CN116801866A - α-细辛脑在制备预防或治疗出血性脑卒中药物中的应用 - Google Patents

α-细辛脑在制备预防或治疗出血性脑卒中药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了α‑细辛脑在制备预防或治疗出血性脑卒中的药物中的应用；α‑细辛脑的结构如式I所示，其可显著改善模型大鼠的短期神经功能缺损和长期学习记忆功能，减轻脑水肿、改善血脑屏障通透性，预防或缓解恢复期脑组织的萎缩，其对于出血性脑卒中动物模型具有确切的治疗作用，且无明显毒副作用，有望成为极具应用前景的出血性脑卒中的预防/治疗药物。

Description

α-细辛脑在制备预防或治疗出血性脑卒中药物中的应用 技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及α-细辛脑在制备治疗或预防出血性脑卒中药物中的应用。
背景技术
脑卒中现为全球第二大死亡病因，仅中国每年新增病例近400万人，发病率高居全球首位，每年因脑卒中死亡人数超200万人，存活的脑卒中患者中约有2/3的病人会导致永久残疾。脑卒中在临床上可分为缺血性卒中和出血性卒中。出血性脑卒中指因颅内血管破裂，导致血液漏入大脑，从而产生相应神经系统功能障碍等一系列临床表现。虽然出血性脑卒中发病率相对较低，但其致死率和致残率高。根据在脑组织中出血部位的不同，出血性脑卒中主要分为脑内出血(Intracerebral Hemorrhage，ICH)和蛛网膜下腔出血(Subarachnoid Hemorrhage，SAH)两类。ICH发生在脑内，而SAH发生在软脑膜和蛛网膜之间。高血压性脑出血是非外伤性ICH最常见病因，而SAH常见病因则为颅内动脉瘤。
出血性脑卒中导致的脑损伤是临床治疗的难点，亦是其致残的重要原因。脑损伤可分为原发性和继发性两类，原发性脑损伤是指初始出血形成的血肿及扩大对周围脑组织造成的直接机械性压迫损伤和缺血性改变，包括谷氨酸过量释放、钙超载、线粒体功能障碍等；而继发性脑损伤的机制较复杂，其病理途径包括血脑屏障的破坏及脑水肿形成、氧化应激和炎症反应、自噬与细胞凋亡、小胶质细胞活化、脑内能量代谢及蛋白质组学改变、铁沉积等，最终导致神经功能缺损。出血性脑卒中诱发的脑损伤病理机制由多种因素、多个环节共同参与，且诸多因素和环节间相互影响、相互关联。其中，兴奋性氨基酸(如谷氨酸)与抑制性氨基酸(如γ-氨基丁酸，GABA)的调节失衡引起的神经元兴奋性毒性，是导致出血性脑卒中急性期神经元损伤和死亡的关键环节。
目前临床上对于出血性脑卒中患者的救治，主要采用药物治疗和手术治疗。药物治疗主要为内科对症治疗，包括降低颅内压、调整血压、止血治疗、亚低温治疗、脑代谢赋活剂、钙离子拮抗剂等，但疗效欠佳。手术疗法的确在挽救患者生命方面起到了积极的作用，但对患者神经功能障碍的疗效也不够理想，并且有较为严格的适用要求。迄今为止，尚无药物治疗被批准用于救治出血性脑卒中导致的神经损伤，从而提高患者生存率或改善患者预后。因此，研发可有效治疗出血性脑卒中的药物具有极为重要的临床意义。
α-细辛脑(Alpha-asarone)系中药石菖蒲的主要有效成分，具有镇静、解痉、抗惊厥等作用。研究表明，α-细辛脑可通过阻滞Na +通道，激活GABA A受体而发挥抗癫痫作用(参见Wang Z J,Levinson S R,Sun L,et al.Identification of both GABA A receptors and voltage-activated Na +channels as molecular targets of anticonvulsant alpha-asarone[J].Front Pharmacol,2014,5(40):5-11和Huang C,Li W G,Zhang X B,et al.alpha-asarone from Acorus gramineus alleviates epilepsy by modulating A-type GABA receptors[J].Neuropharmacology,2013,65(2):1-11)。此外，其还可促进神经祖细胞增殖、抗氧化应激、减少小胶质细胞活化、减轻神经炎症、改善神经元凋亡等(参见Chellian R,Pandy V,Mohamed Z.Pharmacology and toxicology ofα-andβ-Asarone:A review of preclinical evidence[J].Phytomedicine,2017:41-58)。尽管上述研究提示α-细辛脑具有多种神经药理学活性，然而迄今为止，α-细辛脑对出血性脑卒中的治疗作用尚未见报道。
另一方面，临床上治疗因出血性脑卒中导致的继发癫痫，一般不推荐预防性给予抗癫痫药(中华医学会神经病学分会，中华医学会神经病学分会脑血管病学组，中国脑出血诊治指南2019[J].中华神经科杂志，2019，52(12)：994-1005.)，其原因在于抗癫痫药物副作用大，预防性给予抗癫痫药物可能会损害出血性脑卒中病人的神经功能。
发明内容
为了克服现有技术中缺少出血性脑卒中预防或治疗药物的问题，本发明提供了α-细辛脑的新用途。
为此，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了式I所示化合物(反式-2,4,5-三甲氧基-1-丙烯基苯，又称α-细辛脑、α-细辛醚)在制备预防或治疗出血性脑卒中的药物中的应用；
本发明意外地发现式I所示化合物可显著改善模型大鼠的短期神经功能缺损和长期学习记忆功能，减轻脑水肿、改善血脑屏障通透性，预防或缓解恢复期脑组织的萎缩，其对于出血性脑卒中动物模型具有确切的治疗作用，且无明显毒副作用。本发明通过将α-细辛脑、阳性药物长春西汀注射液及尼莫地平注射液用于治疗血管内穿刺构建的蛛网膜下腔出 血模型大鼠和胶原酶注射构建的脑实质出血模型大鼠，发现其中的α-细辛脑能显著减轻模型大鼠的患侧脑组织水肿，改善其血脑屏障通透性，预防或缓解恢复期模型大鼠的脑组织萎缩，从而显著改善其短期神经功能评分和长期学习记忆功能。同时，α-细辛脑还可显著降低模型大鼠因急性出血性脑卒中导致的继发癫痫发生率和死亡率，延长其生存期。
在一些实施方案中，所述的药物还用于预防或治疗因出血性脑卒中导致的继发癫痫。优选地，所述的药物用于治疗出血性脑卒中并预防因出血性脑卒中导致的继发癫痫。
