KR100799266B1 - 향나무 추출물로부터 분리된 위드롤을 유효성분으로함유하는 암 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 향나무(Juniperus chinensis) 추출물로부터 분리된 위드롤(Widdrol)을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 위드롤은 암세포 생장억제효과, 자가사멸 유도효과 및 복제개시 인자의 발현저하 효과를 나타내므로 암 예방 및 치료용 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

향나무 추출물로부터 분리된 위드롤을 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 조성물{A composition comprising Widdrol isolated from the extract of Juniperus chinensis for preventing and treating cancer disease}

본 발명은 향나무 추출물로부터 분리된 위드롤(Widdrol)을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것이다.

암은 인류가 해결해야 할 난치병 중의 하나로, 전 세계적으로 이를 치유하기 위한 개발에 막대한 자본이 투자되고 있는 실정이며, 세계적으로 매년 1,010만 명의 새로운 암 환자가 발생하고 600만 명이 암으로 사망하며, 이는 전체 사망의 12% 정도를 차지하고 있다(손정구, 김유일, 이상필, 심층 정보 분석 보고서, 2003). 이러한 추세가 계속되면 2020년경에는 매년 1,570만 명의 암 환자가 발생하고 1,000만 명이 암으로 사망할 것으로 추정된다. 우리나라 역시 1983년 이후로 한국인의 사망원인으로 암이 첫 번째 원인이 된 이후로 꾸준히 증가하여 현재 질병 사망원인 중 제 1위의 질병으로서 연간 약 10 만 명 이상이 진단되고, 약 6 만 명 이상이 사망하고 있다. 이러한 암의 유발 인자인 발암물질로는 흡연, 자외선, 화학물질, 음식물, 기타 환경인자들이 있으나, 그 유발 원인이 다양하여 치료제의 개발이 어려울 뿐만 아니라 발생하는 부위에 따라 치료제의 효과 또한 각기 다르다.

엠씨엠(Minichromosome maintenance; 이하 Mcm) 단백질은 출아 효모에서 최초로 발견되어 현재 엠씨엠 2~7 이라는 6종의 서브유니트(subunit)가 진핵세포에 보편적으로 존재하고 있다.

엠씨엠 단백질은 헬리카제(helicase) 활성을 지니는 진핵 DNA 복제에 필수 인자로 정상세포에서 인산화와 탈인산화에 의한 DNA 중복복제를 제어하는 단백질이다. 이러한 엠씨엠 단백질의 발현이 조절되지 못하면 암세포로 전환되고 세포는 무한 증식 하게 된다. 엠씨엠 단백질은 정상세포에 비해 암세포에서 대량 발현 되는 것으로 보고 되어있다(Bell SP., Dutta A., Biochem ., 71, pp.333-374, 2002).

PCNA(Proliferating cell nuclear antigen)는 세포주기 중 G1기에서 ORC, CDC6, Mcm(MCM)으로 이루어진 복제 전 복합체가 오리진(origin)이라는 복제 시발점에서 형성된 후 S기에서 DNA 복제와 관련된다(Takisawa H, Himura S. & Kubota Y., cell Biol . 12, pp690-696, 2000).

자가사멸(Apoptosis)은 세포를 죽음으로 이끄는 가장 중요한 경로로써 진핵세포의 항상성 유지와 조직 성장 조절에 있어 매우 중요한 역할을 담당하고 있다(Green and J.C. Reed et al., Science, 281, pp.1308?1312, 1998; M.O. Hengartner, Nature, 407, pp.770?776, 2000). 세포의 죽음과 세포의 증식은 세포내의 균형을 유지하기 위해서 필요한 과정이며 이와 같은 과정을 정상적으로 실행하기 위해서 세포는 정상상태를 유지할 필요성이 있다. 그러나 이와 같은 세포내의 평형이 파괴되면 인간들은 암을 포함한 여러 가지 병을 유발하게 된다(C.B. Thompson et al., Science, 267, pp.1456-1462, 1995).

