invenție și/sau pe baza cunoștințelor utilizate de persoanele de specialitate în domeniu. Tehnici cum sunt, de exemplu, proiectarea rațională a medicamentelor, pot fi utilizate pentru a obține acești produși (compuși) noi care sunt activi atât din punct de vedere biologic, cât și stabili din punct de vedere fiziologic. In proiectarea rațională a medicamentelor, accentul este plasat pe inter-relația dintre grupările chimice sau componentele unei substanțe sau pe inter-acțiunea dintre legarea diferitelor componente. De exmeplu, un component poate fi acidul butiric sau un derivat al acidulu butiric, iar partenerul său de legătură o sare, un metal, un halogen sau alte substanțe neutralizante sau stabilizante. Modelele moleculare ale componentelor sunt creeate având în vedere problemele energetice dintre componenții unui singur compus și ale reacțiilor dintre diferiții compuși. Combinarea abordărilor geometrice și algebrice permite evaluarea cantitativă a inter-acțiunilor propuse. Având aceste cunoștințe, compusul care prezintă interes este proiectat să posede anumite calități și nu altele. In mod alternativ, compușii stabili din punct de vedere fiziologic pot fi identificați din multitudinea de compuși cunoscuți cu cunoașterea regiunilor active din punct de vedere biologic al acidului butiric, și a regiunilor stabile din punct de vedere fizilogic ale altor compuși drept ghid. Compușii identificați în vederea unei probabile utilizări într-o compoziție, sunt testați într-o cultură de țesuturi și pe animale și, dacă este posibil, la oameni privind activitatea anti-neoplasmică și activitatea fiziologică. In cazul în care se creează noi compuși, așa cum s-a descris în prezenta invenție sau se recreează noi compuși cunoscuți anterior, anumite reguli de bază ale chimiei și ale fizicii trebuiesc cunoscute și aplicate.

Un compus stabil din punct de vedere fiziologic, există în starea cu cea mai scăzută energie liberă. Un compus poate ajunge în această stare prin una din cele două schimbări relativ arbitrare. Prima este prin schimbarea stării fizice, de la un solid la un lichid (topire sau dizolvare) sau la un gaz (sublimare], de la un gaz la un lichid (condensare) sau la un solid, sau de la un lichid la un solid (înghețare sau solidificare) sau la un gaz (evaporare). Starea chimică poate fi manipulată prin modificarea structurii moleculare de bază a compusului sau, câteodată, prin modificarea unei singure grupări chimice. Modificări utile ale stării fizice includ transformarea unui lichid într-un spray sau gaz, sau a unui gaz într-un lichid sau solid. Asemenea transformări fizice pot conduce

RO 115498 Bl

505 într-un mod simplu la o cale de administrare eficientă. A doua cale de modificare a stării chimice, este printr-o reacție chimică cum ar fi de exemplu combustia, oxidarea, descompunerea și orice reacție în care grupările atomice sunt schimbate sau modificate. Reacțiile chimice care conduc la creșterea stabilității in vivo a compusului, pot fi grupate în cel puțin două categorii, modificând compoziția moleculară a compusului prin reacția dintre acesta și un alt compus, sau modificând structura atomică a compusului. Amestecarea a doi sau mai mulți compuși pentru a stabiliza pe unul sau pe celălalt nu este în mod necesar nouă. De exemplu, acizii sunt amestecați în mod obișnuit cu baze pentru a neutraliza pH-ul. Sărurile sunt amestecate cu ioni pentru a reduce potențialul ionic. Alte amestecuri pot prezenta, totuși, o noutate. De exemplu, s-a demonstrat că stabilitatea compusului poate fi crescută prin amestecarea compusului dorit cu polietilenglicol, un alt polimer sau cu substanțe înrudite. Aceasta s-a dovedit a fi, în mod surprinzător, încununată de succes. Uneori, poate avea loc un efect sinergetic la compușii amestecați, în care caz amestecul conduce la creearea unui compus nou. Acest lucru s-a întâmplat cu combinația dintre arginină și acidul butiric. A apărut un nou vârf în profilele hPLC ale amestecurilor care nu au fost prezente în profilele individuale ale fiecărui component. Acest vârf poate fi un compus nou și diferit, necunoscut până acum, care este responsabil pentru efectele biologice observate.

Structura chimică a compusului poate fi modificată prin, de exmeplu, modificarea unui acid în aldehidă (butiraldehida) sau în cetonă (buteronă), adăugând sau îndepărtând o grupare metil(metilbutil), etil(etil-butil), propil, butii sau fenil, modificând natura ionică a compusului, cum ar fi prin adiția sau substituția unei grupări polare (benzilacetona: CH₃C0H₂C0C_BH₅], sau a unei grupări nepolalre (neo-pentil-butirat: CH₃CH₂CH₂CDOCH₂C(CI-l₃ Jj], sau modificând amplasamentul relativ al atomilor de carbon, cum ar fi de exemplu formarea izomerilor de poziție sau a stereoizomerilor. Izomerii de poziție diferă doar în ceea ce privește aranjamentul lor spațial cum ar fi amplasamentul exact al unei grupări chimice. Izomerii de poziție ai acidului butiric includ acidul izobutiric. Izomerii de poziție ai derivaților acidului butiric includ butilamina (CH₃CH₂CHCH₃NH₂) și acidul sec-butilfosfonic (CH₃CH₂CHCH₃P0₃H₂). Stereoizomerii diferă numai prin configurație cum sunt izomerii geometrici cis-trans. Stereoizomerii de configurație, de exemplu ai butadienei includ atât cis- cât și trans-butadienă. Izomerii de configurație a unui homolog ai acidului butiric includ acidul tiglic și acidul angelic (CH₃CHCCH₃C00H). întrucât multe enzime catabolice s-au dovedit a fi stereospecifice, dacă o fază limitativă în catabolismul acidului butiric reclamă activitatea pe o asemenea enzimă catabolică, prin simpla creeare a stereoizomerului, activitatea dorită poate fi reținută iar stabilitatea crescută. Chiar dacă aceste două categorii de reacții se întrepătrund într-un anumit grad, fiecare din ele poate produce compuși care sunt diferiți față de materialul de pornire. Asemenea compuși pot avea proprietăți care sunt întrucâtva diferite și pot fi afectați într-un mod diferit de către enzimele endogene ale pacientului gazdă. Scopul este de a stabiliza sau intensifica regiunea activă a compusului prin îndepărtarea sau modificarea regiunilor responsabile pentru instabilitate sau pentru a adăuga un plus de stabilitate substanțelor chimice însuși.

Sărurile acidului butiric includ, sodiu, potasiu, calciu, amoniu și litiu. Totuși, butiratul de sodiu este în general o sare idenzirabilă, întrucât la concentrații eficiente produce o dezvoltare a fluidului care poate conduce eventual la distrugerea țesutului. Alte săruri din prezenta invenție, nu posedă această proprietate, sau compușii care prezintă

510

515

520

525

530

535

540

545

RO 115498 Bl interes pot fi administrați la doze mai scăzute, minimalizând în acest fel efectul distrugător al sodiului. Reagenții care pot fi legați prin legături electrostatice sau covalente cu acidul butiric pentru a-i crește stabilitatea fiziologică includ aminoacizii cum ar fi arginina (butirat de arginină: ArgB], glicină, alanină, asparagină, glutamină, histidină sau lisină, acizi nucleici incluzând nucleozide sau nucleotide, sau substituienți cum ar fi carbohidrați (hidrați de carbon) zaharide, lipide, acizi grași, proteine sau fragmente de proteine. Combinații ale acestor săruri cu acid butiric și derivați ai acidului butiric pot produce, de asemenea noi compuși utili prin interacțiunea combinației.

Derivații acidului butiric sunt bazați pe o porțiune a miezului de acid butiric și cuprind analogi, homologi incluzând homologi adiacenți de grad următor și compuși bazați pe oricare din substanțele de mai sus. Analogii ai acidului butiric includ atât analogi de structură cât și analogi funcționali. Analogii funcționali sunt acei compuși care sunt înrudiți din punct de vedere funcțional, în ceea ce privește activitatea acestora, cu acidul butiric. Analogii de structură sunt acei compuși care sunt înrudiți cu acidul butiric în ceea ce privește aranjamentul sau numărul atomilor de carbon. Compușii înrudiți includ acești compuși care au fost modificați cum ar fi cei modificați prin substituție și/sau adiție. Izobutiramida este un anlog structural al acidului butiric și are patru atomi de carbon, o grupare amino și este stabilă atât din punct de vedere fizilogic cu un timp de înjumătățire a serului mai mare de o oră, cât și eficientă în calitate de agent anti-neoplastic. Alte exemple de analogi și homologi ai acidului butiric cu patru atomi de carbon includ acidul izocrotonic (CH₂CHCH COOH), croton aldehida (CH₃CHCH CHO), acidul izobutiric (acid metil-propionic sau acid metil-propanoic) tetrazol (CN₄H₂), acidul succinic (H00C-CH₂-CH₂CDOH), succinamida (H00C-CH₂-CH₂-C0NH₂), diamida acidului succinic (H₂NOC-CH₂-CH₂C0NH₂), acid 4-oxo-butanoic (C0H-CH₂-CH₂-C00H), acid fumărie (COOH-CH=CH-COOH), monoamida acidului fumărie (fumaramida: h00C-CH=CH-C0NH₂) și diamida (H₂N0CCH=CH-C0NH₂) și anhidrida acidului butiric (CH₃-CH₂-CH_a-C0)₂0).

Homologi adiacenți de grad următor ai acidului butiric sunt acei compuși care posedă un atom de carbon mai mult sau mai puțin față de acidul butiric. Acești compuși posedă trei sau cinci atomi de carbon. Exemple de homologi adiacenți de grad următor care pot prezenta interes ca drept agenți anti-neoplasmic includ acidul tiglic, acidul izovalerianic (CH₃)₂-CH-CH₂-C00H), butiramida, acidul 3-cloropropionic, 5-(2cloroetiljtetrazol, alanina (CH₃-CH(NH₂)-C00H), beta-cloro-D-alanina clorhidrat și clorhidrat de beta-cloro-L.alanină, propilamidă sulfonată (CH₃-CH₂-CHNH₂-SO₃H), sulfat de propil (CH₃-CH₂-CH₂-S0₂) și acid hexafluoro-propionic (CF₃-CF₂-C00F).

