CN102670578B - 原苏木素b作为制备抗膀胱癌灌注液的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及原苏木素B的用途，具体是一种浓度为0.2-2.4%的原苏木素B溶液作为制备抗膀胱癌灌注液的应用。本发明为了填补国内外对原苏木素B的研究空白，提供了原苏木素B的一种新用途。本发明将人膀胱癌细胞株T24、小鼠膀胱癌细胞株BTT接种于小鼠体内形成膀胱癌，对小鼠分组后分别给予注射用水、丝裂霉素、原苏木素B进行实验；实验结果表明给予丝裂霉素、原苏木素B的小鼠生命延长，瘤重减小，具有抑瘤效果；说明原苏木素B有显著的抑制膀胱癌的作用，可广泛适用于制备抗膀胱癌灌注液。
Description
技术领域
本发明涉及原苏木素B的用途，具体是一种浓度为0.2-2.4%的原苏木素B溶液作为制备抗膀胱癌灌注液的应用。
背景技术
苏木（Caesalpinia sappan Linn.），又名苏枋、芳方木、苏方，为小乔木，花期5-10月，果期7月至翌年3月。我国云南、贵州、四川、广西、广东、福建和台湾省都有栽培苏木，它原产印度、缅甸、越南、马来半岛及斯里兰卡。目前，从苏木中已分离到多种化学成分，根据成分的骨架类型，可将其分成5个部分：苏木素类、原苏木素类、高异黄酮类、苏木查尔酮、以及苯丙素类。原苏木素类有原苏木素A、原苏木素B、10-O-甲基原苏木素B、异原苏木素B、10-O-甲基异原苏木素B、以及由苏木素类成分与原苏木素类成分聚合形成的原苏木素E1和原苏木素E2；苏木中还分离到二苯类化合物：苏枋木酚、云实品P、（±）-南烛树脂醇；除以上化合物外，苏木中还含有丁香脂素以及谷甾醇等60余种化合物。
苏木总提取物具有动物体内抗肿瘤活性。任连生等用1ml含1g原药材的苏木水剪液进行EAC、P388、和L1210荷瘤小鼠抑瘤实验，每日腹腔注射，连续7天，0.2ml剂量组EAC、P388和L1210小鼠平均延长生存期分别为185%、107.8%和117.5%（任连生、徐建国、马俊英等在中国中药杂志上发表的苏木抗癌作用的研究，1990.15(5): 50-51；徐建国、马俊英、任连生等在中国中药杂志上发表的苏木煎液抗小鼠白血病作用的研究，1991.16(5):306）。
原苏木素B可直接从市场中购得，为固态药物，其结构式如下：
国内关于原苏木素B的研究报导仅见于中药苏木质量标准建立时作为标准品的使用（中国中药杂志，2010.35(16)：2068-2070）；日本学者Sasaki Y等研究发现原苏木素B有抑制亚油酸氧化的作用（Biol Pharm Bull, 2007.30(1):193-196）；Washiyama M 等报道了原苏木素B等苏木提取物具有良好的抗炎作用（Biol Pharm Bull 2009.32(5):941-944）；目前国内外还没有对原苏木素B更多的研究报道出现。
发明内容
本发明为了填补国内外对原苏木素B的研究空白，提供了原苏木素B的一种新用途，具体是浓度为0.2-2.4%的原苏木素B溶液作为制备抗膀胱癌灌注液的应用。
本发明采用人膀胱癌细胞株T24、小鼠膀胱癌细胞株BTT进行实验，在两种细胞株中均加入原苏木素B并将两种细胞株中均加入水作为对照组；实验结果表明加入原苏木素B的人膀胱癌细胞株T24、小鼠膀胱癌细胞株BTT中的细胞20分钟内就接近全部死亡而对照组中的细胞数呈波动趋势，说明原苏木素B对膀胱癌细胞具有显著的杀伤作用。同时将人膀胱癌细胞株T24、小鼠膀胱癌细胞株BTT接种于小鼠体内形成膀胱癌，对小鼠分组后分别给予注射用水、丝裂霉素、原苏木素B进行实验；实验结果表明给予丝裂霉素、原苏木素B的小鼠生命延长，瘤重减小，具有抑瘤效果；说明原苏木素B有显著的抑制膀胱癌细胞作用，可广泛适用于制备抗膀胱癌灌注液中。
