KR20160128819A

KR20160128819A - 수선화꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20160128819A
Application number: KR1020150060796A
Authority: KR
Inventors: 조성대; 이행은
Original assignee: 전북대학교산학협력단
Priority date: 2015-04-29
Filing date: 2015-04-29
Publication date: 2016-11-08

Abstract

본 발명은 수선화꽃 추출물을 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 수선화꽃 추출물은 암세포의 증식을 억제하고 암세포의 세포사멸을 유도하는 효과가 우수하므로, 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

수선화꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물{Composotion containing Narcissus tazetta var. chinesis extract for preventing or treating cancer}

본 발명은 수선화꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

암은 문명의 발달과 더불어 증가하고 있는 질병중의 하나로, 이를 치료하는 방법으로는 외과적 수술, 방사선 치료, 항암 물질 투여에 의한 화학 요법 등이 있다. 그러나, 이들 치료방법들은 대부분 초기 암환자나 특정암의 치료에만 국한되어 있어 암으로 인한 사망이 꾸준히 증가하고 있고, 특히 방사선 치료법이나 화학 요법은 많은 부작용을 유발하는 등의 문제점이 있다. 이에 부작용을 최소화하면서 제암율을 높일 수 있는 항암제의 개발이 요구되고 있고, 이러한 이유로 천연물, 특히 생약재로부터 항암제를 개발하려는 시도가 지속적으로 이루어지고 있다. 비록 항암제에 관한 연구가 발전해왔음은 분명하지만, 현재 사용되고 있는 항암물질의 경우, 여러 가지 원인에 의해 치료에 실패하거나 항암제 내성, 그리고 부작용과 같은 문제점을 안고 있다. 따라서, 합성된 화학물질보다는 부작용이 적을 것으로 예상되는 천연물을 이용하여 치료보다는 예방에 초점을 맞추는 것이 필요한 시점이다.

구강암은 입술, 혀, 뺨의 안쪽 표면, 경구개, 잇몸 등에서 발생할 수 있으며, 구강암의 대부분은 편평세포암종으로 구강 표면 세포의 성장이 적절하게 조절되지 않을 때 발생한다. 현재 암 치료에 있어 수술 치료 외에 방사선 치료나 항암제와의 복합 치료요법이 개발되어 좋은 효과를 보이고 있으나, 구강암의 경우 다른 암에 비하여 그 예후가 좋지 못한 실정이이다. 구강암이 다른 암에 비하여 예후가 좋지 못하고 높은 사망률을 보이는 이유는, 진단시 주변 조직으로 파급된 진행암인 경우가 많아 예후가 불량하고, 근치적 수술 이후라도 재발이나 이차 원발암(second primary cancer),이 이비인후과 영역의 다른 암(후두암, 상악동암)보다 상대적으로 많기 때문이다. 그러나 구강암의 이러한 특성상 구강암에 대한 근치적 수술, 방사선 치료, 항암제 치료 등의 복합요법 후에 암을 억제할 수 있는 화학적 암억제제 또는 암예방제(chemopreventine agents)의 투여가 구강암 환자의 생존율을 높이는데 중요한 역할을 하게 된다. 그러므로 구강암 치료에 있어 효과적이고 안정적인 암예방제의 개발이 시급한 실정이다.

한편, 수선화꽃은 한국, 중국, 일본 및 지중해 연안에 자생하는 꽃으로, 설중화 또는 수선(水仙)이라고도 하며, 지중해 연안이 원산이다. 비늘줄기는 넓은 달걀 모양이며 껍질은 검은색이다. 잎은 늦가을에 자라기 시작하고 줄 모양이며 길이 20∼40cm, 너비 8∼15mm로서 끝이 둔하고 녹색빛을 띤 흰색이다.

수선화꽃은 열을 내려주고 혈액순환을 촉진하며 월경을 조절하는 효과가 있어, 해열, 생리불순, 자궁질환, 피부염 및 감기 증상의 치료에 사용된다.

