KR20100124054A

KR20100124054A - 더덕 추출물 또는 더덕 사포닌을 포함하는 히스타민 분비 억제용 조성물

Info

Publication number: KR20100124054A
Application number: KR1020090043098A
Authority: KR
Inventors: 조재열; 유대성; 변세은; 이용규; 김민호; 홍억기
Original assignee: 강원대학교산학협력단
Priority date: 2009-05-18
Filing date: 2009-05-18
Publication date: 2010-11-26
Also published as: KR101084727B1

Abstract

본 발명은 더덕 추출물 또는 더덕 사포닌을 유효성분으로 포함하는 비만세포로부터 히스타민의 분비를 억제하는 효과를 갖는 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 조성물과 이를 포함하는 제품은 소양증을 비롯하여 발적, 화끈거리는 열감, 두드러기, 재채기, 맑은 콧물, 코막힘, 객담증가, 흉부압박감, 호흡곤란, 순환기계의 빈맥, 저혈압, 전신 무기력증, 어지러움증과 같은 히스타민의 필요이상의 분비로 인하여 발생되는 질병이나 증상의 예방 또는 치료용도로 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물 및 이를 함유하는 제품은 사람뿐만 아니라 동물에도 적용할 수 있다.

더덕, 사포닌, 소양증, 비만세포, 탈과립, 히스타민

Description

더덕 추출물 또는 더덕 사포닌을 포함하는 히스타민 분비 억제용 조성물{Composition for inhibiting release of histamine comprising extract or a saponin of Codonopis lanceolata}

본 발명은 소양증을 비롯한 히스타민의 필요이상의 분비로 인한 질병이나 증상의 예방 또는 치료용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 더덕 추출물 또는 더덕의 사포닌을 유효성분으로 포함하는 소양증을 비롯한 히스타민과 관련된 질병이나 치료제를 위한 조성물 및 이를 포함하는 제품에 관한 것이다.

히스타민은 거의 모든 인체조직에 함유된 물질로 피부ㆍ소화기관ㆍ폐조직에 많이 분포하며, 주로 비만세포와 백혈구의 일종인 호염기구 등에 과립형태로 저장되어 있다가 자극이 주어지면 분비된다. 히스타민은 체내에서 알레르기 반응에 관여하며, 혈관 확장, 모세혈관의 투과성 증가, 기관지ㆍ장ㆍ자궁 등의 평활근 조직 수축 및 심근 수축력 증가 등을 맡는다. 또 땀ㆍ위산ㆍ침ㆍ기도 분비물을 증가시키며, 뇌에서는 신경전달 물질로 작용하여 각성효과와 체온조절에도 관여한다. 히스타민은 손상된 조직을 회복시키며, 신체적ㆍ정신적 항상성을 유지하는 중요한 기능 을 담당한다. 그러나 알레르기ㆍ피부질환, 상기도 감염(감기) 등 염증성 질환이 있을 경우 가려움증과 두드러기ㆍ발한ㆍ기도 수축 및 분비물의 증가를 유도하며, 아나필락시스 반응에서는 혈관을 과도하게 확장시켜 저혈압과 쇼크로 생명을 앗아갈 수도 있다.

히스타민이 과도하게 분비되면, 소양감, 발적, 화끈거리는 열감, 두드러기 및 따가운 양상의 통증, 호흡기계의 재채기, 맑은 콧물, 코막힘, 객담 증가, 흉부압박감, 호흡곤란, 순환기계의 빈맥, 저혈압과 전신 무기력증, 어지러움증 등이 생길 수 있다.

소양증(pruritus, 가려움증)은 긁고 싶은 욕망을 일으키는 피부의 불유쾌한 감각을 말한다. 소양증은 물리, 화학적 외부자극이나 질병에 의해서 유발되며, 내외인성 물질 등에 매개되기도 하는 등 그 요인이 다양하다. 소양증은 만성신부전증, 간경변증, 폐쇄성 담도질환, 당뇨병, 갑상선 기능항진증, 악성종양 철결핍성빈혈, 진성 혈구증가증, 정신성 질환 등으로부터 기인하기도 하며, 습진, 피부염, 무좀, 건선, 알러지, 두드러기 등의 질환들과 동반되기도 한다. 또한 노인성 변화에 의하여 피부전체가 가려워지는 노인성 소양증, 여성의 갱년기에 볼 수 있는 갱년기 소양증 등을 들 수 있다.