자가 사멸(Apoptosis)은 세포 외부의 자살 수용체(death receptor) 의존성 경로와 세포 내부의 미토콘드리아 의존성 경로를 통해서 일어난다. 세포질에서 시스테인 프로테아제(cysteine proteases)의 종에 속하는 캐스파아제(caspases)는 자가 사멸의 실행에 중요한 역할을 담당한다. 최초 시행자인 프로캐스파아제(pro-caspase)-8은 세포사로 이끄는 자극에 대해서 자신의 자가 공정(self-processing)에 의해 활성형인 캐스파아제-8로 바뀐다. 반면, 프로캐스파아제-9는 미토콘드리아의 경로에 의해서 활성화 된다(G. Denecker, D. Vercammen et al., Cell. Mol . Life Sci ., 58, pp.356?370, 2001). 이는 미토콘드리아 또한 성장 인자의 결핍, 자외선, 사이클로포스파마이드(cyclophosphamide; 백혈병 치료제), 에토포사이드(etoposide)와 같은 항암제 등의 시그날에 의해 세포를 세포사로 유도하는 데에 중요한 역할을 담당한다(S.E. Wilson, Exp . Eye Res., 69, pp.255?266, 1999). 미토콘드리아 경로는 Bcl-2 계 단백질의 중개로 일어난다. Bcl-2 계 단백질에는 Bcl-2 와 Bax단백질이 속해 있으며 이들 단백질은 미토콘드리아에서 사이토크롬(cytochrome)-C의 이동을 조절한다(Kelekar and C.B. Thompson, Trends Cell Biol., 8, pp.324?330, 1998). 여러 가지 자가사멸 유도 시그날을 받은 세포에서는 자가사멸이 일어나고 이때 세포에서는 사이토크롬-C 가 미토콘드리아에서 세포질로 방출된다(D.D. Newmeyer and S. Ferguson-Miller, Cell, 112, pp.481-490, 2003). 방출된 사이토크롬-C는 세포질의 아포프토솜 복합체(apoptosome complex)내에 있는 dATP, Apaf1(apoptosis protease activating factor)와 프로캐스파아제-9와 서로 상호작용하며 결과적으로 프로캐스파아제-9를 활성형인 캐스파아제-9로 변형시킨다(J. Chandra, A. Samali et al., Free Radic . Biol . Med ., 29, pp.323?333, 2000). 활성화된 캐스파아제-9는 캐스파아제-3, 캐스파아제-6 및 캐스파아제-7과 같은 실행자를 활성화시킨다(G.S. Salvesen and V.M. Dixit, Cell, 91, pp.443?446, 1997). 실행자 캐스파아제들은 폴리 ADP-리보스 폴리머라아제(PARP), 세포막(laminas)과 ICAD(caspase activated DNase)의 저해제를 절단한다. 따라서 절단된 이 단백질들은 자가사멸의 실행 타겟 단백질로 사용된다. 이와 같은 자가사멸에 따른 여러 가지 현상에 의해 세포들은 염색체의 응축, DNA의 단편화, 아폽토시스 소체 형성 등의 형태학적인 특징을 가지게 된다(M. Germain, E.B. Affar et al., J. Biol . Chem ., 274, pp.28379?28384, 1999).

암 치료에는 화학 요법, 방사선 요법, 외과 요법, 유전자치료법 등 많은 방법들이 있지만 약물을 이용하는 화학 요법이 가장 많이 사용되고 있다. 그러나 화학 요법은 부작용이 크고 쉽게 완치되지 않아 암 치료를 위한 새로운 접근 방법이 필요하게 되었다. 크게 두 가지 접근 방법이 시도되고 있다. 첫째는 다양한 합성 방법을 통하여 기존의 항암제의 약효를 유지하는 한편 부작용은 현저히 줄어든 새로운 유도체를 합성, 개발하는 것이고, 둘째는 암 발생 자체를 억제시키거나 암의 진행을 지연 혹은 역전시킴으로써 악성 암으로의 진행을 억제하는 화학적 암 예방(cancer chemoprevention)이다. 최근 선진 각국에서는 독성이 없고 효능이 뛰어난 화학적 암 예방제 및 항암제를 야채, 과일, 약용식물 등의 천연자원으로부터 개발하기 위해 많은 관심을 기울이고 있다(Kelloff et al., Annals New York Academy of Sciences, 889, pp1-13, 1999). 화학적 암 예방은 외형상 건강한 사람을 대상으로 암 발생을 억제하기 위한 1차 예방, 양성암을 앓고 있는 사람을 대상으로 발암과정을 역전시키기 위한 2차 예방, 악성화, 전이, 합병증 등을 억제하고 암을 치료한 적이 있는 사람을 대상으로 재발을 예방하기 위한 3차 예방으로 단계적으로 적용할 수 있다. 따라서 암 예방 뿐만 아니라 치료제로서도 매우 유용하게 이용될 수 있다.

발암 과정은 크게 발암 물질이 생체 표적 세포의 DNA를 공격하여 돌연변이를 유도하는 암 개시단계(initiation), 개시화된 세포가 빠르게 증식하여 양성암 상태로 전환되는 암 촉진단계(promotion), 그리고 양성암이 악성암으로 변형되는 암 진행단계(progression)로 구분될 수 있다. 암 개시단계는 발암물질의 활성화를 억제하거나 해독화를 촉진시키고, DNA 복구(repair)를 증가시키며, 활성화된 발암물질이나 활성산소종(ROS: reactive oxygen species)을 제거함으로써 억제할 수 있다. 또한, ROS 제거, 염증반응 억제, 암세포의 증식 억제 및 분화 촉진, 암화에 관여하는 유전자 혹은 단백질 발현의 변화 억제를 통해 암 촉진단계를 차단할 수 있다. 또한, 돌연변이가 발생한 암 개시세포의 아폽토시스(apoptosis)를 유도함으로써 암화를 억제할 수 있다는 것이 알려져 있다(Lotan, Journal of The National Cancer Institute, 87, pp.1655-1657, 1995). 이러한 아폽토시스는 세포가 이미 분화 초기부터 특정 시기가 되거나 특정 자극에 의해 스스로 파괴되는 것을 의미하며(Kerr et al., British Journal of Cancer, 26, pp.239-257, 1972) 발생의 과정이나 성숙 개체에서 불필요하게 된 세포(잉여 세포나 노화 세포 등)나 상해를 받아 이상을 초래하고 생체에 해롭게 된 세포(암 세포, 바이러스 감염 세포 등)를 제거하는데 의의가 있다. 아폽토시스의 본질은 세포를 소거함으로써 개체를 통제하는 데에 있다. 최근 암세포의 아폽토시스를 유도하는 항암제를 이용하여 암을 치료하는 방법이 활발히 연구되고 있다.