Derivații acidului butiric cuprind de asemenea acei compuși în care există o bază sau o structură miez care este acid butiric și prin modificări covalente, numărul de atomi de carbon este în mod semnificativ mai mare decât patru, cum ar fi acidul cinamic (C₆H₅CH=CH-COOH) sau acid 3-fenil-2-propenoic), acid alfa-metil cinamic, acid hidro-cinamic, 3- și 4-fenil butirat, di-, tri- și izo-fenil butirat, acid fenoxiacetic, acid tio-fenoxiacetic, butiranilida, butirat de izoamil și benzoil acetonă. Acești compuși sau derivații lor sau sărurile lor pot fi și s-au arătat in vivo a fi stabili din punct de vedere fiziologic și sunt posibil eficienți în calitate de agenți anti-neoplasmici. Compușii pot produce, de asemenea, efecte sinergistice atunci când sunt uitilizați în combinații.

Derivații ai acidului butiric stabili din punct de vedere fiziologic pot exista de asemenea ca atare sau pot fi creeați ca compuși ce se bazează pe o porțiune a miezului

RO 115498 Bl

595 de acid butiric. Derivații acidului butiric includ compușii izovalină, valină, metionină și treonină, precum și compușii care au fost modificați, cum ar fi de exemplu prin halogenerarea compusului odată sau de mai multe ori folosind elemente ca fluor (F), brom(Br), clor (CI) sau iod (I). Derivații halogenați includ acid cloropropionic (CH₃-CH₂COCI), cloro-etil tetrazol (CH₄H₂-CH₂-CH₂CI), cloroalanină (CH₃-CHNH₂-C0CI), clorură de butii (CH₃-CH₂-CH₂-C0CI) și acid heptafluorobutiric (CF₃-CF₂-CF₂-C0QF). Derivații pot fi, de asemenea creeați prin adăugarea unei grupări sulfoxid (butii sulfonat: CH₃-CH₂-CH₂C0S0₃), o grupare amido (butiramidă: CH₃-CH₂-CH₂-C0NH₂), o grupare azo [-N=N-J, o grupare tiocarbonil (-C=S), o grupare chinoid sau adăugarea unei structuri inelare (acid cinamic: C_BH₅-CH=CH-C00H). Derivații se pot forma, de asemenea prin esterificare, hidrogenare (butanol, CH₃-CH₂-CH₂-CHOH); biacetilenă (CH CCCH), oxidare, hidratare, alchilare, ciclizare (tetrazol) sau prin adiția unor grupări chimice ce conțin fosfor cum ar fi gruparea fosfat (P0₄) sau acid fosforic (acid butil-fosfonic), sulf(S) cum ar fi sulfhidril (SH], grupare sulfonică (-S0₃H) sau o grupare sulfat (S0₄), oxigen (0) cum ar fi o grupare hidroxid (OH), dioxid (0₂) sau trioxid (0₃) sau azot (N) cum ar fi o grupare amidă (NH₂₎; butilamină și acid piperidinic (H₂NCH₂CH₂CH₂C00H) sau o grupare amino (NHJ. Exemple de derivați ai acidului butiric includ acidul amino butiric (CH₃-CH₂CH₂-C0 NH₂); preparat așa cum este descris în literatura de specialitate, izobutiramidă (CH₃CH(CH₃)-C0NH₂), n-butil nitrit (CH₃-CH₂-CH₂-C0 NO); preparat așa cum este descris în literatura de specialitate, butiramidă sau monoamida acidului n-butiric (CH₃-CH₂-CH₂-C0 NH₂), butironitril (CH₃-CH₂-CH₂-CN; preparat așa cum este descris în literatura de specialitate, acid alfa- sau beta-amino n-butiric, succinamidă sau monoamidă succinică (H00C-CH₂CH₂C0 NH₃) sau diamidă (NHjOCCHg-CI^-CONHa), acid butil-fosfonic (CHj-ΟΗ,-ΟΗ,-ΟΗ?P0₃0₂), butiraldehidă (CH₃-CH₂-CH₂COH), fenilbutirat (CgHg-C^-CHpC^-COOH), butanal oxamină (CH₃-CH₂-CH₂-CH NOH), acid L-amino-n-butiric (LAB) și monobutirin (CH₂0HCH0H-CH₂0-C0CH₂-CH₂CH₂) și di- și tn-precum și izobutirin.

Pot fi creeați compuși, care după ce s-au introdus în pacientul gazdă, metabolizează în forme active ale acidului butiric sau analogilor acidului butiric sau derivaților acidului butiric care produc efectul dorit asupra pacientului. Compuși similari sunt descriși în literatura de specialitate, în care esterii acidului butiric sunt hidrolizați in vivo la acid butiric sau la o structură similară. Mai pot fi de asemenea creeați compuși care metabolizează într-un mod de punere în libertate în timp, permițând un număr minim de introduceri care au eficacitate pe perioade lungi de timp. Oricare, respectiv nu o reacție chimică particulară, poate decurge in vivo și depinde de stabilitatea relativă a produselor din reacție atunci când se compară cu cea a reactanților și de disponibilitatea unei căi de reacție care să permită conversia reactanților în produse cu o viteză de reacție rezonabilă. Factorul de stabilitate, a cărei mărime este exprimată prin diferența energiilor libere (delta G) dintre reactanți și produsele de reacție, controlează natura produsului format atunci când se permite reacției să aibe loc înainte de a apărea modificări suplimentare, cu alte cuvinte atunci când se atinge echilibrul chimic. Acesta controlează, de asemenea, randamentul maxim al produselor ce pot fi obținute. Disponibilitatea unei căi de reacție corespunzătoare sau factorul produsului poate avea loc, și de asemenea controlează perioada de timp pentru desăvârșirea reacției.

Activitatea anti-neoplasmică include, de exemplu, abilitatea de a induce diferențierea celulelor transformate incluzând celulele care sunt în bolile de leucemie, limfomul, sarcomul, tumorile celulei tumorale, carcinomul incluzând carcinomul celulelor

600

605

610

615

620

625

630

635

640

RO 115498 Bl scuomoase, seminomul, melanomul, neuroblastoamele, tumorile celulei mixte, tumorile celulei germ, tumorile nediferențiate precum și alte malignizări. După diferențiere, aceste celule își pierd natura lor agresivă, nu mai metastazează în continuare, nu se mai proliferează și eventual mor și/sau îndepărtate de către celulele T, celule ucigașe naturale și macrofage ale sistemului imunitar al pacientului. Procesul diferențierii celulare este stimulat și orientat, de exmeplu, de stimularea și/sau inhibarea transcripției specifice a genei. Anumite produse ale genelor sunt implicate direct în diferențierea celulară și pot transforma o celulă de diviziune activă într-o celulă care și-a pierdut sau i s-a micșorat abilitatea de proliferare. Poate fi observată o modificare asociată a caracterului expresiei genei cleulare. Controlul acestui proces include și abilitatea de a inversa starea de malignitate.

Genele a căror reglare transcripțională este modificată în prezența acidului butiric includ și oncogenele myc, ras, myb, jun, ab1 și src. Activitățile acestor produse ale genelor precum și activitățile altor oncogene sunt descrise în literatura de specialitate.

Activitatea anti-neoplasmică include, de asemenea, abilitatea de a reprima angiogeneza tumorală prin blocarea factorului de activitate a angiogenezei de producere sau de punere în libertate, de reglare transcripțională sau de abilitatea modulării transcripției genelor sub angiogeneză sau factorului de creștere sau a controlului hormonal. Ambele pot constitui o terapie eficientă în mod special împotriva neoplasiei prostatice sau a carcinomului sânului. Activități suplimentare care afectează transcripția și/sau diferențierea celulară includ nivelele cAMP intracelulare crescute, inhibarea acetilării histonei precum și inhibarea metilării genomice. Fiecare dintre aceste activități este legată direct de transcripția genei și deci de diferențierea celulară.

Compozițiile din prezenta invenție sunt preparate sub forma unui lichid, spray, capsulă sau sub formă solidă cum ar fi o pulbere (praf) sau pilulă, ca fiind cele mai potrivite scopului. De exemplu, butiratul de arginină este preparat prin reacția dintre arginină și acid butiric, filtrarea produsului rezultat și diluarea soluției finale la o concentrație fixă cu apă sau ser fiziologic, glicerină, polizaharide, ulei sau alte substanțe care sunt relativ inerte. Izobutiramida este preparată prin reacția dintre acidul propionic și amoniac, filtrarea produsului rezultat care este apoi depozitat la temperatura de 2CTC, O°C, 4°C sau la tmeperatura camerei, timp de luni și chiar timp de ani de zile, fără să aibe o pierdere semnificativă a activității. Izobutiramida solidă poate fi precipitată, spălată cu apă și apoi uscată. Această formă solidă poate fi apoi procesată sub formă de tablete sau capsule, amestecate sau dizolvată cu un lichid relativ inert cum ar fi de exemplu apă, ser fiziologic, glicerină, polizaharide sau ulei. Monobutirin se prepară sub forma unui lichid și poate fi depozitat, fără vreo pierdere semnificativă a activității, pe o perioadă de ani întregi. Filtrarea este efectuată utilizând filtre de 0,45, 0,22 și O,1O microni, ca fiind cele mai corespunzătoare. Sterilitatea acestor compoziții este testată folosind proceduri care le triază pentru creșterea bacteriilor, fungilor și fermenților. Sterilitatea mai poate fi determinată prin testarea în ceea ce privește conținutul de acid nucleic folosind, de exemplu, PCR (polimerase chain reaction - reacția în lanț a polimerazei), tehnologie în care speciile particulare ale acidului nucleic, dacă sunt prezente, sunt amplificate și detectate ca indicatori ai contaminării. Puritățile, fie a formelor lichide fie a formelor solide, sunt testate cu ajutorul cromatografiei lichid la presiune ridicată (HPLC), cromatografie în strat subțire (TLC), cromatografie gaz sau alte alternative ale acestor tehnici cum ar fi cromatografia în lichid rapidă la presiune (FPLC),

RO 115498 Bl cromatografie cu fază inversă (RP) sau cu ajutorul unei alte metode care este cunoscută persoanelor care lucrează în domeniu. Compoziția este, de asemenea, testată dacă este necesar, din punct de vedere al pirogenității efectuând, de exemplu testul limmulus amoebocyte lysate sau testul “reticulocyte lysate”, la iepuri.

