KR101466443B1 - 혼합 생약 추출물을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물 - Google Patents
혼합 생약 추출물을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 소합향, 백단향, 정향, 필발, 천궁, 육두구, 포황 및 단삼의 혼합 생약 추출물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.본 발명에 따른 소합향, 백단향, 정향, 필발, 천궁, 육두구, 포황 및 단삼의 혼합 생약 추출물은 암 세포의 증식을 억제하고, 암 세포 증식을 억제하는 단백질 및 암세포 전이를 억제하는 단백질을 조절하는 우수한 효과를 가지고 있어, 암의 예방 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 소합향, 백단향, 정향, 필발, 천궁, 육두구, 포황 및 단삼의 혼합 생약 추출물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
암은 인류가 해결해야 할 난치병 중의 하나로, 전 세계적으로 이를 치유하기 위한 개발에 막대한 자본이 투자되고 있는 실정이며, 우리나라의 경우, 질병 사망원인 중 제 1위의 질병으로서 연간 약 10 만 명 이상이 진단되고, 약 6 만 명 이상이 사망하고 있다. 이러한 암의 유발 인자인 발암물질로는 흡연, 자외선, 화학물질, 음식물, 기타 환경인자들이 있으나, 그 유발 원인이 다양하여 치료제의 개발이 어려울 뿐만 아니라 발생하는 부위에 따라 치료제의 효과 또한 각기 다르다. 현재 치료제로 사용되는 물질들은 상당한 독성을 지니고 있으며, 암 세포만을 선택적으로 제거하지 못하므로, 암의 발생 후 이의 치료뿐 아니라, 암의 발생을 예방하기 위한 독성이 적고 효과적인 항암제의 개발이 절실히 필요하다.
한편, 냄새 분자는 수용성과 지용성을 동시에 지니고 있다. 수용성이 있어야 코 점막의 수층을 통해 수용기에 도달할 수가 있고, 지용성이 있어야 신경세포의 세포막을 통과할 수 있기 때문이다. 또한 분자가 증기압을 갖지 않으면 공기를 통하여 코에 도달할 수 없으므로 극히 저온에서 증발되는 물질이어야 한다. 그래서 현재까지 발견된 냄새 분자의 분자량은 294 미만이다. 따라서 냄새 분자는 혈액 뇌장벽을 통과하는데 유리한 조건을 갖추고 있고, 특정 유효성분이 그 향 속에 있다면 뇌혈액장벽을 쉽게 통과할 가능성이 높고, 이는 뇌질환 치료에 유용할 것이라고 예상할 수 있다.
현재까지 소합향, 백단향, 정향, 필발, 천궁, 육두구, 포황 및 단삼의 혼합 생약 추출물 또는 이 중 일부 생약만을 포함하는 혼합 생약 추출물이 중추신경억제 및 뇌신경 수용체 활성에 관한 효과, 경련 억제 효과, 진통 효과, 수면 증강 효과 등을 가지고 있음을 확인한 실험 결과가 알려져 있으나, 소합향, 백단향, 정향, 필발, 천궁, 육두구, 포황 및 단삼의 혼합 생약 추출물의 항암 효과에 대해서는 전혀 밝혀진 바가 없으며, 이에 대한 연구도 전무한 상태이다.