소양증을 일으키는 요인으로 진피 내에 존재하는 비만세포(mast cell)로부터 유리되는 히스타민을 들 수 있다. 비만세포는 히스타민을 다량으로 함유하는 과립을 가지고 있는데, 비만세포가 자극되어 활성화 되면 과립이 방출되어 히스타민이 유리되며, 히스타민이 역으로 신경말단에 작용하여, 소양증을 유도한다. 그러므로, 가려움을 예방하거나 그치게 하기 위해서는, 비만세포로부터 히스타민이 분비되는 것을 억제하는 것이 중요하다.

따라서 상기 질병이나 증상들의 예방 또는 치료를 위해서 히스타민의 필요이상의 분비를 억제할 필요가 있다. 종래 사용되어 온 항히스타민제는 복용시 중추신경장애, 소화기장애 등의 부작용이 있는 것으로 알려져 있어, 보다 안전한 약물을 개발하는 것이 필요하다.

한편, 비만세포는 IgE에 대한 고친화성 수용체를 발현하는데, 특정 항원에 의하여 생산된 IgE가 비가역적으로 결합한다. 다음에 그 항원이 다시 신체 내로 들어와 비만세포에 결합된 IgE에 결합하면 비만세포는 내부의 과립을 방출하며 이 때 히스타민, 시토킨 들이 방출되어 면역반응을 일으킨다고 알려져 있다. 또한, 비만세포의 활성은 T 세포에 의존하는 것으로 알려져 있다. 비만 세포의 과립 중에는 히스타민 외에 베타-헥소사미니다제(β-hexosaminidase)도 같이 저장되어 있는데, 비만세포가 활성화되면 베타-헥소사미니다제가 히스타민과 함께 방출되므로 비만세포의 탈과립이나 히스타민의 분비를 조사하기 위한 마커로 사용된다 (Schwartz 등, J. Immunol., 123, 1445-1450(1970).

더덕(Codonopsis lanceolata Benth et Hook)은 초롱꽃과(Campahutaceae)에 속하는 다년생 덩쿨성 식물로서, 면역증강 및 항암효과가 있다고 알려져 있다. 그 예로서, 대한민국 공개특허공보 제2003-57317호에 임파구세포의 증식과 대식세포에서 NO의 조절, iNOS 유전자 발현 및 사이토카인 발현의 조절을 통하여 자양 및 강장 효과의 증강에 기여할 수 있다고 기재되어 있으며, 대한민국 공개특허공보 제 2008-12812호에는 더덕의 열수추출물과 에탄올추출물이 암세포 증식 억제효과가 있다고 기재되어 있다.

한국에서 배양된 C. lanceolate에서 7가지 3,28-bidesmosidic triterpenoid saponin이 확인 되었다. 이 saponin은 1) lancemaside A 2) lancemaside B 3) lancemaside C 4) lancemaside E 5) lancemaside G 6) foetidissimoside A 7) aster saponin Hb 로 분리 명명 되어 있으며, 그 구조식은 아래와 같다.

본 발명의 명세서에 인용되는 선행문헌의 내용은 모두 본 명세서에 도입된다. 또한 이곳에 기재된 정보들은 단지 본 발명의 기술적 배경에 대한 이해를 돕고자 하는 것으로서, 본 발명에 대한 선행기술로써 작용할 수 없음은 당연하다.

종래 사용되어 온 항히스타민제는 복용시 중추신경장애, 소화기장애 등의 부작용이 있는 것으로 알려져 있어, 보다 안전한 약물을 개발하는 것이 필요하다. 따라서, 부작용이 적고 안전하며, 히스타민 분비억제효과를 나타내어, 소양증을 비롯하여 히스타민이 필요이상으로 분비되어 나타나는 질병 또는 증상을 예방 또는 치료할 수 있는 조성물 및 이를 포함하는 제품을 제공하는 것이 본 발명에서 해결하고자 하는 과제이다.

