ES2266512T3 - Composiciones para inhibir angiogenesis. - Google Patents

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Abstract

Uso de una composición para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades asociadas con la angiogénesis patógena seleccionadas de enfermedades oculares y una enfermedad asociada con la inflamación crónica seleccionada del grupo constituido por sarcoidosis, y artritis reumatoide, la composición comprende como un ingrediente activo un compuesto de fórmula I: (Ver fórmula) - R1 y R2 son grupos funcionales hidroxilos; - R3 es un grupo funcional seleccionado del grupo constituido por hidrógeno, alquilo C1-C6, alquenilo C2-C6, alquinilo C2-C6, arilo, hidroxilo, alcoxi C1-C6, halógeno, NO2, NH3 y COOCH3; X1-X3 son grupos funcionales seleccionados del grupo constituido por oxígeno, azufre, -CH2-, o o carboxi; - R4 es un grupo funcional seleccionado del grupo constituido por hidrógeno, alcoxi-C1-C6, glucosa, B-D-glucopiranosa, alquilo C1-C6, alquenilo C2-C6, alquinilo C2-C6, arilo, hidroxilo, halógeno, NO2, NH3, carbohidratos, amino ácido, nucleótidos y lípidos; y - R5 es un grupo funcional seleccionado del grupo constituido por hidrógeno, alquilo C1-C6, alquenilo C2-C6, alquinilo C2-C6, arilo, hidroxilo, alcoxi C1-C6, halógeno, NO2, NH3, y CH3, dicha enfermedad ocular se selecciona del grupo constituido por retinopatía diabética, retinopatía prematura, rechazo del injerto corneal, glaucoma neovascular y fibroplasias retrolental, queratoconjuntivitis epidémica, deficiencia de vitamina A, agotamiento de lentes de contacto, queratitis atópica, queratitis límbica superior, queratitis seca de pterigión, sjogrens, acné rosácea, flictenulosis, sífilis, infecciones micobacterianas, degeneración lipídica, quemaduras con sustancias corrosivas, úlceras bacterianas, úlceras micóticas, infecciones protozoarias, sarcoma de Kaposi, úlcera de Mooren, degeneración marginal de terrien, queratolisis marginal, trauma, lupus sistémico, poliarteritis, sarcoidosis de Wegener, escleritis, enfermedad de Steven-Johnson, caratotomía radial perafigoide, y rechazo al injerto corneal, retinopatía diabética, degeneración macular, anemia falciforme, sarcoide, sífilis, seudoxantoma elástico, y enfermedad de Pager, oclusión de la vena, oclusión de la arteria, enfermedad obstructiva de la carotida, uveitis/vitritis crónica, infecciones micobacterianas, enfermedad de Lyme, eritematosis del lupus sistémico, retinopatía de prematuridad, enfermedad de Eales, enfermedad de Bechets, infecciones que causan una retinitis o coroiditis, presunta histoplasmosis ocular, enfermedad de Bests, miopía, fosetas papilares, enfermedad de Stargarts, pars planitis, desprendimiento de retina crónico, síndromes de hiperviscosidad, toxoplasmosis, complicaciones post-láser y trauma, rubeosis y retinopatía atrial proliferativa.

Description

Composiciones para inhibir angiogénesis.
Antecedentes de la invención
La angiogénesis es el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos a partir de microvasos previamente existentes. El procedimiento angiogénico es un procedimiento natural y regulado en la curación de la herida, desarrollo fetal y embrionario y en la formación del cuerpo lúteo, endometrio y placenta. Estos procedimientos son vitales para la salud y el crecimiento y están muy bien regulados mediante promotores e inhibidores angiogénicos. En estados morbosos, sin embargo, esta regulación se puede evitar y conducir a la angiogénesis patógena. La angiogénesis patógena es una angiogénesis no deseada y es el objetivo de las intervenciones terapéuticas. Un número de enfermedades humanas se caracterizan por angiogénesis no deseada. Estas incluyen cáncer, retinopatía diabética, degeneración macular asociada a la edad, la formación del panus artrítico y en soriasis.
En el cáncer, por ejemplo, la angiogénesis juega un papel crítico en la supervivencia y metástasis de tumores. Los tumores segregan factores angiogénicos que promueven la división y migración de las células endoteliales, las cuales empiezan el proceso angiogénico. Ha llegado a estar claro que los tumores necesitan vascularizarse para crecer y metastatizar. Si un suministro de sangre del tumor se reduce, el tumor no crece más allá de 0,4 mm. Las células tumorales, ausente un adecuado suministro de sangre, al final llegan a ser necróticas y/o apoptóticas. Así la vasculatura de la sangre y especialmente los vasos sanguíneos nuevos crecen o la angiogénesis es un importante aspecto de la biología de tumores. Las terapias dirigidas contra la angiogénesis podrían conducir a la anulación o alivio de estas enfermedades.
La patogénesis y ceguera asociadas con las enfermedades oculares tales como la retinopatía diabética y degeneración macular asociada a la edad es un resultado de la angiogénesis no deseada. En el tejido ocular, la angiogénesis es la causa más común de ceguera. La retinopatía diabética proliferativa se caracteriza por la incursión de los vasos sanguíneos de la retina del vítreo. La degeneración macular asociada a la edad es una enfermedad de la mácula y se distingue de forma seca por los vasos sanguíneos coroideos en el crecimiento hacia el interior de la membrana penetrante de bruch. La patología angiogénica también se asocia con la retinopatía de prematuridad, rechazo del injerto corneal, glaucoma neovascular y fibroplasia retrolental. Las enfermedades asociadas con la neovascularización retinal/coroidal incluyen, pero no se limita a, retinopatía diabética, degeneración macular, anemia falciforme, sarcoide, sífilis, seudoxantoma elástico, y enfermedad de Paget.
Breve resumen de la invención
Esta invención se refiere a compuestos para inhibir la vascularización de las células endoteliales, mediante el contacto una célula, tejido u órgano que tiene células endoteliales con una cantidad anti-angiogénica de un compuesto de Fórmula I. Los compuestos de la Fórmula I tiene la siguiente fórmula general:
Fórmula I
1
En la fórmula I, R1 y R2 son grupos funcionales que incluyen, hidroxilos.
En la fórmula I, R3 es un grupo funcional que incluyen, hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{6}, alquenilos C_{2}-C_{6}, alquinilos C_{2}-C_{6}, arilo, hidroxilo, alcoxi C_{1}-C_{6}, halógeno, NO_{2}, NH_{3}, y COOCH_{3}.
En la fórmula I, R4 es un grupo funcional que incluye, hidrógeno, alcoxi-C_{1}-C_{6}, glucosa, B-D-glucopiranosa, alquilo C_{1}-C_{6}, alquenilo C_{2}-C_{6}, alquinilo C_{2}-C_{6}, arilo, hidroxilo, halógeno, NO_{2}, NH_{3}, carbohidrato, aminoácido, nucleótido y lípido.
En la fórmula I, R5 es un grupo funcional que incluye, hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{6}, alquenilo C_{2}-C_{6}, alquinilo C_{2}-C_{6}, arilo, hidroxilo, alcoxi C_{2}-C_{6}, halógeno, NO_{2}, NH_{3}, y CH_{3.}
En la fórmula I, X1-X3, son grupos funcionales que incluyen, oxigeno, azufre, -CH_{2}-, o carboxi, los cuales pueden ser diferentes pero preferiblemente son grupos funcionales idénticos.
En una realización preferida de la invención, el compuesto de fórmula I es oleoeuropeína con fórmula C_{25}H_{32}O_{13}, como se describe en la décima edición de THE MERK INDEX con monográfico número 6709, y se muestra en la Fórmula II.
Fórmula II
2
El extracto de planta x, que puede comprender cualquiera de los etanólico, acetona, ácido o base inorgánico y orgánico y/o extracción acuosa del extracto de planta x que contiene: oleoeuropeína, el compuesto mostrado en la fórmula II. El extracto de planta x deriva de plantas que incluyen las hojas, brotes, fruta, madera, corteza y las raíces del árbol del olivo Olea europea L., el árbol de alheña, Ligustrum obtusifolium (Oleaceae), etc.
Esta invención también se refiere a compuestos para usar en un procedimiento para inhibir potencialmente la angiogénesis no deseada en un tejido u órgano, el procedimiento comprende el contacto de la célula con un etanólico, acetona, ácido o base inorgánico y orgánico y/o disolución acuosa del extracto x de vegetal o un derivado del etanólico, acetona, ácido o base inorgánico y orgánico y/o disolución acuosa o un componente del mismo, que contiene oleoeuropeína, el compuesto mostrado en la fórmula II o un derivado del mismo como se muestra en la fórmula I o productos de sus hidrólisis, los cuales incluyen oleoeuropeína aglicona, ácido elenólico, alcohol beta-3,4-dihidroxifenietilo, y metil-o-metil elenolato o una composición farmacéutica de los mismos, en una cantidad suficiente para inhibir la angiogénesis. En una realización actualmente preferida, la célula es un organismo vivo.