이에 본 발명자들은, 신규한 항암제를 개발하기 위한 노력을 계속한 결과, 소합향, 백단향, 정향, 필발, 천궁, 육두구, 포황 및 단삼의 혼합 생약 추출물이 암세포의 성장 및 암 전이를 억제하는 우수한 효과가 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 소합향, 백단향, 정향, 필발, 천궁, 육두구, 포황 및 단삼의 혼합 생약 추출물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 소합향, 백단향, 정향, 필발, 천궁, 육두구, 포황 및 단삼의 혼합 생약 추출물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 소합향, 백단향, 정향, 필발, 천궁, 육두구, 포황 및 단삼의 혼합 생약 추출물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 소합향, 백단향, 정향, 필발, 천궁, 육두구, 포황 및 단삼의 혼합 생약 추출물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 소합향, 백단향, 정향, 필발, 천궁, 육두구, 포황 및 단삼의 혼합 생약 추출물은 암 세포의 증식을 억제하고, 암 세포 증식을 억제하는 단백질 및 암세포 전이를 억제하는 단백질을 조절하는 우수한 효과를 가지고 있어, 암의 예방 또는 치료에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1 은 본 발명의 혼합 생약 추출물 (GGSH)이 인간 대장암 세포 (KM12C)의 증식에 미치는 영향을 MTT 어세이를 통해 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 혼합 생약 추출물 (GGSH)이 인간 교모세포종 세포 (A172)에서 TNF-α의 발현에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 혼합 생약 추출물 (GGSH)이 인간 교모세포종 세포 (A172)에서 IL-6의 발현에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 혼합 생약 추출물 (GGSH)이 인간 대장암 세포 (KM12C)에서 TGF-β 의 발현에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 혼합 생약 추출물 (GGSH)이 인간 교모세포종 세포 (A172)에서 Akt 및 GSK-3β 의 인산화에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 혼합 생약 추출물 (GGSH)이 인간 대장암 세포 (KM12C)에서 Akt, ERK1/2 및 PKD1의 인산화에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 혼합 생약 추출물 (GGSH)이 인간 대장암 세포 (KM12C)에서 GSK-3β 의 인산화에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 8은 본 발명의 혼합 생약 추출물 (GGSH)이 인간 대장암 세포 (KM12C)에서 β-카테닌의 발현에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 9는 본 발명의 혼합 생약 추출물 (GGSH)이 인간 교모세포종 세포 (A172)에서 c-Myc 및 β-카테닌의 발현에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 10은 본 발명의 혼합 생약 추출물 (GGSH)이 인간 대장암 세포 (KM12C)에서 c-Myc 의 mRNA 발현에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 11은 본 발명의 혼합 생약 추출물 (GGSH)이 인간 대장암 세포 (KM12C)에서 사이클린 D1 및 서바이빈의 mRNA 발현에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 12는 본 발명의 혼합 생약 추출물 (GGSH)이 인간 대장암 세포 (KM12C)에서 p21 및 p58의 mRNA 발현에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 13은 본 발명의 혼합 생약 추출물 (GGSH)이 인간 대장암 세포 (KM12C)에서 스네일 및 E-카데린의 발현에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 혼합 생약 추출물 (GGSH)이 인간 교모세포종 세포 (A172)에서 TNF-α의 발현에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 혼합 생약 추출물 (GGSH)이 인간 교모세포종 세포 (A172)에서 IL-6의 발현에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 혼합 생약 추출물 (GGSH)이 인간 대장암 세포 (KM12C)에서 TGF-β 의 발현에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 5는 본 발명의 혼합 생약 추출물 (GGSH)이 인간 교모세포종 세포 (A172)에서 Akt 및 GSK-3β 의 인산화에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 혼합 생약 추출물 (GGSH)이 인간 대장암 세포 (KM12C)에서 Akt, ERK1/2 및 PKD1의 인산화에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 7은 본 발명의 혼합 생약 추출물 (GGSH)이 인간 대장암 세포 (KM12C)에서 GSK-3β 의 인산화에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 8은 본 발명의 혼합 생약 추출물 (GGSH)이 인간 대장암 세포 (KM12C)에서 β-카테닌의 발현에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 9는 본 발명의 혼합 생약 추출물 (GGSH)이 인간 교모세포종 세포 (A172)에서 c-Myc 및 β-카테닌의 발현에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 10은 본 발명의 혼합 생약 추출물 (GGSH)이 인간 대장암 세포 (KM12C)에서 c-Myc 의 mRNA 발현에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 11은 본 발명의 혼합 생약 추출물 (GGSH)이 인간 대장암 세포 (KM12C)에서 사이클린 D1 및 서바이빈의 mRNA 발현에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 12는 본 발명의 혼합 생약 추출물 (GGSH)이 인간 대장암 세포 (KM12C)에서 p21 및 p58의 mRNA 발현에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
도 13은 본 발명의 혼합 생약 추출물 (GGSH)이 인간 대장암 세포 (KM12C)에서 스네일 및 E-카데린의 발현에 미치는 영향을 나타낸 도이다.