국내에 자생하는 식물 중에 상록침엽교목인 향나무는 널리 분포하고 있으며, 예로부터 거풍, 산한, 활혈, 해독의 효능이 있으며, 풍한, 감기, 류머티즘으로 인한 관절통, 주마진, 경결, 초기의 종독을 치료하는데 사용되었다.

최근 향나무에서 많은 화학적 성분이 분리되고 그 구조가 밝혀지고 있다. 예를들면 향나무의 잎에서 1개의 노르피마란(norpimarane)과 11개의 노라비에탄(norabietanes)이 분리되었고, 그 외에도 많은 화학적 성분(19-norabieta-8,11,13-trien-4-yl formate, 18-norabieta-8,11,13- triene-4-hydroperoxide, 19-norabieta-8,11,13-triene-4-hydroperoxide , 4-hydroxy-18-norabieta-8,11,13-trien-7-one, 4-hydroxy-19-norab Ieta-8,11,13-trien-7-one, 4-hydroperoxy-19-norabieta-8,11,13-trien -7-one, 7α-hydroxy-19-norabIeta-8,11,13-triene-4-hydroperoxide, 19-norabieta-7,13-dien-4-oland, 13β,14β-epoxy-4-hydroxy-19-nora- biet-7-en-6-one 등)이 분리되었으며(CHING-KUO LEE et al., Phytochemistry, 39, pp.391-394, 1995), 향나무의 심재에서도 많은 화학적 물질(β-cuparenol, α-acorenol, thujopsen-12-ol, isolep-tographiol, caryophylleneoxide, 6,7-epoxycar-yophyll-3-en-14 -ol, cedrol, cedran-3a-ol, cedrane-3/3,12-diol, ferruginol, hinokiol, dehy-droabietinol, abieta-8,11,13-trien-7-one, sugiol, totarol, sandaracopI-maric, trans - communic acid, cis-communic acid, agathic acid, isocupr-essic acid, acetylisocupressic acid, 15-hydroxylabd -8-en-19-oic acid, 15,16-bisnor-13-oxolabda-8,11E-dien-19-oic acid)이 분리되었다(JIN-MIN FANG et al., Phytochemistry, 41, pp.1361-1365, 1996). 또한 향나무 성분의 약리작용으로는 항균, 항진균, 항바이러스의 활성을 나타낸다고 알려져 있으며, 낙태와 피임 효과도 있다.

그러나 상기 문헌 어디에도 본 발명의 향나무 추출물로부터 분리된 위드롤이 암세포에서 아폽토시스를 유도하여 암 질환의 예방 및 치료를 위한 조성물로서 사용가능하다고 교시되거나 개시된 바 없다.

현재 치료제로 사용되는 물질들은 상당한 독성을 지니고 있으며, 암 세포만을 선택적으로 제거하지 못하므로, 암의 발생 후 이의 치료뿐 아니라, 암의 발생을 예방하기 위한 독성이 적고 효과적인 항암제의 개발이 절실히 필요하다.

이에 본 발명자들은 향나무 추출물로부터 분리된 위드롤이 암세포 생장억제효과, 자가사멸 유도효과 및 복제개시 인자의 발현저하 효과를 나타냄을 확인함으로서 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 향나무(Juniperus chinensis) 추출물로부터 분리된 위드롤을 유효성분으로 함유하는 암 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명은 향나무(Juniperus chinensis) 추출물로부터 분리된 위드롤을 유효성분으로 함유하는 암 질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 향나무( Juniperus chinensis ) 추출물로부터 분리된 하기 구조식 (1)의 위드롤을 유효성분으로 함유하는 암 질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

(1)

상기 추출물은 물, 에탄올, 메탄올과 같은 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 등의 극성용매 및 아세톤, 에틸아세테이트, 클로로포름, 디클로로메탄 등의 비극성용매 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매로부터 가용한 추출물을 포함한다.