본 발명자들은 암을 예방 또는 치료하는 효과가 우수한 약물을 개발하기 위하여 천연물 및 이로부터 분리된 화합물에 관하여 연구하던 중, 수선화꽃 추출물이 항암효과가 우수함을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 수선화꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 수선화꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 수선화꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 수선화꽃 추출물은 암세포의 증식을 억제하고 암세포의 세포사멸을 유도하는 효과가 우수하므로, 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 여러 꽃 추출물 처리에 따른 MC3 및 HSC3 세포의 세포 증식 억제 여부를 나타낸 도이다.
도 2는 수선화꽃 추출물의 처리 농도에 따른 MC3 및 HSC3 세포의 세포 생존율을 나타낸 도이다.
도 3은 수선화꽃 추출물을 처리한 MC3 및 HSC3 세포의 세포사와 DNA 분절화(fragmentation) 여부를 관찰한 도이다.
도 4는 수선화꽃 추출물을 처리한 MC3 및 HSC3 세포의 C-카스파제-3, C-카스파제-9 및 C-PARP의 발현 정도와 카스파제 의존성 여부를 나타낸 도이다.
도 5는 수선화꽃 추출물을 처리한 MC3 및 HSC3 세포의 세포기질 내 시토크롬 c 농도 및 미토콘드리아의 막전위 변화를 나타낸 도이다.
도 6은 수선화꽃 추출물을 처리한 MC3 및 HSC3 세포에서 ATF-2 인산화 발현과 핵내 이동을 나타낸 도이다.
도 7은 수선화꽃 추출물을 처리한 MC3 및 HSC3 세포에서 JNK 및 p38의 인산화 발현을 나타낸 도이다.
도 8은 수선화꽃 추출물을 처리한 MC3 및 HSC3 세포에서 JNK, p38 및 ATF-2의 발현을 시간의 흐름에 따라 측정하여 나타낸 도이다.
도 9는 수산화꽃 추출물과 SP600125 및 SB203580를 각각 처리한 MC3 및 HSC3 세포의 세포 생존율과 JNK와 p38 키나아제와의 연관성을 나타낸 도이다.
도 10은 SP600125 및 SB203580를 처리한 MC3 및 HSC3 세포에서 JNK 및 p38 키나아제와 ATF-2 발현과의 상관성을 나타낸 도이다.

본 발명은 수선화꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 약학적 조성물 및 식품 조성물을 포함한다.

이하 본 발명에 관하여 상세히 설명한다.

본 발명의 유효성분인 수선화꽃 추출물은 통상적인 방법으로 추출하여 얻을 수 있고, 시판되는 것을 구입하여 사용할 수 있다. 통상적인 추출방법은 초음파 추출법, 여과법 및 환류추출법 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 일 실시예에서는 수선화꽃 추출물을 하기와 같은 방법으로 추출하였다.

먼저, 수선화꽃을 건조하여 잘게 자른 후, 추출 용매에 냉침, 페르콜레이션(percolation), 온침 등의 임의의 방법에 의해 침출 처리하여 유효 성분을 함유한 추출물을 얻는다. 상기 추출 용매는 이에 제한되지 않으나, 물, C₁~C₄의 알콜 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 1종 이상의 용매를 이용할 수 있으며, 바람직하게는 메탄올이다. 상기 수선화꽃 추출물을 여과한 후, 용매를 증발시켜 농축하여, 최종 수선화꽃 추출물을 수득한다.

본 발명의 수선화꽃 추출물은 암세포의 세포사멸을 유도하고, 암세포의 세포증식을 억제하는 효과가 우수하므로, 암의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

상기 암은 구강암, 간암, 위암, 결장암, 유방암, 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 피부암, 자궁경부암, 난소암, 대장암, 소장암, 직장암, 나팔관암종, 항문부근암, 자궁내막암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 임파선암, 방광암, 담낭암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 신장 또는 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반암종, 중추신경계 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 구강암은 구강편평상피세포암, 선양낭성암, 점액표피양암, 타액선암, 턱뼈 또는 안면부의 근육 등에 발생하는 육종, 구강점막의 악성 흑색종 및 구강 내에 발생한 림프종 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 수선화꽃 추출물과 함께 암의 예방 또는 치료의 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 더 함유할 수 있다.

본 발명의 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한, 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제는 문헌 (Remington's Pharmaceutical Science, 최근, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 것을 사용하는 것이 바람직하다. 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등이 있다. 상기 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용되는 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 개체의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 수선화꽃 추출물은 1일 1 mg/ kg 내지 1000 mg/kg의 양으로 투여할 수 있으며, 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수 회 나누어 투여할 수도 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명의 조성물은 암의 예방 및 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명에서, "건강기능식품"이란, 질병의 예방 및 개선, 생체방어, 면역, 병후의 회복, 노화 억제 등 생체조절 기능을 가지는 식품을 말하는 것으로, 장기적으로 복용하였을 때 인체에 무해해야 한다.