상기 과제를 해결고자 본 발명의 발명자들은 부단한 연구를 한 결과, 놀랍게도 천연소재인 더덕 추출물, 바람직하게는 더덕의 메탄올 추출물의 부탄올 분획, 더욱 바람직하게는 더덕 사포닌이 비만세포의 탈과립을 억제하여 히스타민의 분비를 억제하며 소양증에 대한 치료 효과를 갖는다는 것을 최초로 밝혀내고, 이를 기초로 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 더덕 추출물 (사포닌)을 유효성분으로 포함하는 조성물은 비만세포의 탈과립을 억제하여 히스타민의 분비를 억제하는 효과가 있다. 따라서 본 발명의 조성물은 히스타민이 필요이상으로 분비되어 발생되는 증상 또는 질병의 예방 또는 치료를 위하여 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물 또는 이를 함유하는 제품은 소양증, 두드러기, 발한, 기도 수축 및 분비물의 증가, 아나필락시스 반응에서의 혈관의 과도확장으로 인한 저혈압 및 쇼크, 발적, 화끈거리는 열감, 따가운 양상의 통증, 호흡기계의 재채기, 맑은 콧물, 객담증가, 흉부압박감, 호흡곤란, 순환기계의 빈맥, 저혈압과 전신 무기력증, 어지러움증, 홍반, 짓무름, 건조피부, 부종, 혈종 등과 같은 히스타민으로 인한 질병 또는 증상의 예방 및 치료에 사용이 가능하며, 사람뿐만 아니라 애완동물에도 적용할 수 있다.

더덕은 고가의 소재에 비하여 상대적으로 가격이 저렴하여 제품 개발 시 경제적 타당성이 높다.

본 발명은 더덕 사포닌을 유효성분으로 포함하는 비만세포로부터 히스타민의 분비를 억제하는 효과를 갖는 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 발명자들은, 본 발명의 다른 일실시예를 통하여 비만세포주를 탈과립상태로 만들 때 더덕의 사포닌 분획을 처리하면 탈과립현상을 통해 분비되는 베타-헥소사미나다제의 양이 감소됨을 관찰하여 더덕 사포닌 분획이 비만세포의 탈과립을 억제하여 히스타민의 분비를 억제한다는 것을 밝혔다(도 1).

본 발명의 다른 일실시예는 마우스를 DNCB (1-chloro-2,4-Dinitrochlorobenzene)로 감작시켜 Serum IgE의 수준(level)을 상승 시킨 후, 더덕 사포닌분획을 포함하는 크림을 마우스에 발라주면 대조군(크림베이스만을 처치한 군)과 비교하여 Serum IgE의 수준이 약56% 감소한다는 것을 보여준다 (도2). 비만세포의 탈과립은 비만세포에 발현된 수용체에 결합된 Serum IgE에 항원이 결합되면서 유도되므로, IgE 수준의 감소는 비만세포의 탈과립의 억제를 초래하게 되므로, 도2의 실험결과는 더덕사포닌이 비만세포의 탈과립을 억제한다는 것을 보여준다.

본 발명의 발명자는 또한, DNCB를 처치한 후 더덕사포닌 분획을 포함하는 크림 또는 크림베이스를 처치한 군의 INF-γ와 IL-4의 분비를 비교하여 더덕사포닌이 INF-γ 및 IL-4의 분비를 감소시킨다는 것을 밝혔으며(도3), 이는 더덕 사포닌에 의하여 T세포의 분화능이 억제되며 따라서 T세포에 의한 비만세포의 활성화도 억제된다는 것을 의미한다.

본 발명의 다른 일실시예는 마우스의 털을 제거한 후 대조군을 제외한 다른 2개 군에 1% DNCB로 200ul씩 피부에 1일1회 3일간 도포하여 가려움증을 유도하고, 3일 후부터 대조군을 제외한 군에 대해서 DNCB의 도포를 중단한 후 크림기재 또는 더덕의 사포닌분획을 함유하는 크림을 1일 1회씩 도포하며 각 군의 가려움증의 완화 정도을 측정한 결과, 더덕 사포닌 분획을 함유하는 크림을 처치한 군이 대조군이나 크림기재 만을 처치한 군에 비하여 가려움증의 치료효과가 통계적으로 유의하게 크다는 것을 보여주었다(도4).

또한, 본 발명에서는 더덕사포닌을 포함하는 크림을 사람에게 단기, 장기적으로 적용한 결과 부작용이 없다는 것을 확인하였다(도5 및 도6).

