KR20130105771A - 이나무 열매 추출물 또는 그로부터 분리된 화합물을 포함하는 지방생성 억제용 조성물 - Google Patents
이나무 열매 추출물 또는 그로부터 분리된 화합물을 포함하는 지방생성 억제용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 이나무 열매의 추출물, 그의 분획물 또는 그로부터 분리된 단일 화합물을 유효성분으로 함유하는 지방세포 분화 억제용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 지방전구세포의 지방세포로의 분화를 억제하여 피하 또는 내장지방의 지질 축적을 저해하므로, 비만 또는 이상지질혈증, 고지혈증, 동맥경화, 간지방증, 비알코올성 지방간, 2형 당뇨병, 인슐린 저항성, 대사 증후군과 같은 지질 대사 이상에 기인한 질환의 예방 또는 치료 용도로 광범위하게 응용될 수 있다.
Description
본 발명은 이나무 열매 추출물 및 그로부터 분리한 화합물의 의약학적 및 식품학적 용도에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 이나무 열매로부터 분리된 메틸 1-히드록시-6-옥소-2-시클로헥센카르복실레이트(1-hydroxy-6-oxo-2-cyclohexenecarboxylate)를 모핵으로 하는 화합물을 유효성분으로 포함하는 지방세포 분화 억제용 조성물 및 이를 이용한 비만 등 지질 대사 질환의 예방, 개선 및 치료와 관련된 것이다.
비만은 내분비적 요인, 유전적 요인, 사회환경적 요인 등에 의해 상기 과정의 불균형이 발생하는 경우, 체내에 과잉된 에너지가 지방으로 축적됨으로써 야기되는 피하지방 조직의 이상 비대화에 기인한다. 지방조직의 비대화는 지방세포의 크기가 커지거나(지방세포 비대화) 그 수가 증가하는(지방세포 과형성) 현상으로, 이는 국소 정맥-림프 체계의 정체에도 영향을 미쳐 진피-피하 조직의 혈관조직 질환도 유발할 수 있다. 비만은 그 자체로서 독립된 질병으로 인식되며, 세계보건기구에서는 비만을 세계적인 영양문제로 다루어 건강을 해치는 단순 위험인자가 아닌 치료해야 할 질병으로 인식하고 있다.
또한, 비만은 심혈관계 질환, 2형 당뇨, 인슐린 저항성 증후군 등의 대사성 질환, 호흡기 질환, 골관절염 등의 합병증을 유발한다는 점에서 각종 성인성 질병의 위험인자가 된다 (Antipatis V. J. et al., 2001, Obesity as a global problem. In International textbook of obesity. Per Bjorntorp, ed. John Wiley & Sons Ltd, Chichester, UK. p3-22). 비만 환자에게는 혈액 내의 콜레스테롤 및/또는 중성지방의 양이 증가하는 고지혈증이 빈번하게 수반되고, 이는 고혈압, 심혈관계 질환, 뇌졸중 및 지방간 등의 발생 위험을 증가시킨다. 또한, 말초조직 [Kelley & Mandarino, A reexamination. Diabetes, 49:677-683(2000)]과 복부 지방조직에서의 중성지방 축적 [Kelley et al., Am. J. physiol., 278:E941-E948(2000)]의 증가로 인슐린 저항성이 유발되어 제2형 당뇨병 및 대사 증후군을 발생시킬 수 있다. 따라서, 비만에 대한 관리 및 치료는 비만 자체뿐만 아니라 상기 합병증의 예방 또는 치료 차원에서도 의미가 있다.
