상기 목적을 달성하기 위하여,
본 발명은 물, 알콜 또는 이들의 혼합물로 추출되며 활성성분으로 브라질린, 사판칼콘 및 브라질레인을 포함하는 혈관신생 억제 활성을 나타내는 소목(Caesalpinia sappan L.) 추출물을 제공한다.
또한, 본 발명은 브라질린 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 혈관신생 억제제를 제공한다.
또한, 본 발명은 사판칼콘 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 혈관신생 억제제를 제공한다.
또한, 본 발명은 브라질레인 또는 그의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 혈관신생 억제제를 제공한다.
또한, 본 발명은 소목 추출물, 브라질린, 사판칼콘, 브라질레인 또는 상기 화합물의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 혈관 질환, 심혈관계 질환, 혈관 신생 관련 안과 질환, 만성 염증성 질환, 피부과 질환, 알츠하이머, 비만 또는 암 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 소목 추출물, 브라질린, 사판칼콘, 브라질레인 또는 상기 화합물의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 혈관신생 억제 활성을 나타내는 건강 기능 식품을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 물, 알콜 또는 이들의 혼합 용매로 추출되며, 활성성분으로 브라질린, 사판칼콘 및 브라질레인을 포함하는 혈관신생 억제 활성을 나타내는 소목(Caesalpinia sappan L.) 추출물을 제공한다. 상기 소목 추출물은 건조된 소목을 세절하여 무게(kg)의 약 1배 내지 20배, 바람직하게는 약 3배 내지 10배의 물, C1 내지 C3의 저급 알콜 또는 이들의 혼합물에 가용한 추출물인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 메탄올이다. 더불어, 추출시 온도는 20℃ ~ 100℃인 것이 바람직하며, 약 1시간 내지 10일, 바람직하게는 약 2시간 내지 72시간 동안 열수 추출, 초음파 추출, 환류 냉각 추출 방법 및 냉침 방법등이 사용될 수 있으며, 가장 바람직하게는 48시간동안 냉침하여 추출하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 소목 메탄올 추출물은 건조된 소목을 세절하여 메탄올로 약 2일 동안 냉침한 후, 여과하여 소목 메탄올 추출물을 수득하였다(도 1 참조). 또한, 본 발명의 소목 물 추출물은 건조된 소목을 세절하여 증류수를 가한다. 수욕상에서 환류 냉각하에 추출한 후 동결건조하여 소목 물 추출물을 수득하여 사용하였다.
또한, 본 발명은 브라질린, 사판칼콘, 브라질레인 또는 그들의 약학적으로 허용되는 염을 포함하는 혈관신생 억제제를 제공한다.
상기 소목(Caesalpinia sappan L.) 추출물로부터 유효성분을 분리하기 위하여 에테르(ether), 헥산(hexane), 메틸렌 클로라이드(methylene chloride), 에틸 아세테이트(ethyl acetate) 및/또는 이들의 혼합 용매로 구성되는 군으로부터 선택되는 비극성 용매를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 헥산, 메틸렌 클로라이드, 에틸 아세테이트이다.
상기 비극성 용매 가용 추출물은 실리카겔, 세파덱스, RP-18, 폴리아미드 및 XAD 수지로 이루어진 군으로부터 선택되는 충진제를 이용한 컬럼 크로마토그래피를 통하여 신생혈관 억제 활성을 갖는 성분들을 분리 및 정제할 수 있다 (Harborne J.B. Phytochemical methods: A guide to modern technique of plant analysis. 3rd Ed. pp6-7, 1998).
본 발명의 상기 화합물들을 소목 메탄올 추출물로부터 분리하는 과정은 하기와 같다.
1) 브라질레인(brazilein)의 분리 과정
상기 소목 메탄올 추출물로부터 브라질레인(brazilein)을 분리하는 과정은 도 2의 단계들로 요약되며 이를 구체적으로 살펴보면, 상기 소목 메탄올 추출물을 감압, 농축하는 과정에서 석출된 검붉은색 결정체에 뜨거운 메탄올, 바람직하게는 20℃ 내지 100℃, 더욱 바람직하게는 50℃ 내지 100℃ 메탄올에 용해하여 상온에서 방치한 후 재결정화시켜 수득하였다 (도 2 참조).