이와 같은 실험결과를 바탕으로, 본 발명은 더덕 추출물 또는 더덕의 사포닌을 유효성분으로 포함하는 히스타민의 필요이상의 분비로 인하여 발생되는 질병이나 증상을 예방 또는 치료하기 위한 조성물, 이를 포함하는 제품, 이를 사용하여 상기 질병이나 증상을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명의 조성물과 이를 포함하는 제품은 소양증을 비롯하여 발적, 화끈거리는 열감, 두드러기, 재채기, 맑은 콧물, 객담증가, 흉부압박감, 호흡곤란, 순환기계의 빈맥, 저혈압, 전신 무기력증, 어지러움증과 같은 히스타민의 필요이상의 분비로 인하여 발생되는 질병이나 증상의 예방 또는 치료용도로 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물 또는 이를 포함하는 제품에 의하여 예방 또는 치료가 가능한 소양증은, 예를 들어 무좀, 습진, 피부염 등의 피부염증 질환과 동반될 수 있으나, 이로 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물 및 이를 함유하는 제품은 사람뿐만 아니라 예를 들어, 개, 소, 돼지, 고양이, 카나리아, 앵무새 등의 동물, 가축에도 사용할 수 있다.

본 발명의 더덕 추출물을 포함하는 조성물은 더덕을 정제수, 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 글리세롤, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, n-헥산 및 클로로포름 중에서 선택되는 1종 또는 2종 이상의 용매를 하여 추출하는 단계를 포함하는 방법으로 제조할 수 있다. 또한 본 발명의 더덕 사포닌 분획을 포함하는 조성물은 더덕을 메탄올, 에테르, 부탄올 또는 유사한 특성을 갖는 용매를 사용하여 추출하는 단계를 포함하는 방법으로 제조할 수 있다.

본 발명에 따른 조성물은 더덕 추출물, 더덕의 메탄올 추출물의 부탄올 분획, 또는 더덕 사포닌을 단독으로 함유하거나 하나 이상의 담체, 부형제 또는 희석제 등을 추가로 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물은 의약용, 식품용, 화장용 등으로 사용가능하며 용도에 맞도록 어떠한 방법으로도 투여할 수 있다. 예를 들어, 비경구 또는 경구 투여가 가능하며, 투여 방법에 따라 적절한 제형으로 제조된다. 본 발명에 따른 조성물은 제형에 따라 통상의 방법에 의해 제조할 수 있다. 그 제형은 본 발명의 효과를 발휘할 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않으며, 예를 들면 토닉 등의 가용화제, 유액, 크림 등의 유화제, 연고, 분산액, 젤, 에어졸 등의 임의의 제형을 취할 수 있다. 또 그 제품 형태도 피부케어용 의약품, 의약부외품 또는 화장용품으로서, 예를 들면 비누, 피부팩, 로션, 컨디셔너, 크림 등의 임의의 형태를 취할 수 있다. 또한 본 발명의 조성물은 고형제, 용액제, 유제, 분산제, 미셀, 리포좀, 연고제 등의 형태로 사용될 수 있고, 경구 또는 비경구로 적용하기에 적합한 유기 또는 무기 담체 또는 부형제가 함께 포함될 수 있다. 본 발명의 조성물은, 예를 들면 정제, 산제, 펠렛제, 캡슐제, 좌약제, 용액제, 유제, 현탁제, 액제, 젤리 및 사용하기에 적합한 임의의 기타 형태에 대해 일반적으로 비독성인 제약상 허용되는 담체와 함께 혼합될 수 있다. 사용 가능한 담체에는 고체상, 반고체상 또는 액체상의 포도당, 유당, 아라비아 고무, 젤라틴, 만니톨, 전분 페이스트, 삼규산 마그네슘염, 활석, 옥수수 전분, 각질 (角質), 코로이드성 실리카, 감자 전분, 우레아, 쇄 길이가 중간 정도인 트리글리세리드, 덱스트란 및 제제의 제조에 사용하기에 적합한 기타 담체가 포함된다. 또한, 보조제, 안정화제, 증점제, 착색제 및 향료제가 사용될 수 있다.

본 발명에 있어서, 더덕 추출물 또는 더덕 사포닌은 조성물 전량 중, 0.0005~30중량%, 바람직하게는 0.01~10중량% 포함될 수 있으나, 목적에 따라 얼마든지 조절이 가능하다. 본 발명의 조성물의 최적 투여량은 연령, 개인차, 증상 등에 따라 적절히 결정되지만, 사람에게 투여하는 경우의 투여량은 통상 0.01~100mg/kg, 바람직하게는 0.1~10mg/kg이며, 이 양을 1일 1회 또는 수 회 나누어 투여할 수 있다.