상기 암 질환은 위암, 결장암, 유방암, 폐암, 비소세포성폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 피부 또는 안구 내 흑색종, 자궁암, 난소암, 대장암, 소장암, 직장암, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 소장암, 임파선암, 방광암, 담낭암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관 암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS; central nervous system) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 선종, 바람직하게는 대장암, 자궁경부암, 간암, 폐암, 방광암 또는 백혈병을 포함한다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

본 발명의 위드롤을 수득하는 방법을 설명하면, 우선 건조된 향나무의 중량의 약 10 내지 50배, 바람직하게는 약 15 내지 40배 분량의 물, 메탄올, 에탄올 및 부탄올 등과 같은 C1 내지 C4의 저급알콜 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 메탄올로 0 내지 100℃, 바람직하게는 20 내지 80℃ 추출온도에서 약 10시간 내지 40시간, 바람직하게는 20시간 내지 30시간 동안 냉침추출, 열수추출, 초음파 추출, 환류냉각 추출 등의 추출방법, 바람직하게는 열수추출법으로 1 내지 10회, 바람직하게는 2 내지 7회 반복 추출한 후, 감압 농축하여 조추출물을 수득할 수 있다.

상기에서 수득한 조추출물을 증류수에 현탁한 후, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 부탄올 또는 물로 각각 추출하여 수득한 디클로로메탄 용매 추출물을 디클로로메탄: 메탄올 (100:0 ~ 0:100(v/v))을 용출용매로 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 분획물을 수득할 수 있다.

상기에서 수득한 분획물을 각각 농축하여 다양한 용매를 사용하여 적정 비율로 배합된 혼합용매로 TLC를 수행하고, 동일한 Rf치를 갖는 분획물을 모아 농축하여 여러개의 그룹으로 소분하고 이들 그룹을 감압 농축하는 공정을 통하여 순수 분리된 본 발명의 위드롤을 수득할 수 있다.

본 발명은 상기 방법으로 얻어진 향나무 추출물로부터 분리된 위드롤을 유효성분으로 함유하는 암 질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

본 발명의 향나무 추출물로부터 분리된 위드롤을 유효성분으로 함유하는 암 예방 및 치료용 약학조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 화합물을 0.1 내지 50 중량%로 포함한다.

본 발명의 화합물을 포함하는 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 화합물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명의 화합물을 포함하는 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 화합물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골(macrogol), 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 조성물은 1일 0.0001 내지 100㎎/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 10㎎/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명은 암 질환의 예방 효과를 나타내는 위드롤을 유효성분으로 함유하는 암질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

상기 화합물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류 등이 있다.

또한, 본 발명의 화합물은 암 질환의 예방 및 개선 효과를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 화합물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제, 액제 등의 형태를 포함한다.

본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예, 참고예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 향나무로부터 위드롤의 분리

1-1. 향나무 조추출물 제조

향나무(Juniperus chinensis )는 흥환약업사(서울)에서 2005년 5월에 구입하였으며, 향나무를 자연 건조시킨 후, 잘게 세절하여 사용하였다. 건조된 향나무 3kg에 100% 메탄올 120ℓ을 가하여 70℃에서 가열추출을 3회 행한 후, 농축하여 향나무 조추출물 635.5g를 수득하였다(도 1 참조).

1-2. 향나무 용매 가용 추출물 제조

상기 실시예 1-1의 향나무 조추출물을 증류수에 현탁한 후, 디클로로메탄, 에틸아세테이트, 부탄올 또는 물로 추출하여 각각 301.8g, 156g, 135.5g 및 44.2g를 수득하였다(도 1 참조).

1-3. 위드롤 분리 정제(1)

상기 실시예 1-2에서 수득한 디클로로메탄 가용 추출물 301.8g 중 100g를 실리카겔에 흡착하고, 용출용매로 100% 디클로로메탄을 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 274개(500㎖/분획)의 분획을 수득하였다. 이들 각 분획물을 농축하여 TLC를 행한 후, 50% H2SO4로 발색시킨 후, 동일한 스팟을 가진 분획물을 합쳐서 32개의 그룹 (G1-G32) 으로 나누어, 10번째 및 11번째 분획물 그룹(G10-G11)을 합하여 7.17g의 분획물을 획득하고, 이는 실리카겔에 흡착시켜서 헥산 : 아세톤(30:1) 구성된 용매로 용출하여 270개(100ml/fraction)의 분획을 수득하였다. 이들 각 분획물은 다시 10개의 그룹(Ga1-Ga10)으로 나누었다. 이 중 5번째 분획물 그룹(Ga5) 2.44g을 실리카겔에 흡착시켜서 헥산 : 아세테이트(20:1)로 구성된 용매로 용출하여 80개 (50ml/fraction)의 분획을 수득하고 이를 6개의 그룹(Ga-11-Ga-16)으로 나누었다. 여기서 1번째 분획물 그룹(Ga-16) 0.9214g을 획득하여 이를 실리카겔에 흡착시켜서 헥산 : 아세테이트(10:1) 구성된 용매로 용출하여 27개(50ml/fraction)의 분획을 수득하고 8개의 그룹(Ga-21- Ga-28)으로 나누었다. 그 중 6번째 분획물 그룹(Ga-26)을 감압 농축하여 EI-mass 및 NMR을 측정하여(도 3 및 도 4 참조) 위드롤임을 확인하여, 순수 분리된 본 발명의 위드롤 116.4㎎을 수득하였다(도 1 참조).