본 발명의 조성물은 암의 예방 또는 개선을 목적으로 건강기능식품에 첨가될 수 있다. 본 발명의 수선화꽃 추출물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 수선화꽃 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에 본 발명의 수선화꽃 추출물은 원료에 대하여 15중량% 이하, 바람직하게는 10 중량% 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 수프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 포함할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스, 수크로오스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ml 당 일반적으로 약 0.01 내지 10 g, 바람직하게는 약 0.01 내지 0.1 g 이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 포함할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예, 실험예 및 제제예를 제시한다. 그러나 하기 실시예, 실험예 및 제제예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 이에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 수선화꽃 추출물의 제조

본 실험에 사용된 수선화꽃 메탄올 추출물 (Methanol extract of Narcissus tazetta var. chinesis, MENT)외 17가지의 꽃 메탄올 추출물들은 한국생명공학연구원 한국식물추출물은행에서 2014년에 각각 20mg씩 구입하였으며, 추출물을 모두 20 g/ml의 농도로 dimethylsulfoxide (DMSO, Sigma)에 용해시켜 -20℃에 냉동 보관하여 사용하였다.

실시예 2. 구강암 세포주의 준비 및 배양

인간 구강암 세포주인 MC3 세포를 중국 Fourth military medical university(China)로부터 제공받았으며, 또 다른 인간 구강암 세포주인 HSC3 세포를 Hokkaido University(Japan)로부터 제공받았다. 상기 세포를 10% FBS 및 100 U/MI의 페니실린/스트렙토마이신을 첨가한 DMEM(Dulbeccos modified Eagles medium) 배지에 처리한 후, 5% CO₂, 37℃의 배양조건 하에서 배양하였다.

실험예 1. 수선화꽃 추출물의 암세포 증식 억제 효과 확인

본 발명의 수선화꽃 추출물이 암세포의 증식 억제에 미치는 영향을 확인하기 위하여 하기 실험을 수행하였다. 이하 실험에서는, 상기 실시예 1에서 수득한 수선화꽃 메탄올 추출물을 DMSO에 용해시켜 사용하였다.

수선화꽃을 비롯한 하기 표 1에 기재된 18개의 각기 다른 꽃의 추출물은 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 얻었다.

먼저, MC3 및 HSC3 세포주를 96 웰에 분주한 후 세포의 증식이 50~60%가 되었을 때, 상기의 18가지 꽃 추출물을 MC3와 HSC3 세포주에 각각 20 μg/ml씩 처리하고, 대조군에는 0.1% DMSO를 처리한 후 72시간 후 MTS 용액을 30 μl씩 각 well에 분주하고, 5%의 이산화탄소, 37 ℃배양기에서 2시간 배양 후 MTS 분석 및 세포 증식 분석(cell proliferation assay)을 수행하였으며, 그 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에 나타낸 바와 같이, 수산화꽃 추출물만이 MC3와 HSC3 세포주 모두에서 세포 증식을 억제함을 확인하였다.

실험예 2. 수선화꽃 추출물 처리에 따른 세포 생존율 변화 확인

본 발명의 수선화꽃 추출물이 암세포의 생존율에 미치는 영향을 확인하기 위하여, Neubauer’s chamber (haemocytometer)를 이용하여 세포 생존율의 변화를 측정하였다. 먼저, MC3 및 HSC3 세포주를 6 웰 플레이트에 분주한 후 세포의 증식이 50~60%가 되었을 때, 상기 실시예 1에서 수득한 수선화꽃 추출물을 각각 2.5, 5, 10 및 15 ㎍/㎖씩 처리하고, 대조군에는 0.1% DMSO를 처리한 후 각 세포를 24시간 및 48시간 동안 배양 및 트리판 블루(trypan blue) 첨가 후 헤마토사이토미터(heamocytometer)를 이용하여 살아있는 세포수를 측정하였으며, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에 나타낸 바와 같이, 상기 수선화꽃 추출물을 처리한 MC3 및 HSC3 세포주는 수선화꽃 추출물의 농도에 의존적으로 세포 생존율이 감소한 것을 확인하였다.