在一些实施方案中，所述的出血性脑卒中为脑内出血(Intracerebral Hemorrhage，ICH)和蛛网膜下腔出血(Subarachnoid Hemorrhage，SAH)中至少一种导致的脑卒中。
本发明中，所述的式I所示化合物可具有如下药理作用：(1)拮抗过量谷氨酸引起的神经兴奋性毒性；(2)降低异常升高的谷氨酸与GABA水平；(3)抑制神经细胞钙离子内流、降低细胞内钙超载；(4)稳定神经细胞线粒体膜电位并减少神经元凋亡；(5)减轻损伤神经细胞的氧化应激反应。
本发明中，所述的药物可具有如下药理作用：(1)拮抗过量谷氨酸引起的神经兴奋性毒性；(2)降低异常升高的谷氨酸与GABA水平；(3)抑制神经细胞钙离子内流、降低细胞内钙超载；(4)稳定神经细胞线粒体膜电位、减少神经元凋亡；(5)减轻损伤神经细胞的氧化应激反应。
本发明中，所述的药物可通过(1)降低模型大鼠脑内谷氨酸含量，从而拮抗脑出血引起的谷氨酸兴奋性毒性；(2)恢复GABA水平，促进模型大鼠的运动功能恢复；(3)降低Ca 2+内流，减轻Ca 2+超载引起的不良生化反应及兴奋性毒性；(4)稳定线粒体膜电位、减少神经元凋亡；(5)减少神经元氧化应激及损伤，从而减轻脑水肿、改善血脑屏障通透性，预防或缓解恢复期脑组织萎缩，改善模型大鼠的短期神经功能缺损和长期学习记忆功能障碍，发挥抗出血性脑卒中的作用。
在一些实施方案中，所述的药物用于下列中的至少一种：改善神经或运动功能的损伤(例如ICH或SAH所致的神经或运动功能的损伤)、改善继发性早期脑损伤(例如急性期脑组织水肿或血脑屏障功能障碍，例如ICH或SAH所致的急性期脑组织水肿或血脑屏障功能障碍)、降低出血性脑卒中所致的急性期死亡率、延长生存期、改善出血性脑卒中所致的长期学习记忆功能障碍、以及预防或缓解出血性脑卒中恢复期脑组织萎缩。
在一些实施方案中，所述的式I所示化合物为所述药物中的唯一有效成分。
在一些实施方案中，所述的药物可含有药用辅料。较佳地，所述的式I所示化合物与药用辅料的总重量比例为1：20～1000，例如1：20～200。更佳地，所述的式I所示化合物为所述药物中的唯一有效成分，其与药用辅料的总重量比例为1：20～1000，例如1：20～200。
在一些实施方案中，所述的药物的给药对象可以是人或动物。当所述的药物用于治疗出血性脑卒中模型大鼠时，所述的药物中式I所示化合物的每日有效剂量可为5mg～40mg/kg体重。当所述的药物用于治疗患有出血性脑卒中的人时，所述的药物中式I所示化合物的每日给药剂量范围可为0.15mg～5.0mg/kg体重，优选为0.3mg～3.0mg/kg体重，例如，每日给药2～3次，每次给药剂量范围为0.15mg～1.5mg/kg体重，优选为0.3mg～1.5mg/kg体重。上述剂量可根据不同种属动物之间的剂量换算关系得到。
在一些实施方案中，所述的药物的给药途径是注射、口服、皮下植入、吸入、透皮、黏膜等。优选地，所述的药物的给药途径为注射(优选静脉注射给药)或口服。
本发明中，所述的药物可制成适宜于人和/或动物使用的剂型，例如与不同给药途径相适应的任何剂型，只要该剂型可使式I所示化合物进入脑内并达到有效治疗浓度即可。在一些实施方案中，所述的药物为乳剂(例如乳状注射液、口服乳剂)。乳剂与目前的市售注射剂(溶液型注射剂)相比，其安全性更优；与片剂相比，其生物利用度更高。
在一些实施方式中，所述的乳剂可含有式I所示化合物、可药用的油、可药用的乳化剂以及水。
其中，所述的可药用的油可由大豆油、中链油、橄榄油和鱼油中的至少一种组成。
其中，所述的可药用的乳化剂可由蛋黄卵磷脂、大豆卵磷脂、普朗尼克F-68和聚乙二醇硬脂酸-15(Solutol HS15)中的至少一种组成。
其中，所述的水可为注射用水或纯化水。
其中，根据乳化性能的需要，所述的乳剂还可含有油酸和油酸钠中的至少一种。配制时油酸溶于油相，油酸钠溶于水相，二者的混合物则可分别溶于油、水两相。
其中，所述的乳剂还可含有甘油。
其中，所述的乳剂还可含有抗氧剂。所述的抗氧剂可为亚硫酸氢钠、维生素E、焦性没食子酸酯等。
其中，当口服给药时，所述的乳剂还可含有其它适宜的添加剂如防腐剂和矫味剂中的至少一种。所述的防腐剂可为本领域常规的防腐剂，如苯甲酸、苯甲酸钠、山梨酸、山梨酸钾、尼泊金乙酯、丙酯及丁酯等。所述的矫味剂可为本领域常规的矫味剂，例如可为甜味剂、芳香剂、胶浆剂或泡腾剂。其中的甜味剂可为单糖浆、甜菊苷、阿司帕坦等；其中的芳香剂可为水果香精，如苹果香精、草莓香精等；其中的胶浆剂可为明胶、甲基纤维素胶浆等；其中的泡腾剂可为枸橼酸、酒石酸与碳酸氢钠的混合物。
在一些实施方案中，以重量百分比计，所述的乳剂可含有式I所示化合物0.5％～5％、可药用的油5％～30％、乳化剂0.6％～1.8％、甘油0％～2.5％、以及余量的水(例如纯化水或 注射用水)。式I所示化合物在乳剂中的浓度可在一定范围内变化，浓度变化范围取决于给药量、给药体积和式I所示化合物在油相中的溶解度。
在一些实施方案中，所述的乳剂为乳状注射液。优选地，所述的乳状注射液中，式I所示化合物与药用辅料(包括注射用水)的总重量比例为1：20～1000，例如1：20～200。
其中，所述的乳剂的制备方法可包括以下步骤：将式I所示化合物、可药用的油、可药用的乳化剂以及水经高速剪切混合，得到初乳；将初乳经高压均质处理，得到乳剂。
在一些实施方式中，所述的乳剂的制备方法可包括以下步骤：
步骤1：在氮气或惰性气体保护条件下，将式I所示化合物溶解于60～80℃的可药用的油中，得到油相，再将乳化剂和甘油溶解或分散于60～80℃的水中，得到水相；或者，在氮气或惰性气体保护条件下，将式I所示化合物和乳化剂溶解或分散于60～80℃的可药用的油中，得到油相，再将甘油溶解于60～80℃的水中，得到水相；
步骤2：将上述油相和水相经高速剪切混合，使油相分散于水相中，得到初乳；
步骤3：将初乳经高压均质(均质次数例如可为高压均质1～3次)，使乳滴平均粒径值不大于0.5μm，过滤，在氮气或惰性气体保护条件下，灌装于玻璃安瓿、输液瓶、西林瓶、软袋等药用容器中；根据给药途径的需要，采用旋转式热压灭菌或不经灭菌而添加防腐剂，得到乳剂。
所述高速剪切的剪切速率可为本领域小量试制或大生产制备乳剂时所采用的常规的剪切速率，例如实验室小量试制可为10000～20000r·min -1，又例如大生产制备为2000～4000r·min -1，实际剪切速率的大小取决于剪切半径，二者决定了剪切力的大小。
