CN112574071A - 一种双胍基连接脂肪碳链的两亲性二甲双胍衍生物及其制药用途 - Google Patents

一种双胍基连接脂肪碳链的两亲性二甲双胍衍生物及其制药用途 Download PDF

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Abstract

本发明属药物制剂技术领域，具体涉及一种双胍基连接脂肪碳链的两亲性二甲双胍衍生物及其制药用途，本发明设计合成了阳离子双胍基连接油酸碳链的二甲双胍两亲性衍生物OA‑Met，使其具有与二甲双胍相似或更好的药代动力学行为、体内分布及药效活性，达到调节肿瘤患者其他器官前转移微环境并抑制体内肿瘤细胞定植和肿瘤转移的目的，该两亲性衍生物为二甲双胍联合其他药物进行联合治疗并同时用于纳米靶向递药系统提供基础，以及改善肿瘤治疗效果。

Description

一种双胍基连接脂肪碳链的两亲性二甲双胍衍生物及其制药 用途
技术领域
本发明属药物制剂领域，涉及一种双胍基连接脂肪碳链的两亲性二甲双胍衍生物及其制药用途，本发明中将二甲双胍结构中的双胍基保留并将两个甲基改造为油酸碳链，合成得到两亲性二甲双胍衍生物OA-Met，其具有与二甲双胍相似或更好的药代动力学行为、体内分布及药效活性，达到调节体内其他器官前转移炎性微环境、抑制肿瘤转移的目的。
背景技术
现有技术公开了肿瘤转移是导致肿瘤患者高死亡率的主要原因之一，目前临床在抑制肿瘤转移尚缺乏有效的治疗干预手段及药物，临床实践显示以手术切除和化疗为主的治疗干预方案仅能抑制原位肿瘤但尚不能有效防止肿瘤转移的发生。有研究发现，原位肿瘤可导致其他器官形成一种局部的前转移微环境，该种微环境可发生一系列与炎症相关的细胞或分子水平的异常改变，如内皮细胞被激活并表达粘附分子，促进肿瘤细胞粘附于内皮细胞并利于肿瘤细胞在此前转移微环境定植，从而产生肿瘤转移，等。
二甲双胍是一种传统的口服降糖药，因其疗效和经济性而成为治疗II型糖尿病的首选药物，并且由于其低毒性，该阳离子药物即使在高达2g/天的剂量下也具有良好的安全性；另有研究表明，除了降糖作用外，二甲双胍还可抑制肿瘤的生长和转移，如，尚在进行的早期临床试验表明二甲双胍具有预防包括结肠直肠癌、前列腺癌、子宫内膜癌和乳腺癌等的潜力；另还有研究表明二甲双胍可通过抑制NF-κB通路发挥有效的抗炎作用，而前转移微环境的异常改变，如激活的内皮细胞所表达的粘附分子与炎性NF-κB通路密切相关，因此二甲双胍显示出潜在的改善前转移微环境的作用，可通过抑制肿瘤细胞与前转移微环境内皮细胞的粘附从而抑制转移的发生；然而该些研究表明二甲双胍在细胞或小鼠水平实验中具有一定的抗癌作用，但在人体临床研究中其治疗效果尚差强人意。
基于现有技术的现状与基础，本申请的发明人拟寻找一种有效安全的抗炎药物并在肿瘤的治疗过程中提供有效抑制前转移微环境的手段，从而抑制肿瘤转移的发生并改善肿瘤的整体治疗效果的药物，具体涉及一种新型二甲双胍两亲性衍生物(OA-Met)，及其制药用途。
发明内容
本发明的目的是基于现有技术的现状与基础，提供一种新型二甲双胍两亲性衍生物(OA-Met)及其制药用途。
本发明中将二甲双胍结构中的双胍基保留并将两个甲基改造为油酸碳链，通过合成得到两亲性二甲双胍衍生物OA-Met，并通过实验考察证实其具有与二甲双胍相似及更好的药代动力学行为、体内分布及药效活性，能达到调节体内其他器官前转移炎性微环境、抑制肿瘤转移的目的，可为二甲双胍联合其他药物进行联合治疗同时应用于纳米靶向递药系统提供基础，改善治疗肿瘤疗效。
本发明提供了一种二甲双胍两亲性衍生物(OA-Met)的制备方法，其包括，保留二甲双胍的亲水性阳离子双胍基团，并将疏水性单不饱和十八碳链连接在双胍基的其中一端，采用一步加成反应合成制得OA-Met。
更具体的，本发明采用亲水性二甲双胍为模型药物，保留其结构中的双胍基并将两个甲基改造为单油酸碳链制得二甲双胍两亲性衍生物OA-Met；按下述合成路线以油胺和二氰二胺为原料，在无水FeCl3催化下进行加热，通过一步加成反应合成两亲性二甲双胍衍生物OA-Met，
Figure BSA0000191569120000021
两亲性二甲双胍衍生物OA-Met合成路线
本发明考察了制得的两亲性二甲双胍衍生物OA-Met是否可通过保留二甲双胍结构中的双胍基使其具有与二甲双胍相似或更好的药代动力学行为、体内分布及药效活性，达到调节体内其他器官前转移炎性微环境、抑制肿瘤转移的目的；
本发明所采用的细胞为小鼠三阴性乳腺癌细胞4T1，绿色荧光蛋白标记的4T1细胞(4T1-GFP)和小鼠脑毛细血管内皮细胞bEnd.3均为本领域所公认且市购获得；
本发明所采用的大鼠为雌性SD大鼠，采用的小鼠为雌性Balb/c小鼠，以上均为本领域所公认且市购获得；
本发明通过体内药代动力学和体内分布实验证明了OA-Met具有与二甲双胍相似或更好的体内药动学行为和体内分布；
本发明验证了OA-Met和二甲双胍能有效抑制前转移微环境中肿瘤细胞对激活内皮细胞的粘附作用；OA-Met的抑制作用显著强于二甲双胍。
本发明设计合成了阳离子双胍基连接油酸碳链的二甲双胍两亲性衍生物OA-Met，经实验表明，其具有与二甲双胍相似或更好的药代动力学行为、体内分布及药效活性，达到调节肿瘤患者其他器官前转移微环境并抑制体内肿瘤细胞定植和肿瘤转移的目的，该两亲性衍生物为二甲双胍联合其他药物进行联合治疗并同时用于纳米靶向递药系统提供基础，以及改善肿瘤治疗效果。
按权利要求1所述的双胍基连接脂肪碳链的两亲性二甲双胍衍生物，其特征在于，所述的两亲性二甲双胍衍生物OA-Met在小鼠乳腺癌原位瘤模型主要器官中及肿瘤组织中，与二甲双胍具有相似或更好的体内药物分布。