본 발명은 소합향, 백단향, 정향, 필발, 천궁, 육두구, 포황 및 단삼의 혼합 생약 추출물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
상기 조성물은 약학적 조성물 또는 식품 조성물을 포함한다.
이하, 본 발명에 대하여 보다 상세히 설명한다.
본 발명의 조성물에서 유효성분인 소합향, 백단향, 정향, 필발, 천궁, 육두구, 포황 및 단삼의 혼합 생약 추출물은 하기와 같은 방법으로 수득될 수 있다.
먼저, 소합향, 백단향, 정향, 필발, 천궁, 육두구, 포황 및 단삼을 물로 세척하여 이물질을 제거한다. 소합향, 백단향, 정향, 필발, 천궁, 육두구, 포황 및 단삼은 재배한 것 또는 시판되는 것 등을 제한 없이 사용할 수 있다. 상기 소합향, 백단향, 정향, 필발, 천궁, 육두구, 포황 및 단삼을 혼합한 후, 10~30배 부피의 용매를 가하여 완전히 침지되도록 한다. 상기 생약재의 혼합 비율은 바람직하게는 소합향:백단향:정향:필발:천궁:육두구:포황:단삼=0.5~1.5:1.5~2.5:1.5~2.5:5~7:4~6:3~5:2~4:7~9 중량비이다. 추출 방법은 실온에서 함침하거나 가온할 수 있다. 상기 추출 용매는 이에 제한되지 않으나, 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올, 이들의 혼합용매로부터 선택된 1종 이상의 용매를 이용할 수 있으며, 바람직하게는 에탄올이다. 상기 추출물을 여과 및 감압 농축하여 최종 소합향, 백단향, 정향, 필발, 천궁, 육두구, 포황 및 단삼의 혼합 생약 추출물을 수득한다.
본 발명에 따른 소합향, 백단향, 정향, 필발, 천궁, 육두구, 포황 및 단삼의 혼합 생약 추출물은 암 세포의 증식을 억제하고, 암 세포 증식을 억제하는 단백질을 조절 (TNF-α 및 IL-6의 발현 억제, c-Myc의 mRNA 전사 및 발현 억제, GSK-3β(Ser-9), Akt, ERK1/2 및 PKD1의 인산화 억제, β-카테닌 저하, 서바이빈 및 사이클린 D1의 발현 억제, p58 및 p21 발현 촉진)하고, 암세포 전이를 억제하는 단백질을 조절 (TGF-β 및 스네일의 발현 억제, E-카데린의 발현 촉진)하는 우수한 효과를 가지고 있다.
상기한 바와 같이, 본 발명에 따른 소합향, 백단향, 정향, 필발, 천궁, 육두구, 포황 및 단삼의 혼합 생약 추출물은 암에 대한 치료 효과가 우수하므로, 암의 예방 또는 치료에 유용한 의약품 또는 건강기능식품으로 이용될 수 있다.
상기 암 질환은 일반적인 암 질환을 포함하며, 바람직하게는 위암, 결장암, 유방암, 폐암, 비소세포성폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 피부 또는 안구 내 흑색종, 자궁암, 난소암, 대장암, 소장암, 직장암, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 소장암, 임파선암, 방광암, 담낭암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관 암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 혈액암, 뇌암, 중추신경계(CNS; central nervous system) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 또는 뇌하수체 선종을 포함하며, 보다 바람직하게는 대장암, 뇌암, 폐암, 혈액암, 피부암이다.