2) 사판칼콘(sappanchalcone)의 분리 과정
소목 메탄올 추출물을 감압, 농축하여 획득된 메탄올 가용물을 헥산 : 증류수 혼합 용매를 이용하여 분리하고, 분리된 증류수층에 다시 메틸렌 클로라이드 : 증류수 혼합 용매를 가한 다음 수득된 메틸렌 클로라이드층을 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 및 세파덱스 LH-20 크로마토그래피등의 방법에 의하여 분획한 뒤, 유효성분들을 분리하여 사판칼콘(sappanchalcone)을 수득하였다 (도 3 참조).
3) 브라질린(brazilin)의 분리 과정
상기 사판칼콘 분리에 이용된 메틸렌 클로라이드 : 증류수 혼합 용매에 의해 수득된 메틸렌클로라이드 가용층 이외의 증류수층에 에틸 아세테이트 : 증류수 혼합 용매를 가하여 수득된 에틸 아세테이트 가용층을 세파덱스 LH-20 크로마토그래피 및 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피등의 방법에 의하여 분획한 뒤, 유효성분들을 분리하여 브라질린(brazilin)으로 확인하였다 (도 4 참조).
본 발명에 따른 화합물은 또한 약제학적으로 허용되는 염을 형성할 수 있다. 이러한 약제학적으로 허용되는 염에는 알칼리 금속 수산화물 (예: 수산화나트륨, 수산화칼륨), 알칼리금속 중탄산염 (예: 중탄산나트륨, 중탄산칼륨), 알칼리 금속 탄산염 (예: 탄산나트륨, 탄산칼륨, 탄산칼슘) 등과 같은 무기 염기와 1차, 2차, 3차 아민 아미노산과 같은 유기 염기가 포함된다. 본 발명의 화합물들은 또한 용매화물, 특히 수화물의 형태일 수 있다. 수화는 상기 화합물을 분리하는 동안 일어 날 수 있거나 또는 화합물의 흡습성으로 인해 시간이 경과함에 따라 일어날 수 있다.
또한, 본 발명은 소목 추출물, 브라질린, 사판칼콘, 브라질레인 또는 상기 화합물의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 혈관 질환, 심혈관계 질환, 혈관 신생 관련 안과 질환, 만성 염증성 질환, 피부과 질환, 알츠하이머, 비만 또는 암 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물에서 혈관 질환은 혈관종, 혈관섬유종, 혈관기형 등으로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있고, 심혈관계 질환은 동맥경화, 혈관유착, 부종성 경화증 등으로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있으며, 또한 안과 질환은 각막이식성 혈관신생, 혈관신생성 녹내장, 퇴화반 (macular degeneration), 당뇨병성 망막증(diabetic retinopathy), 조숙아의 망막증, 신생혈관성 녹내장, 신생혈관에 의한 각막 질환, 반점의 변성, 익상편, 망막 변성, 후수정체 섬유 증식증, 과립성 결막염 등으로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있으며, 만성 염증성 질환은 관절염, 피부과 질환은 건선, 모세관 확장증, 화농성 육아종, 지루성 피부염, 여드름 등으로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있으나, 반드시 여기에 국한되는 것은 아니다.
더불어, 상기 암 질환은 폐암, 비소세포성폐암, 간암, 결장암, 골암, 췌장암, 피부암, 두부 또는 경부 암, 피부 또는 안구내 흑색종, 자궁암, 난소암, 직장암, 위암, 항문부근암, 결장암, 유방암, 나팔관암종, 자궁내막암종, 자궁경부암종, 질암종, 음문암종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 식도암, 소장암, 내분비선암, 갑상선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 음경암, 전립선암, 방광암, 신장 또는 수뇨관 암, 신장세포 암종, 신장골반 암종, 중추신경계(CNS: central nervous system) 종양, 1차 CNS 림프종, 척수 종양, 뇌간 신경교종, 뇌하수체 선종 등으로 구성되는 군으로부터 선택될 수 있으며, 본 발명의 조성물을 혈관신생과 관련된 암 질환 및 전이 치료에 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물은 임상 투여시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며, 일반적인 제제의 형태로 사용될 수 있다.
즉, 본 발명의 조성물은 실제 임상 투여시에 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
본 발명에 따른 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 환제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
이러한 고형 제제는 소목 추출물 또는 브라질린, 사판칼콘, 브라질레인 중 하나 이상의 성분에 하나 이상의 부형제 예를 들면, 덱스트린(Dextrin), 전분, 칼슘 카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose) 또는 락토오스(Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈 크 같은 윤활제들도 사용된다.