실험예 3. 수선화꽃 추출물에 의한 아폽토시스 유도 효과 확인

3-1. Live/Dead assay를 이용한 세포 독성 측정

본 발명의 수선화꽃 추출물이 암세포의 독성에 미치는 영향을 확인하기 위해 Live/Dead Viability/Cytotoxicity assay kit (invitrogen)를 사용하여 Live/Dead 분석을 수행하였다. 먼저, 상기 실시예 1에서 수득한 수선화꽃 추출물을 MC3와 HSC3 세포주에 각각 2.5, 5, 10 및 15 ㎍/㎖씩 처리하고, 대조군에는 0.1% DMSO를 처리한 후 이들 세포주를 수거하여 3,500 rpm, 4 ℃에서 5분간 원심 분리하고 상층액 제거 및 PBS로 세척 후, 각각 3개의 샘플로 1.5ml 튜브에 분주하였다. 각각의 세포주에 살아있는 세포를 염색하는 초록색의 Calcein AM과 죽은 세포를 염색하는 붉은색의 Ethd-1(Ethidium homodimer-1) 및 calcein AM과 Ethd-1을 혼합한 것을 각각 처리하여 30분 동안 형광 염색시켰다. 염색이 끝난 후 3,500 rpm, 4 ℃에서 3분 동안 원심 분리하여 상층액을 제거하고, 형광을 측정하였으며, 그 결과를 도 3A에 나타내었다.

도 3A에 나타낸 바와 같이, 상기 수선화꽃 추출물을 처리한 MC3 및 HSC3 세포주는 수선화꽃 추출물을 처리하지 않은 구강암 세포에 비하여 수선화꽃 추출물의 농도에 의존적으로 세포 독성이 증가함을 확인하였다.

3-2. DNA 분절화현상 (fragmentation) 확인

본 발명의 수선화꽃 추출물이 암세포의 DNA 분절화현상(fragmentation) 유발에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 실시예 1에서 수득한 수선화꽃 추출물을 MC3와 HSC3 세포주에 각각 2.5, 5, 10 및 15 ㎍/㎖씩 처리하고, 대조군에는 0.1% DMSO를 처리한 후 이들 세포주를 수거하여 4,000 rpm, 4 ℃에서 5분간 원심 분리하여 상층액을 제거하고 PBS로 2회 세척 후, 100% 메탄올로 상온에서 10분 동안 고정하였다. 고정된 세포를 4,000 rpm, 4 ℃에서 5분간 원심 분리 및 PBS 200 μl에 부유시킨 후 세포가 포함되어 있는 PBS 50 μl를 슬라이드글라스 위에 떨어뜨리고, 2 mg/ml 농도의 DAPI 용액을 60 μl를 첨가하여 상온에서 DAPI(4'-6-diamidino-2-phenylindole) 염색하였다. 그 후 형광 현미경(fluorescene microscope, Carl Zeiss, Germany)을 이용하여 400배의 배율로 각 농도에 따른 세포의 핵의 DNA의 형태를 관찰하였으며, 그 결과를 도 3B에 나타내었다.

도 3B에 나타낸 바와 같이, 상기 수선화꽃 추출물을 처리한 MC3 및 HSC3 세포주는 수선화꽃 추출물을 처리하지 않은 구강암 세포에 비하여 수선화꽃 추출물의 농도에 의존적으로 핵의 DNA가 분절화된 세포의 수가 증가함을 확인하였다. 이는 수선화꽃 추출물이 세포의 DNA를 손상시킴으로써 아폽토시스를 유도함을 나타낸다.

3-3. C- 카스파제 -3, C- 카스파제 -9 및 C- PARP 발현 유도 효과 확인

본 발명의 수선화꽃 추출물이 아폽토시스 유도 관련 전사인자의 발현에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 상기 실시예 1에서 수득한 수선화꽃 추출물을 MC3와 HSC3 세포주에 각각 2.5, 5, 10 및 15 ㎍/㎖씩 처리하고, 대조군에는 0.1% DMSO를 처리한 후 아폽토시스 유도시 발현되는 중요한 전사인자인 C-카스파제-3(cleaved-caspase-3), C-카스파제-9 및 C-PARP(c-poly(ADP-ribose) polymerase)의 발현 정도를 웨스턴 블롯팅을 이용하여 측정하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 상기 수선화꽃 추출물을 처리한 MC3 및 HSC3 세포주는 수선화꽃 추출물을 처리하지 않은 구강암 세포에 비하여 수선화꽃 추출물의 농도에 의존적으로 C-카스파제-3 및 C-카스파제-9의 발현 및 c-PARP의 발현이 증가함을 확인하였다. 이는 수선화꽃 추출물이 C-카스파제-3, C-카스파제-9 및 c-PARP의 발현을 증가시킴으로써 암세포의 아폽토시스를 유도함을 나타낸다.