Pacientul poate fi un animal domestic cum ar fi un câine, o pisică, un cal, o vacă, un juncan, un porc, o oaie, o capră sau un pui, sau poate fi un animal sălbatec - dar este preferabil să fie un om. Administrarea poate fi efectuată pe un adult, un adolescent, un copil mic sau un copil in utero. Administrarea compoziției poate fi de scurtă durată continuă sau sporadică, după cum este necesar. Pacienții care au o tulburare neoplasmică suspectă sau chiar diagnosticată, pot cere un tratament cu respectiva compoziție pentru o perioadă scurtă de timp sau până când neoplasia a început să se retragă sau a fost efectiv eliminată din corp.

Intr-o alternativă de realizare a prezentei invenții, compozițiile și compușii descriși mai înainte sunt utilizabili ca substanțe profilactice sau terapeutice pentru tratamentul unor tulburări neoplasmice, care sunt confirmate sau suspectate la un pacient. De exemplu, pacienții care sunt expuși la agenți mutageni, carcinogeni, radiații sau alți agenți care pot produce cancer, pot fi tratați în mod continuu cu compozițiile care s-au descris mai înainte, în vederea inhibării unei dezvoltări previzibile a condițiilor neoplasmice. De asemenea, se pot administra pacienților care au fost selecționați din punct de vedere genetic și care sunt considerați a prezenta un risc mărit pentru o dezvoltare ulterioară a neoplasmului; administrarea compozițiilor se poate începe chiar de la naștere, și posibil pentru întreaga viață. Amândouă variante, atât utilizările profilactice cât și cele terapeutice sunt ușor de acceptat întrucât acești compuși prezintă în general o bună siguranță și nu sunt toxici.

Tulburarea neoplasmică poate fi orice boală sau maladie care ar putea fi caracterizată ca fiind un neoplasm, o tumoare, o malignizare, un cancer sau o boală care conduce la o creștere relativ autonomă a celulelor. Tulburarea neoplasmică poate fi leucemie, limfomul, sarcomul, carcinomul cum ar fi carcinomul celulei scuamoase, o tumoare a celulei neurale, un seminom, un melanom, o tumoare a celulei embrionare, o tumoare nediferențiată, un neuroblastom (care este considerat de către unii specialiști ca fiind un carcinom], o tumoare a celulei mixte, o neoplasie metastazică, o neoplasie produsă de o infecție cum ar fi un virus (de exmeplu virusul papilloma uman, virusul Simplex herpes I și II, virusul hepatitei, virusul leucemiei celulei umane T sau un alt retrovirus) sau alte malignizări. Tulburările neoplasmice care pot fi tratate profilactic sau terapeutic cu compozițiile din prezenta invenție, includ cancerele pulmonare ale celulei mici și alte cancere pulmonare, rhabdomyosarcoame, chorio carcinomul, glioblastomul multiforma (tumorile la creier], carcinomul gastric și al intestinelor, leucemia, cancerele ovariene, cancerele prostatice, osteosarcomul sau cancerele care au metastazat. Maladiile sistemului imunitar, care pot fi tratate cu aceste compoziții, includ limfomul nonHodkin incluzând limfomul folicular, limfomul Burkitt, leucemia celulelor T adulte și limfomul celulelor adulte T, leucemia celulelor păroase, mielogenul acut, leucemia limfoblastică sau alte tipuri de leucemie, leucemia mielogenică cronică precum și sindromurile mielodisplastice. Maladii suplimentare, care sunt tratate cu compozițiile din prezenta invenție, includ carcinomul celulelor sânului, melanomul și melanomul hematologic, cancerele ovariene, cancerele de pancreas, cancerele hepatice, cancerele

690

695

700

705

710

715

720

725

730

RO 115498 Bl stomacale, cancerele de colon, cancerele osoase, carcinomul celulei scuamoase, carcinomul celulei texticulare precum și adenocarcinomul.

Compozițiile pot fi administrate pe cale orală, parenterală, sublinguală, reactală sau enterală sau mai pot fi administrate prin absorbție pulmonară sau sub formă de aplicații topice. Administrarea parenterală poate fi efectuată prin injecții intravenoase, injecții subcutanate intramusculare, injecții intraarteriale, injecții intratectale, injecții intrapepritoneale sau alte tipuri de administrări injectabile pe locul neoplasmului. Formele injectabile de administrare, sunt deseori preferate atunci când se urmărește un efect maxim. In situația că se urmărește un tratament pe termen lung, prin administrare prin injecții, medi-port, catetere la domiciliu sau mecanisme de pompare automată, este asigurat un acces direct și imediat către arterele din inimă și din prejurul ei precum și la alte organe majore și sisteme de organe.

□ metodă eficientă de administrare a compoziției, chiar pe locul neoplasmului, o poate constitui transfuzia transdermală cum ar fi cea cu plasture transdermal, prin contact direct cu neoplasmul, dacă locul este accesibil cum ar fi cazul melanomului sau a altor tumori ale pielii, sau prin administrare la un neoplasm intern ca urmare a unei incizii sau prin alte orificii artificiale care au fost făcute în corp. Compozițiile pot fi, de asemenea, administrate în traseul nazal prin intermediul unor spray-uri. Maladiile localizate la cap sau în zona creerului sunt tratabile folosind aceas tă manieră, întrucât arterele din zona nasului asigură un acces rapid și eficient către zona superioară a capului. Spray-urile asigură, de asemenea, un acces imediat și nemijlocit către sistemul pulmonar și reprezintă metodele preferate pentru administrarea compozițiilor medicamentoase către aceste zone ale corpului. Accesul către tractul intestinal, este obținut folosind formele orale, clisma sau formele injectabile. Compozițiile pot fi administrate sub forma unei injecții bol sau spray, sau administrate secvențial în timp (în mod sporadic) ca de exmeplu la fiecare 2 până la 4 h, la șase h sau la 8 h, în fiecare zi (QD) sau în fiecare altă zi (QOD), sau după lungi perioade de timp cum ar fi de săptămâni sau chiar de luni.

Compozițiile active care sunt administrate pe cale orală, sunt cele mai prefrate și reprezintă un mijloc convenabil singur și economic de manipulare a medicamentelor. Totuși, administrarea orală este în general dezavantajoasă, întrucât compozițiile medicamentoase sunt slab absorbite prin peretele gastrointestinal. Compușii care sunt slab absorbiți tind să fie puternic polari. In consecință, compușii care sunt eficienți, așa cum s-a descris mai înainte, pot fi făcuți să fie biodisponibili pe cale orală prin reducerea sau eliminarea polarității acestora. Acest lucru se poate realiza prin formularea compoziției împreună cu un agent complimentar, care neutralizează polaritatea acestuia, sau modificând compusul cu o grupare chimică neutralizantă. Biodisponibilitatea orală este, de asemenea, o problemă întrucât medicamentele sunt expuse la maxim, la pH-ul gastric și a enzimelor gastrice. Aceste probleme pot fi rezolvate într-o manieră similară, prin modificarea structurii moleculare, astfel să fie capabilă să facă față condițiilor de pH foarte scăzut și să reziste la enzimele mucoasei gastrice, cum ar fi neutralizarea unei grupări ionice, prin legarea covalentă a unei interacțiuni ionice, sau prin stabilizarea sau îndepărtarea legăturii disulfidice sau a altor legături relativ labile.

In situația când compoziția medicamentoasă este administrată oral, aceasta se poate prezenta sub forma unui lichid, o pilulă sau o capsulă. Lichidele care se administrează pe cale orală pot include agenți ce reprezintă arome, cum ar fi cele de

RO 115498 Bl

780 mentă, cireșe, guavă, lămâie, scorțișoară, portocală, mango sau aromă de fructe amestecate. Pilulele, capsulele sau tabletele care se administrează pe cale orală pot include, de asemenea, agenți ce reprezintă arome. Suplimentar, toate compozițiile mai pot conține agenți de creștere a parioadei de descompunere cum ar fi conservanții, antioxidanții, precum și alte componente necesare condiționării care sunt adecvate fabricării și distribuirii compozițiilor.

Administrarea compozițiilor medicamentoase, prin oricare dintre metode, trebuie făcută cu mare acuratețe, prin măsurarea nivelelor compoziției într-o mostră (probă) a unui fluid din corp cum ar fi sânge, ser sau plasmă. Nivelurile eficiente pentru serul sărurilor acidului butiric, analogilor sau derivaților acidului butiric reprezintă aproximativ □,O1 pM până la aproximativ 5,0 mM, preferabil între aproximativ 1,0 μΜ până la aproximativ 0,5 mM, mai preferabil între aproximativ 0,1 mM și aproximativ 0,4 mM și chiar mai preferabil aproximativ 0,2 mM. Atunci când sunt aplicate prin contact direct, nivelele eficiente ale ingredientului activ pot fi, câteodată, analizate prin determinarea concentrației compoziției în zonele care sunt în contact nemijlocit cu zona de aplicare. De exemplu, atunci când compozițiile se aplică topical asupra pielii, nivelele eficiente pot fi determinate din probele de fluid sau din probele de țesut ale țesutului dermal în interiorul a câțiva centrimetri sub zona de aplicare. In asemenea cazuri, concentrația compoziției poate fi predeterminată și utilizată sub forma unei soluții concentrate. Soluțiile concentrate de acid butiric, săruri ale acidului butiric, analogilor, derivaților acidului butiric sau combinațiilor acestora reprezintă între aproximativ 0,001% și aproximativ 10,0%, dar ele pot fi diluate în continuare, după cum este necesar unui contact direct prelungit cu pielea sau cu alte țesuturi ale corpului.

Compozițiile din prezenta invenție conțin forme stabile din punct de vedere fiziologic ale acidului butiric, sărurile acidului butiric, analogilor sau derivaților acidului butiric, sau combinațiilor acestora, drept agenți care intensifică expresia moleculelor cu histocompatibilitate imuno-reactivă majoră (MHC) pe celule neoplasmice. Aceste celule care exprimă MHC intensificat, sunt mai bune identificate și recunoscute de către sistemul imunitar al gazdei și pot fi eliminate. Expresia întărită a suprafeței antigenelor elimină în mod complet o cale majoră prin care multe celule neoplasmice scapă de sub supravegherea sistemului imunitar. Antigenele MHC care au o expresie intensificată includ Clasa I, Clasa II și așa numită Clasa III. Cele mai multe sunt codificate în interiorul regiunii genetice MHC care este localizată pe cromozomul 17 al șoarecelui și cromozomul 8 de la oameni. Antigenele MHC umane, care se referă de asmeenea la complexul hLA, cuprind antigenele hl_A-A, hLA-B și HLA-C.