경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌 글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸 올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 소목 추출물, 브라질린, 사판칼콘 또는 브라질레인 중 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 형태, 투여 경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위하여 본 발명의 조성물은 1일 0.01 mg/kg 내지 10 g/kg으로, 바람직하게는 1 mg/kg 내지 1 g/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 1일 1회 투여할 수 있으며, 1일 수회로 나누어 투여할 수도 있다.
또한, 본 발명은 상기 소목 추출물, 브라질린, 사판칼콘, 브라질레인 또는 상기 화합물의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 포함하는 혈관신생 억제 활 성을 나타내는 건강 기능 식품을 제공한다.
상기 소목 추출물, 브라질린, 사판칼콘 또는 브라질레인을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능 식품류 등이 있다.
이때, 식품 또는 음료 중의 상기 소목 추출물의 양은 일반적으로 본 발명의 건강 기능 식품 조성물의 경우는 전체 식품 중량의 0.01 내지 90 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 80 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물에는 100 ㎖를 기준으로 0.01 내지 90 g, 바람직하게는 0.1 내지 50 g의 비율로 가할 수 있다.
본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로, 필수 성분으로서 상기 추출물을 함유하는 외에는 액체성분에 특별히 제한되지 않으며, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상기 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리스리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제(예를 들어 사카린, 아스파르탐 등)를 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 건강 음료 조성물 100 ㎖ 당 일반적으로 약 1 ~ 20 g, 바람직하게는 약 5 ~ 12 g이다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스, 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 소목 추출물의 제조
<1-1> 소목 메탄올 추출물 제조
경동시장에서 구입한 세절된 건조 소목 9 ㎏을 18ℓ의 100% 메탄올에 2일간 냉침시키는 단계를 3회 반복한 후, 소목 메탄올 냉침액을 여지를 사용하여 상압하에서 여과(filtering)하여 추출물을 수득하였다(도 1).
<1-2> 소목
물추출물
제조
경동시장에서 구입한 건조된 소목 200 g을 물 1 ℓ에 넣고, 90℃ ~ 100℃에서 6시간씩 2회 가열추출하였다. 상기 추출물을 여지를 사용하여 상압하에서 여과한 다음 동결 건조하여 51.5 g의 소목 물 추출물을 얻었다.
<실시예 2> 유효성분 분리, 정제 및 동정
<2-1> 비극성 용매에 의한 소목 추출물 분리
소목의 유효성분 분리를 위하여 실시예 1에서 수득한 소목 추출물을 걸죽한 상태가 될 때까지 감압하에 농축기를 사용하여 농축하였다. 이 과정에서 석출된 결정체를 글래스 필터(glass filter)를 사용하여 여과하여 검붉은색의 결정체 21 g을 얻었고, 나머지 메탄올 용액에 남아있는 메탄올 가용물을 다시 감압하에 농축하여 450 g을 얻었다.
상기 메탄올 가용물 중 230 g을 증류수 1 ℓ에 현탁시키고 n-헥산 (n-hexane)을 1 ℓ씩 가하여 세게 흔들어 섞은 후 분획이 되도록 방치하였다. 헥산으로 3회 추출하여 헥산 가용층과 증류수층으로 분리하였다. 상기 증류수층에 메틸렌 클로라이드를 1 ℓ 가하여 분획하고, 그 결과, 메틸렌 클로라이드 가용층 4.1g을 수득하였다 (도 1의 B).
또한, 상기 메틸렌 클로라이드 가용층을 제외한 나머지 증류수층에 에틸 아세테이트 를 1 ℓ 가하여 분획하고, 그 결과, 에틸 아세테이트 가용층 150 g을 수득하였다 (도 1의 C).
<2-2> 브라질레인 분리, 정제 및 동정
상기 실시예 2-1의 소목 메탄올 추출물을 감압 농축하는 과정에서 석출된 검붉은색 결정 21g 중 900㎎을 300㎖의 뜨거운(50 ℃) 메탄올에 녹여 24시간 상온에서 방치한 후 재결정을 통하여 순수한 단일 화합물 Compound 1 16g을 얻었으며, 다음의 데이터로부터 브라질레인임을 확인하였다 (도 2 참조).