3-4. 세포기질 내 시토크롬 c 농도 및 미토콘드리아 막전위 변화 화인

시토크롬 c(cytochrome c)는 아폽토시스의 조절인자로서, 아폽토시스 유도 자극에 반응하여 미토콘드리아 내막에서 세포 기질 내로 방출된 후 아폽토시스가 일어나도록 한다. 따라서, 본 발명의 수선화꽃 추출물의 시토크롬 c 농도 조절을 통한 아폽토시스 유도 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 1에서 수득한 수선화꽃 추출물을 MC3와 HSC3 세포주에 각각 2.5, 5, 10 및 15 ㎍/㎖씩 처리하고, 대조군에는 0.1% DMSO를 처리한 후 세포기질 내 시토크롬 c의 농도를 웨스턴 블롯팅을 이용하여 측정하였으며, JC-1 분석을 통해 미토콘드리아 막전위 변화를 확인하고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, 상기 수선화꽃 추출물을 처리한 MC3 및 HSC3 세포주는 수선화꽃 추출물을 처리하지 않은 구강암 세포에 비하여 수선화꽃 추출물의 농도에 의존적으로 세포기질 내 시토크롬 c의 농도가 증가하며, 미토콘드리아 외막의 막전위가 감소함을 확인하였다. 이는 수선화꽃 추출물이 암세포의 미토콘드리아에서 시토크롬 c를 세포질로 내보내면서 아폽토시스를 유도함을 나타낸다.

실험예 4. 수선화꽃 추출물의 종양 억제 효과 확인

4-1. ATF -2의 활성 증가 효과 확인

본 발명의 수선화꽃 추출물의 종양 억제 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 1에서 수득한 수선화꽃 추출물을 MC3와 HSC3 세포주에 각각 2.5, 5, 10 및 15 ㎍/㎖씩 처리하고, 대조군에는 0.1% DMSO를 처리한 후 종양 억제 유전자로 알려진 ATF-2(Activating transcription factor 2)의 인산화를 웨스턴 블롯팅 분석을 이용하여 측정하였으며, 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 상기 수선화꽃 추출물을 처리한 MC3 및 HSC3 세포주는 수선화꽃 추출물을 처리하지 않은 구강암 세포에 비하여 수선화꽃 추출물의 농도에 의존적으로 ATF-2의 인산화 정도가 증가하며, 세포질에서 핵으로의 이동이 증가함을 확인하였다. 이는 수선화꽃 추출물이 암세포의 종양 억제 효과가 있음을 나타낸다.

4-2. JNK 및 p38 의 활성 증가 효과 확인

본 발명의 수선화꽃 추출물의 종양 억제 효과를 확인하기 위하여, 상기 실시예 1에서 수득한 수선화꽃 추출물을 MC3와 HSC3 세포주에 각각 2.5, 5, 10 및 15 ㎍/㎖씩 처리하고, 대조군에는 0.1% DMSO를 처리한 후 MAP 인산화효소(MAPK; Mitogen-activated protein kinase) 중 JNK 및 p38 인산화 발현을 웨스턴 블롯팅 분석을 이용하여 측정하였으며, 그 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7에 나타낸 바와 같이, 상기 수선화꽃 추출물을 처리한 MC3 및 HSC3 세포주는 수선화꽃 추출물을 처리하지 않은 구강암 세포에 비하여 수선화꽃 추출물의 농도에 의존적으로 JNK 및 p38의 활성이 증가함을 확인하였다.

4-3. 시간 의존적 효과 확인

JNK, p38 및 ATF-2의 활성을 상기 실험예 4-1 및 4-2와 동일한 방법으로 시간의 흐름에 따라 측정하였으며, 그 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타낸 바와 같이, 상기 수선화꽃 추출물을 처리한 MC3 및 HSC3 세포주는 시간에 의존적으로 JNK, p38 및 ATF-2의 활성이 증가함을 확인하였다.