具体实施方式
实施例1：下面用原苏木素B对膀胱癌细胞的杀伤作用实验说明其在制药领域的新用途：
1、实验细胞及药物：
细胞株：人膀胱癌细胞株T24，购自中科院上海生命科学研究院；小鼠膀胱癌细胞株BTT，山西医科大学第一附属医院泌尿外科杨晓峰主任惠赠；
原苏木素B：用注射用水配制成浓度为0.4%的药液，高压灭菌；
台盼蓝染液。
2. 实验方法：
（1）消化、收集细胞、1000rp/5min离心，人膀胱癌细胞株T24、小鼠膀胱癌细胞株BTT分别用注射用水调整细胞浓度为2× 
/ml。
（2）原苏木素B组在离心管中加入T24细胞悬液500μL，采用倍比稀释的方法向T24细胞悬液中加入500μL原苏木素B溶液，使原苏木素B终浓度为0.2%；对照组在离心管中加入T24细胞悬液500μL后加入500μL注射用水。在37℃、5%CO2条件下的培养箱中进行培养，0分钟作为基本对照；分别于药物作用20min、40min、60min、80min、100min时，各组分别取100μl 的细胞悬液，加等量的台盼蓝染色计数细胞，置100倍光学显微镜下计数4个大格内的细胞总数，分别计数活细胞（未着色的细胞）和死细胞（染成蓝黑色的细胞）数，按如下公式计算细胞死亡率：细胞死亡率=死细胞数/（死细胞数+活细胞数）×100%。
（3）采用上述方法观察原苏木素B对BTT细胞的杀伤作用。
3. 实验结果：
如下表1所示，加入原苏木素B的膀胱癌细胞20分钟内就会接近全部死亡而对照组中的细胞数呈波动趋势；说明原苏木素B对膀胱癌细胞具有显著的杀伤作用。
实施例2：下面通过小鼠的生存时间观察丝裂霉素、不同剂量的原苏木素B对T739小鼠腹腔接种BTT细胞后的抑瘤作用。
1. 实验材料
实验动物：T739小鼠，50只，雌性，体重24~36g；由山西省肿瘤研究所动物实验室提供，生产许可证号为SCXK(晋）2007-0001。
实验细胞：小鼠膀胱癌细胞株BTT，由山西医科大学泌尿外科杨晓峰教授惠赠。
实验药物：丝裂霉素（常用的抗癌西药），浙江海正药业股份有限公司，批号100401；原苏木素B：批号：20101010-2。
2. 实验方法：
（1）接种：无菌条件下，将BTT实体瘤研磨，用生理盐水制成细胞悬液，调节浓度至5×106/ml，腹腔接种，每只0.2ml，即1×106/鼠。
（2）分组与给药
模型组，10只，注射注射用水0.2ml，每天1次，连续6天；
丝裂霉素组，10只，1mg/kg，隔天1次，共给三次；
原苏木素B低剂量组，10只，100mg/kg，使用时用注射用水配制成浓度为0.5%的药液，每天1次，连续6天；
原苏木素B中剂量组，10只，200mg/kg，使用时用注射用水配制成浓度为1%的药液，每天1次，连续6天；
原苏木素B高剂量组，10只，300mg/kg，使用时用注射用水配制成浓度为1.5%的药液，每天1次，连续6天；
（3）观察：观察时间为60天，记录动物的生存时间，生存时间超过60天时按60天计算，观察期间每5天称重一次，观察小鼠的体重变化。
3. 实验结果：
实验结果表明小鼠成瘤率100%；如下表2所示，与模型组相比，丝裂霉素组、不同剂量的原苏木素B组的小鼠都极大地延长了荷瘤T739小鼠的生存时间，抑制了BTT细胞；而且原苏木素B的使用剂量在200mg/kg时，效果最好。
实施例3：
1、实验材料：
实验细胞：人膀胱癌T24细胞株引自中科院上海生命科学研究院。T24细胞株以含10%胎牛血清的RPMI-l640培养基培养，实验选用处于对数生长期的细胞，以含有EDTA的胰酶消化，台盼蓝拒染法测定细胞活力，融合PBS缓冲液（磷酸盐缓冲液）制成浓度为1×
/ml的细胞悬液。