Clasa I a antigenelor MHC este predentă pe suprafața tuturor celulelor nucleate și este responsabilă pentru recunoașterea celulelor tință de către celulele citotoxice T. Celulele țintă, în acest context, sunt celulele infectate viral și bacterial, celulele altoi exprimând antigenele ne-MHC, celulele vătămate și celulele transformate. Antigenele codificate MHC reprezintă lanțuri glicoproteice înalt polimorfe cu o greutate moleculară în jurul a 40.000 până la 60.COD daltoni, la oameni. Asociată cu lanțul glicoproteinic este o peptidă mică cu o greutate moleculară de aproximativ 12.5DO daltoni, la oameni denumită B2-microglobulină care, în contrast cu glicoproteinele codificate MHC, nu este polimorfă. Cu toate că majoritatea pozițiilor care codifică antigenele Clasa I se află în interiorul regiunii genetice MHC, există un număr de molecule foarte asemănătoare cum ar fi pozițiile Qa la șoarece care sunt separate.

785

790

795

800

805

810

815

820

RO 115498 Bl

Calasa II de antigene MHC se găsește pe o varietate largă de celule care prezintă antigen până la celulele T cum ar fi celulele T ajutătoare și alte celule prezentând antigen (APC). Fiecare antigen din Clasa II MHC constă din două peptide cu greutate moleculară de aproximativ 20.000 până la 40.000 daltoni, fiecare dintre ele fiind polimorfă. Moleculele imature din Clasa II se găsesc adeseori asociate cu un alt antigen denumit lanț gamma invariat. Antigenele din Clasa II pot fi găsite pe celule cum ar fi macrofagele din splină și din măduva oaselor, celule B, celule denditrice, celule Langerhan, celule Kupffer, celule ucigașe naturale, astrocitele, anumite celule endoteliale și anumite fibroblaste dermale. Un număr de componente din cascada compliment incluzând C2, C4 și factorul B sunt codificate în interiorul MHC, atât la oameni cât și la șoareci, și sunt adeseori raportate ca fiind molecule din Clasa III MHC. Funcțiile lor sunt implicate în diferite reacții imunitare, dar acești antigeni sunt oarecum diferiți față de antigenii clasici din Clasa I și Clasa II.

Compușii din prezenta invenție, induc suplimentar expresia suprafeței celulei, a antigenelor non-MHC receptori de suprafață ai celulei, antigenilor cu histocompatibilitate majoră, antigenilor specifici-tumorali, antigenilor receptor interleukin [IL] cum ar fi receptorul IL-2(IL-2R] și alți receptori citochine, complexe de proteină rezistente la multimedicamente (multi-drug) cum ar fi proteina Pgp, și receptorii factorului de creștere cum ar fi receptorul factorului de creștere epidermal (EGF). Anumite forme de cancer manifestă, de asemenea, antigeni specifici-tumorali care în mod normal nu se găsesc pe suprafața celulelor necanceroase, dar a căror expresie poate fi de asemenea indusă sau mărită în prezența sărurilor acidului butiric sau a derivaților acidului butiric. Compozițiile medicamentoase care conținforme stabile din punct de vedere fiziologic ale acidului butiric, sărurilor acidului butiric sau derivaților acidului butiric, sau combinațiilor acestora, intensifică abilitatea sistemului imunitar al gazdei de a elimina celulele înbolnăvite din corp prin stimularea expresiei acestor antigeni non-MHC. Expresia mărită a antigenilor specifici-tumorali ar conduce de asemenea la o creștere mare a eficacității terapiei anticorp, cum ar fi anticorpii conjugați toxinei sau anticorpii monoclonali conjugați medicamentelor.

Un alt aspect al prezentei invenții, este acela că compozițiile medicamentoase pot fi utilizate în oricare din exemplele de realizare descrise în prezenta invenție, în combinație cu alți agenți având drept scop maximizarea efectului compozițiilor într-o manieră aditivă sau sinergetică. Citochinele care ar putea fi eficiente în combinație cu compozițiile din prezenta invenție includ factorii de creștere cum ar fi factorul de creștere al celulei B (BCGF-B), factorul de creștere derivat-fibroblast (FDGF), factorul de stimulare a coloniei macrofagelor/granulocitelor (GM-CSF), factorul de stimulare a coloniei de granulocite (G-CSF), factorul de stimulare a coloniei de macrofage (M-CSF), factorul de creștere epidermal (EGF), factorul de creștere derivat platelet (PDGF), factorul de creștere al nervului (NGF), factorul celulei stern (SCF) și factorul de transformare a creșterii ( TGF). Acești factori de creștere plus o compoziție, pot stimula suplimentar diferențierea celulară și/sau expresia anumitor antigeni MHC sau antigeni tumorali. De exemplu, BCGF plus o compoziție poate fi eficient în tratarea anumitor leucemii ale celulei B. NGF plus o compoziție poate fi utilizabil în tratamentul anumitor neuroblastome și/sau a tumorilor celulei nervoase. Intr-un mod asemănător alți agenți, cum ar fi agenții de diferențiere pot fi utilizabili în combinație cu una din compozițiile prezentei invenții, în vederea prevenirii sau tratării tulburărilor neoplasmice. Alți agenți de diferențiere includ

RO 115498 Bl factorul de diferențiere a celulei B (BCDF), eritropoietin (EPO), factorul paloș, activin, inhibin, proteine morfogenice ale oaselor (BMPs), acid retinoic sau derivați ai acidului retinoic cum ar fi retinol, prostaglandin și TPA.

In mod alternativ, alte citokine și antigeni înrudiți, în combinație cu o compoziție sunt de asemenea utilizabili pentru a trata sau a preveni diferite neoplasme. Citokine potențial utilizabile includ factorul de necrozare a tumorii (TNF), interleukin IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, etc. proteina interferon (IFN) cum ar fi IFN-alfa, IFN-beta și IFN-gama; AMP ciclic include AMP dibutil ciclic, hemin hidroxiuree, hipoxantin, hormoni glucocorticoizi, dimetilsulfoxid (DMSO) și citozină arabinoside. Terapiile folosind combinații ale acestor agenți, ar constitui terapii sigure și eficiente împotriva malignizărilor și a altor forme de cancer. Combinații de terapii pot fi de asemenea eficiente în inducerea regresiei sau aliminării tumorii sau a altor forme de cancer, cum ar fi compozițiile din prezenta invenție combinate cu o terapie cu radiații, cu toxine sau cu anticorpi conjugată cu medicamente folosind anticorpi monoclonali sau policlonali care sunt orientați împotriva celulelor transformate, terapie cu gene sau terapie specifică anti-sens. Efectele pot fi aditive, logaritmice sau sinergetice, iar metodele care implică combinații de terapii pot fi protocoale simultane, protocoale intermitente sau protocoale care sunt determinate empiric.

Un alt aspect al prezentei invenții, cuprinde compoziții și metode pentru tratamentul tulburărilor neoplasmice intensificând terapia chemo convențională, terapia cu radiații, terapia cu anticorpi, precum și alte forme de terapie. Compozițiile conținând forme stabile din punct de vedere fiziologic al sărurilor acidului butiric sau derivaților acidului butiric, sau ale combinațiilor acestora în combinație cu agenți chemoterapeutici, intensifică efectul agentului chemoterapeutic luat singur. Compozițiile conduc la scăderea expresiei sau a activității proteinei responsabile, cu scăderea concentrației intra-celulare a agenților chemoterapeutici. Proteinele responsabile pentru rezistență la medicamente și alți agenți, proteinele de rezistență la multi-medicamente (MDR), includ glicoproteina P (Pgp) codificată de genele mdr-1. In consecință, medicamentele convenționale pentru tratamentul tulburărilor neoplasmice se acumulează în concentrații mai mari pentru perioade de timp mai lungi și sunt mai eficiente atunci când sunt utilizate în combinație cu compozițiile din prezenta invenție. Unii agenți chemoterapeutici convenționali care ar fi utilizabili în combinații de terapii cu compoziții din prezenta invneție includ ciclofosfamida drept un agent de alchilare, purina și analogi ai pirimidinei cum ar fi mercaptopurina, alcaloizi vinca și de tipul vinca, etoposide sau medicamente asemănătoare etoposidei, antibiotice cum sunt deoxirubocin și bleomicin, corticosteroide, substanțe mutagene cum este nitrozoureea, substanțe antimetabolice incluzând metotraxat, medicamente citotoxice pe bază de platină, antagoniști hormonali cum sunt antiinsulina și antiandrogen, substanțe antiestrogenice cum este tamoxifen sau alți agenți cum sunt deoxirubicin, Lasparaginază, dacarbazin (DTIC), amsacrină (mAMSA), procarbazin, hexametilmelamin și mitoxantron. Agenții chemoterapeutici pot fi administrați simultan cu compușii din prezenta invenție sau alternativ după cum este definit în protocolul proiectat a conduce la maximum eficacitatea medicamentelor, dar minimalizând în același timp toxicitatea față de corpul pacientului.

Un alt aspect al prezentei invenții este orientat spre compoziții și metode care cuprind săruri ale acidului butiric, derivați ai acidului butiric și combinații ale acestora care sunt utilizabili și vindecarea rănilor. Aceste combinații accelerează și intensifică

870

875

880

885

890

895

900

905

910

915

RO 115498 Bl rezoluția pozitivă a escarelor, leziunilor, abraziunilor și inciziilor datorate intervențiilor chirurgicale și altor intruzii medicale în corpul pacienților, chiar după ce alte terapii convenționale, care s-au aplicat, au dat greș. Rezoluția vătămării țesutului include stimularea diferențierii celulare, regenerarea țesutului și androgeneza din jurul zonei țesutului vătămat. Aceste compoziții ar constitui o metodă preferată de tratament în multe situații, întrucât pacienții nepolastici prezintă adesea ori complicații datorită bolii lor sau o consecință a tratamentului. Compozițiile pot fi administrate direct pe rană, administrate direct prin injecții sau administrate oral sub formă de lichid, capsule sau pilule. Suplimentar, compozițiile pot fi absorbite în tampoane, ca de exemplu pansamente sau bandaje pentru răni, în vederea unei terapii prelungite, sau incorporate în obiecte care urmează a fi inserate în rază sau lângă rana pacientului, în vederea terapiei profilactice.