본 발명의 조성물은 소합향, 백단향, 정향, 필발, 천궁, 육두구, 포황 및 단삼의 혼합 생약 추출물과 함께 항암 효과를 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 더 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제는 문헌 (Remington's Pharmaceutical Science, 최근, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 것을 사용하는 것이 바람직하다. 상기 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등이 있다. 상기 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 또한, 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "투여"는 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.
본 발명의 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르며, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 조성물은 1 일 1 mg/kg 내지 1000 mg/kg의 양으로 투여할 수 있다. 상기 조성물의 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수 회 나누어 투여할 수도 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 조성물은 암의 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
본 발명에서, "건강기능식품"이란 질병의 예방 또는 개선, 생체방어, 면역, 병후의 회복, 노화 억제 등 생체조절기능을 가지는 식품을 말하는 것으로, 장기적으로 복용하였을 때 인체에 무해하여야 한다. 본 발명의 소합향, 백단향, 정향, 필발, 천궁, 육두구, 포황 및 단삼의 혼합 생약 추출물은 암의 예방 또는 개선을 목적으로 건강기능식품에 첨가될 수 있다. 본 발명의 소합향, 백단향, 정향, 필발, 천궁, 육두구, 포황 및 단삼의 혼합 생약 추출물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 소합향, 백단향, 정향, 필발, 천궁, 육두구, 포황 및 단삼의 혼합 생약 추출물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에 본 발명의 소합향, 백단향, 정향, 필발, 천궁, 육두구, 포황 및 단삼의 혼합 생약 추출물은 원료에 대하여 15중량 % 이하, 바람직하게는 10 중량 % 이하의 양으로 첨가된다. 그러나, 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 수프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 포함할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토오스, 수크로오스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ml 당 일반적으로 약 0.01 내지 10 g, 바람직하게는 약 0.01 내지 0.1 g이다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일주스, 과일주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 포함할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예, 실험예 및 제조예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예, 실험예 및 제조예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예, 실험예 및 제조예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
실시예
1. 혼합 생약 추출물의 제조
소합향, 백단향, 정향, 필발, 천궁, 육두구, 포황 및 단삼은 동양허브 (대한민국)에서 구입하여 정선한 것을 사용하였다. 상기 8가지 생약재를 하기 표 1과 같은 성분비로 혼합하여 분말로 만든 다음, 10배 부피의 30% 에탄올을 넣어 85~90℃에서 3시간씩 2회 추출하였다. 상기 추출액을 50㎛ 필터로 여과하고, 그 여액을 60℃ 이하에서 감압 농축한 후 건조하여 최종 혼합 생약 추출물 2.4~3.6kg을 수득하였다 (평균수득율 23.08%).
| 성분 | 학명 | 양 (g) |
| 소합향 | resin of Liquidambar orientalis Miller | 411 |
| 백단향 | lumber of Santalum album L. | 821 |
| 정향 | flower buds of Eugenia caryophyllata Merrill et Perry | 821 |
| 필발 | fructus of Piper longum L. | 2731 |
| 천궁 | rhizome of Cnidium officinale Makino | 2189 |
| 육두구 | seed of Myristica fragrans Houtt | 1642 |
| 포황 | pollen of Typha orientalis Presl. | 1095 |
| 단삼 | root of Salvia miltiorrhiza Bunge | 3284 |
| 총량 | 12994 |
실험예
1. 본 발명의 혼합 생약 추출물이 암 세포 증식에 미치는 영향 검증
상기 실시예 1에서 제조한 소합향, 백단향, 정향, 필발, 천궁, 육두구, 포황 및 단삼의 혼합 생약 추출물이 암 세포 증식에 미치는 영향을 검증하기 위하여, MTT 어세이를 수행하였다.