Compound 1: reddish-brown crystals (MeOH-H2O), [a]D25 -700 (DMSO; c 1.00), UV λmax MeOH nm: 445, IRv : 3409, 2924, 2855, 1739, 1599, 1498 cm-1, mp. 260-265℃, EI-MS (m/z): 284 [M]+ C16H12O5, 1H-NMR (500MHz, DMSO-d6) : δ 7.80 (1H, d, J=8.7 Hz, H-1), 7.10 (1H, s, H-11), 6.56 (1H, d, J=8.5 Hz, H-2), 6.35 (1H, s, H-4), 6.32 (1H, s, H-8), 4.45 (1H, d, J=11.7 Hz, H-6a), 4.00 (1H, d, J=11.7 Hz, H-6b), 2.85 (2H, d, J=3.7 Hz, H-7) 13C-NMR (125MHz, DMSO-d6) : δ 39(C-7), 72(C-6), 74(C-6a), 102(C-4), 104(C-11), 110(C-1a), 110(C-2), 117(C-8), 126(C-11a), 130(C-1), 151(C-12), 152(C-10), 157(C-4a), 158(C-7a), 162(C-3), 179(C-9)
<2-3>
사판칼콘의
분리 정제 및 동정
상기 실시예 2-1에서 수득한 메틸렌 클로라이드 가용층 4.1g을 메틸렌 클로라이드/메탄올 혼합 용매를 용출 용매로 사용하여 단계적 농도 구배법(20:1 → 1:1) 방식으로 실리카 겔 (70-230 mesh, 350g) 컬럼 (φ=3.0 x 50 cm) 크로마토그래피를 실시하여 AS30-M1 (1.3㎎), AS30-M2 (870㎎), AS30-M3 (560㎎), AS30-M4 (270㎎), AS30-M5 (300㎎), AS30-M6 (800㎎) 등 총 6개의 분획으로 나누었다. 이 중 4번째 분획 (AS30-M4)을 50% 메탄올 조건으로 세파덱스 LH-20 컬럼 (φ=3.0 x 50 cm) 크로마토그래피를 실시하여 세 개의 분획으로 나누고 그 중 두번째 분획(AS30-M42)에서 Compound 2 60㎎을 분리하였으며, 다음의 데이터로부터 사판칼콘임을 확인하였다 (도 3 참조).
Compound 2: Yellow needles, [a]D25 +15.2 (MeOH; c 1.00), UV λmax MeOH nm: 366, IRv : 3370, 2928, 1602, 1514, 1445 cm-1,mp. 198-199℃, EI-MS (m/z): 286 [M]+ C16H14O5, 1H-NMR (500MHz, DMSO-d6) : δ 7.57 (1H, d, J=8.5 Hz, H-6'), 7.49 (1H, d, J=15.6 Hz, H-b), 7.36 (1H, d, J= 15.6 Hz, H-a), 7.11 (1H, br s, H-2), 6.98 (1H, d, J=8.1 Hz, H-6), 6.79 (1H, d, J=8.1 Hz, H-5), 6.51 (1H, br s, H-3'), 6.45 (1H, d, J=8.5 Hz, H-5'), 3.88 (3H, -OMe) 13C-NMR (125MHz, DMSO-d6) : δ 56(C-OMe), 100(C-3'), 109(C-5'), 115(C-2), 116(C-5), 121(C-1'), 123(C-6), 125(C-6'), 128(C-1), 133(C-a), 144(C-b), 146(C-3), 149(C-4), 162(C-2'), 164(C-4'), 193(C=O)
<2-4> 브라질린의 분리, 정제 및 동정
상기 실시예 2-1에서 수득한 에틸 아세테이트 가용층 150g 중에서 18g을 메 틸렌 클로라이드 : 메탄올 (15:1) 혼합 용매를 이용하여 세파덱스 LH-20 컬럼 (φ=5.0 x 50 cm) 크로마토그래피를 실시한 후, 이의 네 번째 분획을 다시 메틸렌 클로라이드 : 메탄올 (20:1) 혼합 용매를 이용하여 세파덱스 LH-20 컬럼 (φ=5.0 x 50 cm) 크로마토그래피를 실시하여 4개의 분획을 획득하였고, 이의 세번째 분획(AS30-E43 (1.67g))을 메틸렌 클로라이드 : 에틸 아세테이트 혼합 용매를 용출 용매로 사용하여 단계적 농도 구배법(stepwise gradient elution) (7:3→5:5→3:7 에틸 아세테이트)으로 실리카 겔 (70-230 mesh, 350g) 컬럼 (φ=3.0 x 50 cm) 크로마토그래피를 실시한 다음, 이의 두 번째 분획을 다시 메틸렌 클로라이드/에틸 아세테이트 혼합 용매를 용출 용매로 단계적 농도 구배법 (7:3→5:5 에틸 아세테이트)으로 실리카 겔 (70-230 mesh, 150g) 컬럼 (φ=2.5 x 30 cm) 크로마토그래피로 정제하여 획득한 첫번째 분획 (AS30 - E4321)에서 Compound 3 160㎎을 분리하였으며, 다음의 데이터로부터 브라질린임을 확인하였다 (도 4 참조).