所述高速剪切的剪切时间可为本领域制备乳剂所采用的常规的剪切时间，例如可为3～10分钟，又例如为5～8分钟。
所述的高压均质的均质压力可为本领域制备乳剂所采用的常规的均质压力，例如可为500～1500bar，又例如为500～1000bar。
所述的高压均质的循环次数可为本领域制备乳剂所采用的常规的循环次数，例如可为1～3次。
本发明还提供了一种用于预防或治疗出血性脑卒中的药物组合物，其中，所述的药物组合物含有式I所示化合物以及药用辅料。
在一些实施方案中，所述的药物组合物还用于预防或治疗因出血性脑卒中导致的继发癫痫。
在一些实施方案中，所述的药物组合物用于治疗出血性脑卒中并预防因出血性脑卒中导致的继发癫痫。
在一些实施方案中，所述的式I所示化合物为所述药物组合物中的唯一有效成分。
在一些实施方案中，所述的药物组合物为乳剂。
本发明还提供了一种治疗或预防受试者出血性脑卒中的方法，其包括：给予所述受试者治疗或预防有效量的如式I所示化合物。
优选地，所述的方法用于治疗或预防受试者出血性脑卒中并治疗或预防因出血性脑卒中导致的继发癫痫。
更优选地，所述的方法用于治疗受试者出血性脑卒中并预防因出血性脑卒中导致的继发癫痫。
定义与说明
除非另有说明，本文所用的下列术语和短语旨在具有下列含义。一个特定的术语或短语在没有特别定义的情况下不应该被认为是不确定的或不清楚的，而应该按照普通的含义去理解。当本文中出现商品名时，意在指代其对应的商品或其活性成分。
除非另有说明，本发明中，术语“可药用的”是指针对那些化合物、材料、组合物和/或剂型而言，它们在可靠的医学判断的范围之内，适用于与人类和动物的组织接触使用，而没有过多的毒性、刺激性、过敏性反应或其它问题或并发症，与合理的利益/风险比相称。
除非另有说明，本发明中，术语“药学上可接受量的”是指针对那些化合物、材料、组合物和/或剂型的量而言，它们在可靠的医学判断的范围之内，而没有过多的毒性、刺激性、过敏性反应或其它问题或并发症，与合理的利益/风险比相称。
除非另有说明，术语“药用辅料”，是指生产药品和调配处方时使用的赋形剂和附加剂，是除活性成分以外，包含在药物制剂中的所有物质。可参见中华人民共和国药典(2020年版)四部、或Handbook of Pharmaceutical Excipients(Raymond C Rowe,2009 Sixth Edition)。
除非另有说明，术语“治疗”指治疗性疗法。涉及具体病症时，治疗指：(1)缓解疾病或者病症的一种或多种生物学表现，(2)干扰(a)导致或引起病症的生物级联中的一个或多个点或(b)病症的一种或多种生物学表现，(3)改善与病症相关的一种或多种症状、影响或副作用，或者与病症或其治疗相关的一种或多种症状、影响或副作用，或(4)减缓病症或者病症的一种或多种生物学表现发展。
除非另有说明，术语“预防”是指获得或发生疾病、障碍或病症的风险降低。
除非另有说明，术语“治疗有效量”是指在给予受试者时足以有效治疗本文所述的疾病或病症的化合物的量。“治疗有效量”将根据化合物、病症及其严重度、以及欲治疗患者的年龄而变化，但可由本领域技术人员根据需要进行调整。给药对象不同(如人或动物)，该 有效量也不同。
除非另有说明，术语“预防有效量”是指足以预防疾病、障碍或病症的量，或足以预防与疾病、障碍或病症有关的一或多种症状的量，或防止疾病、障碍或病症复发的量。
除非另有说明，术语“受试者”是指根据本发明的实施例，即将或已经接受了该化合物给药的任何动物，哺乳动物为优，人类最优。术语“哺乳动物”包括任何哺乳动物。哺乳动物的实例包括但不限于牛、马、羊、猪、猫、狗、小鼠、大鼠、家兔、豚鼠、猴、人等，以人类为最优。
本发明中未指明反应温度的，其反应温度为室温，室温一般为20～35℃。
除非另有说明，本发明中“因出血性脑卒中导致的继发癫痫”，是指病患本身无癫痫病史，出血性脑卒中发生后导致的继发性癫痫发作(排除与出血性脑卒中无关的病变)。
在不违背本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：
本发明首次公开了α-细辛脑具有治疗/预防出血性脑卒中的作用，药效学机制研究结果表明α-细辛脑可通过(1)降低模型大鼠脑内谷氨酸含量，从而拮抗脑出血引起的谷氨酸兴奋性毒性；(2)恢复GABA水平，促进模型大鼠的运动功能恢复；(3)降低Ca 2+内流，减轻Ca 2+超载引起的不良生化反应及兴奋性毒性；(4)稳定线粒体膜电位、减少神经元凋亡；(5)减轻神经元氧化应激及损伤，从而减轻脑水肿、降低脑损伤，改善血脑屏障通透性，预防或缓解恢复期脑组织萎缩，进而改善模型大鼠的短期神经功能缺损和长期学习记忆功能障碍，显著降低模型大鼠急性期癫痫发生率和死亡率，延长其生存期，提高生存率并改善预后，发挥抗出血性脑卒中的作用。
本发明意外地发现，α-细辛脑在改善SAH急性期大鼠的神经功能缺损方面，效果显著优于长春西汀注射液；在改善SAH恢复期大鼠的学习记忆功能以及预防或缓解脑组织萎缩方面，效果优于显著尼莫地平注射液；在改善ICH大鼠的神经功能缺损方面，效果显著优于尼莫地平注射液，优于长春西汀注射液。据此，α-细辛脑有望成为极具应用前景的出血性脑卒中的预防/治疗药物。
α-细辛脑安全、有效，在本发明的全部实验过程中未见α-细辛脑有明显的毒副作用。
附图说明
图1：α-细辛脑对SAH大鼠学习记忆功能及恢复期脑组织萎缩的影响。A：各组大鼠在获得性训练期间找到平台的潜伏期；B：空间探查期间各组大鼠在目标象限停留时间和游泳速度；C：各组大鼠在空间探查期间的活动热图，圆圈所示为平台位置，其所在象限为目标象限；D：水迷宫实验结束后经心脏灌注取脑，各组脑组织萎缩情况；P、S、M、N分别表示假手术组、SAH模型组、α-细辛脑中剂量组、尼莫地平注射液组；与假手术组相比， ###P<0.001， ##P<0.01， #P<0.05；与模型组相比， **P<0.01， *P<0.05；与α-细辛脑中剂量组相比， &&&P<0.001， &&P<0.01。
图2：α-细辛脑对模型大鼠脑水肿和血脑屏障通透性的影响。A：各组SAH大鼠脑组织不同部位含水量；B：各组SAH大鼠脑组织伊文思蓝渗出量；C：各组ICH大鼠脑组织不同部位含水量；D：各组ICH大鼠脑组织伊文思蓝渗出量；P、S、I、M分别表示假手术组、SAH模型组、ICH模型组、α-细辛脑中剂量组；与假手术组相比， ###P<0.001， ##P<0.01， #P<0.05；与模型组相比， *P<0.05。