암 세포주는 한국세포주은행에서 분양받은 인간 대장암 세포주(KM12C)를 이용하였다. 먼저, KM12C 세포를 5×103/ml 농도로 96 웰 플레이트(Nunc, Denmark)에 분주하고, 상기 실시예 1에서 제조한 혼합 생약 추출물(GGSH)을 2, 10, 50μg/ml의 농도로 처리하였다. 그 후 37℃, 5% CO2 조건에서 48 시간 동안 배양하였다. 그 후 MTT (3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 시약(5mg/ml)을 각각의 세포에 처리하였다. 4시간 동안 배양 후 상층액을 제거하고, 100 μl의 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 첨가하였다. 그 후 590 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였으며, 이를 대조군과 비교하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 소합향, 백단향, 정향, 필발, 천궁, 육두구, 포황 및 단삼의 혼합 생약 추출물은 농도 의존적으로 암세포의 증식을 억제함을 확인하였다.
실험예
2. 본 발명의 혼합 생약 추출물이 암 세포에서
TNF
- α,
IL
-6 발현에 미치는 영향 검증
상기 실시예 1에서 제조한 소합향, 백단향, 정향, 필발, 천궁, 육두구, 포황 및 단삼의 혼합 생약 추출물이 암 세포에서 TNF-α (Tumor necrosis factor alpha), IL-6 (Interleukin-6) 발현에 미치는 영향을 검증하기 위하여, ELISA를 수행하였다.
인간 교모세포종 세포주(A172)에 상기 실시예 1에서 제조한 혼합 생약 추출물(GGSH)을 2, 10, 50μg/ml의 농도로 30분간 처리한 후, PMA(Phorbol myristate acetate) 1 μM을 2시간 동안 처리하여 탈분극을 유도하였다. 그 후, ELISA kit(R&D system, Minneapolis, MN)를 이용하여, TNF-α 또는 IL-6 발현에 미치는 영향을 확인하였다. PMA만 처리한 그룹과 아무것도 처리하지 않은 세포를 대조군으로 분석하였다. 그 결과를 각각 도 2 및 도 3에 나타내었다.
도 2 및 도 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 소합향, 백단향, 정향, 필발, 천궁, 육두구, 포황 및 단삼의 혼합 생약 추출물은 암 세포에서 염증성 사이토카인인 TNF-α 및 IL-6의 발현을 억제함을 확인하였다.
실험예
3. 본 발명의 혼합 생약 추출물이 암 세포에서
TGF
-β 발현에 미치는 영향 검증
상기 실시예 1에서 제조한 소합향, 백단향, 정향, 필발, 천궁, 육두구, 포황 및 단삼의 혼합 생약 추출물이 암 세포에서 TGF-β (Transforming growth factor beta)발현에 미치는 영향을 검증하기 위하여, RT-PCR을 수행하였다.
RNA 및 RT-PCR RNA 세포의 준비를 위하여 100㎜ 세포배양 접시에 KM12C 세포를 5×106cells/ml 의 농도로 분주한 다음, 하루 밤 동안 안정화시켰다. 상기 세포에 실시예 1에서 제조한 혼합 생약 추출물(GGSH)을 2, 10, 50μg/ml의 농도로 처리한 후, 6시간 동안 배양하였다. 그 후, 세포를 모아 PBS로 세척하고, 이지 블루(easy blue, Intron) 1㎖를 가하여 실온에서 교반하였다. 클로로포름 200㎕를 넣고 다시 교반하여 13,000rpm, 4℃에서 10분간 원심분리 한 다음, 상등액 400㎕에 아이소프로판올을 가하여 다시 원심분리하여 RNA 펠렛을 수득하였다. 상기 RNA에 MuLV 역전사효소(reverse transcriptase) 1mM, dNTP 0.5㎍을 넣어 cDNA를 만들어, RT-PCR을 수행하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 소합향, 백단향, 정향, 필발, 천궁, 육두구, 포황 및 단삼의 혼합 생약 추출물은 암 세포에서 세포 외 기질 분자와 세포의 상호작용 및 세포 간의 상호작용을 조절하며, 영양세포층이 조직 내 세포 침윤을 나타내는 표현형으로 분화하도록 하는 효과가 있다고 알려진, TGF-β의 발현을 억제함을 확인하였다.