Esta invención reivindica el uso de una composición para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades asociadas con la angiogénesis patógena seleccionada de las enfermedades oculares y una enfermedad asociada con la inflamación crónica seleccionada del grupo constituido por sarcoidosis, y artritis reumatoide, la composición comprende como un ingrediente activo un compuesto de fórmula I:
3
donde
- R1 y R2 son grupos funcionales hidroxilos;
- R3 es un grupo funcional seleccionado del grupo constituido por hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{6}, alquenilo C_{2}-C_{6}, alquinilo C_{2}-C_{6}, arilo, hidroxilo, alcoxi C_{1}-C_{6}, halógeno, NO_{2}, NH_{3} y COOCH_{3}; X1-X3 son grupos funcionales seleccionados del grupo constituido por oxígeno, azufre, -CH_{2}-, o carboxi;
- R4 es un grupo funcional seleccionado del grupo constituido por hidrógeno, alcoxi-C_{1}-C_{6}, glucosa, B-D-glucopiranosa, alquilo C_{1}-C_{6}, alquenilo C_{2}-C_{6}, alquinilo C_{2}-C_{6}, arilo, hidroxilo, halógeno, NO_{2}, NH_{3}, carbohidratos, amino ácido, nucleótidos y lípidos; y
- R5 es un grupo funcional seleccionado del grupo constituido por hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{6}, alquenilo C_{2}-C_{6}, alquinilo C_{2}-C_{6}, arilo, hidroxilo, alcoxi C_{1}-C_{6}, halógeno, NO_{2}, NH_{3}, y CH_{3}, dicha enfermedad ocular se selecciona del grupo constituido por retinopatía diabética, retinopatía prematura, rechazo del injerto corneal, glaucoma neovascular y fibroplasias retrolental, queratoconjuntivitis epidémica, deficiencia de vitamina A, agotamiento de lentes de contacto, queratitis atópica, queratitis límbica superior, queratitis seca de pterigión, sjogrens, acné rosácea, flictenulosis, sífilis, infecciones micobacterianas, degeneración lipídica, quemaduras con sustancias corrosivas, úlceras bacterianas, úlceras micóticas, infecciones protozoarias, sarcoma de Kaposi, úlcera de Mooren, degeneración marginal de terrien, queratolisis marginal, trauma, lupus sistémico, poliarteritis, sarcoidosis de Wegener, escleritis, enfermedad de Steven -Johnson, caratotomía radial perafigoide, y rechazo al injerto corneal, retinopatía diabética, degeneración macular, anemia falciforme, sarcoide, sífilis, seudoxantoma elástico, y enfermedad de Pager, oclusión de la vena, oclusión de la arteria, enfermedad obstructiva de la carotida, uveitis/vitritis crónica, infecciones micobacterianas, enfermedad de Lyme, eritematosis del lupus sistémico, retinopatía de prematuridad, enfermedad de Eales, enfermedad de Bechets, infecciones que causan una retinitis o coroiditis, presunta histoplasmosis ocular, enfermedad de Bests, miopía, fosetas papilares, enfermedad de Stargarts, pars planitis, desprendimiento de retina crónico, síndromes de hiperviscosidad, toxoplasmosis, complicaciones post-láser y trauma, rubeosis y retinopatía atrial proliferativa dicho uso comprende administrar a un animal vivo un compuesto antiangiogénico de los etanólico, acetona, ácido inorgánico y orgánico o base y/o solución acuosa del extracto x de la planta o un derivado del etanólico, acetona, ácido o base inorgánico y orgánico y/o disolución acuosa del extracto x de vegetal o un derivado del etanólico, acetona, ácido o base inorgánico y orgánico y/o disolución acuosa o un componente del mismo, que contiene oleoeuropeína, el compuesto mostrado en la fórmula II o un derivado del mismo como se muestra en la fórmula I o productos de sus hidrólisis, los cuales incluyen oleoeuropeína aglicona, ácido elenólico, alcohol beta-3,4-dihidroxifenietilo, y metil-o-metil elenolato o una composición farmacéutica de los mismos, disolución en una cantidad suficiente para inhibir la angiogénesis. Estos compuestos se utilizan para mejorar los efectos de las condiciones que se caracterizan por angiogénesis anormal o indeseable o proliferación de células endoteliales y/o migración.
Otras características, objetivos y ventajas de la invención y sus realizaciones preferidas llegarán a ser evidentes a partir de la descripción detallada que sigue.
Breve descripción de los dibujos
Estas así como otras características de la presente invención llegarán a ser más evidentes en referencia a los dibujos en los que:
Gráfica 1A. la gráfica de la inhibición del crecimiento de los vasos sanguíneos mediante oleoeuropeína en base al número de nódulos de los vasos sanguíneos en la membrana corioalantoica de pollo (CAM). Las gráficas de barra representan los valores del error promedio y estándar. El significado estadístico se obtuvo usando una prueba t individual.
Gráfica 1B. la gráfica de la inhibición del crecimiento de los vasos sanguíneos mediante oleoeuropeína basada en el número final de vasos sanguíneos en el CAM. Las gráficas de barra representan los valores de error promedio y estándar. El significado estadístico se obtuvo usando una prueba t individual.
Figura 1. Las fotografías representativas ilustran la inhibición de la angiogénesis mediante una disolución acuosa de oleoeuropeína. Los embriones de pollo de tres días se inyectaron con 0,5 cc que contenían 9,3 \mum/huevo de oleoeuropeína. Las inyecciones se hicieron directamente en el saco de yema. Los embriones se incubaron durante 4 días posteriores a la inyección. El huevo se rompió y el CAM se fotografió usando una cámara Kodak de 100 mds.
Figura 2. Las fotografías representativas ilustran la inhibición de la angiogénesis mediante una disolución acuosa de oleoeuropeína. Los embriones de pollo de tres días se inyectaron con 0,5 cc que contenían 0,93 \mum/huevo de oleoeuropeína. Las inyecciones se hicieron directamente en el saco de yema. Los embriones se incubaron durante 4 días posteriores a la inyección. El huevo se rompió y la CAM se fotografió usando una cámara Kodak de
100 mds.
Figura 3. Las fotografías representan la ilustración del nivel de angiogénesis en el control. Los efectos de una disolución acuosa en angiogénesis. Los embriones de pollo de tres días se inyectaron con 0,5 cc de agua destilada. Las inyecciones se hicieron directamente en el saco de yema. Los embriones se incubaron durante 4 días posteriores a la inyección. El huevo se rompió y la CAM se fotografió usando una cámara Kodak de 100 mds.
Figura 4. Compara los lechos capilares de CAM de control y experimental. Muestra la desaparición de los capilares en los huevos tratados con oleoeuropeína.
Figura 5. Una preparación completa del embrión incluyendo la CAM. Ilustra el efecto de la oleoeuropeína en el tamaño de la CAM y posteriormente en el tamaño del embrión.
Figura 6. Las fotografías representativas ilustran la inhibición de angiogénesis mediante una disolución acuosa de un extracto de hoja de olivo. Las fotografías (A), (B), y (C) representan las CAM de control de embriones inyectados con agua/disolución salina. Las fotografías (D), (E), y (F) representan los embriones de pollo que se inyectaron con 0,5 cc de extracto de hoja de olivo. Las inyecciones se hicieron directamente en el saco de yema. Los embriones se incubaron durante 4 días posteriores a la inyección. Los huevos se rompieron y la CAM se fotografió usando una cámara Kodak de 100 mds.
Figura 7. Las fotografías comparadas ilustran la inhibición de angiogénesis mediante una solución acuosa de oleoeuropeína. La fotografía (A) muestra de una oreja de un ratón adulto que no se ha quemado o tratado en todo caso. La vascularización representa la que se encuentra normalmente en la oreja del ratón adulto. La fotografía (B) representa la inducción del crecimiento de los vasos sanguíneos mediante una quemadura con hidróxido sódico. Una respuesta angiogénica muy significativa se produce en comparación a la oreja no quemada. La fotografía (C) muestra una mayor respuesta detallada al cubrir totalmente el área quemada. Los vasos sanguíneos se pueden ver crecer rápidamente a partir de los existentes y viajando hacia la quemadura. La fotografía (D) muestra una oreja de ratón que ha sido quemada pero el crecimiento de los nuevos vasos sanguíneos se ha inhibido mediante inyecciones intraperitoneales de oleoeuropeína.
Figura 8. Las fotografías comparadas ilustran la inhibición de la angiogénesis mediante disolución acuosa de oleoeuropeína. Las fotografías (A), (B), (C) y (D) muestran orejas de ratones adultos que han sido quemadas mediante hidróxido de sodio según se describe a continuación. La vascularización representa la inducción del crecimiento de los vasos sanguíneos mediante la incineración del hidróxido de sodio. Se produjo una respuesta angiogénica muy significativa en comparación a la oreja no quemada. Las fotografías (E), (F), (G), y (H) muestran las orejas de ratón que han sido quemadas mediante hidróxido de sodio, pero los ratones se trataron con oleoeuropeína. El crecimiento de los vasos sanguíneos se inhibió potencialmente por los tratamientos de oleoeuropeína.
Descripción detallada de la invención A. Definiciones
El término "animal" se refiere a un organismo con un sistema circulatorio cerrado de vasos sanguíneos e incluye aves, mamíferos y cocodrilos. El término "animal" usado aquí también incluye sujetos humanos.
El término "angiogénesis" se refiere a la generación de nuevos vasos sanguíneos en células, tejidos, órganos o tumores.
El término "metástasis" se refiere al proceso por el cual las células del tumor se extienden en distintas partes del cuerpo. El término aquí también usado se refiere a un tumor que se desarrolla a través de un proceso metastático.