图3：α-细辛脑对模型大鼠脑组织谷氨酸和GABA含量的影响。A：各组SAH大鼠脑组织谷氨酸含量；B：各组SAH大鼠脑组织GABA含量；C：各组ICH大鼠血肿周围脑组织谷氨酸含量；D：各组ICH大鼠血肿周围脑组织GABA含量；与假手术组相比， ##P<0.01， #P<0.05；与模型组相比， *P<0.05。
图4：α-细辛脑对模型大鼠脑组织钙离子和线粒体膜电位的影响。A：各组SAH大鼠脑组织钙离子含量测定结果；B：各组SAH大鼠脑组织线粒体膜电位测定结果；C：各组SAH大鼠脑组织钙离子和线粒体膜电位荧光强度统计图；D：各组ICH大鼠脑组织钙离子含量测定结果；E：各组ICH大鼠脑组织线粒体膜电位测定结果；F：各组ICH大鼠脑组织钙离子和线粒体膜电位荧光强度统计图；与假手术组相比， ###P<0.001， ##P<0.01， #P<0.05；与模型组相比， ***P<0.001， *P<0.05。
图5：不同剂量的α-细辛脑对6μM氧合血红蛋白损伤的PC12细胞的影响。与对照组相比， ###P<0.001， ##P<0.01；与模型组相比， ***P<0.001， **P<0.01。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
制备实施例1 α-细辛脑注射乳剂的制备
称取α-细辛脑0.50～50.0g、注射用大豆油50.0～300.0g，置适宜容器中，在充氮气保护条件下加热至60～80℃，搅拌使溶解；续称取蛋黄卵磷脂6.0～18.0g，加入其中，搅拌使溶解(必要时加入油酸、油酸钠或二者的混合物0.10～0.50g)，制得油相，备用。另称取普朗尼克(F68)0～3.0g、甘油0～25.0g，量取水约800mL，在充氮气保护条件下加热至60～80℃，搅拌使溶解；制得水相。将上述油相加入水相，高速剪切5～15分钟，补加水至1000mL，制备成初乳。续将初乳采用高压均质机均质1～3次，使均质后的乳滴平均粒径不大于0.5μm，滤膜过滤，滤液在充氮气保护条件下灌装于5mL～20mL玻璃安瓿中，旋转式热压灭菌121℃×8～12min，即得α-细辛脑注射乳剂，其中含α-细辛脑的浓度为0.5～50mg/mL。
制备实施例2 α-细辛脑注射乳剂的制备
称取α-细辛脑10.0g、注射用大豆油50.0g、注射用中链甘油三酯(MCT)50.0g，置适宜容器中，在充氮气保护条件下加热至60～80℃，搅拌使溶解；续称取蛋黄卵磷脂12.0g、油酸钠0.3g，加入其中，搅拌使溶解，制得油相，备用。另称取甘油22.0g，量取水约800mL，在充氮气保护条件下加热至60～80℃，搅拌使溶解；制得水相。将上述油相加入水相，高速剪切5～15分钟，补加水至1000mL，制备成初乳。续将初乳采用高压均质机均质1～3次，使均质后的乳滴平均粒径不大于0.5μm，滤膜过滤，滤液在充氮气保护条件下灌装于5mL或10mL玻璃安瓿中，旋转式热压灭菌121℃×8min，即得α-细辛脑注射乳剂，其中含α-细辛脑的浓度为10mg/mL。
制备实施例3 α-细辛脑注射乳剂的制备
称取α-细辛脑20.0g、注射用大豆油100.0g、注射用中链甘油三酯(MCT)100.0g，置适宜容器中，在充氮气保护条件下加热至60～80℃，搅拌使溶解；续称取蛋黄卵磷脂12.0g、油酸0.3g，加入其中，搅拌使溶解，制得油相，备用。另称取甘油22.0g，量取水约800mL，在充氮气保护条件下加热至60～80℃，搅拌使溶解；制得水相。将上述油相加入水相，高速剪切5～15分钟，补加水至1000mL，制备成初乳。续将初乳采用高压均质机均质1～3次，使均质后的乳滴平均粒径不大于0.5μm，滤膜过滤，滤液在充氮气保护条件下灌装于5mL或10mL玻璃安瓿中，旋转式热压灭菌121℃×8min，即得α-细辛脑注射乳剂，其中含α-细辛脑的浓度为20mg/mL。
制备实施例4 α-细辛脑注射乳剂的制备
称取α-细辛脑1.0g、注射用大豆油100.0g，置适宜容器中，在充氮气保护条件下加热 至60～80℃，搅拌使溶解；续称取蛋黄卵磷脂12.0g、油酸0.3g，加入其中，搅拌使溶解，制得油相，备用。另称取甘油22.0g，量取水约800mL，在充氮气保护条件下加热至60～80℃，搅拌使溶解；制得水相。将上述油相加入水相，高速剪切5～15分钟，补加水至1000mL，制备成初乳。续将初乳采用高压均质机均质1～3次，使均质后的乳滴平均粒径不大于0.5μm，滤膜过滤，滤液在充氮气保护条件下灌装于50mL输液瓶中，旋转式热压灭菌121℃×12min，即得α-细辛脑注射乳剂，其中含α-细辛脑的浓度为1mg/mL。
制备实施例5 α-细辛脑口服乳剂的制备
制备方法同实施例1，油相可加入药学上可接受量的抗氧剂如维生素E、焦性没食子酸酯等，油相还可加入药学上可接受量的防腐剂，如尼泊金乙酯等；水相可加入药学上可接受量的矫味剂，如具有芳香味的果汁糖浆；水相还可加入药学上可接受量的防腐剂，如苯甲酸、苯甲酸钠等。同法制备成初乳，续将初乳采用高压均质机均质1～3次，使均质后的乳滴平均粒径不大于10μm，滤膜过滤，滤液在充氮气保护条件下灌装于适宜药用包装中，流通蒸汽灭菌100℃×30min，或121℃×8min，即得α-细辛脑口服乳剂。
制备实施例6 α-细辛脑注射乳剂的制备
称取α-细辛脑1.0g～20.0g、注射用大豆油50.0g～200.0g，置适宜容器中，在充氮气保护条件下加热至60～80℃，搅拌使溶解；续称取蛋黄卵磷脂12.0g、油酸0～0.3g，加入其中，搅拌使溶解，制得油相，备用。另称取甘油22.0g，量取水约800mL，在充氮气保护条件下加热至60～80℃，搅拌使溶解；制得水相。将上述油相加入水相，高速剪切5～15分钟，补加水至1000mL，制备成初乳。续将初乳采用高压均质机均质1～3次，使均质后的乳滴平均粒径不大于0.5μm，滤膜过滤，滤液在充氮气保护条件下灌装于2mL、5mL、10mL玻璃安瓿中，旋转式热压灭菌121℃×8～12min，即得α-细辛脑乳状注射液，其中α-细辛脑的含量为1mg/mL～20mg/mL。
制备实施例7 α-细辛脑注射乳剂(又称乳状注射液)的制备
实验材料：
α-细辛脑(2883-98-9，武汉拉那白医药化工有限公司)；
注射用大豆油(DD20200603，山东瑞生药用辅料有限公司)；
蛋黄卵磷脂(202008013，上海太伟药业股份有限公司)；