실험예
4. 본 발명의 혼합 생약 추출물이 암 세포에서 단백질 발현 및 인산화에 미치는 영향 검증
상기 실시예 1에서 제조한 소합향, 백단향, 정향, 필발, 천궁, 육두구, 포황 및 단삼의 혼합 생약 추출물이 암 세포에서 단백질 발현 및 인산화에 미치는 영향을 검증하기 위하여, 다양한 단백질에 대한 항체를 이용하여 웨스턴 블랏을 수행하였다.
4-1. 암 세포에서
GSK
-3β와
Akt
의 인산화에 미치는 영향 검증
인간 교모세포종 세포주(A172)에 상기 실시예 1에서 제조한 혼합 생약 추출물(GGSH)을 2, 10, 50μg/ml의 농도로 30분간 처리한 후, PMA (1 μM)로 2시간 동안 처리하였다. 그 후, 상기 각각의 세포에 세포용해제 (lysis buffer, 50mM HEPES pH 7.0, 250mM NaCl, 5mM EDTA, 0.15 Nonidet P-40, 1mM phenylmethylsulfonyl flouride, 0.5mM dithiothretol, 5mM NaF 및 0.5mM Na orthovanadate)를 처리하여 단백질을 분리한 후, GSK-3β (Glycogen synthase kinase-3-beta), p-GSK-3β(ser9), Akt (protein kinase B) 또는 p-Akt에 대한 항체를 이용하여 웨스턴 블랏을 수행하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 소합향, 백단향, 정향, 필발, 천궁, 육두구, 포황 및 단삼의 혼합 생약 추출물은 암 세포에서 Akt 및 암세포에서 분비되는 당단백질인 Wnt 신호전달 체계에서 중요한 역할을 하는 GSK-3β의 인산화를 억제함을 확인하였다.
4-2. 암 세포에서 신호 전달 단백질의 인산화에 미치는 영향 검증
인간 대장암 세포주(KM12C)에 상기 실시예 1에서 제조한 혼합 생약 추출물(GGSH)을 2, 10, 50μg/ml의 농도로 30분간 처리하였다. 그 후, 상기 각각의 세포에 세포용해제를 처리하여 단백질을 분리한 후, Akt, p-Akt, PKD1, p-PKD1, ERK (Extracellular signal-regulated kinases) 또는 p-ERK에 대한 항체를 이용하여 웨스턴 블랏을 수행하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 소합향, 백단향, 정향, 필발, 천궁, 육두구, 포황 및 단삼의 혼합 생약 추출물은 암 세포에서 초기의 신호전달을 담당하는 PKD1과 ERK1/2의 인산화, 및 변이원성에 중추적인 역할을 하는 것으로 알려진 Akt의 인산화를 억제함을 확인하였다. 상기 결과를 통하여, 실험예 4-1에서 확인한 GSK-3β의 인산화 억제 효과는 Akt, ERK1/2, PKD1의 신호 전달 억제 효과를 통하여 일어나는 것임을 확인하였다.
4-3. 암 세포에서
Wnt
신호 전달 단백질 발현에 미치는 영향 검증
상기 실험예 4-2과 동일한 방법으로 GSK-3β, p-GSK-3β 또는 β-카테닌(beta-catenin)에 대한 항체를 이용하여 웨스턴 블랏을 수행하였다. 그 결과를 각각 도 7 및 도 8에 나타내었다.
도 7 및 도 8에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 소합향, 백단향, 정향, 필발, 천궁, 육두구, 포황 및 단삼의 혼합 생약 추출물은 암 세포에서 GSK-3β의 인산화를 억제하고 β-카테닌의 발현을 저하함을 확인하였다.
또한, 동일한 방법으로 인간 교모세포종 세포주(A172)에서 β-카테닌이 신호전달 매개체로 작용하는 c-Myc의 발현에 미치는 영향을 확인하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 소합향, 백단향, 정향, 필발, 천궁, 육두구, 포황 및 단삼의 혼합 생약 추출물은 암 세포에서 c-Myc과 β-카테닌의 세포 내 양을 감소시킴을 확인하였다.