Compozițiile din prezenta invenție sunt, de asemenea, utilizabile pentru tratamentul sau profilaxia tulburărilor gastrointestinale incluzând colita, boli inflamatorii ale intestinului, maladia Chron și colite ulceroase. Tulburările pot fi cauzate de infecții, tulburări nutriționale sau de cauze necunoscute și neidentificate. Compozițiile din prezenta invenție sunt în general mai utilizabile pentru tratamentul tulburărilor sistemului gastrointestinal care sunt orientate mai ascuns în organism.

Compozițiile sunt administrate în formulări orale sau cu ajutorul clismelor, sau prin injecții rectale având în vedere obținerea unui contact maximum dintre acestea și sistemul gastrointestinal și a creșterii eficienței asupra respectivului sistem. Dozele sunt cuprinse între aproximativ 1 până la aproximativ 12% (vol/vol) sau între aproximativ 1 până la 1OO mM. Dozele sunt administrate între aproximativ două și aproximativ patru ori pe zi, până când simptomele se ameliorează sau dispar total. Dozarea multiplă și frecventă nu constituie o problemă, întrucât compușii din prezenta invenție sunt siguri (netoxici) și sunt stabili din punct de vedere fiziologic. Efectele pozitive ale tratamentului includ o scădere a frecvenței de evacuare a scaunului, a volumului scaunului sau pierderile de sânge. Evaluarea endoscopică a peretelui de mucoasă poate fi de asemenea îmbunătățită, așa cum s-a demonstrat prin indicații vizuale și rezoluția inflamației.

Un alt aspect al prezentei invenții este orientat către teste de diagnosticare sau încercări de detemrinare a stadiului sau nivelului de severitate al unui neoplasm particular și acea susceptibilitate a cancerului la medicamente, radiații sau alte forme de tratament. Celulele de la un pacient pot fi preluate și plasate în condițiile de cultură a unui țesut. La cultura celulară și la cultura de control (celule de control pozitive și/sau negative) care poate constitui o linie celulară, celulele primare sau celule ne-neoplasmice de la același pacient sau de la un pacient diferit, se adaugă un compus în conformitate cu prezenta invenție. Cultura care este tratată cu compusul respectiv și cultura de control, sunt incubate pentru o perioadă de timp, preferabil pe o perioadă de o zi, mai preferabil până la 6 h și, încă, mai preferabil mai puțin de o oră. Culturile sunt apoi examinate după perioada de incubație, și sunt determinate în ceea ce privește cantitatea de diviziune celulară, proliferarea celulară, replica ADN, ADN, ARN sau sinteza proteinei, sau expresia citochinei, receptori ai citochinei, alte molecule de suprafață ale celulelor sau alți antigeni, sau o altă activitate metabolică. Cu cât este mai mate efectul asupra activității, în comparație cu cea de control, cu atât mai mare este posibilitatea ca forma particulară de cancer care este examinată să necesite un tratament agresiv. Asemenea

RO 115498 Bl

965 teste ar fi utilizate pe o scară mare, ca modalități de diagnostic în stabilirea celui mai bun tratament pentru un anumit pacient, și de asemenea pentru sortarea de noi compuși în vederea unei posibile utilizări terapeutice sau profilactice a cancerului. Aceasta este relativ ne-invazivă, necostisitoare, cantitativă și relativ scurtă. Enumerările unor forme organ-specifice sau alte tipuri specifice leucemice, canceroase și alte forme de celule transformate (cancere de tipul I - V] ar putea fi testate și utilizate pentru a elabora un grafic sau un tabel privind severitatea cancerului față de eficacitatea chemoterapeutică, din care se pot estima tratamentele pentru formele de cancer necunoscute în mod eficient. In acest mod, medicamentele terapeutice pot fi selectate cu mai multă grijă în ceea ce privește efectul și rezultatul final determinat cu un mare grad de certitudine și cu un risc coborât.

Exemplele de realizare care urmează, ilustrează modul de aplicare a prezentei invenții, dar nu trebuie privite ca fiind limitative.

Se dau în continuare 14 exmeple de realizare a invenției, în legătură și cu fig. 1 ...7, care reprezintă:

- fig. 1, curbele de răspuns la doză, a liniilor celulare neoplasmice tratate cu butirat de arginină, față de procentul de creștere celulară;

- fig. 2, date de la curbele de răspuns a creșterii, indicând inhibarea creșterii cu butirat de arginină;

- fig. 3, curbele de răspuns la doză a liniilor celulare, tratate cu izobutiramidă față de procentul de creștere celulară;

- fig.4, curbele de răspuns la doză a liniilor celulare neoplasmice tratate cu monobutirin, față de procentul de creștere celulară;

- fig.5, date de la curbele de răspuns a creșterii, indicând inhibarea creșterii, cu utilizarea monobutirinei

- fig.6, analiza FACS a nivelelor expresiei antigen MHC de suprafață pe celulele K562 tratate cu 907, butirat de arginină, izobutiramidă sau 901;

- fig.7, analiză FACS a nivelelor expresiei antigen MHC de suprafață pe celulele K562 tratate cu gama-interferon, izobutiramidă sau monobutirin.

Exemplul 1. Prepararea compușilor. Butiratul de arginină, folosit pentru injectare, a fost preparat într-o concentrație de 1 g/ml în greutate. Astfel, L-arginină anhidră a fost combinată cu acid butiric, la pH 5,0 ... 5,5, în apă sterilă non-pirogenică și a rezultat o soluție hipertonică. Această soluție a fost filtrată printr-un filtru Nalgene de 0,45 microni și un filtru Nalgene de 0,2 microni. In timpul transferului acestei soluții în sticle sterile, în vederea administrării la pacient, preparatul a fost filtrat a treia oară printr-un filtru Nalgene de 0,2 microni. Sub forma unei soluții hipertonice, acest produs ar trebui să fie infuzat direct la pacient printr-un acces intravenos lung și profund, în scopul de a evita iritarea venoasă periferică. Testul de stabilitate a determinat faptul că medicamentul a fost stabil pentru o perioadă de timp de cel puțin 28 zile (cea mai lungă perioadă de timp testată). Graficul de doză inițială pentru pacient, este de așteptat să fie la intervale de 250 mg, cuprins între 500 ... 2000 mg/kg corp, pe zi și timp de 14 zile. Soluția pentru administrare orală, de izobutiramidă (100 mg/ml] include 0,1% benzoat de sodiu (USP), ca fiind substanță cu rol de conservare, și mai cuprinde un sirop simplu (38% sucroză, la concentrație finală). S-au adăugat de asemenea arome artificiale de scorțișoară-mentă (USP), pentru a crește palatibilitatea. Această soluție a fost filtrată și apoi testată în ceea ce privește stabilitatea și pirogenitatea acesteia.

970

975

980

985

990

995

1000

1005

RO 115498 Bl

Exemplul 2. Inducerea diferențierii in vitro. Un număr mare de culturi de celule umane și murine, primare și continui au fost menținute in vitro, în condițiile de cultură cerute de fiecare tip de celulă sau linie celulară. In tabelul 1, care urmează, se prezintă situația acestui rezultat.

Tabelul 1

Rhabdomiosarcom	Fibroblaste (umane normale]
□steosarcom (HOS)	Fibroblaste (șoarece BALB/C-3T3]
Choriocarcinom (JAR)	Limfocite (umane, în MLR]
Glioblastom multiform	Carcinom gastric (AGS)
Leucemie mieloidă (HL 60]	Eriotroleucemie (K562)
Adenocarcinom de colon (HT 29)	Neuroblastom (SK-N-MC)

Pe scurt, celulele au fost menținute în culturi de țesuturi în flacoane cu DMEM sau RPMI-1640 suplimentat cu până la 5% sau 10% ser fetal de bovine sau de vițel. Celulele au fost apoi trecute, după necesitate. Sărurile de acid butiric sau derivații acidului butiric, au fost adăugate, la un număr egal din fiecare cultură și într-un domeniu de concentrații. Rezultatele obținute sunt prezentate în tabelul 2, care urmează.

Tabelul 2

Săruri ale acidului burtiric, analogi și derivați

Butirat de sodiu (NaB)	Izobutiramidă (IBA)
Butirat de arginină (AgB]	Monobutirin (MoB)
5-(2-cloroetil]-tetrazol(575664]	Acid L-amino-n-butiric (LAB)
Acid heptafluorbutiric(9O7388] (016249)	CH₃-CH₂CHNH₂-S0₃H
Acid 3-cloropropionic (901409)	CH₃-CH₂-CH₂-S0₂(428494)
Clorhidrat de beta-cloro-D-alanină (D594516)	CH₃-CH₂-C00H(103038)
Clorhidrat de beta-cloroalanină(594515)	4-fenil butirat
Acid izobutiric (acid metil propionic)	Butironitril
Acid fumărie	Acid cinamic
Succinamidă	Acid D-amido-n-butiric(DAB)
Acid alfa-metil cinamic	Monoamida acidului fumărie
3-fenil butirat	Acetat de fenil
Tributirin(TriB)

RO 115498 Bl

1050

Toate experimentele au fost efectuate cu probe de control, în paralel fără substanțe adăugate, și prin contrast cu un standard de tratament al butiratului de sodiu. Rezultatele în concentrații minime inhibitoare (MIC) au fost înscrise în tableul 3, care urmează. Creșterea și morfologia au fost evaluate pe o bază zilnică. Acolo unde s-a găsit a fi corespunzător, un număr de concentrații diferite ale serului au fost, de asemenea, utilizate. Soluțiile de acid butiric au fost preparate la o concentrație de 5 mM și diluate de două ori, până la concentrația de 5 μΜ. Anumiți compuși nu au prezentat nici o acțiune inhibitoare, la concentrații de până la 5OOO μΜ. De exmeplu 5-(2-cloroetil]tetrazol (575664) nu a prezentat niciun efect inhibitor asupra nici unei celule sau linii celulare la concentrații de până la 5 mM.