油酸(160907，西安力邦制药有限公司)；
甘油(20191213，浙江遂昌惠康药业有限公司)；
实验步骤：称取α-细辛脑10.0g、注射用大豆油100.0g，置适宜容器中，在充氮气保护条件下加热至80℃，搅拌使溶解；续称取蛋黄卵磷脂12.0g、油酸0.3g，加入其中，搅拌使溶解，制得油相，备用。另称取甘油22.0g，量取水约800mL，在充氮气保护条件下加热至80℃，搅拌使溶解；制得水相。将上述油相加入水相，以19000r/min高速剪切10分钟，使油相分散于水相中，补加水至1000mL，制备成初乳。续将初乳采用高压均质机以1000bar压力均质3次，使均质后的乳滴平均粒径不大于0.5μm，滤膜过滤，滤液在充氮气保护条件下灌装于2mL、5mL、10mL玻璃安瓿中，旋转式热压灭菌121℃×8min，即得α-细辛脑乳状注射液，其中α-细辛脑的含量为10mg/mL，批号20201228。
制备实施例8 α-细辛脑口服乳剂的制备
称取α-细辛脑10.0g、药用大豆油100.0g，置适宜容器中，在充氮气保护条件下加热至80℃，搅拌使溶解；续称取蛋黄卵磷脂12.0g、油酸0.3g、抗氧剂维生素E 10.0g、尼泊金乙酯2.0g加入其中，搅拌使溶解，制得油相，备用。另称取甘油22.0g，量取水约800mL，在充氮气保护条件下加热至80℃，搅拌使溶解；制得水相。将上述油相加入水相，以19000r/min高速剪切10分钟，使油相分散于水相中，补加水至1000mL，制备成初乳。续将初乳采用高压均质机以1000bar压力均质3次，使均质后的乳滴平均粒径不大于0.5μm，滤膜过滤，滤液在充氮气保护条件下灌装于10mL口服西林瓶中，流通蒸汽灭菌100℃×30min，或旋转式热压灭菌121℃×8min，即得α-细辛脑口服乳剂，其中α-细辛脑的含量为10mg/mL，批号为20210105。
效果实施例1：α-细辛脑对SAH和ICH大鼠的短期治疗作用
实验材料：SPF级SD大鼠，雌雄各半，体重200～240g，购于四川省成都达硕实验动物有限公司，合格证号：SCXK(川)2020-030。
胶原酶Ⅶ购于美国Sigma-Aldrich公司(规格：1.5KU；批号：0000111586)。
α-细辛脑原料药购于武汉拉那白医药化工有限公司(规格：2kg；批号：2883-98-9)，其乳状注射液为自制，批号20201228、20210105。
长春西汀注射液购于河南润弘制药股份有限公司(规格：10mg:2mL；批号：1811283)。
尼莫地平注射液购于拜耳医药保健公司(规格：10mg:50mL；批号：BXJC71)。
实验分组：血管内穿刺后或胶原酶Ⅶ注射后2小时采用Zea Longa评分判断造模是否成功，取造模成功的大鼠随机分组给药。
大鼠随机分为假手术组(P组，给予与乳状注射液高剂量组等体积的生理盐水)、模型组(S或I组，给予与乳状注射液高剂量组等体积的空白乳剂)、α-细辛脑乳状注射液低剂量组(由制备实施例7制得，7.5mg/kg，L组)、α-细辛脑乳状注射液中剂量组(由制备实施例7制得，15mg/kg，M组)，α-细辛脑乳状注射液高剂量组(由制备实施例7制得，30mg/kg，H组)、α-细辛脑乳剂口服给药组(由制备实施例8制得，40mg/kg，O组)、β-细辛脑乳状注射液组(同制备实施例7法操作，制备成乳状注射液，浓度为10mg/mL，给药剂量为20mg/kg，B组)、长春西汀注射液组(市售，2mg/kg，V组)，尼莫地平注射液组(市售，1mg/kg，N组)，每组12只，除N组采用腹腔注射给药，其余各组均通过尾静脉给药。
1.1血管内穿刺法建立SAH
术前大鼠禁食12小时，大鼠用4％异氟烷诱导麻醉，并采用2％异氟烷维持麻醉。仰卧位固定，维持动物体温为37℃左右。颈部备皮，取颈部正中切口，沿胸锁乳突肌内缘分离肌肉和筋膜，暴露右侧并钝性分离颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA)，在CCA近心端、ICA及ECA处置线备用。结扎CCA近心端、ECA，用动脉夹暂时夹闭ICA，然后在CCA距分叉部约4mm处用针头戳一小孔，将穿刺线经CCA插入ICA，松开ICA上的动脉夹，将穿刺线向颅内插入。当穿刺线头端距颈总动脉分叉处约18～19mm后，有阻力感，表示穿刺线头端已达大脑前动脉与大脑中动脉分叉处，略用力再伸入约2mm后，此时穿刺线已刺破大脑前动脉与大脑中动脉分叉。完全拔除穿刺线，结扎ICA，使用生理盐水清洗创面后缝合。假手术组只是当穿刺线刺入感到阻力时退出，不刺破大脑前动脉与大脑中动脉分叉，其余操作步骤与实验组相同。麻醉清醒后，正常饲养。
SAH的严重程度评分在完成短期神经功能评分后将大鼠安乐死后进行，根据基底池及脑组织表面蛛网膜下腔出血情况进行评分：基底池被基底动脉、大脑前动脉、颈内动脉、大脑后动脉以及后交通动脉组成的Willis环分成6区域。根据蛛网膜下腔血凝块的多少，每个区域的评分被分为0～3分：0：无蛛网膜下腔血；1：少量蛛网膜下腔血；2：中等量血凝块，颅底动脉可识别；3：血块覆盖了区域内的所有动脉。将所有6部分评分相加，总分18分。根据最终得分SAH出血严重程度可分为0-7分：轻度蛛网膜下腔出血，8-12分：中度蛛网膜下腔出血，以及13-18分：重度蛛网膜下腔出血。选择中度～重度的SAH模型纳入统计(评分≥8分)。
1.2胶原酶注入法构建ICH模型
术前大鼠禁食12小时，大鼠用4％异氟烷诱导麻醉，并采用2％异氟烷维持麻醉。俯卧位固定，维持动物体温为37℃左右。头部备皮，取头部正中切口，根据诸葛启钏主译的 大鼠脑立体定位图谱(GeorgePaxinos,CharlesWatson,Paxinos,Watson,&诸葛启钏.大鼠脑立体定位图谱[M].人民卫生出版社,2005)，使用立体定位仪定位大鼠右侧尾状核(以前囟为原点，向右3mm，深度5.5mm)，标记后使用颅骨转孔，将微量注射器针头插入脑组织尾状核，注入含0.5UⅦ型胶原酶1μL，注射时间5分钟，注射完后留针8分钟，缓慢将针退出，骨蜡封闭颅骨钻孔，缝合皮肤，回笼饲养。假手术组大鼠只插针注射灭菌生理盐水，不注射药物，其他操作不变。
1.3脑出血模型入选标准
参照Zea Longa神经功能评分，术后2小时待大鼠麻醉清醒后进行评分，评分为1～3分者入组：
0分：无神经功能缺失症状，活动正常者；
1分：不能完全伸展对侧前爪；
2分：动物爬行时出现转圈；
3分：身体向偏瘫侧倾倒；
4分：不能自发行走，意识丧失者。