실험예
5. 본 발명의 혼합 생약 추출물이 암 세포에서
RNA
발현에 미치는 영향 검증
상기 실시예 1에서 제조한 소합향, 백단향, 정향, 필발, 천궁, 육두구, 포황 및 단삼의 혼합 생약 추출물이 암 세포에서 RNA 발현에 미치는 영향을 검증하기 위하여, RT-PCR을 수행하였다.
5-1. 암 세포에서 c-
Myc
,
서바이빈
,
사이클린
D1
의
mRNA
발현에 미치는 영향 검증
인간 대장암 세포주(KM12C)에 상기 실시예 1에서 제조한 혼합 생약 추출물(GGSH)을 2, 10, 50μg/ml의 농도로 6시간 동안 처리한 후, 상기 실험예 3과 동일한 방법으로 RT-PCR을 수행하여, 세포 주기와 관련된 c-Myc, 사이클린 D1 (cyclin D1) 또는 서바이빈(Survivin)의 mRNA 발현에 미치는 영향을 확인하였다. 그 결과를 도 10 및 도 11에 나타내었다.
도 10 및 도 11에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 소합향, 백단향, 정향, 필발, 천궁, 육두구, 포황 및 단삼의 혼합 생약 추출물은 암 세포에서 변이 원성의 중요한 인자로 알려진 c-Myc, 세포 분화 주기에 중요한 역할을 하는 것으로 알려진 사이클린 D1 및 세포의 생존에 중요한 영향을 미치는 서바이빈의 mRNA 발현을 억제함을 확인하였다.
5-2. 암 세포에서
p21
및
p53
의
mRNA
발현에 미치는 영향 검증
상기 실험예 5-1과 동일한 방법으로 세포 주기와 관련된 p21 및 p53의 mRNA 발현에 미치는 영향을 확인하였다. 그 결과를 도 12에 나타내었다.
p21은 사이클린 의존 인산화 효소의 억제자(cyclin-dependent kinase inhibitor)로 알려진 단백질로서, p21(Cip1/Waf1)이 사이클린 의존 인산화 효소와 결합하여 복합체를 형성함으로써 세포 주기를 조절한다고 알려져 있다. p21(Cip1/Waf1) 유전자의 발현은 종양 억제 유전자로 알려진 p53에 의하여 조절된다고 알려져 있다.
도 12에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 소합향, 백단향, 정향, 필발, 천궁, 육두구, 포황 및 단삼의 혼합 생약 추출물은 암 세포에서 p21 및 p53의 mRNA 발현을 증가시킴을 확인하였다.
5-3. 암 세포에서
EMT
신호전달에 미치는 영향 검증
상기 실험예 5-1과 동일한 방법으로 EMT 신호전달과 관련된 스네일 (Snail) 및 E-카데린(E-cadherin)의 mRNA 발현에 미치는 영향을 확인하였다. 그 결과를 도 13에 나타내었다.
세포와 세포간의 접착력 소실과 세포분화는 악성세포가 전이할 때 나타내는 중요한 특징으로, 이는 스네일의 발현이 증가되고 E-카데린의 발현이 억제되는 것과 밀접하게 연관되어 있다고 알려져 있다.
도 13에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 소합향, 백단향, 정향, 필발, 천궁, 육두구, 포황 및 단삼의 혼합 생약 추출물은 암 세포에서 스네일의 발현을 억제하고, E-카데린의 발현을 증가시킴을 확인하였다.
이하 본 발명의 약학적 조성물 및 건강기능식품의 제제예를 설명하나, 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
제제예
1. 약학적 조성물의 제조
1-1.
산제의
제조
소합향, 백단향, 정향, 필발, 천궁, 육두구, 포황 및 단삼의 혼합 생약 추출물 20 mg
유당 100 mg
탈크 10 mg
상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.
1-2. 정제의 제조
소합향, 백단향, 정향, 필발, 천궁, 육두구, 포황 및 단삼의 혼합 생약 추출물 10 mg
옥수수전분 100 mg
유당 100 mg
스테아린산 마그네슘 2 mg
상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.