1-4. 위드롤 분리 정제(2)

상기 실시예 1-3의 향나무 디클로로메탄 가용 추출의 32개 분획물 중 13번째 분획물 그룹(G13), 14번째 분획물 그룹(G14) 및 15번째 분획물 그룹(G15)을 합하여 4.18g의 분획물을 수득하고, 이는 실리카겔에 흡착시켜서 헥산 : 아세테이트(40:1, 30:1)로 구성된 용매로 용출하여 306개(100ml/fraction)의 분획을 획득하였다. 이들을 농축하여 TLC를 행한 후 50% H2SO4로 발색시킨 후, 동일한 스팟을 가진 분획물을 합쳐서 10개의 그룹 (Gb1- Gb10)으로 나누었으며, 이 중 3번째 분획물 그룹(Gb3) 1.08g을 실리카겔에 흡착시켜서 헥산 : 아세테이트(20:1)로 구성된 용매로 용출하여 66개(50ml/fraction)의 분획을 얻었고, 이는 다시 4개의 그룹(Gb-11- Gb-14)으로 나누었다. 그 중 3번째 분획물 그룹(Gb-13) 1.0026g을 실리카겔에 흡착시켜서 헥산 : 아세톤(20:1)으로 구성된 용매로 용출하여 46개(50ml/fraction)의 분획을 얻었고, 이를 11개의 그룹(Gb-21- Gb-211)으로 나누었다. 여기서 4번째 분획물 그룹(Gb-24) 272mg을 실리카겔에 흡착시켜서 헥산 : 아세테이트(10:1)로 구성된 용매로 용출하여 65개(50ml/fraction)의 분획을 얻었고, 이는 다시 9개의 그룹(Gb-31- Gb-39)으로 나누었다. 여기서 5번째 분획물 그룹(Gb-35)을 감압 농축하여 EI-mass 및 NMR을 측정하여(도 3 및 도 4 참조) 위드롤임을 확인하여, 순수 분리된 본 발명의 위드롤 116.4㎎을 수득하였다(도 1 참조).

참고예 1. 실험 준비

1-1. 항체의 준비

사이토크롬 C(cytochrome c) 항체 및 엠씨엠 4(MCM4) 항체는 BD 바이오사이언스 사(Biosciences)에서, 캐스파아제-8(caspase-8)항체, 캐스 파아제-9(caspase-9) 항체, 캐스파아제-3(caspase-3) 항체, PARP 항체, 엠씨엠 2, 3, 6, 7(MCM 2, 3, 6, 7) 항체 및 PCNA 항체는 산타 크루즈 바이오테크놀로지 사(Santa Cruz Biotechnology)에서 구입하여 사용하였다.

1-2. 암세포주의 준비

본 실험에 사용된 인체 대장암 세포로는 HT29 세포주를 ATCC(American Type Culture Collection, Rockville)에서 분양받아 사용하였으며, 세포배양은 RPMI 1640(Life Technologies 사)에 10% 소 태아혈청 (fetal bovine serum, FBS; UBI) 및 0.1% 젠타마이신 (gentamycin)을 첨가한 배지에서 5% CO2가 함유된 37℃ 항온기에서 수행하였다.

자궁경부암 세포주인 HeLa 세포는 ATCC(American Type Culture Collection, Rockville)에서 구입하여 사용하였으며, HeLa 세포는 DEME(Dulbecco's modified Eagle's medium)에 10%(v/v) FBS(Fetal bovine serum) 및 0.1% 젠타마이신(gentamycine)을 첨가한 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건하에서 배양하였다.

인간 간암 세포주인 HepG2 세포는 ATCC(American Type Culture Collection, Rockville)에서 구입하여 사용하였으며, HepG2 세포는 DEME(Dulbecco's modified Eagle's medium)에 10%(v/v) FBS(Fetal bovine serum) 및 0.1% 젠타마이신(gentamycine)을 첨가한 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건하에서 배양하였다.

인간 폐암 세포주인 A549 세포는 ATCC(American Type Culture Collection, Rockville)에서 구입하여 사용하였으며, A549 세포는 RPMI 1640에 10%(v/v) FBS(Fetal bovine serum) 및 0.1% 젠타마이신(gentamycine)을 첨가한 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건하에서 배양하였다.

인간 방광암 세포주인 T24 세포는 ATCC(American Type Culture Collection, Rockville)에서 구입하여 사용하였으며, T24 세포는 RPMI 1640에 10%(v/v) FBS(Fetal bovine serum) 및 0.1% 젠타마이신(gentamycine)을 첨가한 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건하에서 배양하였다.