1.4短期神经功能缺损评分
造模24小时后采用Garcia评分、平衡木实验对大鼠神经功能进行全面评估，Garcia评分标准见表1，对大鼠的运动、感觉、攀爬、四肢对称性进行评价，评分范围为3～18分，得分越低，神经功能损伤越重；平衡木实验评分标准见表2，对大鼠的本体感觉和身体协调性进行评价，评分范围为0～6分，得分越高，神经功能损伤越严重。评分由未参与造模和给药的不知情者独立完成。
表1 Garcia神经功能评分
表2 平衡木评分标准
评价标准 得分
稳定平衡姿势 0分
紧抓平衡木边缘 1分
紧抱平衡木，一肢体从平衡木垂落 2分
紧抱平衡木，二肢体从平衡木垂落或在平衡木上旋转(>60秒) 3分
试图在平衡木上平衡但跌落(>40秒) 4分
试图在平衡木上平衡但跌落(>20秒) 5分
跌落；未尝试在平衡木上平衡(<20秒) 6分
由表3可见，相较假手术组(P组)，模型组(S或I组)在术后24小时的Garcia评分明显降低(P<0.001)，平衡木评分明显升高(P<0.001)，可见SAH或ICH后24小时模型组的大鼠发生明显神经功能缺损；不同剂量α-细辛脑静脉给药(L、M、H组)及α-细辛脑口服给药(O组)均能不同程度的提高Garcia得分、降低平衡木评分，改善SAH或ICH引起的神经功能缺损，其中M组给药改善效果最为显著(P<0.01)。对于SAH模型，M组用药疗效优于临床用于改善蛛网膜下腔出血后血管痉挛的药物尼莫地平(N组)及用于治疗脑出血后遗症的药物长春西汀(V组)；对于ICH模型，L、M组用药疗效优于V组，且均显著优于N组；相反，β-细辛脑给药组(B)对SAH和ICH模型大鼠神经功能均无明显改善作用。此外，SAH各组大鼠经心脏灌注取脑后发现模型组、给药组的出血评分均没有显著差异，可排除因造模轻重不一导致的行为功能差异。
表3 大鼠短期神经功能缺损评分
注：与假手术组(P组)比较， ###P<0.001， ##P<0.01， #P<0.05；与模型组(S或I组)比较， **P<0.01， *P<0.05；与尼莫地平组(N组)比较， &P<0.05。相比数据用x±SD表示，用ANOVA和Tukey-post-hoc进行多组比较分析。
效果实施例2：α-细辛脑降低SAH大鼠继发癫痫的发生率
实验材料、分组、造模方式及给药方案同效果实施例1，观察大鼠SAH后24小时内各组大鼠癫痫发作情况。结果如表4所示，与P组相比，S组的Racine评分显著升高(P<0.001)，L、M、H组及O组均能不同程度的降低Racine评分，其中M组给药降低效果最为显著(P<0.05)。据此，α-细辛脑可以显著降低大鼠SAH导致的继发癫痫发生率。
表4 α-细辛脑对大鼠SAH导致的继发癫痫发作的影响
组别 Racine评分 阵挛性发作(％) 强直性发作(％)
P 0±0 0 0
S 1.72±1.87 ### 38.9％ 11.1％
L 0.53±1.46 6.7％ 6.7％
M 0.44±1.34 * 5.6％ 5.6％
H 0.73±1.44 # 8.0％ 6.7％
O 0.77±1.59 # 15.4％ 7.7％
N 0.81±1.56 # 18.8％ 6.2％
注：与P组(给予生理盐水)相比， ###P<0.001， #P<0.05；与S组(给予空白乳剂)相比， *P<0.05。发作级别参照Racine标准，此标准依据癫痫发作程度将发作行为分为6级：0级为无反应或抽搐停止；Ⅰ级为节律性嘴角或面部抽动；Ⅱ级为点头或甩尾；Ⅲ级为单肢抽动；Ⅳ级为多肢抽动或强直；Ⅴ级为全面性强直-阵挛发作。Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ级为阵挛性发 作，Ⅳ和Ⅴ级为强直性发作。
效果实施例3：α-细辛脑对SAH大鼠的长期保护作用
3.1大鼠长期生存率
实验材料、分组和造模方式同效果实施例1，SAH造模后2小时，立即按分组给药方案给药，此后继续给药14天，每天给药一次，观察并记录大鼠14天存活情况。结果如表5所示，S组24小时内死亡率高达53.8％，M、H、O组及N组给药能显著降低SAH大鼠24小时内死亡率，延长大鼠生存期，即α-细辛脑可以显著降低SAH大鼠的24小时死亡率，延长其14天生存期。
表5 SAH大鼠的长期生存率
3.2长期学习记忆功能评价
Morris水迷宫用来评估各组大鼠的长期空间感知和记忆能力，在结束生存期观察记录后，即SAH后第15-19天进行。水迷宫为圆形水池，直径150cm，深60cm。实验开始之前向里面填充温水(24±2)℃至水深30cm，然后使用颜料将水染成黑色。水池被等分为4个象限，在不同象限的池壁贴上不同的标志以示区分。在其中一个象限中央放置一个无色透明的平台，其直径为10cm，高28cm，平台没于水下2cm。实验开始后按照实验指南在指定的象限释放大鼠。第1-4天，大鼠分别从4个不同象限释放入水进行实验各1次，每一轮实验间隔为10分钟。若大鼠在60秒内找到平台，让其于平台上站立10秒；若未找到，用棒将其引导至平台上，并让其站立10秒。第5天，取下平台，让大鼠自由游动60秒，用计算机跟踪系统(Noldus Ethovision,Tacoma,WA,USA)记录逃避潜伏期、游动速 度和目标象限探索时间等数据。
实验结果如图1A所示，在获得性训练期间，与P组相比，S组和N组找到平台的潜伏期明显延长(P<0.001)；而M组的逃避潜伏期明显短于S组和N组，甚至到第四天与P组已无统计学差异；由图1B、1C可以看出，在空间探查期间，与P组相比，S组和N组在目标象限停留时间更短，而M组的目标象限停留时间延长，与P组相当，此外，该组的游泳速度显著快于S组(P<0.05)；由图1D所示，长期用药后，S组和N组均有大鼠患侧脑组织出现发白、萎缩的现象；而P组和M组则没有。综上，α-细辛脑长期给药不仅可显著改善SAH大鼠恢复期的学习记忆功能、促进运动功能恢复，还可缓解SAH大鼠恢复期的脑组织萎缩。
效果实施例4：α-细辛脑抗出血性脑卒中的作用机制研究
实验材料：
伊文思蓝(C11891158，上海麦克林生化科技)；
甲酰胺(20190716，天津博迪化工)；
谷氨酸检测试剂盒(20210525，北京索莱宝科技)；
GABA-Elisa试剂盒(202101，上海江莱生物)；
DNA酶Ⅰ(226F031，北京索莱宝科技)；
木瓜蛋白酶(111S022，北京索莱宝科技)；
钙离子荧光探针(20210313，江苏凯基生物)；