1-3. 캡슐제의 제조
소합향, 백단향, 정향, 필발, 천궁, 육두구, 포황 및 단삼의 혼합 생약 추출물 10 mg
결정성 셀룰로오스 3 mg
락토오스 14.8 mg
마그네슘 스테아레이트 0.2 mg
통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.
1-4. 주사제의 제조
소합향, 백단향, 정향, 필발, 천궁, 육두구, 포황 및 단삼의 혼합 생약 추출물 10 mg
만니톨 180 mg
주사용 멸균 증류수 2974 mg
Na2HPO42H2O 26 mg
통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당 (2 ml) 상기의 성분 함량으로 제조한다.
1-5.
액제의
제조
소합향, 백단향, 정향, 필발, 천궁, 육두구, 포황 및 단삼의 혼합 생약 추출물 20 mg
이성화당 10 g
만니톨 5 g
정제수 적량
통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ml로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.
제제예
2. 식품 조성물의 제조
2-1. 건강식품의 제조
소합향, 백단향, 정향, 필발, 천궁, 육두구, 포황 및 단삼의 혼합 생약 추출물 100 mg
비타민 혼합물 적량
비타민 A 아세테이트 70 μg
비타민 E 1.0 mg
비타민 B1 0.13 mg
비타민 B2 0.15 mg
비타민 B6 0.5 mg
비타민 B12 0.2 μg
비타민 C 10 mg
비오틴 10 μg
니코틴산아미드 1.7 mg
엽산 50 μg
판토텐산 칼슘 0.5 mg
무기질 혼합물 적량
황산제1철 1.75 mg
산화아연 0.82 mg
탄산마그네슘 25.3 mg
제1인산칼륨 15 mg
제2인산칼슘 55 mg
구연산칼륨 90 mg
탄산칼슘 100 mg
염화마그네슘 24.8 mg
상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.
2-2.
건강음료의
제조
소합향, 백단향, 정향, 필발, 천궁, 육두구, 포황 및 단삼의 혼합 생약 추출물 100 mg
비타민 C 15 g
비타민 E(분말) 100 g
젖산철 19.75 g
산화아연 3.5 g
니코틴산아미드 3.5 g
비타민 A 0.2 g
비타민 B1 0.25 g
비타민 B2 0.3g
물 정량
통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85 ℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 l 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.
상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.
Claims (6)
- 소합향, 백단향, 정향, 필발, 천궁, 육두구, 포황 및 단삼의 혼합 생약 추출물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 혼합 생약 추출물은 소합향, 백단향, 정향, 필발, 천궁, 육두구, 포황 및 단삼의 혼합물을 물, 탄소수 1 내지 4의 알코올 및 이들의 혼합 용매로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 용매로 추출한 것을 특징으로 하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제 2항에 있어서, 상기 탄소수 1 내지 4의 알코올은 에탄올인 것을 특징으로 하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제 2항에 있어서, 상기 소합향, 백단향, 정향, 필발, 천궁, 육두구, 포황 및 단삼의 혼합물은 소합향 : 백단향 : 정향 : 필발 : 천궁 : 육두구 : 포황 : 단삼 = 0.5~1.5 : 1.5~2.5 : 1.5~2.5 : 5~7 : 4~6 : 3~5 : 2~4 : 7~9 중량비로 혼합된 것을 특징으로 하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 암은 위암, 결장암, 유방암, 폐암, 비소세포성폐암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부암, 피부 또는 안구 내 흑색종, 자궁암, 난소암, 대장암, 소장암, 직장암, 항문부근암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 소장암, 임파선암, 방광암, 담낭암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 방광암, 신장 또는 수뇨관 암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 혈액암, 뇌암, 중추신경계(CNS; central nervous system) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종 및 뇌하수체 선종으로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는, 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 소합향, 백단향, 정향, 필발, 천궁, 육두구, 포황 및 단삼의 혼합 생약 추출물을 유효성분으로 포함하는 암의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
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2012
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