更具体的，所述的双胍基连接油酸碳链的两亲性二甲双胍衍生物可制备用于体外抑制肿瘤细胞对前转移微环境中激活内皮细胞的粘附作用的制剂，或用于抑制后续肿瘤细胞在前转移微环境的定植及肿瘤转移的产生的制剂。
附图说明
图1是化合物核磁谱图，其中，
图A是原料油胺的化合物氢谱(1HNMR)；
图B是二甲双胍衍生物OA-Met的化合物氢谱(1HNMR)。
图2是二甲双胍和OA-Met在大鼠血浆中的药时曲线。
图3是二甲双胍和OA-Met在原位瘤小鼠模型中各主要器官组织和肿瘤组织的药物浓度，其中，
图A是尾静脉给药后0.5小时二甲双胍和OA-Met在各主要器官和肿瘤组织的浓度；
图B是尾静脉给药后12小时二甲双胍和OA-Met在各主要器官和肿瘤组织的浓度。
图4是OA-Met对肿瘤细胞与前转移微环境中激活内皮细胞粘附的抑制作用，其中，
图A是OA-Met和二甲双胍对肿瘤细胞与前转移微环境中激活内皮细胞粘附抑制作用的定性结果；
图B是OA-Met和二甲双胍对肿瘤细胞与前转移微环境中激活内皮细胞粘附抑制作用的定量结果；
其中，****P＜0.0001.
具体实施方式
实施例1：OA-Met的合成和表征
采用一步法化学合成OA-Met。将300mg油胺、140mg二氰二胺和15mL的1，4-二氧六环加入到50mL反应瓶中，室温搅拌下缓慢滴加180mg无水三氯化铁的1，4-二氧六环溶液(2mL)，加热至90℃并搅拌过夜，冷却至室温，减压蒸除溶剂，柱层析纯化得最终产物OA-Met(淡黄色油状物)；
结果显示：1HNMR显示原料油胺在δ1.2显示氨基氢信号，而终产物OA-Met在δ1.2的氨基氢信号消失，并出现特征双胍基氢信号(δ6.5-7.2)，其他氢信号基本不变，解析后与结构一致，证明该反应方案成功以油胺和二氰二胺为原料合成OA-Met。
实施例2：OA-Met的体内药代动力学考察
考察OA-Met的体内药代动力学性质，将6只SD大鼠分成2组(n＝3)，通过大鼠尾静脉注射二甲双胍和OA-Met，二甲双胍的给药剂量为8mg/kg。注射后分别在0.083、0.25、0.5、1、2、4、6、8、12和24小时采集250μL血样，并加至含肝素的EP管中，然后立即将血液样品以4500rpm速度离心10分钟，取30μL上清液血浆样品，加入甲醇(150μL)沉淀蛋白质后并将样品涡旋5分钟，随后10000rpm离心10分钟，最后取适量上清液进行LC-MS/MS分析，并通过药物和统计学软件(DAS 2.0)计算主要药代动力学参数，并绘制药时曲线；
表1是二甲双胍和OA-Met在大鼠血浆中的主要药动学参数，
表1
Figure BSA0000191569120000041
结果显示：直接检测血浆中二甲双胍和OA-Met的浓度绘制药时曲线，同时计算主要药代动力学参数，根据药时曲线和药动学参数曲线下面积(AUC0-24h)、半衰期(t1/2)、清除率(CL)和平均驻留时间(MRT0-24h)可知，OA-Met具有与二甲双胍相似的药代动力学行为，而OA-Met药动学参数略好于二甲双胍。
实施例3：OA-Met在体内主要器官及肿瘤组织中分布的评价
取对数生长期的4T1细胞，细胞悬液浓度调整为1×108cells/mL，置于4℃条件下备用，雌性Balb/c小鼠腹腔注射120μL的5％水合氯醛麻醉，脱毛褪下小鼠左侧第三和第四对乳脂垫的体毛，将细胞悬液接种于小鼠的第四对左侧的乳脂垫内，小鼠乳脂垫处出现明显充盈后，慢慢移出针头，在伤口处滴适量抗生素，至小鼠苏醒后继续饲养；
在接种4T1后第14天，将小鼠分成2组(n＝6)，通过尾静脉分别注射二甲双胍和OA-Met，二甲双胍的给药量为8mg/kg；给药0.5小时后，每组随机取3只小鼠常规处理，收集主要器官(心、肝、脾、肺、肾)和肿瘤组织，对所有器官组织进行称重，将各组织器官浸入1mL生理盐水中并高速匀浆，将900μL甲醇加入至50μL组织匀浆液中沉淀蛋白，将样品涡旋5分钟后以10000rpm离心10分钟，最后上清液中二甲双胍和OA-Met的浓度通过LC-MS/MS进行检测；另外给药12小时后，每组中剩余3只小鼠的二甲双胍和OA-Met的体内分布同样通过上述方法进行检测；
结果显示：在给药后0.5小时和12小时，OA-Met在心、脾、肾和肿瘤组织中具有与二甲双胍相似的分布情况，而在肺(具有前转移微环境)和肝中OA-Met的分布多于二甲双胍，结果表明OA-Met具有与二甲双胍相似的体内分布情况。
实施例4：OA-Met对肿瘤细胞与前转移微环境中激活内皮细胞粘附的抑制作用考察
将对数生长期的bEnd.3细胞以5×105个/孔的密度接种到6孔板中(n＝3)，孵育24小时后，加入50ng/mL的TNF-α的无血清DMEM稀释液刺激细胞4小时，并分别加入二甲双胍、OA-Met(二甲双胍的给药浓度为0.85μg/mL)和无血清DMEM并共孵育24小时，PBS缓冲液漂洗细胞后直接加入对数生长期4T1-GFP细胞的无血清培养基悬浮液(肿瘤细胞与内皮细胞数量比为1∶1)，培养40分钟后，用PBS缓冲液漂洗细胞除去未粘附的4T1-GFP，4％多聚甲醛溶液固定细胞并用Hoechst 33258对细胞核染色，使用倒置荧光显微镜对绿色荧光4T1-GFP进行拍照并定量计数；
结果显示：在TNF-α激活内皮细胞的情况下，与正常内皮细胞相比，4T1-GFP细胞对激活内皮细胞的粘附数量显著增多，可能由于TNF-α刺激内皮细胞高表达粘附分子促进肿瘤细胞与内皮细胞的粘附作用，二甲双胍和OA-Met均可显著抑制这种粘附作用，其中OA-Met的作用显著强于二甲双胍，可能由于二甲双胍的水溶性阻止其被内皮细胞摄取降低其药效，而OA-Met本身的两亲性和亲水头基的正电荷促进其被内皮细胞摄取降低粘附分子表达，从而抑制这种粘附作用；本实验直观考察肿瘤细胞与内皮细胞粘附作用，结果表明，所述的OA-Met可有效抑制这种粘附作用，可防止后续肿瘤细胞在前转移微环境的定植及转移发生。