El término "contactando" se usa aquí intercambiable con lo siguiente: combinado con, añadido a, mezclado con, pasado sobre, incubado con, fluido sobre, etc. Además, los compuestos de la presente invención se pueden "administrar" mediante algún procedimiento convencional tal como, por ejemplo, vías parenteral, oral, tópical, y de inhalación como se describen aquí.
El término "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a aquellas sales de compuestos los cuales retienen las propiedades y efectividad biológica de las bases libres y las cuales se obtienen por reacción con ácidos inorgánicos tales como ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido p-toluenosulfonico y ácido salicílico. Las sales farmacéuticamente aceptables incluyen, por ejemplo, sales de metales alcalinos, tales como sodio y potasio, sales alcalinotérreas y sales amónicas.
"Una cantidad suficiente", "una cantidad efectiva", "cantidad efectiva terapéuticamente" o cantidad "anti-angiogénico" se refiere a una cantidad de un compuesto o composición efectiva para disminuir, ocultar o inhibir la angiogénesis o resultar en aumento de síntomas asociados con una enfermedad angiogénica. El resultado deseado puede ser o un alivio subjetivo de un síntoma o una mejora identificable objetiva en el recipiente de la dosificación, una reducción en la vascularización de las células endoteliales o una reducción en el índice de angiogénesis como se notará por un clínico u otro observador cualificado.
Los términos "tratamiento de cáncer", "terapia", y similares se refieren generalmente a cualquier mejora en los mamíferos que tienen cáncer en la que la mejora se puede atribuir al tratamiento con los compuestos de la presente invención. La mejora puede ser bien subjetiva o bien objetiva. Por ejemplo, si el mamífero es humano, el paciente puede notar un vigor o vitalidad mejorados o dolor disminuido como síntomas subjetivos de mejora o respuesta a la terapia. Alternativamente, la clínica puede darse cuenta de la reducción del tumor en el tamaño del tumor o masa del tumor en base a examen físico, parámetros de laboratorio, marcadores tumorales o hallazgos de radiografías. Algunas señales de laboratorio que la clínica puede observar para respuesta a la terapia incluyen normalización de pruebas tales como recuento de glóbulos blancos, recuento de glóbulos rojos, recuento de plaquetas, índice de sedimentación de eritrocitos, y diversos niveles de enzima. Adicionalmente, la clínica puede observar un decrecimiento en un marcador del tumor detectable. Alternativamente, se pueden usar otras pruebas para evaluar la mejora objetiva tales como sonogramas, pruebas de resonancia magnética nuclear y prueba de emisiones de positrón.
"Inhibir el crecimiento de las células tumorales" se puede evaluar por cualquier procedimiento aceptado de medir si el crecimiento de las células tumorales se ha ralentizado o disminuido. Esto incluye la observación directa y la evaluación indirecta tal como síntomas sujetivos o señales objetivas según se trata arriba.
El término "alquilo" se usa aquí para referirse a un radical de hidrocarburo monovalente, ramificado o no ramificado, saturado o insaturado, que tiene desde 1-12 carbonos y preferiblemente, desde 1-6 carbonos. Cuando el grupo alquilo tiene a partir de 1-6 átomos de carbono, se refiere como un "alquilo inferior". Los radicales alquilo adecuados incluyen, por ejemplo, metilo, etilo, n-propilo, i-propilo, 2-propenilo (o alilo), n-butilo, t-butilo, i-butilo (o 2-metilpropilo). Según se usa en el presente documento, el término engloba "alquilos sustituidos".
"Alquilo sustituido" se refiere a un alquilo como se acaba de describir que incluye uno o mas grupos funcionales como alquilo inferior, arilo, acilo, halógeno (es decir, alquilhalos, por ejemplo, CF_{3}), hidróxido, amino, alcóxidos, alquilamina, acilamino, acilóxido, arilóxido, ariloxi-alquilo, mercapto, tanto hidrocarburos cíclicos saturados como insaturados, y heterociclos. Estos grupos se pueden adjuntar a cualquier carbono de la fracción de alquilo.
El término "S-alquilo" que se usa aquí para referirse al grupo -SR, donde R es un alquilo inferior o un alquilo inferior sustituido según se define en el presente documento.
El término "arilo" se usa en el presente documento para referirse a un sustituyente aromático el cual puede ser un anillo aromático sencillo o anillos aromáticos múltiples que se fusionan juntos, enlazados covalentemente, o enlazados a un grupo común como una fracción de metileno o etileno. El grupo enlazador común también puede ser un carbonilo como en benzofenona. El/los anillo(s) arómatico(s) puede(n) incluir fenilo, naftilo, bifenilo, difenilmetilo y benzofenona entre otros. El término "arilo" engloba "arilalquilo".
"Aril sustituido" se refiere a un arilo como se acaba de describir que incluye uno o más grupos funcionales tales como alquilo inferior, acilo, halógeno, alquilhalos (por ejemplo, CF_{3}), hidroxi, amino, alcoxi, alquilamina, acilamino, aciloxi, mercapto y tanto hidrocarburos cíclicos saturados como insaturados los cuales se fusionan a el/los anillo(s) aromático(s), enlazados covalentemente o enlazados a un grupo común como un resto de metileno o etileno. El grupo enlazado también puede ser un carbonilo como en ciclohexilfenilcetona. El término "aril sustituido" engloba "arilaquil sustituido".
El término "halógeno" se usa en el presente documento para referirse a los átomos de flúor, bromo, cloro y yodo.
El término "hidróxi" se usa en el presente documento para referirse al grupo -OH.
El término "amino" se usa para referirse al grupo -NRR', donde R y R' puede ser independientemente hidrógeno, alquilo, alquilo sustituido, arilo, arilo sustituido o acilo.
El término "nitro" se usa en el presente documento para referirse al grupo -NO_{2}.
El término "alcoxi" se usa en el presente documento para referirse al grupo -OR, donde R es un alquilo inferior, alquilo inferior sustituido, arilo, arilo sustituido, arilaquilo o arilalquilo sustituido en el que los grupos l alquilo, arilo arilo sustituido, arilalquilo y arilalquilo sustituido son como se ha descrito aquí. Radicales alcoxi adecuados incluyen, por ejemplo, metoxi, etoxi, fenoxi, fenoxi sustituido, benciloxi, fenetiloxi, t-butoxi.
El término "alquenilo" se usa en el presente documento para referirse a un radical hidrocarburo monovalente de cadena lineal, ramificada o cíclica insaturada que tiene al menos un enlace doble carbono-carbono. El radical puede estar en bien en la conformación cis o bien en la trans en relación a el/los doble(s) enlace(s). Los radicales alquenilos adecuados incluyen, por ejemplo, etenilo, propenilo, isopropenilo, ciclopropenilo, butenilo, isobutenilo, ciclobutenilo, terc-butenilo, pentenilo, hexenilo.
El término "alquinilo" se usa en el presente documento para referirse a un radical de hidrocarburo monovalente de cadena lineal, ramificada o cíclica insaturada que tiene al menos un enlace triple carbono-carbono. Los radicales alquinilos adecuados incluyen, por ejemplo, etinilo, propinilo, butinilo, isobutinilo, pentinilo, hexinilo.
B. Compuestos
La presente invención se refiere al descubrimiento de compuestos de fórmula I inhiben angiogénesis y son útiles para el tratar enfermedades angiogénicas. Los compuestos de fórmula I tienen la siguiente fórmula general:
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Fórmula I
4
En la que R1, R2, R3, R4, R5 y X1, X2 y X3 son como se definen anteriormente. En una realización preferida de la invención, el compuesto de formula I es oleoeuropeína según se muestra abajo en la Fórmula II:
Fórmula II
5 
\vskip1.000000\baselineskip
Oleoeuropeína, el compuesto usado en la presente invención puede ser fácilmente obtenido a partir de plantas que incluyen el árbol de oliva Olea europea L. y el árbol de alheña, Ligustrum obtusifolium (Oleaceae).
Los compuestos adecuados para usar en los procedimientos de la presente invención se pueden identificar fácilmente usando ensayos de rastreo in vivo e in vitro. Tales ensayos pueden rastrear la capacidad de un compuesto particular para inhibir la angiogénesis o la vascularización de células endoteliales in vitro e in vivo. Por ejemplo, el ensayo de la membrana corioalantoica del embrión de pollo (CAM), el cual se describe con más detalle más adelante, se puede usar para rastrear un compuesto dado en busca de su capacidad de inhibir la vascularización. En el ensayo de la membrana corioalantoica como se lleva a cabo en esta invención, los embriones de pollo fecundados se inyectaron con un compuesto en el día 3 ó 4. Los embriones luego se dejaron desarrollarse durante 4 días tras la inyección tras los cuales la cáscara se rompe y se fotografía. Se pudo valorar la complejidad de vascularización en base al número de nódulos y extremos de vasos sanguíneos la CAM la complejidad de vascularización se pudo valorar. Este ensayo se pudo usar para valorar las propiedades anti-angiogénicas de los compuestos en esta invención. Será fácilmente patente para aquellos expertos en la técnica que los compuestos en esta invención se pueden administrar solos, en forma de una sal farmacéuticamente aceptable y/o en forma de una composición farmacéutica.