Tabelul 3

1055

Celule MIC	Compus	MIC	Compus
1	2	3	4
Ne-Tumorale
Fibroblaste >5000 μΜ	NaB	>5000 μΜ	ArgB
(normale umane)	901	5000 μΜ	MoB
>5OOO μΜ	D-594	5000 μΜ	-
Fibroblaste >5000 pM	NaB	>5000 μΜ	MoB
1	2	3	4
Balb/c-3T3)	901	5000 μΜ	ArgB
Tumori umane
Rhabdomisarcom <78 μΜ	NaB	156 μΜ	L-594
1250 μΜ	ArgB	156 μΜ	103
2500 μΜ	MoB	156 μΜ	D-594
30 pM	901	<39μΜ	IBA
Osteosarcom(HOS)
78 μΜ	NaB	312 pM	901
N.D	ArgB	312 μΜ	L-594
60 μΜ	MoB	312 μΜ	IBA
Choriocarcinom(JAR)
<78 μΜ	NaB	156 μΜ	901
N.B.	ArgB	156 μΜ	L-594
32 μΜ	MoB	156 μΜ	IBA
Glioblastom multiform
156 μΜ	NaB	N.B.	901

1060

1065

1070

1075

1080

RO 115498 Bl

N.D	ArgB	1OOO μΜ	L-594
312 μΜ	MoB	1000 μΜ	ΙΒΑ
Adenocarcinom de colon
312 μΜ	NaB	2000 μΜ	901
[HT29]	ArgB	2000 μΜ	L-594
N.D	MoB	2000 pM	ΙΒΑ
Carcinom gastric
312 μΜ	NaB	2000 μΜ	901
(AGS) 321 μΜ	ArgB	2000 μΜ	L-594
N.D	MoB	2000 μΜ	ΙΒΑ
Leucemie mieloidă
< 78 μΜ	NaB	78 pM	L-594
(HL 60]	ArgB	78 μΜ	907
625 μΜ	MoB	78 μΜ	ΙΒΑ
16 μΜ	901	<39 μΜ	-
Eritroleucemie
> 5000 μΜ	NaB	>5000 μ Μ	907
(K562) 5OOD μΜ	ArgB	1250 μΜ	L-594
275 μΜ	MoB	1250 μΜ	ΙΒΑ

			(nu este dat)

Exemplul 3. Efectele compușilor asupra celulelor neuroblastomului uman. Celulele neuroblastomului uman, SK-N-CN, au fost incubate în prezența diferitelor săruri și derivați ai acidului butiric. Aceste celule au fost lăsate să crească timp de patru săptămâni, în timpul expunerii, și s-au determinat numerele de celule finale. Rezultatele sunt date în tabelul 4, care urmează.

Tabelul 4

Compusul	Concentrația	Număr de celule
Fără tratament	-	1 χ 10⁸
3-fenil butirat	1,00 mM	1 χ 10^s
Acetat de fenil	1,00 mM	1 χ 10^θ
Butirat de arginină	0,05 mM	1 χ 10⁵
Butirat de arginină	1,00 mM	<1 χ 10³
Izobutiramidă	0,05 mM	<1 χ 10³

RO 115498 Bl

1120

Scăderi dramatice în creșterea celulelor a fost observată după tratamentul fie cu butirat de arginină, fie cu izobutiramidă, la nivele ale medicamentului realizate în plasmă în mod rapid. Expresia oncogenă a fost de asemenea micșorată de aproximativ trei ori în celulele neuroblastomului tratate cu butirat de arginină (1mM), în comparație cu celulele normale. Celulele tratate cu butirat de fenil sau cu acetat de fenil nu au arătat nici o scădere în comparație cu celulele netratate, indicând că efectele asupra creșterii celulelor au fost specifice.

Exemplul 4. Efectul compușilor asupra liniilor celulare de tumori umane. Celulele de leucemie mieloidă (HL 60) au răspuns la sărurile și derivații acidului butiric, prin diferențiere de-a lungul liniilor mieloide. Celulele au dobândit un număr de caracteristici ale neutrofilelor mature, diferențiate terminal, incluzând morfologia neutrofilelor mature, stimularea expresiei mieloperoxidazei și a altor esteraze specifice și capacitatea de a genera o explozie oxidativă. Celulele de eritroleucemie au dobândit capacitatea de a sintetiza globină și hemoglobină, asemănător unei celule roșii sanguine normale, devenind practic de colorație roșie. Celulele de adenocarcinom de colon (HT 29) au fost tratate cu săruri și derivați ai acidului butiric. Acești compuși afectează creșterea celulară și au produs o frânare a creșterii absolute în zilele 3 ... 4, cu o încetare completă a creșterii după 25 de zile. Inhibarea sintezei ADN (așa cum a fost măsurată prin incorporare de ³H-thymidină) s-a produs după 6 h. Expresia proto-oncogenei, o graniță de finisare matură, precum și genele de sucroză și izomaltoză, toate au fost pronunțate. Celulele carcinomului gastric (AGS) au formulat mucin, după tratament, ceea ce este un indicator al celulei gastrice mature.

Izobutiramida, butiratul de arginină și monobutirinul au fost examinate în ceea ce privește efectele citotoxice, pe un număr de celule tumorale stabilite de mai înainte. Citotoxicitatea, așa cum a fost măsurată în aceste studii, nu este în mod necesar aceeași ca inhibarea sau creșterea în ceea ce privește diferențierea. Aceste efecte nu ar fi fost de așteptat să apară în mod proieminent în aceste teste. Butiratul de arginină, s-a găsit că are aceeași activitate citotoxică asupra celulelor leucemiei, celulelor de melanom, celulelor de cancer ovarian, celulelor de cancer al sânului (fig. 1 și fig.2). Concentrația de 50% letală (LC₅₀) a butiratului de arginină asupra fiecărui dintre aceste celule a fost determinată și s-a găsit că este mai mare decât 0,1 mM (log_1o LC₅₀, care este mai mare decât - 3,6). S-a găsit că izobutiramida ar avea o oarecare activitate citotoxică asupra liniei de celule mari a cancerului pulmonar (fig.3). S-a mai găsit că monobutirinul ar avea o oarecare activitate citostatică asupra celulelor de leucemie, celulelor cancerului pulmonar al celulelor mari, celulelor cancerului pulmonar al celulelor mici, celulelor melanomului, celulelor cancerului ovarian precum și asupra celulelor cancerului renal (fig.4 și fig.5). Concentrația 50%letală (LC₅₀) a izobutiramidei asupra fiecărei linii celulare a fost determinată ca fiind mai mare decât 1,0 mM (log_1Q LCg-,, mai mare decât - 2,3).

Exemplul 5. Efectele compușilor asupra proliferării limfocitelor.Compușii din prezenta invenție au fost testați în ceea ce privește efectele de reprimare imunitară potențială, folosind proliferarea limfocitelor umane într-o reacție limfocită mixtă (MLR) sau într-o cultură de limfocite umane stimulate cu fitohemaglutinin (PHA). Limfocitele au fost expuse la un stimul mitogenic și compoziții, timp de 48 h, după care a fost incorporată ³H-thymidină. Proliferarea limfocitelor în reacție stimulată MLR sau PHA cere ca un număr de acțiuni complexe să aibe loc, incluzând interacțiunea secvențială a lectinelor

1125

1130

1135

1140

1145

1150

1155

1160

RO 115498 Bl și limfochinelor cu receptorii de suprafață celulari timp de mai multe ore, precum și sinteza autocrină și secreția limfochinelor de către limfocite. Aceasta este un indicator extrem de sensibil al citotoxicității compușilor asupra celulelor normale (ne-tumorale). Aceste rezultate sunt date în tabelul 5, care urmează.

Tabelul 5

Compusul	Concentrația inhibitoare (pM)
100%	50%
Butirat de sodiu	2.500	400
Butirat de arginină	3.500	3.500
MoB	3.500	3.500
L-594515	500	75
901409	>850	100
D-594516	>2500	800
9077388	>2500	1.400
103038	>2.500	>2.500
IBA	>5.000	>2.500

Butiratul de sodiu, butiratul de arginină, monobutirinul, 901409 (acidul 3cloropropionic), izobutiramida și izomerul L al beta-L-alaninei-clorhidrat, au arătat efectele inhibitoare potente asupra majorității liniilor celulare tumorale care au fost testate. Efectele au fost bune în cazul diferitelor concentrații ale serului. Clorhidratul de betacloro-D-alanină (L-594), butiratul de arginină și monobutirinul au prezentat aceeași activitate ca și butiratul de sodiu. L-594, butiratul de arginină și monobutirin au fost de 4 ... 5 ori mai activ decât butiratul de sodiu, iar izobutiamida a fost de 10 ... 20 ori mai activă decât butiratul de sodiu. Nici unul dintre acești compuși nu au fost, în mod deosebit, toxic față de celulele non-tumorale.

Cei mai potenți agenți antitumorali cum ar fi butirat de sodiu, butirat de arginină, monobutirin, acidul 3-3-cloropropionic (901409), clorhidratul beta-cloro-L-alaninei (L594515), izobutiramida au arătat o oarecare inhibare a reactivității limfocitelor la concentrații foarte ridicate ale toxicității pentru celulele tumorale care menajează celulele umane normale și limfocitele. Aceasta este în contrast cu oricare altă activitate chemoterapeutică clasică. Unele linii celulare tumorale utilizate nu sunt cunoscute a fi “diferențiabile” în culturi, astfel că mecanismul de inhibare a creșterii de către acești compuși nu este cunoscut. Agenții care prezintă efectele cele mai potente, în ceea ce privește inhibarea tumorii, sunt în unele cazuri diferiți față de compușii care sunt cei mai activi în reglarea expresiei genei globin fetale. Unii dintre compușii care prezintă un efect antitumoral potent (acid 3-cloropropionic și clorhidratul beta-cloro-L-alaninei) sunt homologi adiacenți de grad următor ai acidului butiric.

Exemplul 7. Inducția MHC Clasa I de către compuși. □ eritroleucemie umană care nu exprimă antigeni MHC Clasa I (K562) a fost tratată cu izobutiramidă, butirat de arginină sau monobutirin. Fiecare dintre aceste substanțe a produs o reglare în sus a

RO 115498 Bl expresiei antigen MHC așa cum s-a determinat prin imunofluorescență cu un anticorp monoclonal specific Clasei I MHC. Creșterea în expresia MHC pe celulele tumorale la șoareci și pe celulele tumorale umane (K 562, Jurkat, HuT 78) rezultată la recunoașterea și distrugerea lor de către limfocitele T citotoxice umane și de șoarece, așa cum este cunoscut din literatura de specialitate.