Compound 3: [a]D25 +93.7 (MeOH; c 1.44), UV λmax MeOH nm: 274 , IRv : 3393, 2926, 2852, 1622, 1509 cm-1, EI-MS (m/z): 286 [M]+ C16H14O5, 1H-NMR (500MHz, DMSO-d6) : δ 7.18 (1H, d, J=8.4 Hz, H-1), 6.70 (1H, s, H-8), 6.59 (1H, s, H-11), 6.46 (1H, dd, J=8.3, 2.4 Hz, H-2), 6.29 (1H, d, J=2.4 Hz, H-4), 3.96 (1H, br s, H-12), 3.92 (1H, dd, J=1.2, 11.3 Hz, H-6a), 3.69 (1H, d, J=11.2 Hz, H-6b), 3.02 (1H, d, J=15.6 Hz, H-7a), 2.77 (1H, d, J=15.6 Hz, H-7b) 13C-NMR (125MHz, DMSO-d6) : δ 43(C-4a), 51(C-3), 71(C-9), 78(C-10), 104(C-11a), 110(C-1), 112(C-7a), 113,(C-1a) 115(C-8), 131(C-11), 132(C-2), 137(C-4), 145(C-6a), 145(C-6), 155(C-12), 158(C-7)
<실험예 1> HUVEC의 분리 및 배양
신생아의 탯줄 정맥으로부터 사람 제대혈관 내피세포 (human umbilical vein endothelial cell; 이하, 'HUVEC'라 약칭함)를 분리하여 일차 배양하였다. 구체적으로, 그랜트 등의 문헌에 기재된 방법에 따라 HUVEC를 분리하였으며 (Grant, D.S. et al., Cell, 58, pp933-943, 1989), 분리된 HUVEC를 M-199 (Gibco BRL, 31100-035), 10% FBS, 50 ㎍/㎖ ECGS (Endothelial cell growth supplement, Sigma E2759), 50 ㎍/㎖ 헤파린 (Heparin, Sigma H3149)으로 구성된 배양배지에서 배양하였다.
HUVEC의 배양이 종료된 후에, 인자 Ⅷ (factor Ⅷ)의 항체 (DAKO, Code No. M0616)를 이용하여 면역염색함으로써 HUVEC이 성공적으로 분리되었음을 확인하였다 (Valen, G. et al., Free Radic . Biol . Med ., 26, pp1480-1488, 1999; Rhim, J.S. et al., Carcinogenesis, 19, pp673-681, 1998).
<실험예 2> HUVEC 관형성 억제 효능
소목 메탄올 추출물, 소목 물추출물 및 소목에서 분리한 유효성분인 브라질레인, 사판칼콘, 브라질린이 혈관신생 억제 효능이 있음을 측정하기 위하여, HUVEC을 이용한 HUVEC 관 형성 억제분석(tube formation inhibition assay)을 통하여 혈관신생 억제 효능을 세포수준에서 측정하였다 (도 5).
HUVEC 관형성 억제분석은 혈관신생을 측정하는 시험관내 (in vitro) 분석 중에서 생체내 (in vivo) 실험과 가장 상관성이 높은 실험이다.
구체적으로, 실험예 1에서 분리·배양된 HUVEC를 5회 이내에서 계대 배양(passage 5)한 후에, 기저막 성분인 마트리젤 (Matrigel) (BD Biosciences, Bedford, MA)이 포함된 배지를 이용하여 48 웰 플레이트(well plate)의 웰 당 20,000~50,000 개의 세포를 분주한 후, 실험예 1의 일차 배양배지 조성하에서 배양하였다.