4-4. 종양 억제 유도의 작용 기전 확인

본 발명의 수선화꽃 추출물이 종양을 억제하는 작용 기전을 확인하기 위하여, JNK 및 p38 억제 실험을 진행하였다. 먼저, 상기 실시예 1에서 수득한 수선화꽃 추출물을 MC3와 HSC3 세포주에 각각 15 ㎍/㎖씩 처리하였다. 그 후, 실험군에는 JNK 억제제인 SP600125와 p38 억제제인 SB203580을 각각 처리하고, 대조군에는 0.1% DMSO를 처리한 후 상기 실험예 2와 동일한 방법으로 살아있는 세포수를 측정하였으며, 그 결과를 도 9에 나타내었다.

도 9에 나타낸 바와 같이, SP600125 및 SB203580를 처리하여 각각 JNK 및 p38를 억제한 경우, 이를 처리하지 않은 경우에 비해 MC3 및 HSC3 세포주의 세포 생존율이 증가함을 확인하였다.

또한, JNK 및 p38 키나아제와 ATF-2 발현과의 상관성을 확인하기 위하여 JNK, p38 및 ATF-2의 활성을 상기 실험예 4-1 및 4-2와 동일한 방법으로 측정하였으며, 그 결과를 도 10에 나타내었다.

도 10에 나타낸 바와 같이, SP600125 및 SB203580를 처리하여 각각 JNK 및 p38를 억제한 경우, 이를 처리하지 않은 경우에 비해 JNK, p38 및 ATF-2의 활성이 감소함을 확인하였다. 이는 수선화꽃 추출물이 JNK 및 p38의 활성을 통해 ATF-2를 활성화를 촉진시킴으로써 종양 억제 및 세포 사멸을 유도함을 나타낸다.

이하 본 발명의 수선화꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 암의 예방 또는 개선용 식품 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 약학적 제제의 제조

1. 산제의 제조

수선화꽃 추출물 20 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

2. 정제의 제조

수선화꽃 추출물 10 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

3. 캡슐제의 제조

수선화꽃 추출물 10 mg

결정성 셀룰로오스 3 mg

락토오스 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

4. 주사제의 제조

수선화꽃 추출물 10 mg

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2974 mg

Na₂HPO₄ _·2H₂O 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당 (2 ml) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

5. 액제의 제조

수선화꽃 추출물 20 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ml로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

제제예 2. 식품 제제의 제조

1. 건강식품의 제조

수선화꽃 추출물 100 mg

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 g

비타민 E 1.0 mg

비타민 B1 0.13 mg

비타민 B2 0.15 mg

비타민 B6 0.5 mg

비타민 B12 0.2 g

비타민 C 10 mg

비오틴 10 g

니코틴산아미드 1.7 mg

엽산 50 g

판토텐산 칼슘 0.5 mg

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 mg

산화아연 0.82 mg

탄산마그네슘 25.3 mg

제1인산칼륨 15 mg

제2인산칼슘 55 mg

구연산칼륨 90 mg

탄산칼슘 100 mg

염화마그네슘 24.8 mg

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

2. 건강음료의 제조

수선화꽃 추출물 100 mg

비타민 C 15 g

비타민 E(분말) 100 g

젖산철 19.75 g

산화아연 3.5 g

니코틴산아미드 3.5 g

비타민 A 0.2 g

비타민 B1 0.25 g

비타민 B2 0.3g

물 정량

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2L 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.

Claims

수선화꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 수선화꽃 추출물은 수선화꽃을 물, C₁-C₄의 알콜 또는 이들의 혼합용매로 추출한 것을 특징으로 하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 수선화꽃 추출물은 메탄올 추출물인 것을 특징으로 하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 암은 구강암, 간암, 위암, 결장암, 유방암, 폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두경부암, 피부암, 자궁경부암, 난소암, 대장암, 소장암, 직장암, 나팔관암종, 항문부근암, 자궁내막암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 임파선암, 방광암, 담낭암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 백혈병, 급성 백혈병, 림프구 림프종, 신장암, 수뇨관암, 신장세포 암종, 신장골반암종, 중추신경계 종양, 1차 중추신경계 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제4항에 있어서, 상기 암은 구강암인 것을 특징으로 하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제5항에 있어서, 상기 구강암은 구강편평상피세포암, 선양낭성암, 점액표피양암, 타액선암, 턱뼈에 발생하는 육종, 안면부의 근육에 발생하는 육종, 구강점막의 악성 흑색종 및 구강 내에 발생하는 림프종으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
제1항에 있어서, 상기 조성물은 암세포의 세포사멸을 유도하는 것을 특징으로 하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
수선화꽃 추출물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 개선용 식품 조성물.