Exemplul 8. Reglarea În sus a IL-2R de către compuși. Butiratul de arginină, monobutirinul și izobutiramida au fost găsite ca fiind capabile să regleze în sus expresia TAC (p55) a ambelor celule umane de leucemie T și B a celulelor limfomului. Inducția IL2R este arătată în tabelul 6 care urmează, la patru zile după adăugarea sărurilor acidului butiric sau a derivaților acestuia, după colorarea cu un anticorp fluorescent specific pentru IL-2R. Fluorescența arătată în suprafața celulară pe o scară logaritmică, unde fiecare creștere de 15,5 unități reprezintă o dublare a expresiei IL-2R a suprafeței celulare.

1205

1210

1215

Tabelul 6

Linii celulare	Linie de bază	0,5 mM	1,0mM	2,0mM
Butirat de arginină
NALM6	14	57	68	65
RAJ 1	55	78	65	72
CEM	40	-	67	-
Izobutiramidă
NALM6	14	35	34	44
RAJI	55	75	75	69
CEM	40	-	44	-
3-fenil butirat
NALM6	14	32	29	45
RAJI	55	75	78	79
CEM	40	-	51

1220

1225

1230

1235

1240

Alte forme ale acidului butiric (3-fenil butirat], care au fost administrate în condiții de siguranță la animale, de asemenea, induc o creștere în expresia IL-2R. Date suplimentare au demonstrat că expresia IL-2R poate fi modulată de către sărurile acidului butiric sau a derivaților acestuia, în malignizările hematopoietice. Acești compuși au condus la creșterea susceptibilității celulei tumorale pentru uciderea toxinelor de fuziune ce reprezintă ținta pentru IL-2R.

Exemplul 9. Inhibarea activității proteinelor în ceea ce privește rezistența la multimedicamente. Expresia glicoproteinei-P(Pgp), proteină responsabilă pentru cea mai mare parte a rezistenței față de multi-medicamente în tumori, poate fi crescută cu ajutorul sărurilor acidulu butiric sau a derivaților acestuia în linii celulare derivate din tumori ce apar din celule care în mod normal exprimă Pgp. Cu toate că nivelul Pgp crește de 25 ori după tratamentul cu acid butiric, în celulele carcinomului de colon uman SW 62D,

RO 115498 Bl acumularea intracelulară a agenților chemoterapeutici vinblastin, adriamicin și actinomicin D cresc, în loc să descrească. Tratamentul unei sublinii Pgp, care exprimă rezistența față de multi-medicamente SW 620, cu compoziții din prezenta invenție a condus la o interferență activă cu funcția Pgp. Butiratul de sodiu, cu toate că a condus la creșterea nivelelor Pgp, a inhibat fosforilarea Pgp. Studiile care s-au efectuat de-a lungul timpului au relevat o relație strânsă dintre scăderea fosforilării Pgp și creșterea acumulării vinblastinei după tratamentul cu butirat. Retractarea acidului butiric conduce la creșterea fosforilării Pgp, reducând în același timp acumularea vinblastinei.

Exemplul 10. Inducția MHC antigenilor asupra celulelor K 652

Analiza FACS (Sortator fluorescent al celulei activate] a fost utilizată la examinarea nivelelor expresiei antigen MHC pe celule K 562 în cultură înainte (control) și după tratament (24 h de expunere) cu butirat de arginină de concentrații 1 ,□ mM, izobutiramidă la 2 h diferite, de concentrații 1,0 mM și 0,1 mM, cu acid heptafluorobutiric (907388) la o concentrație de 1,0 mM, acid 3-cloropropionic (901409) de concentrație 1,0 mM, monobutirin de concentrație 1,0 mM sau gamainterferon de concentrație 1000 U/ml. Rezultatele obținute sunt ilustrate în fig. 6 și 7. Acidul heptafluorbutiric (907) și ale forme chimice nu au avut efect asupra expresiei MHC. Butiratul de arginină, izobutiramida de concentrație 1,0 mM, acidul 3cloropropionic (901409), monobutirin și gama-interferon, toate au indus expresia MHC de 10 ,,, 50 ori. Izobutiramida de concentrație 0,1 mM a indus expresia MHC de 5 ori.

Exemplul 11. Efectele regulatoare ale derivaților acidului butiric asupra leucemiei și celulelor limfomului. Pentru a defini efectele citotoxice de diferențiere ale butiratului și derivaților butiratului de arginină și ale izobutiramidei asupra liniilor de celule ale leucemiei T și B și asupra celulelor de la pacienți cu leucemie limfocitică cronică (CLL), viabilitatea celulelor a fost studiată prin încercări MIT, iar expresia IL-2R a fost cantitativă. Ca urmare a unei expunerii de 72 h, la acid butiric de concentrație 1,0 mM,procentul de supraviețuire a celulelor CEM, RAJI și NALM6 a fost de 14 ... 25% față de cel de control în timp ce creșterea celulelor HUT 102 a fost relativ neafectată (90% față de control). Limfocite proaspăt recoltate de la doi pacienți CLL au demonstrat o inhibare a creșterii cu 50% și 60% în prezența butiratului de sodiu de concentrații de 1,0 mM.Butiratul de arginină a produs o inhibare a creșterii de un grad similar în liniile celulare și în celulele pacienților, în timp ce izobutiramida, prin contrast, a afectat creșterea doar într-o manieră modestă. Expresia IL-2R, măsurată, folosind ficoeritrină-IL-2, a crescut ca urmare a folosirii acidului butiric și a butiratului de arginină de cinci ori în celulele NALM6 și de 1,5 ... 2 ori în celulele RAJI și CEM. In mod similar, izobutiramida a indus expresia IL-2R pe celulele NALM6 și celulele RAJI, dar nu și pe celulele CEM. Aceste rezultate determină efectele citotoxice sau efectele de diferențiere pentru derivații acidului butiric, asupra liniilor celulare ale leucemiei T și B și asupra celulelor proaspete CLL. Astfel, inducția receptorilor IL-2 de către acești derivați ar demonstra posibilitatea lor clinică de exploatare în combinații cu agenți care țintesc celulele cu expresia IL-2R.

Exemplul 12. Farmacocinetica compușilor. Butiratul de arginină a fost administrat pacienților pe cale intravenoasă, dozele fiind cuprinse între 10 și 50 g/kg greutate corporală, pe zi și pe peprioade de 5 ... 21 zile. Nivelele de plasmă ale medicamentelor au fost determinate din probele de sânge preluate și analizate, la intervale diferite și au fost comparabile în ceea ce privește metoda de administrare.

Nivelele de vârf ale plasmei au fost în domeniul cuprins între 0,3 și 5,0 mM, atât la

RO 115498 Bl animale (maimuță] cât și la oameni. Durata de înjumătățire a serului a fost determinată a fi de aproximativ 15 min. Toate dozele au fost bine tolerate, în general.

Izobutiramida a fost administrată oral, la un anumit număr de pacienți. Acest compus este absorbit rapid în mucoasa gastrică iar nivelele detectabile ale medicamentului au fost prezente la primate și la oameni, pe durate de timp mai mari de 24 h după administrare. Izobutiramida a apărut în plasmă în decurs de 5... 15 min de la administrarea orală. Nivelele de vârf au apărut la aproximativ 2 h, iar timpul de înjumătățire a fost de aproximativ 6,5 ... 10,5 h, în funcție de doza administrată. Studiile efectuate “ in vitro” și in vivo au demonstrat că sinteza globinei fetale, un efect biologic, a fost stimulată sau crescută în timp de 6 h de la expunere, fără a exista efecte secundare adverse.

Pacientul nr. 1 a primit 50 ... 150 mg/kg corp. Nivelele de plasmă au fost cuprinse între 0,9 și 1,88 mM la 2 h după administrare și au scăzut la aproximativ 0,4 mM după 15 ... 22 h după ultima doză. Pacientul nr. 2 a primit 100 mg/kg corp, și după 2 h a prezentat un nivel al medicamentului de 3,6 mM. Nivelele medicamentului, la două h după o altă doză au fost următoarele: 10 mg/kg corp = 0,24 mM; 25 mg/kg corp = 0,44 mM; 60 mg/kg corp = 0,93 mM; 75 mM/kg corp = 1,29 mM. Pacientul nr. 3 a primit o singură doză orală și a prezentat un nivel al serului medicamentului după 2 h de la administrare de 1,88 până la 3,15 mM. Doze suplimentare au fost cuprinse între 60 și 100 mg/kg corp. Dozele următoare de 75 ... 100 mg/kg corp au produs nivele ale medicamentului de 4,32 mM 4 h după administrare, 2,45 mM 8 h după administrare și medicamentul a fost încă detectabil 24 h după administrare. Pacientul nr. 4 a primit o singură doză de 50 mg/kg corp, care a produs nivele ale serului de 1,55 mM la 1,5 h, 1,42 mM la 2 h 1,16 mM la 4 h și 0,49 mM la 12 h. Pacientul nr. 5 a primit două doze orale de 25 ... 100 mg/kg corp și la 2 h a prezentat un nivel al medicamentului cuprins între 0,4 mM și 2,6 mM. Nivelele de medicament s-au acumulat chiar mai ridicate la doze zilnice care au fost administrate multiplu. Toate dozele, la toți pacienții, au fost în general bine tolerate.

Exemplul 13. Reducerea ulcerului la picior, În urma tratamentului cu butirat. Unei paciente în vârstă de 22 ani i s-a administrat ca tratament continuu, timp de 20 de zile, doze crescute (de la 2 g/kg corp] de butirat de arginină pe cale intravenoasă. In timpul zilellor de tratament, ulcerația la picior, care nu a răspuns la tratamentele convenționale incluzând creme și unguente cu antibiotice, a început să dea semne de vindecare. După 20 de zile complete de tratament cu butirat de arginină, ulcerația piciorului aproape că s-a vindecat, iar în continuare s-a vindecat complet. Pacienta nu a mai revenit la tratament, chiar când tratamentul a fost întrerupt mai bine de un an de zile.