Claims (5)

1.一种双胍基连接脂肪碳链的两亲性二甲双胍衍生物，其特征在于，保留二甲双胍的亲水性阳离子双胍基团，并将疏水性单不饱和十八碳链连接在双胍基的其中一端，采用一步加成反应合成制得双胍基连接脂肪碳链的两亲性二甲双胍衍生物OA-Met。
2.权利要求1所述的双胍基连接脂肪碳链的两亲性二甲双胍衍生物的制备方法，其特征在于，采用亲水性二甲双胍为模型药物，保留其结构中的双胍基并将两个甲基改造为单油酸碳链制得二甲双胍两亲性衍生物OA-Met；按下述合成路线以油胺和二氰二胺为原料，在无水FeCl3催化下进行加热，通过一步加成反应合成两亲性二甲双胍衍生物OA-Met，
Figure FSA0000191569110000011
3.按权利要求1所述的双胍基连接脂肪碳链的两亲性二甲双胍衍生物，其特征在于，所述的两亲性二甲双胍衍生物OA-Met在小鼠乳腺癌原位瘤模型主要器官中及肿瘤组织中，与二甲双胍具有相似或更好的体内药物分布。
4.权利要求1所述的双胍基连接油酸碳链的两亲性二甲双胍衍生物在制备用于体外抑制肿瘤细胞对前转移微环境中激活内皮细胞的粘附作用的制剂中的用途。
5.权利要求1所述的双胍基连接油酸碳链的两亲性二甲双胍衍生物在制备用于抑制后续肿瘤细胞在前转移微环境的定植及肿瘤转移的产生的制剂中的用途。
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