또한, 본 발명은 더덕 추출물 또는 더덕의 사포닌을 유효성분으로 함유하는 히스타민의 필요이상의 분비로 인한 증세 또는 질병의 예방과 증상완화를 위한 식품 조성물을 제공한다. 본 발명의 더덕 추출물 또는 더덕의 사포닌을 포함하는 식품 조성물은 단독으로 또는 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.　 유효성분의 혼합량은 그의 사용 목적에 따라 적합하게 결정될 수 있다.　 일반적으로, 더덕 추출물 또는 더덕의 사포닌은 식품 또는 음료의 제조 시에 원료에 대하여 각각 0.0001 내지 30 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 10 중량%의 양으로 첨가될 수 있으나, 첨가되는 양은 목적에 따라 얼마든지 조절이 가능하다. 상기 식품의 종류에 특별한 제한은 없으며, 예로는 육류, 소세지, 빵, 초코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있다.

본 발명은 또한 더덕 추출물, 바람직하게는 더덕의 메탄올 추출물의 부탄올 분획, 더욱 바람직하게는 더덕 사포닌을 유효성분으로 포함하는 조성물을 사용하여 사람 또는 동물에서 히스타민의 필요이상의 분비로 인한 질병, 증상을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 이를 위하여 전신투여(예를 들어 경구 투여) 및 국소투여(예를 들어 피부도포) 방법을 동시에 사용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시 예에 의하여 상세히 설명한다. 그러나 하기 실시 예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시 예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

실시예

실험 동물

대한 바이오 링크에서 입수한 6주령의 수컷 ICR 마우스를 실험실에서 3일간 순화시킨 후 일반상태를 관찰하여 외관상 건강한 동물만을 선별하여 실험에 사용하였다. 체중범위는 280g~310g으로 제한하고, 사육 환경은 명암은 12시간으로 자동 조절 시켰으며 온도는 20±2℃, 습도 50±10%로 유지하였고 대한 바이오 링크사의 DBL혼합 사료를 급식하였으며 물은 정수기를 사용 자유롭게 섭취토록 하였다.

더덕 사포닌 분획 추출

조사포닌분획(curde saponin)제조는 인삼 사포닌 성분을 추출하는 방법을 응용하였다. 먼저 80% 메탄올 100ml에 더덕 (Codonopis lanceolata) 분말 4g을 넣어 1시간 정도 추출(4회 반복)한 후 여과하여 80% 메탄올로 2회 정도 반복하고 여과하였다. 그 후 여액을 증발시켜 농축시키고 증류수를 넣어 농축물과 섞어주었다. 에 테르(ether)를 넣어 분액 깔대기에서 층분리를 하고, 물층에 수포화 부탄올을 첨가하여 3회 정도 추출한 다음 수포화 부탄올층만을 모아 증류수로 세척하였다. 수포화 부탄올층을 감압증류하여 crude 사포닌 분획을 얻었다(부탄올의 제거 수준은 약 98% 이상). 이후 사포닌 분획의 부탄올과 증류수를 7:3의 비율로 혼합한 뒤 상층의 수포화 부탄올층을 분리하였다. 마지막으로, 남은 부탄올층을 증발시켜 완전히 농축시키고 건조시킨 후 그 무게를 측정하였다. 더덕 분말에서 조사포닌의 함량은 2.41%였다.

<실시예 1> 더덕 사포닌에 의한 β- hexosaminidase 의 방출량 평가

베타-헥소사미니다제(β-hexosaminidase)는 비만세포의 과립을 구성하는 물질로서, 비만세포의 탈 과립에 의한 히스타민 분비는 베타-헥소사미니다제 방출량에 비례한다. 따라서, 더덕 사포닌 분획의 탈과립 및 히스타민 분비억제효과를 랫트의 비만세포주인 RBL-2H3 세포에서 베타-헥소사미니다제의 방출량을 측정함으로써 확인하였다.