Exemplul 14. Expunerea sumară privind experiența cu butirat la pacienții cu neoplasme refractare. Pacientul nr. 1 (nu se referă la pacientul din exmeplul de realizare nr.11] cu melanom metastazat la creer și piele a fost supus unui ciclu complet de 10 zile, la infuzie cu butirat de arginină în concentrație de 500 mg/zi, infuzia efectuându-se pe o perioadă de 6 ... 8 h. Pacientul a simțit o creștere a durerii sub noduli tumorali ai pielii, la 12 h după începerea infuziei, durere care a scăzut la 36 h după întreruperea infuziei, după ziua a cincea. Durerea pacientului s-a înrăutățit din nou, după aproximativ 12 h după începerea infuziei din ziua a șasea, dar cerința de narcotice pentru a controla durerile a fost mai redusă. Aceas tă formă de cancer, nu este în mod general asociată cu dureri ale celulelor neoplastice și durerile nu sunt în legătură cu terapia de infuzie. S-a

1290

1295

1300

1305

1310

1315

1320

1325

1330

RO 115498 Bl crezut că tratamentul ar putea avea oarecare efect. Până la inițierea tratamentului, numărul de celule ale melanomului au continuat să crească, ca având agresivitate a metastazei. Evaluarea, după două săptămâni de la terminarea primului ciclu de tratament, a arătat că leziunile metastazice nu au crescut ca dimensiuni și număr. Nu au existat efecte adverse asupra funcției organelor pacientului și anume în legătură cu ficatul, rinichii, inima, plămânii, tractul gastrointestinal sau măduva oaselor, ca urmare a tratamentului cu butirat de arginină.

Pacinetul nr. 2 era bolnav de cancer metastazic al sânului

In prima zi a infuziei cu butirat de arginină, în cantitate de 500 mg/kg corp/zi, pacientul a raportat o senzație de greață și scădere a apetitului cu 18 h înainte de începerea tratamentului cu medicamente, și a vomitat înainte de începerea infuziei. 4 h după începerea infuziei, pacientul a continuat să aibă greață și a vomitat de cinci ori, în ciuda faptului că a primit medicamente cu efect antiemetic. Pacientul a fost adus la spital pentru hidratare și diagnosticare. Pacientul a avut mai multe episoade de diaree apoasă, două zile, și a avut senzație de greață timp de 36 h. A prezentat și un nivel scăzut de febră, adică 37,9°C. Investigarea care s-a făcut pacientului a inclus, analiza sângelui, urina și scaunul, aptitudinea CT față de R/O. Pacientul a prezentat și un ușor vârf de prednison înainte de a începe tratamentul cu butirat de arginină, și a avut o doză diminuată, o săptămână înainte de inițierea cu butirat de arginină. Pacientul a avut doza de prednison crescută în mod empiric până la nivelele anterioare, iar senzația de greață s-a rezolvat în decurs de 12 h. Pacientul a început primul ciclu cu butirat de arginină.

Pacientul nr. 3 a avut cancer de colon metastazat, la ficat

Acest pacient a efectuat două cicluri de tratament cu izobutiramida în doză de 400 mg/kg corp/zi, fiecare ciclu având o durată de 14 zile. Această desfășurare a tratamentului a fost complicată de apariția unui emesis de 15 ... 30 min, după administrarea medicamentului, în ziua a patra a primului ciclu de desfășurare a tratamentului. Acest emesis, post-doză, a continuat în ciuda unei reduceri a dozei cu 25% și 50%. Ultimile patru zile ale ciclului al doilea de tratament, au avut succes în menținerea medicamentului, după ce în final pacientul a luat o prescripție pentru compazină, care a fost administrată înainte de ingestia izobutiramidei. In timpul desfășurării tratamentului, analiza fenomenului emesis a inclus evaluarea privind obstrucția gastrică/gastrită și CNS întânit, care s-au prezentat ca fiind negative. S-a constatat, în timpul experimentelor, o creștere a fosfatazei alcaline în ser, pe durata celor două cicluri, dar la alte teste privind funcționarea ficatului acestea au rămas stabile. Pacientul a prezentat și o stare de slăbiciune progresivă a extremităților, pe perioada tratamentului cu izobutiramidă. Analiza a inclus MRI a coloanei vertebrale față de meningită carcinomatică R/0 și seria EMG, aceasta din urmă demonstrând procesul de demielinizare a nervului periferic neuniform. Reexaminarea înregistrărilor pe pacienți a sugerat faptul că simptomele neurologice ale pacienților preced inițierea izobutiramidei. Opinia serviciului de neurologie a fost că aceste simptome sunt rezultatul unui proces de demielizare autoimună cronică și nu este în legătură directă cu folosirea butiraților. La recomandarea secției de neurologie, s-a administrat pacientuli Imunoglobulină IV, timp de 1,5 săptămâni după terminarea ciclului al doilea cu îmbunătățirea conducției EMG, dar fără a se constata o îmbunătățire subiectivă. Refacerea tumorii după ce s-au efectuat două cicluri de tratament cu izobutiramidă a demonstrat progresia tumorii din ficat, și pacientul nu a mai făcut obiectul de studiu. Nu au fost constatate efecte adverse

RO 115498 Bl

1385 asupra funcției organelor și anume în ficat, rinichi, plămâni, inimă sau măduva osoasă. Pacientul a prezentat, în urma experimentării, un grad de toxicitate de 2 Gl (2 până la 3 episoade de emesis în timpul a 24 h].

Exemplul 15. Modelul buclei ileale la șobolan, În maladia intestinală inflamatoare. Șobolanii au fost pretratați, timp de trei zile, cu izobutiramidă care a fost administrată oral într-o doză de 100 mg/kg/zi. La sfârșitul acestei perioade, la cinci animale tratate și cinci netratate li s-au creeat pe cale chirurgicală câte trei bucle ileale, pe fiecare animal. S-a administrat lipopolizaharidă pentru a incita răspunsul inflamator în bucle și s-au utilizat doi parametri pentru a determina extinderea colitei: (1) volumul fluidului în bucle și [2] fluxul de manitol prin intestine. La animalele tratate cu izobutiramidă, s-a constatat o reducere în medie cu 40% în volumul fluidului și a fluxului de manitol, în buclele ileale, inducând faptul că izobutiramidă este responsabilă în ceea ce privește moderarea răspunsului inflamator.

Alte exmeple de realizare ale prezentei invenții, sunt evidente pentru specialiștii care lucrează în domeniu. Se dorește ca specificația și exemplele de relaizare prezentate mai sus să fie considerate doar cu titlu de exemple, scopul real și spiritul invenției fiind redate în revendicările care ilustrează prezenta invenție.

Claims

Revendicări

1. Metodă de tratament al neoplasmului, utilizând derivați de acid butiric, caracterizată prin aceea că se administrează unui pacient o cantitate de 500 ... 2000 mg de un derivat stabil de acid butiric care are mai puțin de 8 atomi de carbon și o stabilitate mai mare de 4 h cum ar fi butirat de arginină sau izobutiramidă, pe o perioadă de 14 zile, într-un purtător acceptabil din punct de vedere farmaceutic care să nu conțină în mod substanțial sodiu, și suplimentar, se administrează substanțe chemoterapeutice.
2. Metodă conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că purtătorul acceptabil din punct de vedere farmaceutic este selectat dintr-un grup constând din apă, etanol, ser fiziologic, glicerină, polizaharide și ulei.
3. Metodă conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că se administrează parenteral, sublingual, rectal, enteral, prin absorbție pulmonară sau aplicație topică, iar administrarea parenterală se efectuează prin injecții intravenoase, injecții subcutanate, injecții intramusculare, injecții intraarteriale, injecții intratraheale, injecții intraperitoneale sau injecții direct pe locul neoplasmului.
4. Metodă conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că efectul biologic constă în ameliorarea simptomelor, reducerea dimensiunilor, reducerea volumului și numărului celulelor neoplasmice, inducerea diferențierii sau o modificare în expresia genei.
5. Metodă conform revendicării 4, caracterizată prin aceea că expresia modificată a genei codifică o proteină rezistentă la multi-medicamente, un receptor interleukin, un receptor al factorului de creștere, un antigen specific-tumoral sau un antigen de histocompatibilitate majoră.
6. Metodă conform revnedicării 1, caracterizată prin aceea că se induce diferențierea celulelor neoplasmice, prin reducerea în ceeea ce privește dimensiunile sau

1390

1395

1400

1405

1410

1415

1420

1425

RO 115498 Bl volumul neoplasmului, creșterea sau descreșterea expresiei unei histocompatibilități majore sau a diferențierii antigenului, replica ADN scăzută sau diviziunea celulară coborâtă.
7. Metodă conform revendicării 6, caracterizată prin aceea că antigenul de diferențiere este selectat dintr-un grup constând din receptori ai factorului de creștere, receptori ai interleukinei sau a altor citokine și antigeni ai histocompatibilității majore, de exemplu cum ar fi receptorul interleukin-2 și receptorul factorului de creștere epidermal.
8. Metodă, conform revendicării 1, caracteirzată prin aceea că induce expresia unui antigen a celulei neoplasmice care este selectată dintr-un grup constând din antigeni specifici tumorali, proteine rezistente la multimedicamente, receptori de suprafață celulari și antigeni de histocompatibilitate majoră.
9. Metodă conform revendicării 8, caracterizată prin aceea că receptorul de suprafață celular este un receptor interleukină-2 sau un receptor al factorului de creștere epidermal.
10. Metodă conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că agentul chemoterapeutic este selectat dintr-un grup constând din agenți de achilare, analogi ai purinei și pirimidinei, alcaloizi vinca și de tipul vinca, medicamente etoposide și de tipul etoposidelor, antibiotice, corticosteroide, nitrozuree, antimetaboliți, medicamente citotoxice bazate pe platin, antagoniști hormonali, anti-androgeni și anti-estrogeni.
11. Metodă conform revendicării 10, caracterizată prin aceea că antibioticul este un agent antibacterial, antifungic sau antiviral.
12. Metodă conform revendicării 1D, caracterizată prin aceea că agentul chemoterapeutic este selectat dintr-un grup constând din tamoxifen, doxorubicin, Lasparaginază, dacarbazin, amsacrin, procarbazine, hexametilmelamine și mitoxantrone.
13. Metodă conform revendicării 1, caracterizată prin aceea că tulburarea neoplazică este selectată dintr-un grup constând din leucemii, limfoame, sarcom, carcinom, tumori ale celulei neurale, carcinom al celulei scuamoase, tumori ale celulei embrionare, tumori nediferențiate, seminom, melanom, neuroblast, neoplasme metastazice ale tumorilor celulei mixte, neoplasme datorate infecțiilor patogenice și ale malignizării.