实验药物：原苏木素B，批号：20101010-2；丝裂霉素，常用的抗癌药物，为浙江海正药业股份有限公司生产，规格2mg/支，生产批号：110716。
实验动物：雌性BALB/C裸鼠60只，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，SPF级，7~9周龄，体重20g~22g，饲养于万级净化屏障环境，饲养条件23℃±2℃、40%~60%湿度，空气流速0.1m/s~0.2m/s，15LX~20LX照明、12小时（昼）/12小时（夜）交替，饲料为经60Co辐射灭菌的全价营养饲料、垫料经辐射灭菌。
2、建立原位膀胱移植瘤动物模型
2.1 偏角针的制备
24#静脉留置针(由Becton Dickinson Infusion Therapy Systems, Inc生产) ，取出针芯，在距针尖15mm处将针芯折约5-7度的偏角，旋转针芯时针尖处可形成Φ=2.61-3.66 mm的圆。
∵sinA=a / c ∴a=c · sinA
∵c = 15 mm，sinA1=sin5o = 0.087，sinA2=sin7o = 0.122
∴a1=0.087×15 mm=1.305，a2 = 0.1218 × 15 mm = 1.83 mm
∴Φ1 = 2a1 = 2.61，Φ2 = 2a2 = 3.66
2.2 膀胱瘤细胞原位接种方法
将小鼠腹腔内注入戊巴比妥钠60mg/kg进行麻醉，实验室温度为28℃±2℃；小鼠下腹部常规消毒，24#静脉留置针的套管外涂以液体石蜡，经尿道口缓慢插入小鼠膀胱腔内，抽出尿液，将带有偏角的针芯缓慢插入套管中，一手固定套管，另一手转动针芯6周，拔出针芯，立即注入100μl T24膀胱瘤细胞悬液，拔出套管，待动物自然苏醒即可。模型组小鼠插管后不插入针芯损伤膀胱粘膜，直接将100μl T24细胞悬液注入小鼠膀胱腔内。
3、实验方法：
3.1 将60只BALB/C裸鼠接种后24h随机分组，并分别进行膀胱腔内灌注给药；分为3个组，每组20只，即模型组、丝裂霉素组、原苏木素B组。模型组每天给予生理盐水；丝裂霉素组给予浓度为0.26mg/ml的丝裂霉素，每只给予100μl，第1、6d给药，共2次；原苏木素B组给予浓度为2.4%的原苏木素B药液，每只给予100μl，每隔1d给药1次，共5次。
3.2 观察动物的生长情况，定期称量动物体重，检查有无血尿及膀胱部位的肿瘤形成情况。记录动物的生存时间，以观察期限为60天， 60天后将全部动物麻醉解剖，观察膀胱肿瘤，检测各组膀胱肿瘤的大小，测定膀胱湿重、进行组间比较，按以下公式求出肿瘤抑制率和生命延长率：
肿瘤抑制率=[1－(给药组平均瘤重/对照组平均瘤重)]×100%。
生命延长率=(实验组平均生存天数-对照组平均生存天数)/对照组平均生存天数×100%。
4、实验结果：
实验结果表明模型组接种细胞后第29d开始出现死亡，其他动物则出现不同程度的消瘦，死亡后解剖发现小鼠膀胱腔内均形成肿瘤，成瘤率100%，平均生存时间39.83±10.94d。丝裂霉素组接种细胞后第26d开始出现死亡，第33d动物出现不同程度的消瘦，死亡后解剖发现小鼠膀胱腔内均形成肿瘤，肝脏均可见转移，成瘤率100%，平均生存时间37±9.96d。原苏木素B组接种细胞后，第30d出现死亡，其他动物则出现不同程度的消瘦，死亡后解剖可见膀胱瘤块或膀胱壁增厚，平均生存时间43.33±11.94。如下表3所示，原苏木素B组与对照组比较差异显著，说明原苏木素B可以有效抑制膀胱肿瘤。
Claims (1)
1.浓度为0.2-2.4%的原苏木素B溶液作为制备抗膀胱癌灌注液的应用。
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