RBL-2H3 세포를 10% FBS를 포함한 DMEM에 현탁 시킨 후 24 well plate에 각 well당 2×10⁵개의 세포를 분주한 다음, 각 well당 0.5 μg/ml DNP-IgE로 감작시킨 후 5% CO₂ 인큐베이터에서 하룻밤 배양하였다. 이후 각 well의 세포들을 Siraganian 완충액 (119 mM NaCl, 5 mM KCl, 5.6 mM glucose, 0.4 mM MgCl₂, 25 mM HEPES, 40 mM NaOH, 1 mM CaCl₂, 0.1% BSA, pH 7.2)으로 2번 세척한 다음 37℃에서 10분간 Siraganian 완충액으로 전 반응시키고, 시험물질을 첨가한 후 10분간 다시 반응시켰다. 이후 세포를 37℃에서 30분간 항원(DNP-BSA, 10 μg/ml)을 처리하여 탈 과립상태로 만든 후, 얼음에서 10분간 두어 반응을 종결시키고, 상층액 20 μl를 취해 96 well plate에 옮긴 후 1mM p-nitrophenyl-N-acetyl- β-D-glucosaminide를 넣고 1시간 동안 배양시킨 다음 stop solution (0.1 M Na₂CO₃/NaHCO₃)을 넣은 다음 ELISA로 흡광도 405 nm에서 측정하여 정량하였다.

0~100 μM의 더덕 사포닌 분획(SF)을 처리하였을 때 β-hexosaminidase가 농도 의존적으로 감소되며 100 μM의 농도에서는 약 63%정도까지 방출이 억제된 것을 관찰할 수 있었다(도1). 이로부터 더덕 사포닌 분획이 비만세포에서의 베타-헥소사미니다제의 방출을 억제하여 탈 과립에 의한 히스타민의 분비를 억제하였다는 것을 알 수 있다.

<실시예 2> 더덕 사포닌에 의한 serum IgE level 평가

IgE는 비만세포를 자극시켜 과립을 분비하게 하는 면역글로블린으로, 이들의 비만세포 자극은 비만세포 내 과립의 방출을 유도하여 히스타민이나 프로스타글란딘 및 산화질소 등의 물질을 분비하게 한다. 따라서 이들 항체의 억제효능은 히스타민 분비억제의 기능분석 시 매우 중요하게 이용되고 있다.

ICR 마우스에서 DNCB를 챌린지한 후 베이스크림과 사포닌분획 함유 기재를 각각 도포하였을 때 Serum IgE의 level을 ELISA로 각각 측정하였다.

ICR 마우스의 등의 털을 제모기로 제모한 후, 제모크림(비트크림)을 사용하여 털을 완전히 제거하였다. 대조군(normal군)을 제외한 다른 2개 군에 대해 1% DNCB로 200ul씩 피부에 1일1회 3회 도포하였다. 3일 후부터 대조군을 제외한 군에 대해서 크림기재 (vehicle군-Labrafac　:　23% Tween　80　:　10.5% GMS (Glycerol　Monostrearate)　:　4.0% Stearic　acid　:　7.0% Cetyl　alcohol　:　2.0% Propylene　glycol　:　9.0% GMO (Glycerol　Monooleate)　:　3.5% Water　:　41%) 또는 1% 사포닌분획을 함유 하는 크림기재를 1일 1회 1주일간 도포하였다. 그 후 크림기재(Base)와 사포닌분획 함유 크림기재(SF)를 도포한 마우스의 대동맥에서 혈액을 채취, 원심분리하여 상층액만을 분리하였다. 마이크로플레이트에 100㎕/well로 항-mouse IgE를 코팅한 후 4 °C에서 하룻밤 동안 배양하였다. 마이크로 플레이트를 씻은 후 Pharmingen's Assay Diluent로 1시간 동안 blocking 시켰다. 지표물질로서 연속적으로 희석시킨 mouse anti-DNP IgE mAb로 사용하였으며 샘플(분리한 상층액)은 100㎕/well로 처리하였으며 상온에서 2시간 동안 배양하였다. 다시 플레이트를 씻고 바이오틴화 시킨 DNP-KLH와 avidin과 horseradish peroxidase가 결합된 것을 각 well에 처리한 후 상온에서 1시간 동안 배양하였다. 다시 플레이트를 씻은 후 100㎕ 의 tetramethylbenziidine와 hydrogen peroxide를 각 well에 처리하였다. 반응은 50㎕의 2N H2SO4를 처리함으로써 멈추었다. 효소의 활성은 microplate spectrophotometer를 이용해 450 nm 와 570 nm 파장에서 읽었다. 혈청 중 전체 IgE의 양은 OptEIA 키트를 사용하였다.

마우스를 DNCB로 처리하면 Serum IgE의 level이 상승되었으며, 그 후에 크림기재(Base) 또는 사포닌분획 함유 크림기재(SF)를 각각 도포하면, 사포닌 분획 투여군에서의 Serum IgE의 level이 크림기제 도포군과 비교하여 약 56%정도 감소한 것을 관찰할 수 있었다(도2). 이는 사포닌 분획이 Serum IgE의 level을 낮춰 Serum IgE에 의한 비만세포의 자극이 줄고, 따라서 탈 과립에 의한 히스타민의 분비가 억제되었다는 것을 의미한다.