C. Usos para los compuestos de la presente invención
Como se ha explicado arriba, la presente invención se refiere al descubrimiento de que compuestos de fórmula I o su realización preferida oleoeuropeína, o sus productos de hidrólisis son útiles para inhibir la angiogénesis y, sucesivamente, para tratar enfermedades asociadas con angiogénesis indeseada. Como tal, la presente invención se refiere a un procedimiento de angiogénesis no deseada en una célula el procedimiento comprende el contacto de la célula con una cantidad efectiva, es decir, una cantidad anti-angiogénica, de un compuesto de fórmula I o su realización preferida oleoeuropeína o sus productos de hidrólisis. La presente invención también se refiere a un procedimiento de inhibir la vascularización de las células endoteliales, el procedimiento comprende poner en contacto una célula, tejido u órgano que contiene las células endoteliales con una cantidad efectiva de un compuesto de fórmula I o su realización preferida oleoeuropeína o sus productos de hidrólisis. En una realización preferida actualmente, las células están en un sujeto animal.
Esta invención reivindica el uso de una composición para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades asociadas con la angiogénesis patógena seleccionada de las enfermedades oculares y una enfermedad asociada con la inflamación crónica seleccionada del grupo que consiste de sarcoidosis, y artritis reumatoide, la composición comprende como un ingrediente activo un compuesto de fórmula I.
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en la que
- R1 y R2 son grupos funcionales hidroxilos;
- R3 es un grupo funcional seleccionado del grupo constituido por hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{6}, alquenilo C_{2}-C_{6}, alquinilo C_{2}-C_{6}, arilo, hidroxilo, alcoxi C_{1}-C_{6}, halógeno, NO_{2}, NH_{3} y COOCH_{3}; X1-X3 son grupos funcionales seleccionados del grupo constituido por oxígeno, azufre, -CH_{2}-, o carboxi;
- R4 es un grupo funcional seleccionado del grupo constituido por hidrógeno, alcoxi-C_{1}-C_{6}, glucosa, B-D-glucopiranosa, alquilo C_{1}-C_{6}, alquenilo C_{2}-C_{6}, alquinilo C_{2}-C_{6}, arilo, hidroxilo, halógeno, NO_{2}, NH_{3}, carbohidratos, amino ácido, nucleótidos y lípidos; y
- R5 es un grupo funcional seleccionado del grupo constituido por hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{6}, alquenilo C_{2}-C_{6}, alquinilo C_{2}-C_{6}, arilo, hidroxilo, alcoxi C_{1}-C_{6}, halógeno, NO_{2}, NH_{3}, y CH_{3}, dicha enfermedad ocular se selecciona del grupo constituido por retinopatía diabética, retinopatía prematura, rechazo del injerto corneal, glaucoma neovascular y fibroplasias retrolental, queratoconjuntivitis epidémica, deficiencia de vitamina A, agotamiento de lentes de contacto, queratitis atópica, queratitis límbica superior, queratitis seca de pterigión, sjogrens, acné rosácea, flictenulosis, sífilis, infecciones micobacterianas, degeneración lipídica, quemaduras con sustancias corrosivas, úlceras bacterianas, úlceras micóticas, infecciones protozoarias, sarcoma de Kaposi, úlcera de Mooren, degeneración marginal de terrien, queratolisis marginal, trauma, lupus sistémico, poliarteritis, sarcoidosis de Wegener, escleritis, enfermedad de Steven -Johnson, caratotomía radial perafigoide, y rechazo al injerto corneal, retinopatía diabética, degeneración macular, anemia falciforme, sarcoide, sífilis, seudoxantoma elástico, y enfermedad de Pager, oclusión de la vena, oclusión de la arteria, enfermedad obstructiva de la carotida, uveitis/vitritis crónica, infecciones micobacterianas, enfermedad de Lyme, eritematosis del lupus sistémico, retinopatía de prematuridad, enfermedad de Eales, enfermedad de Bechets, infecciones que causan una retinitis o coroiditis, presunta histoplasmosis ocular, enfermedad de Bests, miopía, fosetas papilares, enfermedad de Stargarts, pars planitis, desprendimiento de retina crónico, síndromes de hiperviscosidad, toxoplasmosis, complicaciones post-láser y trauma, rubeosis y retinopatía atrial proliferativa dicho uso comprende administrar a un animal vivo un compuesto antiangiogénico de fórmula I o su realización preferida de oleoeuropeína o sus productos de hidrólisis en una cantidad, es decir, una dosificación, suficiente para inhibir la angiogénesis. La dosificación particular de un compuesto de fórmula I o su realización preferida oleoeuropeína o sus productos de hidrólisis requeridos para inhibir la angiogénesis y/o enfermedades angiogénicas dependería de la severidad del la afección, la vía de administración, y los factores relacionados que se decidirán por el médico a cargo. Generalmente, las dosis diarias efectivas y aceptadas serían la cantidad suficiente para inhibir efectivamente la angiogénesis y/o enfermedades angiogénicas.
Los compuestos proporcionados por ésta invención se pueden administrar a un animal en necesidad de los mismos una dosis de un compuesto de fórmula I o de su realización preferida oleoeuropeína o de sus productos de hidrólisis (o una sal farmacéuticamente aceptable o un solvato del mismo) que es efectiva para inhibir la angiogénesis y/o las enfermedades angiogénicas. El término "inhibir" se usa en el presente documento para incluir su significado generalmente aceptado el cual incluye tratar profilácticamente un sujeto humano para provocar la angiogénesis y/o enfermedades angiogénicas, y mantener en revisión y/o tratar la angiogénesis y/o las enfermedades angiogénicas existentes. Como tal, la presente invención incluye tratamiento terapéutico médico y/o tratamiento profiláctico, ambos según sea apropiado.
Las composiciones de la presente invención pueden ser usadas para tratar las enfermedades según la reivindicación 1.
La sarcoidosis es otra enfermedad inflamatoria crónica que se caracteriza según un trastorno granulomatoso multisistema. Los granulomas de esta enfermedad se pueden formar en cualquier parte del cuerpo y, así, los síntomas dependen del lugar del los granulomas y de si la enfermedad se activa. Los granulomas se crearon mediante los brotes capilares angiogénicos que proporcionan un constante suministro de células inflamatorias. Los compuestos y procedimientos de ésta invención se pueden usar para tratar la sarcoidosis.
Otra enfermedad que se puede tratar según la presente invención es la artritis reumatoide. La artritis reumatoide es una enfermedad inflamatoria crónica caracterizada por una inflamación no específica de la articulación periférica. Se pensó que los vasos sanguíneos en la capa sinovial de las articulaciones experimentaban angiogénesis. Además, para formar la nueva red vascular, las células endoteliales liberan factores y especies de oxigeno reactivas que conducen al crecimiento del pannus y a la destrucción del cartílago. Los factores implicados en angiogénesis pueden contribuir activamente a, y ayudan a mantener, el estado inflamado crónicamente de la artritis reumatoide.
En una realización particular preferida, los compuestos de la fórmula o su realización preferida oleoeuropeína se pueden usar en combinación con inmunoterapia activa.
Además, de acuerdo con lo anterior, los sujetos mamíferos incluyen, humanos, animales de laboratorio, mascotas domesticas y animales de granja.
D. Formulaciones Farmacéuticas/Vías de Administración
En la presente invención, los compuestos de fórmula I o su realización preferida de oleoeuropeína o sus productos de hidrólisis se pueden aplicar y administrar a un mamífero, por ejemplo, un paciente humano, solos, en forma de una sal farmacéuticamente aceptable, o en forma de una composición farmacéutica donde el compuesto se mezcló con vehículos o excipiente(s) adecuados en una cantidad efectiva terapéuticamente, por ejemplo, a dosis efectivas para disminuir, suprimir o inhibir la angiogénesis o da como resultado una mejora de síntomas asociados con las enfermedades angiogénicas.
Los compuestos de fórmula I o su realización preferida oleoeuropeína o sus productos de hidrólisis, los cuales se usan en la presente invención, se pueden incorporar en una variedad de formulaciones para la administración terapéutica. Más particularmente, los compuestos de fórmula I o su realización preferida oleoeuropeína o sus productos de hidrólisis se pueden formular en composiciones farmacéuticas mediante combinación con vehículos o diluyentes farmacéuticamente aceptables, apropiados, y se pueden formular en preparaciones en formas sólidas, semi-sólidas, líquidas o gaseosas, tales como comprimidos, cápsulas, píldoras, polvos, gránulos, grageas, geles, suspensiones, pomadas, disoluciones, supositorios, inyecciones inhaladores y aerosoles. Como tal, la administración de los compuestos se puede lograr en diversas maneras, que incluyen administración oral, bucal, rectal, parenteral, intraperitoneal, intradérmica, transdérmico, intraqueal, etc. Además, el compuesto se puede administrar de una manera local más que sistemática, a menudo en un depósito o formulación de liberación sostenida. Además, los compuestos se pueden administrar en un sistema de administración del fármaco objetivo.
Además, los compuestos de la fórmula I o su realización preferida oleoeuropeína o sus productos de hidrólisis se pueden formular con excipientes, diluyentes o vehículos comunes, y comprimirse en comprimidos, o formularse como elixires o disoluciones para la conveniente administración oral, o administrarse por las vías intramuscular o intravenosa. Los compuestos se pueden administrar transdérmicamente, y se pueden formular en formas de dosificación de liberación sostenida y similares.