이 때, 상기 배지에 실시예 1의 소목 추출물들, 실시예 2에서 분리·정제된 브라질레인, 사판칼콘, 브라질린을 각각 10㎍/ml와 50 ㎍/ml 농도로 첨가하고 대조군에는 DMSO를 첨가하였다. 배양 18시간 경과 후에, 현미경으로 관 형성(tube formation)을 관찰하여 하기의 표 1에 정리하였다(- : 관 형성을 전혀 억제하지 않음, +/- : 거의 억제하지 않음, + : 관 형성을 약간 억제하여 튜브가 끊겨짐, ++ : 관이 많이 끊겨짐, +++: 관이 전혀 생기지 않음).
도 5와 표 1에서 보는 바와 같이 소목 메탄올 추출물, 소목 물 추출물, 브라질린, 사판칼콘 및 브라질레인 모두 50㎍/㎖ 처리시 HUVEC 관형성을 크게 억제함을 관찰하였다.
시료 |
관형성 억제 |
50㎍/㎖ |
10㎍/㎖ |
소목 메탄올 추출물 |
+++ |
+(+) |
소목 물추출물 |
+++ |
+(+) |
브라질린 |
+++ |
+++ |
사판칼콘 |
+++ |
++(+) |
브라질레인 |
+++ |
+++ |
<
실험예
3> 세포 독성 실험
소목에서 분리한 유효성분인 브라질레인, 사판칼콘, 브라질린에 대한 세포 독성 여부를 측정하기 위하여, HUVEC의 생존율을 측정하였다 (도 6).
24-웰 플레이트(well plate)를 2% 젤라틴(gelatin)으로 코팅한 후에 HUVECs을 웰당 약 1x105 개 세포를 분주(seeding)한 후, 다음날 1% M199 배지로 6시간 동안 배양하여 기아상태(starvation)를 만들었다. 기아 상태가 된 후, 브라질린, 사판칼콘 및 브라질레인을 1 ng/ml, 10 ng/ml, 100 ng/ml, 1 ㎍/ml 및 10 ㎍/ml로 처리하고 각각 48시간이 지난 후에 MTT 분석 (Ealey PA, et al., Growth Regul, 5: 36-44 (1995))을 통하여 살아있는 세포를 570 nm 흡광도로 정량하였다.
도 6은 브라질린, 사판칼콘 및 브라질레인을 48시간 처리 후 HUVECs를 40배 확대하여 촬영한 사진으로서, 상기 유효성분들을 농도를 달리하여 처리하여도 세포 독성이 나타나지 않음을 확인할 수 있었다. 또한, 표 2에서 보는 바와 같이 관형성을 억제하는 50㎍/ml와 10㎍/ml 농도로 소목 추출물, 브라질린, 사판칼콘, 브라질레인을 24 시간동안 처리하였을 때 HUVECs의 생존율에는 큰 영향이 없는 것을 확인할 수 있었다.
시료 |
HUVECs 생존율(%) |
50㎍/ml |
10㎍/ml |
소목 메탄올 추출물 |
59.3 |
100 |
소목 물추출물 |
52.5 |
100 |
브라질린 |
100 |
100 |
사판칼콘 |
73.5 |
87.0 |
브라질레인 |
99.7 |
100 |
<
실험예
4>
HUVEC
증식 억제 효능
브라질레인, 사판칼콘 및 브라질린이 세포 증식 억제 효능이 있음을 측정하기 위하여, 상기 추출물 및 유효성분들을 처리한 시료에 VEGF를 10 ng/ml의 농도로 처리하여 HUVEC의 증식율을 측정하였다 (도 7).
24-웰 플레이트를 2% 젤라틴으로 코팅한 후에 HUVECs을 웰당 2×104 개 세포를 분주(seeding)한 후, 다음날 1% M199 배지로 6시간 동안 배양하여 기아상태(starvation)를 만들었다. 기아 상태가 된 후, 브라질린, 사판칼콘, 브라질레인을 농도별 (1 ng/ml, 10 ng/ml, 100 ng/ml, 1 ㎍/ml, 10 ㎍/ml)로 처리하고, 30분 후 VEGF (10ng/ml)를 처리한 다음 40시간이 지난 뒤에 MTT 분석을 수행하여 증식된 세포를 570nm 흡광도로 정량하였다.
도 7은 HUVECs 증식율을 그래프로 정량화한 것으로서, 나타낸 바와 같이 브라질린, 사판칼콘, 브라질레인을 40시간 동안 처리하였을 때, 브라질린 및 브라질레인은 10 ㎍/ml의 농도에서, 사판칼콘은 1 ㎍/ml의 농도에서 VEGF에 의해 유도되는 HUVECs의 증식이 크게 억제되는 것을 확인할 수 있었다.