<실시예 3> 더덕 사포닌 분획에 의한 Th1/Th2 시토카인 생산 level 평가

상기 실시예들에서 관찰된 더덕 사포닌 분획의 히스타민분비 억제효과의 근원적 원인을 알아보기 위하여 T 세포 관련 실험을 하기와 같이 진행하였다.

실시예2의 ICR 마우스로부터 무균조작으로 비장을 적출하고 주사기를 이용하여 차가운 RPMI 1640 배지로 비세포(splenocyte)를 분리하였다. 분리된 splenocyte를 원심분리로 모은 후 0.83% ammonium chloride-20 mM Tris buffer (pH 7.4)를 이용하여 적혈구를 용해시켰다. 다시 Hanks' balanced salts solution 및 RPMI 1640 배지로 3회 세척 후 10% FBS 함유 RPMI 1640 배지를 이용하여 세포를 1×10⁷ cells/ml 농도로 96 well plates에 접종하였다. 여러 농도의 시료와 Concanavaline A(ConA)를 10 μg/ml의 농도로 동시에 처리하고 48시간 동안 배양하였다. 그 후 상층액을 채취하여 INF-γ의 분비량을 ELISA법으로 확인하였다. IL-4 분비량의 경우도 INF-γ의 분비량의 측정과 같은 방법으로 상층액을 채취하여 ELISA법으로 확인 하였다. 크림기재투여군과 비교해서 사포닌 분획함유 크림투여군에서의 INF-γ와 IL-4의 생성량이 각각 56%와 33%정도 감소된 것을 관찰할 수 있었다(도3). 이를 통해 사포닌 분획은 ConA에 의해 증가된 T 세포의 분화능을 억제함으로써 INF-γ와 IL-4의 분비를 감소시킨다는 것을 알 수 있으며, 이러한 현상들은 사포닌 분획이 T 세포의 분화능을 억제하고 그로 인한 각종 cytokine의 분비를 감소 시킴으로써 T 세포에 의해 활성화 되는 비만세포의 기능을 억제한다고 것을 의미한다.

<실시예 4> 더덕 사포닌 분획 처치에 의한 마우스의 긁는 횟수에 대한 영향

실시예2과 같은 방법으로 등의 털을 제모하고 1% DNCB를 처리한 마우스에 크림기재 또는 더덕 사포닌 분획을 포함하는 크림을 처치하며, 처치일수에 따른 마우스의 긁는 횟수를 측정하여 대조군과 비교하였다. 실시예2에서 사용된 크림기재, 더덕 사포닌분획 함유 크림을 각각 도포하였을 때 안면 혹은 등 부위 피부를 긁는 횟수를 30분간, 하루에 2번씩 일주일간 측정하였으며, 측정 시간은 크림기재, 더덕 사포닌분획 함유 크림을 각각 도포한 후 3시간과 6시간 이후에 각각 측정하였고, 각각의 측정값의 평균값을 비교하였다.

DNCB의 처치는 마우스에 가려움증을 유발시켰으며, 대조군(normal)이나 크림기재를 처치한 군(base cream)에 비하여 더덕 사포닌분획을 포함하는 크림을 처치한 군(saponin)의 긁는 횟수가 날이 갈수록 점점 줄어들었다(도4). 더덕 사포닌 분획을 처치한 군의 긁는 횟수는 크림기재만을 처치한 군에 비하여 통계적으로 유의한 차이 (*p<0.05, **p<0.01)를 보였고, 처치 일수에 따라 긁는 횟수가 감소하여 마지막 7일째 되는 날은 22±4.2의 측정값을 보였다.

<실시예 5> 더덕 사포닌 분획의 단기 안전성 시험

더덕 사포닌 분획에 대한 단기 피부 자극성을 시험하였다. 건강한 20세 이상의 성인 남녀 (무작위 선출) 10명을 대상으로 단기적 도포에 의한 부작용 유무를 평가하였으며, 실시예2의 1% 더덕 사포닌 분획 함유 크림을 1회 처리 후 피부 변화를 관찰하였다.