罗丹明123染液(119I033，北京索莱宝科技)；
冰冷离心缓冲液(20210525，北京索莱宝科技)。
实验步骤与结果：
4.1脑含水量和血脑屏障通透性测定
完成24小时短期神经功能评分后，将4％伊文思蓝溶液(2.5mL/kg)注入大鼠右侧尾静脉，1小时后深度麻醉大鼠，经心脏灌注100mL生理盐水，迅速断头取脑，立即分为左侧半球、右侧半球、小脑和脑干。左、右半球冠状分为两部分，一部分用精度为0.1mg的天平分别称量脑组织(湿重)；随后，将样品置于烘箱105℃烘干24小时，再次分别称重(干重)；脑含水量计算：脑含水量＝[(湿重-干重)/湿重]×100％。将另一部分脑组织称得湿重后，置于10倍体积的纯甲酰胺中浸泡，60℃孵育48h，25℃、10000rpm/min离心30min，吸取上清采用紫外分光光度法在622nm处检测伊文思蓝染料，绘制标准曲线定量，最终结果显示为每克脑组织伊文思兰含量(μg/g)。
结果如图2所示，相较假手术组(P组)，模型组(S或I组)出血侧大脑半球在术后24小时脑含水量明显升高，伊文思蓝渗出量明显增多、血脑屏障通透性增大，而α-细辛脑中剂量静脉给药(M组)能显著降低大鼠出血侧脑组织含水量、减轻脑水肿，减少伊文思蓝渗出、改善血脑屏障通透性。
4.2谷氨酸和GABA含量测定
造模后12～24小时，将大鼠深度麻醉，断头取脑，取出血侧大脑半球皮层约60～120mg，加入10倍体积用于生化检测的冰冷离心缓冲液，冰浴下匀浆10min，4℃、14000rpm/min离心30分钟，取上清液按谷氨酸含量检测试剂盒说明书及大鼠GABA Elisa试剂盒说明书分别检测谷氨酸和GABA含量。
结果如图3所示，相较P组，S或I组大鼠出血侧脑半球在术后12～24小时谷氨酸和GABA含量明显升高，而M组给药能显著降低脑出血大鼠脑组织谷氨酸和GABA含量，有利于抗衡谷氨酸兴奋性毒性、恢复脑内兴奋性氨基酸/抑制性氨基酸(EAA/IAA)平衡、改善大鼠运动功能。
4.3Ca 2+含量或线粒体膜电位测定
造模后12～24小时，断头取脑，取血肿周围大脑半球皮层，立即采用酶消化法(木瓜蛋白酶：2mg/mL；DNA酶Ⅰ：0.05mg/mL)制备单细胞悬液，调整细胞浓度为5×10 6个/mL，取100μL细胞悬液，加入终浓度为5μM的Fluo-3/AM染液或终浓度为10μM的罗丹明123染液，在37℃孵育45min，PBS(磷酸盐缓冲液，pH＝7.2-7.4)洗细胞2次，加0.5mL PBS重悬细胞，在激发波长506nm，发射波长526nm条件下使用流式细胞仪检测10,000个细胞，并用Flowjo软件分析Fluo-3和Rh123平均荧光强度。
结果如图4所示，相较P组，S或I组在术后12～24小时钙离子含量明显升高，线粒体膜电位升高，提示线粒体遭破坏、细胞凋亡增多；而M组给药能显著降低钙离子含量、稳定线粒体膜电位，从而减少神经元凋亡、坏死。
效果实施例5：α-细辛脑对氧合血红蛋白损伤神经元的保护作用
实验材料：
PC12细胞株购自武汉普诺赛生命科技有限公司；
氧合血红蛋白(20210201，北京索莱宝科技有限公司)；
MTT(C12029690，美国Sigma-Aldrich)；
DMEM高糖培养基(AG29301810，美国Hyclone)；
胎牛血清(20010401，美国Gibco)
青霉素-链霉素溶液(双抗)(20201220，美国Hyclone公司)
PBS粉末(WK173618-1，北京中山金桥生物科技有限公司)；
DMSO(20201220，北京索莱宝科技有限公司)。
实验步骤：
完全培养基：将DMEM高糖培养基、胎牛血清和青霉素-链霉素溶液(双抗)按90：9：1的体积比混合均匀，4℃冰箱保存即得。
无血清培养基：将DMEM高糖培养基和青霉素-链霉素溶液(双抗)按99：1的体积比混合均匀，4℃冰箱保存即得。
取完全培养基培养的处于对数生长期的PC12细胞，将其以1×10 4个/100μL/孔接种到96孔板，边缘孔用无菌PBS填充，37℃、5％CO 2培养24小时，直至细胞完全贴壁；弃上清，加入终浓度分别为0μM、4μM、6μM、8μM、10μM的氧合血红蛋白，37℃、5％CO 2培养24小时；随后每孔加入5mg/mL的MTT 10μL，37℃、5％CO 2培养4小时；弃上清，加入DMSO 100μL/孔，并于37℃、500r/min振摇15分钟以充分溶解甲瓒，采用酶标仪检测570nm处OD值，计算PC12细胞活力，按公式“细胞非正常增殖倍数＝[(实验组平均吸光度值-调零孔平均吸光度值)/(对照组平均吸光度值-调零孔平均吸光度值]”，筛选出在本实验条件下细胞非正常增殖倍数最大值为1.5倍时，对应的氧合血红蛋白浓度为6μM。据此，将该浓度作为预试验优选的氧合血红蛋白致氧化应激损伤模型浓度，用于以下细胞药效学实验。
另取完全培养基培养的处于对数生长期的PC12细胞，将其以1×10 4个/100μL/孔接种到96孔板，边缘孔用无菌PBS填充，37℃、5％CO 2培养24小时，直至细胞完全贴壁；弃上清，除对照组和模型组外，其余各给药组加入100μL不同浓度的用无血清培养基稀释的α-细辛脑乳剂(由制备实施例7制得，使α-细辛脑终浓度分别为1μM、5μM、10μM、25μM、50μM)。培养2小时后，再向上述各给药组中加入终浓度为6μM的用无血清培养基稀释的氧合血红蛋白溶液，每孔20μL，37℃、5％CO 2继续培养至24小时。对照组仅加入同体积的无血清培养基；模型组依次加入100μL无血清培养基稀释的空白乳剂(处方中除不含α-细辛脑外，其余同制备实施例7操作)和20μL终浓度为6μM的用无血清培养基稀释的氧合血红蛋白溶液；对照组与模型组其余操作与给药组相同。随后每孔加入5mg/mL的MTT 10μL，37℃、5％CO 2培养4小时；弃上清，加入DMSO 100μL/孔，并于37℃、500r/min振摇15分钟以充分溶解甲瓒，采用酶标仪检测570nm处OD值，结果如图5所示。
实验结果：如图5所示，与对照组相比，模型组因氧合血红蛋白的加入致使PC12细 胞非正常增殖，吸光度显著升高，提示细胞活力显著增强，发生明显氧化应激反应；另一方面，不同浓度的α-细辛脑显著降低了因氧合血红蛋白所致的细胞活力异常升高，表明其可显著减轻氧合血红蛋白所致的氧化应激反应(图5)。
效果实施例6：α-细辛脑乳状注射液的安全性初步评价—小鼠骨髓微核实验