<
실험예
5>
VEGF
유도 후
브라질레인의
내피세포 이동 억제 효과
<5-1> 주화성 이동 실험
브라질레인에 의한 HUVEC 세포의 이동 억제 효과를 알아보기 위하여, 주화성 이동실험을 수행하였다 (도 8).
6.5mm 직경을 가지며, 기공 크기가 8㎛인 폴리카보네이트 필터가 있는 인서트 체임버(insert chamber)(Corning Costa, USA)의 필터의 아랫부분 표면을 젤라틴 10㎍으로 코팅하였다. VEGF를 포함하는 1 % (v/v) FBS를 포함하는 성장 배지를 하부 웰에 넣고, 1×106 개 세포/ml의 HUVEC 세포를 0.001μM, 0.01μM, 0.1μM 및 1μM의 브라질레인으로 상온에서 30분 동안 전처리한 후, 상부 웰에 100㎕를 넣은 다음, 37℃의 배양기에서 4시간 동안 배양하였다. 이어, 인서트 체임버의 폴리카보네이트 필터를 떼어내어 세포를 고정시키고, 헤마톡실린 (Sigma-Aldrich Co., USA)과 에오신 (Sigma-Aldrich Co., USA)으로 염색한 다음 (도 8의 A), 필터를 통과한 각 실험군의 HUVEC 세포의 수를 측정하였다 (도 8의 B).
상기 결과에서, 브라질레인의 농도 변화에 따라 VEGF에 의하여 필터를 통과한 HUVEC 세포수가 감소됨을 알 수 있었다.
<5-2> 상처 이동 분석(
Wounding
migration
assay)
브라질레인에 의한 HUVEC 세포의 비주화성 세포 이동 억제 효과를 알아보기 위하여, 상처 이동 분석을 수행하였다 (도 9).
HUVEC 세포를 젤라틴이 코팅된 6 웰에 3 ×105 세포로 배양한 후, 200 ㎕ 짜리 팁으로 일정 부위에 직선으로 상처를 낸다. 0.1 ㎍/ml, 1 ㎍/ml의 브라질레인으로 30분 동안 전처리한 후, 20 ng VEGF를 처리하고 18시간 후, 상처 부위로 이동한 세포를 현미경하에서 관찰하였다 (도 9의 A).
상기 분석 결과, 브라질레인의 농도변화에 따라 VEGF에 의해 유도된 HUVEC 이동에 의한 상처 회복(wound healing)이 감소됨을 알 수 있었다 (도 9의 B).
<실험예 6> VEGF 유도 ERK 인산화 억제 효능
브라질레인이 VEGF에 의해 유도되는 ERK 인산화에 어떠한 영향을 미치는지 알아보기 위하여 웨스턴 블랏(western blot) 분석을 수행하였다 (도 10).
60 mm 플레이트를 2% 젤라틴으로 코팅한 후에 HUVECs을 80~90%로 접종한 다음, 다음날 1% M199 배지로 6시간동안 기아상태(starvation)를 만들었다. 기아 상태가 된 후, 브라질린, 사판칼콘, 브라질레인을 농도별로 (1 ng/ml, 10 ng/ml, 100 ng/ml, 1 ㎍/ml, 10 ㎍/ml) 30분 동안 전처리한 후에 VEGF (10 ng/ml)를 10분 동안 처리하였다. 그런 다음 세포를 2×SDS PAGE 샘플 버퍼(24 mM Tris-HCl, pH 6.8, 5 % glycerol, 0.8 % SDS, 6 mM 2-mercaptoethanol, 0.04% bromophenol blue)로 용해(Lysis)하였다. 용해된 샘플을 바로 10분 동안 끓인 후 SDS-PAGE를 수행하여 항(anti)-phospho-ERK 항체를 이용하여 웨스턴 블랏(western blot) 분석을 수행하였다.
도 10은 브라질린, 사판칼콘, 브라질레인의 농도에 따른 ERK의 인산화 정도를 보여주는 그림으로 브라질린, 사판칼콘, 브라질레인은 VEGF에 의해서 유도되는 ERK의 인산화를 억제하지 않는다는 것을 확인할 수 있었다.
이는 소목 추출물 및 이의 유효성분들이 VEGF 에 의한 ERK 인산화 경로가 아닌 다른 경로 또는 다른 타겟에 관여하여 혈관신생을 억제한다는 것을 의미한다.