인간 혈액암 세포주인 Jurket E6-1 세포는 ATCC(American Type Culture Collection, Rockville)에서 구입하여 사용하였으며, Jurket E6-1 세포는 RPMI 1640에 10%(v/v) FBS(Fetal bovine serum) 및 0.1% 젠타마이신(gentamycine)을 첨가한 배지를 사용하였여 37℃, 5% CO2 조건하에서 배양하였다.

실험예 1. 세포 독성 및 증식 억제 효과 확인

1-1. 세포 독성 억제 효과 확인

실시예 1에서 수득한 위드롤의 세포독성을 확인하기 위하여 MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5 -diphenyltetrazolium bromide) 방법으로 하기와 같이 측정하였다.

HT29 세포(1.5×104 cells/well)를 96-웰 플레이트에 접종하고 위드롤을 농도별로 처리하여 24시간 배양시킨 후, MTT용액(1.0 ㎎/㎖) 50㎕를 각 웰에 첨가하고 4시간 배양시킨 다음, 상등액을 제거하였다. MTT에 의해 생성된 세포내의 포르마잔 결정을 DMSO 150㎕를 첨가하여 용해한 후, OD값은 마이크로 플래이트 리더(microplate reader)를 사용하여 540nm에서 측정하였다.

상기 실험 결과, 24시간 동안 위드롤(15 내지 30 ㎍/㎖)을 처리한 HT29 세포 (1.5×104 cell/well)는 농도 의존적으로 세포생존율이 감소하였다. 위드롤 농도가 15 ㎍/㎖일 때는 40% 정도의 생존률을 나타냈으나, 30 ㎍/㎖ 농도로 위드롤을 처리하였을 때는 20% 이하의 생존률을 나타내어 위드롤이 HT29 세포에 강한 독성을 나타냄을 확인하였다(도 5 참조).

또한, 각각의 세포주(HT29, HePG2, A549, T24, Hela 및 Jurket)에 대한 위드롤의 세포독성의 활성은 저농도에서도 암세포 생존 저해율이 뛰어남을 알 수 있었다(표 1 참조).

세 포 주	세 포 기 원	독성 (IC50; ㎍/㎖)
HT29	대장암	26.73
HePG2	간 암	48.39
A549	폐암	26.32
T24	방광암	25.12
Hela	자궁경부암	24.23
Jurket	혈액암	45.73

1-2. 세포 증식 억제 효과 확인

실시예 1에서 수득한 위드롤의 세포 증식 억제 효과를 확인하기 위하여 문헌에 기재된 방법을 이용하여 하기와 같은 방법으로 측정하였다(Jones, K.H., Senft, J.A., The Journal of Histochemistry and Cytochemistry , 33, pp77?79, 1985).

HT29 세포(2.5×105 cells/㎖)를 35mm 배양용기에 접종하고, 위드롤을 농도별로 처리하여 7일 동안 배양시켰다. 그 후, 세포를 PBS(phosphate buffered saline)로 세척하고, 트립신(Trypsin)을 처리하여 HT29 세포를 회수하였다. 회수한 세포는 트리판 블루 다이(Trypan blue dye) 용액을 첨가하여 헤모사이토메타 (Hemacytometer)로 트리판 블루 다이 용액에 염색된 세포는 제외하고 세포수를 측정하였다.

상기 실험결과, 위드롤을 처리한 HT29세포는 시간이 지날수록 농도 의존적으로 세포 증식이 억제되었다(도 6 참조).

실험예 2. 자가사멸 소체( apoptotic body) 확인

실시예 1에서 수득한 위드롤 처리 후, 배양된 HT29 세포의 자가사멸 소체를 확인하기 위하여 DAPI 염색을 하기와 같이 시행하였다.

세포를 PBS로 세척하고, 3.7% 파라포름알데히드 (paraformaldehyde)를 가하여 실온에서 10분 동안 고정시킨 후, 고정된 세포를 다시 PBS로 세척하고 DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole; Sigma) 용액으로 실온에서 10분 동안 염색시켰다. 염색된 세포는 PBS로 2회 세척하고 형광현미경으로 관찰하였다.

상기 실험결과, 자가사멸 소체를 확인할 수 있었다(도 7 참조).

실험예 3. 캐스파아제 ( caspase ) 활성 측정

3-1. 활성형 캐스파아제 -3으로의 전환

여러가지 자극으로 유도되는 자가사멸 중 캐스파아제-3가 중요한 역할을 한다. 즉, 32-kDa 효소 전구체(pro-enzyme)형의 캐스파아제-3 단백질이 가수분해되어 19-kDa 활성형 캐스파아제-3으로 전환된다 (Meinhardt et al., Exp cell Res. 247, pp534-542, 1999). 위드롤에 의해 유도되는 HT29 세포의 자가사멸도 캐스파아제-3의 활성화에 관련이 있는지를 확인하기 위하여 웨스턴 블럿을 하기와 같이 시행하였다.