Los compuestos de fórmula I o su realización preferida de oleoeuropeína o sus productos de hidrólisis se pueden administrar solos, en combinación entre sí, o se pueden usar en combinación con otros compuestos conocidos (es decir, otros fármacos anticáncer u otros fármacos, tales como AZT, anti-inflamatorios, antibióticos, corticosteroides, vitaminas, etc.). Por ejemplo, el compuesto de fórmula 1 o su realización preferida oleoeuropeína o sus productos de hidrólisis se pueden usar en terapia conjunta con otros agentes conocidos antiangiogénicos o antineoplásicos (es decir, alcaloides de vinca, antibióticos, antimetabolitos, complejos de coordinación de platino, etc). Por ejemplo, compuestos de fórmula I o su realización preferida de oleoeuropeína o sus productos de hidrólisis se pueden usar en terapia conjunta con un compuesto alcaloide de vinca, tal como vinblastina, vincristina, taxol, etc.; un antibiótico, tal como adriamicina (doxorubicina), datinomicina (actinomicina D), daunorubicina (daunomicina, rubidomicina), bleomicina, plicamicina (mitramicina) y mitomicina (mitomicina C), etc.; un antimetabolito, tal como metotrexato, citarabina (AraC), azauridina, azaribina, fluorodeoxiuridina, deoxicoformicina, mercaptopurina, etc.; o un complejo de coordinación de platino, tal como cisplatino (cis-DDP), carboplatino, etc. Además, aquellos expertos en la técnica apreciarán que los compuestos de la presente invención se pueden usar en terapia conjunta con quimioterapia anti-angiogenica conocida o compuestos antineoplasticos. En formas de dosificación farmacéutica, los compuestos se pueden administrar en forma de sus sales farmacéuticamente aceptables, o también se pueden usar solos o en asociación apropiada, así como en combinación con otros compuestos farmacéuticamente activos.
Las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento se pueden elaborar en una manera que se conoce por aquellos expertos en la técnica, es decir, por medio de procedimientos de mezcla, disolución, granulación, fabricación de grageas, levigación, emulsión, encapsulación, atrapamiento o liofilización. Los siguientes procedimientos y excipientes son meramente ejemplares.
Para inyección, los compuestos se pueden formular en preparaciones mediante disolución, suspensión o emulsión de ellos en una disolución acuosa o no acuosa, tal como aceites vegetales u otros aceites similares, glicéridos de ácidos alifáticos sintéticos, ésteres de ácidos alifáticos superiores o propilenglicol; y si se desea, con aditivos convencionales tales como solubilizadores, sustancias isotónicas, agentes de suspensión, agentes emulsionantes, estabilizadores y conservantes. Preferiblemente, los compuestos de la invención se pueden formular en disoluciones acuosas, preferiblemente en tampones compatibles fisiológicamente tales como disolución de Hanks, disolución de Ringer o tampón salino fisiológico. Para la administración transmucosal, los penetrantes adecuados que se infunden en la barrera son usados en la formulación. Tales penetrantes se conocen generalmente en la técnica.
Para administración oral, los compuestos de la fórmula I o su realización preferida oleoeuropeína o sus productos de hidrólisis se pueden formular fácilmente combinando con vehículos farmacéuticamente aceptables que se conocen bien en la técnica. Tales vehículos permiten a los compuestos formularse como comprimidos, píldoras, grageas, cápsulas, emulsiones, suspensiones lipofílicas e hidrofílicas, líquidos, geles, jarabes, suspensiones y similares, para la ingestión oral por un paciente que a tratarse. Las preparaciones farmacéuticas para uso oral se pueden obtener por mezcla de compuestos con excipientes solidos, opcionalmente mezcla un resultado de enrrejado, y un proceso de mezcla de gránulos, después adicción adecuada de auxiliares, si se desea, para obtener comprimidos o núcleos de grageas. Son excipientes adecuados, en particular, agentes de carga tales como azúcares, incluyendo lactosa, sacarosa, manitol, o sorbitol, celulosa preparaciones tales como, por ejemplo, almidón de maíz, almidón de trigo, almidón de arroz, almidón de patata, gelatina, goma de tragacanto, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio, y/o polivinilpirrolidona (PVP). Si se desea, se pueden añadir agentes disgregantes, tales como la polivinilpirrolidona entrecruzada, agar, o ácido algínico o una sal del mismo tal como alginato de sodio.
Los núcleos de grageas se proporcionan con recubrimientos adecuados. Para este propósito, se pueden usar las disoluciones de azúcar concentradas, la cuales pueden contener opcionalmente goma arábiga, talco, polivinilpirrolidona, gel carbopol, polietilenglicol, y/o dióxido de titanio, disoluciones de laca, y disolventes orgánicos adecuados o mezclas de disolventes. Se pueden añadir colorantes o pigmentos a los comprimidos o recubrimientos de grageas para la identificación o para caracterizar diferentes combinaciones de dosis de compuesto activo.
Las preparaciones farmacéuticas las cuales se pueden usar oralmente incluye cápsulas duras hechas de gelatina, así como blandas, cápsulas selladas hechas de gelatina y un plastificante, tal como glicerol o sorbitol. Las cápsulas duras pueden contener los ingredientes activos en mezcla con agente de carga tal como lactosa, aglutinantes tal como almidones, y/o lubricantes tal como talco o estereato de magnesio y opcionalmente, estabilizadores. En cápsulas blandas, los compuestos activos se pueden disolver o suspender en líquidos adecuados, tales como aceites grasos, parafina líquida, o polietilenglicoles líquidos. Además, se pueden añadir estabilizadores. Todas las formulaciones para administración oral estarían en dosificaciones adecuadas para tal administración. Para administración bucal, las composiciones pueden tomar la forma de comprimidos o pastillas formuladas de manera convencional.
Para la administración por inhalación, los compuestos para usar de acuerdo con la presente invención se administran convenientemente en forma de una presentación de pulverizador de aerosol a partir de paquetes presurizados o un nebulizador, con el uso de un propulsor adecuado, por ejemplo, diclorodifluorometano, tricloroflulorometano, diclorotetrafluoroetano, dióxido de carbono u otro gas adecuado, o a partir de un propulsor libre, inhaladores de polvo seco. En el caso de un aerosol presurizado la dosificación unitaria se puede determinar proporcionando una válvula para administrar una cantidad medida. Las cápsulas y cartuchos de, por ejemplo gelatina para usar en un inhalador o insuflador se pueden formular conteniendo una mezcla en polvo del compuesto y una base en polvo adecuado tal como lactosa o almidón.
Los compuestos se pueden formular para administración parenteral mediante inyección, por ejemplo, mediante inyección intravenosa rápida o infusión continua. Las formulaciones para inyección se pueden presentar en una forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en ampollas o en recipientes multidosis, con un conservante añadido. Las composiciones pueden tomar formas tales como suspensiones, disoluciones o emulsiones en aceites o vehículos acuosos, y pueden contener agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersan-
tes.
Las formulaciones farmacéuticas para la administración parenteral incluyen soluciones acuosas de los compuestos activos en forma soluble en agua. Adicionalmente, las suspensiones de los compuestos activos se pueden preparar como suspensiones de inyección aceitosa adecuada. Disolventes o vehículos lipófilos adecuados incluyen aceites grasos tales como aceite de sésamo, o ésteres de ácidos grasos sintéticos, tales como oleato de etilo o triglicéridos, o liposomas. Suspensiones de inyecciones acuosas pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, tal como carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol, o dextrano. Opcionalmente, la suspensión puede contener también estabilizadores o agentes adecuados los cuales aumenten la solubilidad de los compuestos para permitir la preparación de disoluciones altamente concentradas. Alternativamente, el ingrediente activo puede estar, antes de usarse, en forma de polvo para constitución con un vehiculo adecuado, por ejemplo, agua libre de pirógeno estéril.
Los compuestos también se pueden formular en composiciones rectales tales como supositorios o enemas de retención, por ejemplo, que contienen bases de supositorios convencionales tales como manteca de cacao, carbowaxes, polietilenglicoles u otros glicéridos, todas los cuales funden a temperatura corporal, todavía están solidificadas a temperatura ambiente.
Además de las formulaciones previamente descritas, los compuestos también se pueden formular como una preparación de depósito. Tales formulaciones de larga duración se pueden administrar mediante implantación (por ejemplo subcutáneamente o intramolecularmente) o mediante inyección intramuscular. Así, por ejemplo, los compuestos se pueden formular con materiales poliméricos o hidrófobos adecuados (por ejemplo como una emulsión en un aceite aceptable) o resinas de intercambio iónico, o como derivados solubles en poca cantidad, por ejemplo, como una sal soluble en poca cantidad. Alternativamente, se pueden emplear otros sistemas de administración para los compuestos farmacéuticos hidrófobos. Los liposomas y emulsiones son ejemplos bien conocidos de vehículos o trasportadores de administración para fármacos hidrófobos.
También se pueden emplear ciertos disolventes orgánicos tales como dimetilsulfoxido. Adicionalmente, los compuestos se pueden administrar usando un sistema de liberación sostenida, tal como matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el agente terapéutico. Se han establecido diversos tipos de materiales de liberación sostenida y se conocen bien por aquellos expertos en la técnica. Las cápsulas de liberación sostenida pueden, dependiendo de su química natural, liberar los compuestos durante desde unas cuantas semanas hasta por encima de 100 días.