实验材料：SPF级雄性昆明小鼠50只，体重18～22g，购于成都达硕实验动物有限公司，许可证号SCXK(川)2020-030。注射用环磷酰胺购于江苏盛迪医药有限公司；1,4-哌嗪二乙磺酸(PIPES，715H021，北京Solarbio公司)、TritonX-100(829I0210，北京Solarbio公司)、碘化丙啶(PI，1024S043，北京Solarbio公司)。
实验分组及给药：将动物随机分为五组，每组10只，空白对照组(Blank组，给予与α-细辛脑高剂量组给药体积相当的空白乳剂)，环磷酰胺组(CTX组，40mg/kg)，α-细辛脑乳状注射液低剂量组(由制备实施例7制得，100mg/kg/日，ASA-L组)，α-细辛脑乳状注射液中剂量组(由制备实施例7制得，150mg/kg/日，ASA-M组)，α-细辛脑乳状注射液高剂量组(由制备实施例7制得，200mg/kg/日，ASA-H组)。
所有药物均通过尾静脉注射，除阳性对照药物环磷酰胺(CTX)仅在取材前24小时单次注射外，其余每组连续通过尾静脉给药4天，末次给药后24小时，断颈处死小鼠，分离两侧股骨后，用PBS冲出股骨骨髓细胞，过300目尼龙网制成单细胞悬液，1650rpm离心5min，PBS重悬后调整细胞浓度为5×10 6个/mL，每个样品取100μL细胞悬液小心加入PIPES-PI溶液(10mL PIPES溶液(浓度为3.5mg/mL)+0.5mg PI+0.01mL Triton X-100(浓度为0.1％))400μL，轻轻吹打混匀，4℃避光染色30min后，使用流式细胞仪检测，结果见表6。如表6所示，其中PCE为嗜多染红细胞，MNPCE为含微核的嗜多染红细胞，fMNPCE为含微核的嗜多染红细胞占嗜多染红细胞的比例，反应了小鼠骨髓细胞的微核率，该数值越高表明遗传毒性越强。
结果如表6所示，阳性对照药物环磷酰胺组(CTX)的微核率较空白乳液组极显著提高(P<0.01)；α-细辛脑乳状注射液各剂量组与空白乳液组相比，微核率无显著差异；与CTX组相比，微核率显著降低，均有统计学差异(ASA-L：P<0.01；ASA-M：P<0.05；ASA-H：P<0.05)。
上述小鼠造血细胞体内染色体损伤的毒理学研究结果表明，α-细辛脑乳状注射液静脉给药剂量高达200mg/kg时，小鼠骨髓细胞的微核率未发生显著性变化。结合其前述用于治疗出血性脑卒中的有效剂量考虑，预期该药的安全性良好。
表6 流式细胞仪检测小鼠的骨髓fMNPCE(‰)结果
注：与空白组(Blank)比较， ##P<0.01；与CTX组比较， **P<0.01， *P<0.05。
综上体内外药效学研究结果，α-细辛脑可显著改善出血性脑卒中大鼠的短期神经行为功能、长期学习记忆功能、减少SAH大鼠继发癫痫的发生率和死亡率；减轻脑水肿、改善血脑屏障通透性、预防或缓解恢复期脑组织萎缩；拮抗谷氨酸兴奋性毒性、恢复GABA水平、恢复脑内兴奋性氨基酸/抑制性氨基酸(EAA/IAA)平衡；减少Ca 2+内流，稳定线粒体膜电位，减少神经元凋亡；减轻氧化应激，发挥神经保护作用。据此，α-细辛脑有望成为极具应用前景的治疗出血性脑卒中药物。
虽然以上描述了本发明的具体实施方式，但是本领域的技术人员应当理解，这些仅是举例说明，在不背离本发明的原理和实质的前提下，可以对这些实施方式做出多种变更或修改。因此，本发明的保护范围由所附权利要求书限定。

Claims (15)

  1. 式I所示化合物在制备预防或治疗出血性脑卒中的药物中的应用；
  2. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的药物还用于预防或治疗因出血性脑卒中导致的继发癫痫。
  3. 如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的药物用于治疗出血性脑卒中并预防因出血性脑卒中导致的继发癫痫。
  4. 如权利要求1-3中任一项所述的应用，其特征在于，所述的出血性脑卒中为脑内出血和蛛网膜下腔出血中至少一种导致的脑卒中。
  5. 如权利要求1-3中任一项所述的应用，其特征在于，所述的药物用于下列中的至少一种：改善ICH或SAH所致的神经功能或运动功能的损伤、改善ICH或SAH所致的急性期脑组织水肿或血脑屏障功能障碍、降低出血性脑卒中所致的急性期死亡率、延长生存期、改善出血性脑卒中所致的长期学习记忆功能障碍、以及预防或缓解出血性脑卒中恢复期脑组织萎缩。
  6. 如权利要求1-3中任一项所述的应用，其特征在于，所述的式I所示化合物为所述药物中的唯一有效成分。
  7. 如权利要求1-3中任一项所述的应用，其特征在于，所述的药物含有药用辅料；较佳地，所述的式I所示化合物与药用辅料的总重量比例为1：20～1000。
  8. 如权利要求1-3中任一项所述的应用，其特征在于，当所述的药物用于治疗患有出血性脑卒中的人时，所述的药物中式I所示化合物的每日给药剂量范围为0.15mg～5.0mg/kg体重，优选为0.3mg～3.0mg/kg体重。
  9. 如权利要求1-3中任一项所述的应用，其特征在于，所述的药物的给药途径是注射或口服。
  10. 如权利要求1-3中任一项所述的应用，其特征在于，所述的药物为乳剂。
  11. 一种用于预防或治疗出血性脑卒中的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物含有式I所示化合物以及药用辅料；
  12. 如权利要求11所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物还用于预防或治疗因出血性脑卒中导致的继发癫痫。
  13. 如权利要求11所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物用于治疗出血性脑卒中并预防因出血性脑卒中导致的继发癫痫。
  14. 如权利要求11-13中任一项所述的药物组合物，其特征在于，所述的式I所示化合物为所述药物组合物中的唯一有效成分。
  15. 一种治疗或预防受试者出血性脑卒中的方法，其特征在于，包括：给予所述受试者治疗或预防有效量的如式I所示化合物；优选地，所述的方法用于治疗或预防受试者出血性脑卒中并治疗或预防因出血性脑卒中导致的继发癫痫；更优选地，所述的方法用于治疗受试者出血性脑卒中并预防因出血性脑卒中导致的继发癫痫；
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