실시예 1에서 수득한 위드롤로 처리된 HT29 세포(2×105 cells)를 용해시키기 위해, CSK 완충액(10mM pipes pH6.8, 100mM NaCl, 1mM MgCl2, 1mM EGTA, 1mM dithiothreitol, 1mM phenylmethanesalfonyl fluoride, 0.1% Triton X-100, 1mM ATP 및 proteinase inhibitors) 100㎕에 현탁하였다. 세포 현탁액은 4℃에서 30분간 초음파 처리하여 세포를 파쇄 시킨 후, 원심 분리하여 단백질을 추출하였다. 단백질 추출액은 정량하여 동일 양의 단백질(30?40 ㎍)로 조정하여 SDS가 함유된 샘플 완충액(sample buffer)로 변성시킨 후, SDS 폴리아크릴 아마이드 겔(polyacrylamide gel; 15% 캐스파아제-3, 캐스파아제-8, 캐스파아제-9, 사이토크롬-c, 8% PARP)을 사용하여 전기영동을 수행하였다. 그 후 겔상에 존재하는 시료 단백질은 PVDF 막(PALL, FL)에 전사 시켰다. 그 막은 블로킹 용액(BlockaceTM, Dai-Nippon)에 희석시킨 1차 항체와 4℃에서 12시간 이상 반응시키고, 그 후 TBS 용액(Tris buffered saline; 0.15M nacl, 0.1% Triton X-100 및 50mM Tris/HCl, pH 7.5)으로 세척하였다. 세척되어진 막은 페록시다아제(peroxidase)가 결합된 2차 항체와 반응시킨 후, 화학반응 시스템(chemiluminescene system; Supersignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate, Pierce)을 이용하여 항체와 반응 되어진 단백질을 검출하고 반응의 레벨은 단백질 양의 측정(FluorchemTM 5500, Alpha Innotech)을 통하여 확인하였다.

상기 실험결과, 위드롤을 48시간 처리한 HT29 세포에서도 전-캐스파아제-3(pro-caspase-3; 32 kDa)이 활성형 캐스파아제-3(19 kDa)로 전환되어 감소되는 현상이 관찰 되었다(도 8 참조).

3-2. PARP 의 분해

자가사멸 유도에 의한 활성형 캐스파아제-3는 다운 스트림 (downstream)에서 표적(target)인 폴리 폴리머라아제(poly (ADP-ribose) polymerase; PARP)를 분해한다는 보고가 있어(Lazebnik et al., Nature. 371, pp346-347, 1994), 활성형 캐스파아제-3에 의한 PARP 분해가 위드롤에 의해서도 이루어지는지를 상기 실험예 3-1과 동일한 방법으로 실험하였다.

상기 실험결과, 웨스턴 블럿 분석에서 PARP 분해는 위드롤 농도가 15-25㎍/㎖일 때 캐스파아제-3이 활성을 나타내면서 함께 확인되었다(도 8 참조).

3-3. 캐스파아제 -8 및 캐스파아제 -9의 활성화

위드롤에 의해 유도되는 자가사멸의 최초 시행자인 캐스파아제-8 및 캐스파아제-9 활성화와도 관계가 있는지를 상기 실험예 3-1과 동일한 방법으로 실험하였다.

상기 실험결과, 위드롤 농도가 15~25 ㎍/㎖일 때, 프로캐 스파아제-8(pro-caspase-8) 레벨의 감소 및 캐스파아제-8의 활성을 확인하였고, 프로캐스파아제-9(pro-caspase-9) 레벨의 감소는 캐스파아제 -9의 활성 뿐만아니라, 미토콘드리아의 사이토크롬 C 방출도 동반함을 확인하였다(도 8 참조).

실험예 4. 세포주기 변화측정(Flow cytometry )

세포주기 분석은 플로 사이토메트리(Flow cytometry)로 문헌에 기재된 방법을 이용하여 하기와 같이 실험하였다(Kim, Y.H., Proust, J.J et al., Journal of Immunology, 149, pp.17-23, 1992).

실시예 1에서 수득한 위드롤을 처리한 HT29세포 1×106 (cells)를 100 ㎕의 PBS에 현탁하고 교반하면서 200㎕의 95% 에탄올을 첨가한 후, 4℃에서 1시간 동안 고정시켰다. 그 후, 고정된 세포를 PBS로 세척하고 RNase 12.5 ㎍이 포함된 1.12% 구연산나트륨 버퍼(sodium citrate buffer; pH 8.45) 250㎕를 첨가하여 37℃에서 30분간 처리하고, 프로피디움 요오드화물 (propidium iodide; 50 ㎍/㎖)을 250㎕ 첨가하여 실온에서 30분간 DNA를 염색하였다. 염색된 세포는 플로 사이토메터(FACScan flow cytometer)로 분석하였다.

상기 실험결과, 위드롤을 48시간 처리했을 때, 자가 사멸 세포 (sub-G1) 상의 레벨이 현저하게 증가함을 확인 할 수 있었다(도 9 참조).