Las composiciones farmacéuticas también pueden comprender transportadores o excipientes en fase gel o sólido adecuados. Ejemplos de tales transportadores o excipientes incluyen pero no se limitan carbonato de calcio, fosfato de calcio, varios azúcares, almidones, derivados de celulosa, gelatina y polímeros tales como polietilenglicoles.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas para uso en la presente invención incluyen composiciones en las que los ingredientes activos están contenidos en una cantidad farmacéuticamente efectiva. La cantidad de composición administrada dependerá, por supuesto, del sujeto que sea tratado, del peso del sujeto, la severidad de la aflicción, la manera de administración y el juicio del médico que receta. La determinación de una cantidad efectiva está bien dentro de la habilidad de aquellos expertos en la técnica, especialmente a la luz de la revelación detallada proporcionada en el presente documento.
Actualmente, se ha contemplado que las cantidades terapéuticamente efectivas de los compuestos que se utilizaron en la práctica de la presente invención pueden comprender en cualquier parte entre aproximadamente 0,030 g a 20,000 g de tal compuesto por kilogramos de masa de peso corporal del sujeto.
F. Ejemplos
La invención se describirá en mayor detalle por medio de ejemplos específicos.
Ejemplo 1
Este ejemplo ilustra las propiedades anti-angiogénicas de oleoeuropeína en el ensayo de membrana corioalantoica de pollo (CAM). El punto final del ensayo de CAM fue una determinación cuantitativa del número de puntos de ramificación y extremos de vasos sanguíneos en la membrana corioalantoica. Así una cuantificación ilustraría la complejidad de la vasculatura de la sangre en el desarrollo de la membrana coriolantoica. El decrecimiento en la complejidad de la vasculatura sangínea de la membrana coriolantoica como resultado de la aplicación de oleoeuropeína indica sus propiedades anti-angiogénicas.
A. Aproximación
El CAM en el embrión de pollo que se desarrolla es un excelente sistema in vivo para estudiar la angiogénesis, porque hay crecimiento de vasos sanguíneos nuevos en curso. El ensayo de la CAM implica el seguimiento de la vasculatura de la sangre del desarrollo de la membrana corioalantoica de los embriones de pollo vivos. Se han desarrollado diversas aproximaciones de ensayo de CAM. Estas incluyen el cultivo de embriones de pollo vivos en placas de Petri bajo condiciones estériles especiales. Otra aproximación es cortar una ventana en la cáscara de los huevos fertilizados y directamente se aplica el compuesto a estudiarse en la ventana usando un papel de filtro. Usamos una aproximación modificada de la propuesta para el ensayo de la CAM, la cual incluye un procedimiento menos invasivo para introducir el compuesto oleoeuropeína. Los huevos fertilizados de pollo se iluminaron en el tercer día de desarrollo. Se identificaron la vasculatura sanguínea y la yema. Se hizo un pequeño agujero de 1 mm en la cáscara. Una pequeña aguja calibrada que llevaba 0,4 ml de oleoeuropeína diluida en disolución salina/agua se inyectó directamente en el saco de la yema. El agujero se tapó y los huevos se devolvieron a la incubadora para el desarrollo adicional. Después de tres días los huevos se retiraron y se rompieron en una placa blanca y se fotografió la membrana corioalantoica. Los huevos control se inyectaron con agua/disolución salina.
B. Materiales
Los huevos fertilizados fueron suministrados por Country Farm Eggs, Los Angeles, CA. El PBS se obtuvo de Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, Mo. La oleoeuropeína se obtuvo de Indefine chemical company, Inc., Somerville, NJ. Se obtuvieron agujas y lancetas de Express Pharmacy Services, Pittsburg, Pa. Los microscopios diseccionados se compraron de Microscope World, Encinitas, CA. Una incubadora TX7 de sobremesa se obtuvo de Lyons Electric Company Inc. Chula Vista, CA. Una cámara Kodak MDS-100 se compró de Eastman Kodak company, New Haven, CT.
C. Desarrollo de la CAM para Medir Inhibición de Angiogénesis
Los huevos fértiles frescos se incubaron durante tres días en un incubador de huevos estándar. La temperatura y humedad se mantuvieron constantes a 37,77ºC (100ºF) y al 65% respectivamente. En el día 3, los huevos se examinaron sosteniéndolos frente a una luz usando una luz ultrarrápida de seguridad. Se identificaron el embrión y la yema. La superficie de la cáscara se limpió con un copo de algodón empapado en alcohol. La cáscara de huevo se perforó con una lanceta haciendo un agujero de 1 milímetro. Se usó una aguja para retirar 0,5 ml de yema. Se administró una inyección de 0,5 ml directamente dentro del saco de yema. Los experimentos previos mostraron que la inyección de tinta, usada con igual consistencia en nuestro experimento e inyecciones de control, se difundió dentro del saco de yema en segundos tras inyección. Los huevos experimentales se inyectaron con una concentración del 0,1% y el 1% de oleoeuropeína. Los huevos de control se inyectaron con una cantidad equivalente de agua. Después de la inyección el agujero se cubrió con una pequeña pieza de cinta escocesa y los huevos volvieron a la incubadora para el desarrollo adicional. El día 3 posterior a la inyección los huevos se sacaron y se examinaron sosteniéndolos frente a una luz. Se rompieron suavemente usando un cuchillo de mantequilla sobre una placa blanca. El embrión y la CAM se prepararon cuidadosamente para observación y fotografía. El latido del corazón se grabó usando un vídeo de suministro en directo con una cámara Kodak mds-100 sujeta a un microscopio estereoscópico. La morfología del embrión se anotó y los embriones se fotografiaron usando una cámara canon. La vasculatura sanguínea en el CAM también se fotografió usando la cámara Kodak de 100 mds montada en un microscopio estereoscópico.
E. Resultados
La tabla 1 muestra el efecto anti-angiogénico de oleoeuropeína en el embrión de pollo CAM. Los resultados resumen dos experimentos diferentes con un total de 17 huevos con 102 campos fotografiados para el análisis. La oleoeuropeína muestra estadísticamente efectos inhibidores importantes en la angiogénesis de la CAM. Una inyección de 0,93 \mumol/huevo causa la inhibición del crecimiento de los vasos sanguíneos del 84% comparado con el control. Los resultados a partir de estos dos experimentos sugieren que la oleoeuropeína es un potente inhibidor angiógenico. Se entiende que las concentraciones usadas anteriormente pretenden ser ilustrativas y no restrictivas.
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TABLA 1
Efecto inhibidor de oleoeuropeína sobre angiogénesis en el ensayo del embrión de pollo
Compuestos Dosis (\mumol/huevo) Número de nodulos + % Inhibición
finales (significa \pm S.E.)
Oleoeuropeína 9,3 44 \pm 5,3^{a} 84
0,93 72 \pm 11^{b} 73
Control - 271 \pm 25 -
^{a} Significativamente inferior que control, P < 0,0001
^{b} Significativamente inferior que control, P > 0,0001
Un ejemplo de la inhibición de la angiogénesis por oleoeuropeína se ilustra claramente por fotografías representativas tomadas de la CAM a la conclusión del experimento. La Figura 1 muestra las fotografías representativas de la CAM de los huevos tratados con 9,3 \mumol/huevo de oleoeuropeína. En estas CAM el número de vasos sanguíneos está muy disminuido y la ramificación es menos compleja que en los controles, los cuales se muestran en la Figura 3. No solamente están los lechos capilares eliminados sino que los vasos medianos e incluso los vasos largos se colapsan o están en proceso de colapso. Incluso 0,93 \mumol/huevo de oleoeuropeína inhibió potentemente la vasculatura de CAM (figura 2) según se compara con redes de vasos sanguíneos extensas en CAM controles (figura 3). Una mirada más cercana al lecho capilar, donde el mayor intercambio de gas tiene lugar cerca del borde de la CAM, ilustra una desaparición de las redes capilares extensas en los huevos tratados con oleoeuropeína según se comparan con los huevos de control (figura 4).
También se observó en la CAM de ensayo como un resultado del tratamiento con oleoeuropeína la contracción de la CAM y el embrión (figura 5). La CAM de ensayo se ha usado tradicionalmente para valorar las propiedades antiangiogénicas de diversos compuestos. Estos compuestos se han aplicado habitualmente a una pequeña ventana abierta en la superficie del huevo y no tuvieron resultados en la CAM o el embrión como un todo. En éste ejemplo se ha usado una modificación del ensayo de la CAM para valorar el efecto de la oleoeuropeína en la CAM total y posteriormente en el tamaño del embrión. En el desarrollo animal el embrión está sufriendo rápidas divisiones celulares así como diferenciación celular y morfogénesis. Se podría trazar una analogía entre la división celular rápida y el crecimiento en el del embrión del pollo en desarrollo con la división celular rápida y el crecimiento de las células tumorales. El crecimiento en ambos ejemplos depende del suministro de sangre. El embrión de pollo necesita una CAM altamente vascularizada para mantener la división celular y el crecimiento. Limitar el suministro de sangre encogería el embrión y por deducción lo mismo podría decirse de tumores. En este ensayo de CAM modificado la oleoeuropeína disminuyó significativamente el crecimiento de los vasos sanguíneos y se observó una posterior contracción del embrión (figura 5). El ejemplo ilustrativo mostrado en la figura 5 indica que había una correlación directa entre el tamaño de la CAM y el tamaño del embrión. La CAM tratada con oleoeuropeína era aproximadamente un 50% más pequeña en diámetro que la CAM de control. Los embriones tratados con oleoeuropeína eran proporcionalmente mas pequeños en aproximadamente un 60% del tamaño de los embriones de control no tratados. La dosis más alta de oleoeuropeína aunque afecta dramáticamente tanto el tamaño de la CAM como el tamaño del embrión través del efecto dramático del tamaño de ambos CAM y tamaño del embrión no tuvo resultados sobre viabilidad del embrión.