현재 비만 치료제는 작용기전에 따라, 중추 신경계에 작용하여 식욕에 영향을 주는 약제와 위장관에 작용하여 흡수를 저해하는 약제로 분류될 수 있다. 중추 신경계에 작용하는 약물로는 세로토닌 (5-HT) 재흡수를 억제하는 펜플루라민과 덱스펜플루라민, 노르아드레날린 재흡수를 억제하는 에페드린 및 카페인, 및 최근에는 세로토닌과 노르아드레날린 신경계에 동시 작용하는 시부트라민 등이 있다. 위장관에 작용하여 비만을 저해하는 약물로는, 췌장에서 생성되는 리파이제를 저해하여 지방의 흡수를 줄여줌으로써 비만 치료제로 허가된 오를리스타트(orlistat)가 있다 (Birari 및 Bhutani., 2007). 그러나, 기존에 사용된 약물 중. 식욕억제제인 펜플루라민은 마약성분으로 분류되었을 뿐 아니라 원발성 폐고혈압이나 심장 판막 병변과 같은 부작용을 일으켜 사용이 금지되었으며, 다른 식욕억제 약물들도 혈압 감소 또는 유산 산증을 발생시킬 수 있어 심부전, 신장 질환 환자에는 사용이 제한되고 있다. 지방분해 억제제인 오를리스타트도 위장관 부작용을 일으켜 불쾌감을 유발하고 지용성 비타민의 흡수를 저해하며, 미국 FDA에 장기적 비만치료를 목적으로 승인받은 시부트라민은 심계 항진과 같은 심혈관계 질환 또는 현기증 등을 초래하여 시판이 금지되었다.
상기 약물들의 부작용을 줄이고 보다 근본적인 비만의 예방 및 억제를 위한 대안으로서 제시되고 있는 것 중 하나가 지방세포 분화 억제제이다. 1990년대 초반까지 지방 조직은 주로 지방세포로 구성되어 인체에 필요한 에너지를 중성지방의 형태로 저장하고, 필요시 이를 분해하여 이용하도록 하는 에너지 저장소로만 생각되어 왔다. 그러나, 1990년 중반 이후, 지방 조직은 단순한 에너지 저장소가 아닌, 다른 조직에 영향을 줄 수 있는 물질들을 분비하는 내분비기관으로서의 기능을 수행한다는 것이 밝혀졌다. 현재 밝혀진 분비 물질로, TNF-α, IL-6, IL-8, 플라스미노겐 활성화제 억제제-1, 안지오텐신-Ⅱ, 렙틴(leptin) 및 아디포넥틴(adiponectin) 등이 있으며, 이들은 각종 대사성 질환 및 심혈관 질환을 야기하는 것으로 알려졌다 [Proc, Nutl, Soc., 64, 163-169 (2005)]. 지방 조직에서의 에너지 저장 및 내분비 물질 분비는 지방세포의 분화 및 성장과 밀접한 관련이 있으며, 지방생성 과정과 동시적으로 발생한다. 지방세포의 성장은 지방세포 수에는 변화가 없이, 분화된 지방세포에 중성지방이 축적되어 비대형 지방세포가 형성되는 과정으로서, 비대형 지방세포 증가로 인한 비만은 성인에서 빈번하며 식이요법으로 조절가능하다. 반면, 지방세포 분화에 의한 비만은 소아 또는 고도 비만에서 주로 나타나며, 식이요법으로 조절이 어려우므로 지방전구세포의 지방세포로의 분화를 차단하는 것이 중요하다. 따라서, 지방세포의 분화를 저해하여 생성되는 지방세포 수를 조절하고, 그에 따라 축적되는 여분의 에너지를 조절할 수 있는 약물의 연구 개발이 진행되고 있다.