<
실험예
7> 동물에서의 혈관 신생 억제 효과(마우스
마트리젤
모델)
상기 실시예에서 분리한 소목 메탄올 추출물, 사판칼콘 및 브라질레인의 혈관신생 억제 효과를 알아보기 위해서 마우스-마트리젤(Mouse-Matrigel) 모델을 이용하여 분석하였다 (도 11 및 도 12).
6 ~ 8 주령된 C57BL/6 마우스(mouse)(Japan SLC, Inc., Japan)에 마트리젤(BD biosciences, USA) 0.4 ㎖와 혈관신생 유도인자인 염기성 FGF (Fibroblast Growth Factor) 50 ng/㎖ 및 헤파린 (Sigma-Aldrich Co., USA) 50 unit/㎖을 혼합하여 피하 주사하였다. 3~5일 후 표피를 제거하여 마트리젤을 조심스럽게 분리하여 젤을 회수한 후, 혈액에서 총 헤모글로빈 양을 측정하는 시약인 드랩킨 시약 (Drabkin's reagent, Sigma)을 이용하여 헤모글로빈 양을 측정하고, 이를 대조군으로 사용하였다.
또한, 소목 메탄올 추출물을 10 % 에탄올에 녹여 1.5 mg씩 1일 2회 경구투여하였으며, 대조군의 경우에는 같은 양의 10% 에탄올을 1일 2회 경구투여하였다. 브라질레인 (0.5mg, 1mg), 사판칼콘 (0.2mg, 0.5mg)도 소목 메탄올 추출물과 동일하게 10% 에탄올에 녹여 1일 2회 경구투여하였다. 4일간 복용한 후에 헤모글로빈 함량을 측정하여 대조군과 비교하였다.
소목 메탄올 추출물을 투여한 군을 대조군과 비교한 결과 약 33.3 %의 혈관 신생 억제 효과를 나타내었다 (표 3, 도 11). 더불어, 사판칼콘을 투여한 군은 대조군에 비해 0.2 mg 투여시 약 70 %, 0.5 mg 투여시 41.7 % 혈관신생 억제 효과가 나타났으며, 브라질레인을 투여한 군은 대조군에 비해 0.5 mg 투여시 58.6 %, 1.0 mg 투여시 96.4 % 억제 효과를 나타내었다 (표 4, 도 12).
상기와 같이 소목 메탄올 추출물, 사판칼콘 및 브라질레인을 투여하였을 때 헤모글로빈 함량이 낮게 나타났으며, 특히 브라질레인의 혈관 신생 억제 활성이 유의성을 나타내었다.
시료 |
헤모글로빈 함량(g/dL) |
억제율(%) |
대조군 |
759±317 |
|
소목 메탄올 추출물 |
1.5mg/mouse |
506±489 |
33.3 |
시료 |
헤모글로빈 함량(g/dL) |
억제율(%) |
대조군 |
415±314 |
|
사판칼콘 |
0.2 mg/mouse |
124±62 |
70.1 |
0.5 mg/mouse |
242±476 |
41.7 |
브라질레인 |
0.5 mg/mouse |
172±223 |
58.6 |
1.0 mg/mouse |
15±12 |
96.4 |
<제제예 1> 환제의 제조
실시예 2-2의 브라질레인 120mg
옥수수 전분 100mg
멸균증류수 적량
상기의 성분을 혼합하고, 통상의 환제 제조방법으로 0.3cm 지름으로 제환하여 환제를 제조한다.
<제제예 2> 정제의 제조
실시예 2-3의 사판칼콘 200mg
유당 100mg
전분 100mg
스테아린산 마그네슘 적량
상기의 성분을 혼합하고 통상의 정제의 제조방법에 따라 타정하여 정제를 제조한다.
<제제예 3> 액제의 제조
실시예 1의 소목 추출물 1000mg
설탕 20g
이성화당 20g
레몬향 적량
정제수를 가하여 전체 1000㎖로 맞추었다. 통상의 액제 제조 방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 갈색병에 충전하고 멸균시켜 액제를 제조한다.
<제제예 4> 건강음료의 제조
실시예 1의 소목 추출물 1000mg
구연산 1000mg
올리고당 100g
매실농축액 2g
타우린 1g
정제수를 가하여 전체 900㎖로 맞추었다. 통상의 건강음료 제조 방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다. 상기 조성비는 비교적 기호 음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 수요 계층, 수요 국가, 사용용도등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.