Ejemplo 2
Este ejemplo ilustra las propiedades anti-angiogénicas del extracto de la hoja de olivo en el ensayo de la membrana corioalantoica de pollo (CAM). El punto final del ensayo de CAM fue una visualización directa del número de puntos de ramificación y extremos de los vasos sanguíneos en la membrana corioalantoica. Tal visualización ilustraría la complejidad de la vasculatura sanguínea en la membrana corioalantoica que se desarrolla. La disminución en la complejidad de la vasculatura sanguínea de la membrana corioalantoica como un resultado de la aplicación del extracto de hoja de olivo indica sus propiedades anti-angiogénicas.
A. Aproximación
Como se describe en el ejemplo 1, el ensayo de CAM se usó para valorar las propiedades anti-angiogénicas del extracto de la hoja de olivo.
B. Materiales
Los huevos fertilizados se suministraron por Country Farm Eggs, Los Angeles, CA. El PBS se obtuvo de Sigma-Aldrich Chemical Co., St. Louis, Mo. El extracto de la hoja de olivo se obtuvo de la hoja de olivo. Las agujas y lancetas se obtuvieron de Express Pharmacy Services, Pittsburg, Pa. El microscopio de disección se compró de Microscope World, Encinitas, CA. Una incubadora TX de sobremesa se obtuvo de Lyons Electric Company Inc. Chula Vista, CA. Una cámara Kodak 100 mds se compró de la Eastman Kodak Company, New Haven, CT.
C. Desarrollo de la CAM para Medir Inhibición de la Angiogénesis
Se incubaron huevos fértiles frescos durante tres días en una incubadora de huevos estándar. La temperatura y humedad se mantuvieron constantes a 37,77ºC (100ºF) y al 65% respectivamente. En el día 3, los huevos se iluminaron sosteniéndolos frente a una luz usando una luz ultrarrápida de seguridad. Se identificaron el embrión y la yema. La superficie de la cáscara se limpió con un copo de algodón empapado en alcohol. La cáscara de huevo se perforó con una lanceta haciendo un agujero de 1 milímetro. Se usó una aguja para retirar 0,5 ml de yema. Se administró una inyección de 0,5 ml directamente dentro del saco de yema. Los experimentos previos mostraron que la inyección de tinta, usada con igual consistencia en nuestro experimento e inyecciones de control, se difundió dentro del saco de yema en segundos tras inyección. Los huevos experimentales se inyectaron con agua que contenía el extracto de la hoja de olivo. Los huevos de control se inyectaron con una cantidad equivalente de agua. Se añadieron diez mililitros de agua hirviendo a una media cucharilla de hojas de olivo secadas machacadas y se llevó a cabo la extracción durante 2 horas antes del uso del extracto del experimento. Después de la inyección el agujero se cubrió con una pequeña pieza de cinta escocesa y los huevos se devolvieron a la incubadora para el desarrollo adicional. En el día 4 tras la inyección se retiraron los huevos de la incubadora y se rompieron con cuidado usando un cuchillo de mantequilla sobre un plato blanco. El embrión y la CAM se prepararon con cuidado para la observación y fotografía. El latido del corazón del embrión se grabó usando un vídeo de suministro en directo con una cámara Kodak mds-100 sujeta a un microscopio estereoscópico. La morfología del embrión se anotó y los embriones se fotografiaron usando una cámara canon. La vasculatura sanguínea en el CAM también se fotografió usando la cámara Kodak de 100 mds montada en un microscopio estereoscópico.
C. Resultados
Los resultados a partir de tres experimentos sugieren que el extracto de la hoja de olivo es un potente inhibidor angiogénico. Se entiende que las concentraciones usadas anteriormente se desean para ser ilustrativas y no restrictivas. Un ejemplo de la inhibición de angiogénesis mediante extracto de la hoja de olivo se ilustra claramente por las fotografías representativas tomadas de la CAM a la conclusión de los experimentos. La Figura 1 muestra las fotografías representativas de la CAM de los huevos control (Figura 6a, b y c) y los huevos tratados con extracto de hoja de olivo (Figura 6d, e y f). En las CAMs tratadas el número de vasos sanguíneos está grandemente disminuido y la ramificación es menos compleja que en los controles.
Ejemplo 3
Estos ejemplos ilustran las propiedades antiangiogenicas de oleoeuropeína en el modelo de oreja del ratón adulto. El punto final del ensayo del modelo de la oreja del ratón adulto fue una visualización directa del número de puntos de ramificación y extremos de vasos sanguíneos. Tal visualización ilustraría la complejidad de la vasculatura sanguínea en la oreja del ratón adulto. La disminución en la complejidad de la vasculatura sanguínea inducida de la oreja del ratón adulto como un resultado de la aplicación de la oleoeuropeína indicaría sus propiedades antiangiogénicas.
A. Aproximación
En el modelo previo (la CAM en el desarrollo del embrión del pollo), aunque hay un excelente sistema in vivo para estudiar angiogénesis, porque hay crecimiento de vasos sanguíneos nuevos en curso en embrión en crecimiento, probamos otros modelos en la valoración si la oleoeuropeína puede inhibir crecimiento de vasos sanguíneos inducidos en un mamífero adulto. El modelo elegido por los inventores para usar fue la oreja del ratón adulto. La oreja del ratón se vasculariza y es bastante delgada para visualizarse directamente mediante un microscopio óptico. Si se aplica un estimulo a los vasos sanguíneos existentes de la oreja del ratón adulto son capaces hacer que broten unos nuevos (angiogénesis). Usando este modelo se pueden probar los compuestos antiangiogénicos para ver sus efectos. Los inventores aplicaron una quemadura de hidróxido sódico, la cual estimuló los vasos sanguíneos existentes en la oreja del ratón adulto para el brote de nuevos vasos sanguíneos. Antes de la aplicación de la quemadura de hidróxido sódico los ratones experimentales se inyectaron intraperitonealmente con disolución salina tamponada con fosfato que contenía oleoeuropeína. Los ratones control se inyectaron intraperitonealmente con disolución salina tamponada con fosfato sola. La quemadura de hidróxido sódico se aplicó a las orejas de ambos grupos. Un tercer grupo de ratones no se inyectaron y no se quemaron. Este tercer grupo de ratones mostró el estado de los vasos sanguíneos no inducidos en la oreja de los ratones adultos. El ensayo de las orejas de ratones adultos implica el control de la vasculatura sanguínea de la oreja en los ratones adultos tres días después de la aplicación de la quemadura de hidróxido
sódico.
B. Materiales
Los ratones se criaron por los inventores en un entorno limpio y saludable. El PBS se obtuvo de Sigma-Aldrich Chemical Co.; St. Louis, Mo. La oleoeuropeína se obtuvo de Indefine chemical company, Inc., Somerville, NJ. El hidróxido sódico se obtuvo de Sammy's Camera en Los Angeles. Las agujas y Nair se obtuvieron de Thrifty's drugs en Los Angeles CA. El microscopio de disección se compró de Microscope World, Encinitas, CA. Una cámara Kodak de 100 mds se compró de The Eastman Kodak Company, New Haven, CT.
C. Desarrollo del modelo de oreja de ratones adultos para Medir Inhibición de la Angiogénesis
Los ratones se usaron cuando habían crecido totalmente en 2-3 meses. Los ratones experimentales se inyectaron intraperitonealmente con 0,25 ml de disolución salina tamponada con fosfato que contenía 0,025 gramos de oleoeuropeína. Los ratones control se inyectaron con 0,25 ml de disolución salina tamponada con fosfato sola. Los grupos experimentales y de control se inyectaron intraperitonealmente una vez al día durante tres días antes de la quemadura con hidróxido sódico. En el cuarto día un hisopo de algodón humedecido con una disolución de hidróxido sódico al 2% se aplicó durante un tiempo total de un minuto a las orejas de ambos grupos de ratones. Posteriormente las orejas se lavaron con cantidades copiosas de agua. Los ratones volvieron a las jaulas durante otros tres días, tiempo durante el cual se les dio inyecciones intraperitoneales una vez al día. El cuarto día los ratones se mataron de forma humanitaria por dislocación cervical. Las orejas se trataron con Nair para retirar el exceso de pelo y la vasculatura de la sangre se fotografió usando una cámara digital de 100 MDS unida a un microscopio estereoscópico.