지방세포 분화 또는 지방생성(adipogenesis)은 지방전구세포가 증식하고 이들이 성숙한 지방세포로 분화되면서 중성 지방이 축적되는 과정을 의미하며, 비만, 당뇨병, 지방간, 심장 질환과 같은 질환을 유발하는 위험 요인으로 알려져 있다. 지방세포는 골수 내의 다분화능 중간엽 줄기세포로부터 분화되며 (Caplan, 2001 #151; Pittenger, 1999 #83), 이 과정은 인슐린이나 인슐린 유사 성장인자-1(IGF-1), 성장 호르몬 등이 지방전구세포에 작용하여 CAAT 인핸서 결합 단백질 (C/EBP), 퍼옥시좀-활성화 수용체 γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ, PPARγ)와 같은 전사인자들을 활성화시킴으로서 조절된다. 특히, 핵 수용체인 PPARγ은 지방세포 분화에 핵심적인 역할을 하며, PPARγ 결핍시 지방조직이 생성되지 않고, PPARγ의 이소성(ectopic) 과발현은 섬유아세포로부터 지방세포 분화를 유도한다.
산화질소(nitric oxide, NO)는 자유 라디칼 분자로서 병원성 염증, 세포 증식 및 분화를 포함한 다수의 생물학적 기능을 수행한다. NO는 3T3-L1에서 지방전구세포 분화를 억제하는 것으로 보고되었다 (Kawachi, 2007 #1971). NO는 3가지 NO 신타아제(NOS) 이형인, 신경 NOS(nNOS), 유도성 NOS(iNOS), 및 내피 NOS(eNOS)에 의해, L-아르기닌으로부터 합성된다. 이들 중 eNOS 및 iNOS가 지방조직에서의 NO 생성에 관여하며, 특히 iNOS mRNA는 인 비트로 지방생성 분화에서 현저한 수준으로 발현되는 것으로 나타났다. 또한, iNOS 발현은 비만 및 당뇨 동물 모델, 제2형 당뇨 환자의 지방 조직, 근육 및 간에서 유의하게 증가하였으며 Perreault, 2001 #1959; Fujimoto, 2005 #1973; Dallaire, 2008 #1972), iNOS가 결핍된 비만 생쥐는 PPARγ 효능제의 대사 작용에 대해 감응성을 보였다 (Torres, 2004 #1977).
이나무 (Idesia polycarpa Maxim.)는 이나무과 (Flacourtiaceae)에 속하는 낙엽교목으로 높이가 15m에 달하고 우리나라 내장산 이남 산지의 숲속에서 자생하며, 일본, 중국, 대만 등에 분포한다. 열매는 장과로서 둥글고 주황색으로 익으며 남천의 열매와 비슷하다. 종자는 10개로 달걀을 거꾸로 세워놓은 모양이며 고동빛이다. 한방에서는 이나무의 씨를 산동자라 하여 살충제로 쓰였고, 산동엽이라 불리는 잎은 지혈작용이 있다고 알려져 왔다 (Kim et al., 2005). 이나무의 성분으로 페놀성 글리코시드(phenolic glycoside) 계열의 이데신(idesin), 살리레핀(salirepin), 페나진(phenazine) 유도체 계열, 및 특히 이나무 열매에서 이데솔리드(idesolide), 카르팔리드(carpalide), 이데솔리딘(idesolidine) 등의 성분들이 분리 및 보고되었다. 이들의 활성과 관련하여, 멜라닌 생성 저해 활성 (Baek et al., 2006), 해마의존성 재인 기억 향상 효과 (Lee et al., 2008), C2C12 근육세포주에서 세포내 HSP 70의 유도를 통한 세포사멸 저해 활성 (Jung et al., 2010) 등에 대한 연구가 수행되었다. 그러나, 이나무 열매로부터 지방전구세포의 분화를 억제하는 활성과 관련된 성분 연구는 보고된 바 없다.
이에 본 발명자들은 이나무 추출물로부터 지방전구세포의 분화를 억제하는 활성을 갖는 물질을 활성지향적 분리기법을 통해 분리하고 그 화학 구조를 동정하여, 비만 등 지질 대사성 질환에 사용하기 위한 새로운 활성 성분을 규명하였다.