결과는 도5에 나타난 것과 같이 10명 모두에게서 피부 부작용은 발생하지 않아, 1% 더덕 유래 사포닌 분획 크림은 인체에 대한 단기적인 독성이나 부작용은 없는 것으로 나타났다.

<실시예 6> 더덕 사포닌 분획에 대한 장기 안전성 시험

1% 더덕 사포닌 분획 크림에 대한 장기적 부작용의 유무에 대한 평가로써, 실시예5의 임상 실험을 바탕으로 1% 더덕 사포닌 분획 크림을 이용하여 장기적 도포에 의한 부작용 유무를 평가하였다. 건강한 20세 이상의 성인 남녀 (무작위 선출) 5명을 대상으로 일주일간 같은 부위에 1일 1회 처리하였으며, 일주일간 피부 변화를 관찰하였다.

도6에서 관찰된 것과 같이 일주일간 1% 더덕 사포닌 분획 크림의 처리 후에도 5명 모두에게서 피부 부작용이 나타나지 않는 것을 확인하였다. 따라서 단기적 처리 및 장기적 처리 두 경우 모두 1% 더덕 사포닌 분획 크림이 인체 독성이 없는 것을 확인하였으며, 부작용 또한 없는 것으로 확인 되었다.

<제조예>

본 발명의 더덕사포닌 함유 더덕 추출물 또는 더덕 사포닌을 포함하는 조성물로는 하기와 같은 투여 가능한 제품을 만들 수 있으며 이에 제한되는 것은 아니다.

연고제

본 발명의 더덕 사포닌 분획 1g

덱스판테놀 1.5g

스테아린산 1.0g

유동파라핀 5.0g

경납 4.0g

세탄올 3.0g

프로필렌글리콜 13.0g

트리에탄올아민 1.5g

디부틸하이드록시톨루엔 0.025g

안식향산프로필 0.015g

폴리소르베이트 800.1g

정제수 63.0g

상기와 같은 조성의 성분들을 통상의 연고제 제조방법에 따라 배합하여 연고 제를 제조하였다.

도1 은 랫트의 비만세포주인 RBL-2H3 세포에서 더덕 사포닌분획의 탈과립과 히스타민 분비에 미치는 영향을 확인하기 위해 베타-헥소사미니다제의 방출량을 측정한 결과이다.

도 2는 ICR 마우스에 DNCB를 챌린지하여 증가된 Serum IgE의 level에 대한 더덕 사포닌분획의 효과를 나타낸 것이다.

도3은 ICR 마우스에 DNCB를 챌린지하여 분비가 증가된 INF-γ와 IL-4에 대한 더덕 사포닌분획의 효과를 나타낸 것이다.

도4는 DNCB에 의해 유도된 가려움증에 대한 더덕 사포닌 분획의 효과를 나타낸 것이다.

도 5 는 건강한 성인남녀 10명을 대상으로 1% 더덕 사포닌 분획 함유 크림을 1회 처리 후 피부 변화를 관찰한 결과이다.

도 6 은 건강한 성인남녀 5명을 대상으로 같은 부위에 1% 더덕 사포닌 분획 함유 크림을 1일 1회 일주일간 처리한 결과이다.

Claims

더덕추출물 또는 더덕 사포닌을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 히스타민 분비 억제용 조성물.
더덕추출물 또는 더덕 사포닌을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 소양증, 발적, 화끈거리는 열감, 두드러기, 재채기, 맑은 콧물, 코막힘, 객담증가, 흉부압박감, 호흡곤란, 순환기계의 빈맥, 저혈압, 전신 무기력증, 어지러움증으로 구성된 군으로부터 선택되는 질병이나 증상의 예방 또는 치료용 의약 조성물.
제2항에 있어서, 더덕 사포닌을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 소양증의 예방 또는 치료용 의약 조성물.
제3항에 있어서, 소양증이 무좀, 습진 또는 피부염 등의 피부염증질환과 동반되는 것인 소양증의 예방 또는 치료용 의약 조성물.
더덕추출물 또는 더덕 사포닌을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 소양증의 예방 또는 개선용 화장료용 조성물.
더덕추출물 또는 더덕 사포닌을 유효성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 소양증, 발적, 화끈거리는 열감, 두드러기, 재채기, 맑은 콧물, 코막힘, 객담증가, 흉부압박감, 호흡곤란, 순환기계의 빈맥, 저혈압, 전신 무기력증, 어지러움증으로 구성된 군으로부터 선택되는 질병이나 증상의 예방 또는 개선용 식품 조성물.