E. Resultados
Un total de cinco ratones control (quemados), cinco ratones experimentales (quemados y tratados con oleoeuropeína), y cinco ratones de control (no quemados y no tratados) se usaron en el experimento anterior con un total de 30 orejas. Los resultados del experimento anterior muestran que la oleoeuropeína es un potente inhibidor angiogénico. Un ejemplo de la inhibición de la angiogénesis mediante oleoeuropeína está claramente ilustrado por las fotografías representativas tomadas de las orejas de los ratones a la conclusión del experimento. La Figura 7 muestra una comparación de las orejas de todos los tres grupos de los ratones. Las orejas de los ratones que no han sido quemadas o tratadas, de alguna manera muestran claramente alguna vascularización (Figura 7a). Las orejas de los ratones en el grupo de control que han sido quemadas con hidróxido sódico muestran una cantidad de vascularización incrementada, indicando que los inventores han tenido éxito en la inducción del crecimiento de los vasos sanguíneos (Figura 7b). Un ejemplo destacado de crecimiento de los vasos sanguíneos inducido se puede ver en la figura 7c, donde se pueden ver brotar a partir de un vaso sanguíneo existente y viajar los nuevos vasos hacia el área de la quemadura. El potente efecto anti-angiogénico de la oleoeuropeína se muestra en la Figura 7d. En esta figura las orejas se trataron con hidróxido sódico y los ratones también recibieron dosis diarias de oleoeuropeína. Se puede ver que la oleoeuropeína inhibió potentemente los vasos sanguíneos existentes con respecto a formación de brotes. El área quemada está de hecho desprovista de vasos sanguíneos. Este fue un resultado consistente con los ratones a los que se les dieron diariamente inyecciones de oleoeuropeína.
Ejemplo 4
Este ejemplo ilustra las propiedades antiangiogénicas del extracto de la hoja de olivo en el modelo de oreja de ratones adultos. El punto final del ensayo del modelo de la oreja de los ratones adultos fue una visualización directa del número de puntos de ramificación y extremos de los vasos sanguíneos. Tal visualización ilustraría la complejidad de la vasculatura sanguínea en la oreja del ratón adulto. El decrecimiento en la complejidad de la vasculatura sanguínea inducida de la oreja de los ratones adultos como un resultado de la aplicación del extracto de la hoja de olivo indicaría sus propiedades anti-angiogénicas.
A. Aproximación
Como se describe en el ejemplo 3, el modelo de oreja de ratones adultos se usó para valorar las propiedades antiangiogénicas del extracto de la hoja de olivo.
B. Materiales
Los ratones se criaron por los inventores en un entorno limpio y saludable. El PBS se obtuvo de Sigma-Aldrich Chemical Co.; St. Louis, Mo. El extracto de la hoja de olivo se obtuvo de la hoja de olivo. El hidróxido sódico se obtuvo de Sammy's Camera en Los Angeles. Las agujas y Nair se obtuvieron de Thrifty's drugs en Los Angeles CA. El microscopio diseccionado se compró de Microscope World, Encinitas, CA. Una cámara Kodak de 100 mds se compró de The Eastman Kodak Company, New Haven, CT.
C. Desarrollo del modelo de oreja de ratones adultos para Medir Inhibición de la Angiogénesis
Los ratones se usaron cuando habían crecido totalmente en 2-3 meses. Los ratones experimentales se inyectaron intraperitonealmente con 0,25 ml de disolución salina tamponada con fosfato salino neutralizado que contenía extracto de hoja de olivo. El extracto de hoja de olivo se preparó moliendo hojas de olivo secas en un molinillo de café hasta que las hojas estuvieron en forma de polvo. Diez mililitros de las hojas en polvo empaquetadas se mezclaron con 45 mililitros de agua caliente. Se añadió a la mezcla disolución salina tamponada con fosfato. Los grupos experimentales y de control se inyectaron intraperitonealmente una vez al día durante tres días previo a la quemadura con hidróxido sódico. Cada uno de los ratones recibió una inyección de 0,25 ml. El grupo experimental recibió una inyección de disolución salina tamponada con fosfato que contenía el extracto de hoja de olivo. El grupo de control recibió una inyección de disolución salina tamponada con fosfato sola. En el cuarto día un hisopo de algodón humedecido con una disolución de hidróxido sódico al 2% se aplicó durante un tiempo total de un minuto a las orejas de ambos grupos de ratones. Posteriormente las orejas se lavaron con cantidades copiosas de agua. Los ratones volvieron a las jaulas durante otros tres días, tiempo durante el cual se les dio inyecciones intraperitoneales una vez al día. El cuarto día los ratones se mataron de forma humanitaria por dislocación cervical. Las orejas se trataron con Nair para retirar el exceso de pelo y la vasculatura de la sangre se fotografió usando una cámara digital de 100 MDS unida a un microscopio estereoscópico.
E. Resultados
Un total de siete ratones de control y siete ratones experimentales se usaron en el experimento anterior con un total de 28 orejas. Los resultados a partir de los experimentos anteriores mostraron que el extracto de hoja de olivo es un potente inhibidor angiogénico. Un ejemplo de la inhibición de angiogénesis mediante el extracto de la hoja de olivo se ilustra claramente por las fotografías representativas tomadas de las orejas de los ratones en la conclusión del experimento. La Figura 8 muestra las fotografías representativas de ocho orejas representativas desde los ratones de control (Figura 8a, b, c, y d) y los ratones tratados con el extracto de hoja de olivo (Figura 8e, f, g y h). Las orejas de los ratones de control estaban altamente vascularizadas indicando una inducción de crecimiento de nuevos vasos sanguíneos. Los ratones tratados con el extracto de hoja de olivo habían disminuido la vascularización, indicando el efecto potente del extracto de la hoja de olivo en la inhibición del crecimiento de los nuevos vasos sanguíneos.

Claims (6)

1. Uso de una composición para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades asociadas con la angiogénesis patógena seleccionadas de enfermedades oculares y una enfermedad asociada con la inflamación crónica seleccionada del grupo constituido por sarcoidosis, y artritis reumatoide, la composición comprende como un ingrediente activo un compuesto de fórmula I:
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7 
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en la que
- R1 y R2 son grupos funcionales hidroxilos;
- R3 es un grupo funcional seleccionado del grupo constituido por hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{6}, alquenilo C_{2}-C_{6}, alquinilo C_{2}-C_{6}, arilo, hidroxilo, alcoxi C_{1}-C_{6}, halógeno, NO_{2}, NH_{3} y COOCH_{3}; X1-X3 son grupos funcionales seleccionados del grupo constituido por oxígeno, azufre, -CH_{2}-, o carboxi;
- R4 es un grupo funcional seleccionado del grupo constituido por hidrógeno, alcoxi-C_{1}-C_{6}, glucosa, B-D-glucopiranosa, alquilo C_{1}-C_{6}, alquenilo C_{2}-C_{6}, alquinilo C_{2}-C_{6}, arilo, hidroxilo, halógeno, NO_{2}, NH_{3}, carbohidratos, amino ácido, nucleótidos y lípidos; y
- R5 es un grupo funcional seleccionado del grupo constituido por hidrógeno, alquilo C_{1}-C_{6}, alquenilo C_{2}-C_{6}, alquinilo C_{2}-C_{6}, arilo, hidroxilo, alcoxi C_{1}-C_{6}, halógeno, NO_{2}, NH_{3}, y CH_{3}, dicha enfermedad ocular se selecciona del grupo constituido por retinopatía diabética, retinopatía prematura, rechazo del injerto corneal, glaucoma neovascular y fibroplasias retrolental, queratoconjuntivitis epidémica, deficiencia de vitamina A, agotamiento de lentes de contacto, queratitis atópica, queratitis límbica superior, queratitis seca de pterigión, sjogrens, acné rosácea, flictenulosis, sífilis, infecciones micobacterianas, degeneración lipídica, quemaduras con sustancias corrosivas, úlceras bacterianas, úlceras micóticas, infecciones protozoarias, sarcoma de Kaposi, úlcera de Mooren, degeneración marginal de terrien, queratolisis marginal, trauma, lupus sistémico, poliarteritis, sarcoidosis de Wegener, escleritis, enfermedad de Steven -Johnson, caratotomía radial perafigoide, y rechazo al injerto corneal, retinopatía diabética, degeneración macular, anemia falciforme, sarcoide, sífilis, seudoxantoma elástico, y enfermedad de Pager, oclusión de la vena, oclusión de la arteria, enfermedad obstructiva de la carotida, uveitis/vitritis crónica, infecciones micobacterianas, enfermedad de Lyme, eritematosis del lupus sistémico, retinopatía de prematuridad, enfermedad de Eales, enfermedad de Bechets, infecciones que causan una retinitis o coroiditis, presunta histoplasmosis ocular, enfermedad de Bests, miopía, fosetas papilares, enfermedad de Stargarts, pars planitis, desprendimiento de retina crónico, síndromes de hiperviscosidad, toxoplasmosis, complicaciones post-láser y trauma, rubeosis y retinopatía atrial proliferativa.
2. Uso de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicha composición comprende un compuesto de fórmula II:
8
3. Uso de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, que comprende un transportador o diluyente farmacéuticamente aceptable.
4. Uso de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende al menos un producto de hidrolización del compuesto de fórmula I, en el que dicho producto se selecciona del grupo constituido por oleoeuropeína aglicona, ácido elenólico, alcohol beta-3,4-dihidroxifeniletilo y metilo-metilelenolato.
5. Uso de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicha composición está en forma de comprimidos o elixir para administración oral.
6. El uso de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho medicamento es para administración oral, bucal, rectal, parental, intraperitoneal, intradérmica, transdérmica, intraqueal, intramuscular o intravenosa o para inhalación.
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