실험예 5. 엠씨엠 단백질의 발현 저하 확인

복제개시 인자인 엠씨엠 단백질 발현 저하를 확인하기 위하여 문헌에 기재된 방법을 이용하여 하기와 같이 실험하였다(Ishimi Y, Okayasu I, et al., Eur J Biochem, Mar, 270(6), pp101-1089, 2003).

실시예 1에서 수득한 위드롤로 처리된 HT29 세포(2×105 cells)를 CSK 완충액(10mM pipes pH6.8, 100mM NaCl, 1mM MgCl2, 1mM EGTA, 1mM dithiothreitol, 1mM phenylmethanesalfonyl fluoride, 0.1% Triton X-100, 1mM ATP 및 proteinase inhibitors) 100㎕에 현탁하였다. 세포 현탁액을 4℃에서 30분간 초음파 처리하여 세포를 파쇄시킨 후, 원심분리하여 단백질을 추출하였다. 단백질 추출액은 정량하여 동일 량의 단백질(30?40 ㎍)로 조정하여 SDS가 함유된 샘플 완충액(sample buffer)으로 변성시킨 후, SDS 폴리아크릴 아마이드 겔(polyacrylamide gel; 10% 엠씨엠-2, 엠씨엠-3, 엠씨엠-4, 엠씨엠-6, 엠씨엠-7, 15% PCNA)을 사용하여 전기영동을 행하였다. 그 후, 겔상에 존재하는 시료 단백질은 PVDF 막(PALL, FL)에 전사 시키고, 그 막은 블로킹 용액(BlockaceTM, Dai-Nippon)에 희석시킨 1차 항체와 4℃에서 12시간 이상 반응시켰다. 그 후, TBS 용액(Tris buffered saline; 0.15M NaCl, 0.1% Triton X-100 및 50mM Tris/HCl, pH 7.5)으로 세척하여 세척되어진 막은 페록시다아제(peroxidase)가 결합된 2차 항체와 반응시킨 후, 화학반응 시스템(chemiluminescene system; Supersignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate, Pierce)을 이용하여 항체와 반응되어진 단백질을 검출하고 반응의 레벨은 단백질 양의 측정(FluorchemTM 5500, Alpha Innotech)을 통하여 확인하였다.

상기 실험결과, 위드롤을 48시간 처리한 HT29 세포에서 지금까지 발견된 6종의 엠씨엠 2~7 단백질 중 엠씨엠 5 단백질을 제외한 엠씨엠 단백질의 발현저하를 확인 할 수 있었다. 이와 동시에 DNA 복제 단백질인 PCNA 단백질의 발현 저하도 함께 확인 할 수 있었다(도 10 참조).

본 발명의 조성물을 포함하는 약학조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 제조

위드롤 20 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

위드롤 10 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

위드롤 10 mg

결정성 셀룰로오스 3 mg

락토오스 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

위드롤 10 mg

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2974 mg

Na2HPO4?12H2O 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

위드롤 20 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 6. 건강 음료의 제조

위드롤 100 ㎎

비타민 C 15 g

비타민 E (분말) 100 g

젖산철 19.75 g

산화아연 3.5 g

니코틴산아미드 3.5 g

비타민 A 0.2 g

비타민 B1 0.25 g

비타민 B2 0.3g

물 정량

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 향나무(Juniperus chinensis ) 추출물로부터 분리된 위드롤(Widdrol)은 암세포 생장 억제효과, 자가사멸 유도효과 및 복제개시 인자의 발현 저하 효과를 나타내므로 암 예방 및 치료용 조성물로 이용될 수 있다.

도 1은 위드롤의 정제공정을 나타낸 도이고,

도 2는 위드롤의 질량(Mass)을 나타낸 도이며,

도 3은 위드롤의 1H-NMR 데이터를 나타낸 도이고,

도 4는 위드롤의 13C-NMR 데이타를 나타낸 도이며,

도 5는 위드롤 농도에 따른 HT29 세포 생존율을 나타낸 도이고,

도 6은 위드롤 농도에 따른 HT29 세포 증식 억제 효과를 나타낸 도이며,

도 7은 위드롤을 48시간 처리한 HT29 세포의 형태적 변화를 DAPI 염색을 통해 알아본 도이고,

도 8은 위드롤을 48시간 처리한 HT29 세포의 캐스파아제 활성을 나타낸 도이며,

도 9는 위드롤을 48시간 처리한 HT29 세포의 세포주기를 분석한 도이고,

도 10은 위드롤을 48시간 처리한 HT29 세포의 엠씨엠(Mcm)과 PCNA의 발현저하 효과를 나타낸 도이다.

Claims (4)

1. 위드롤(Widdrol)을 유효성분으로 함유하는 대장암, 간암, 폐암, 방광암 또는 백혈병 질환의 예방 및 치료용 약학조성물.
2. 삭제
3. 위드롤(Widdrol)을 유효성분으로 함유하는 대장암, 간암, 폐암, 방광암 또는 백혈병 질환의 예방 및 개선용 건강 기능 식품.
4. 삭제