본 발명의 목적은, 안전하고 효과적인 비만 및 기타 지질대사 관련 질환의 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물을 제공하는 것이다. 구체적으로 본 발명은, 지방세포의 분화를 억제함으로써 종래 식욕억제제, 흡수저해제 등에 비해 부작용이 적고 항비만 효과가 우수하며, 자극성 및 독성을 나타내지 않는 천연물 유래의 유효 성분을 함유하는 약학적 조성물 및 건강기능성 식품 조성물을 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 지방세포 분화 억제 활성을 갖는, 하기 화학식 Ⅰ 또는 화학식 Ⅱ의 화합물, 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 유효성분으로 포함하는, 비만 및 기타 지질대사 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
- 식 중, R은 H, 4-히드록시-페닐 β-D-글루코피라노시드, 또는 6-히드록시-페닐 β-D-글루코피라노시드로부터 선택된다.
본 발명은 또한 상기 화학식 Ⅰ 또는 화학식 Ⅱ의 화합물을 다량으로 함유하는, 이나무 열매의 C1-C4 알코올 추출물, 그의 CHCl3 분획물, EtOAc 분획물 또는 n-부틸알코올 분획물을 포함하는 비만 및 기타 지질대사 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 이나무 열매의 추출물 또는 분획물을 포함하는 조성물의 제조 방법을 제공한다.
또한 본 발명은, 상기 화합물, 추출물 또는 그의 분획물을 포함하는 비만 및 기타 지질대사 관련 질환의 예방 또는 개선용 기능성 식품 조성물을 제공한다.
본 발명의 화합물인 메틸 1-히드록시-6-옥소-2-시클로헥센카르복실레이트, 그의 이합체인 (-)-이데솔리드, 및 이들의 유도체들은 지방전구세포의 지방세포로의 분화를 저해하고 그에 의해 지방생성을 감소시키므로, 비만 및 지질 대사 이상으로 야기되는 기타 질환에 대한 예방 및 치료 효과를 나타낸다. 또한 상기 화합물들은 천연 유래 성분을 사용하여 통상의 복용량에서 인체에 무해하고 독성 및 자극성을 유발하지 않는다. 따라서, 상기 화합물 또는 이들을 다량으로 함유하는 이나무 추출물을 포함하는 본 발명의 조성물은 비만, 고지혈증, 이상지질혈증, 동맥경화, 간지방증, 2형 당뇨병, 대사 증후군 등의 질환을 예방, 개선 또는 치료하기 위한 약학적 조성물 또는 기능성 식품 조성물로서 사용될 수 있다.
도 1은 실시예 1에 따라 이나무 열매로부터 총 메탄올 추출물 및 그의 n-헥산, CHCl3, EtOAc, n-부탄올 분획물을 얻는 과정을 도식화한 개략도이다.
도 2는 실시예 2-1에 따라 이나무 추출물의 CHCl3 분획으로부터 활성 화합물을 분리하는 과정을 도식화한 개략도이다.
도 3은 실시예 2-2에 따라 이나무 추출물의 n-부탄올 분획으로부터 활성 화합물을 분리하는 과정을 도식화한 개략도이다.
도 4는 실시예 2에서 이나무 추출물로부터 분리하여 동정한 화합물(1~14)들의 구조를 나타낸 것이다.
도 5는 실험예 1에 기술된 바와 같이, 3T3-L1 세포주에 이나무 열매의 총 추출물 및 그의 n-헥산, CHCl3, EtOAc, n-부탄올 분획물을 농도별로 (10, 50 및 100 ㎍/mL) 처리한 경우 지방세포로의 분화에 미치는 효과를 도시한 그래프이다 (ctrl: 음성대조군(미분화군), diff.ctrl: 양성대조군(분화유도군), T: 총 추출물 처리군, H: n-헥산 분획물 처리군, C: CHCl3 분획물 처리군, EA: EtOAc 분획물 처리군, B: n-부탄올 분획물 처리군, W: 물 분획물 처리군) (대조군 대비 *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001).
도 6은 실험예 2에 기술된 바와 같이, 3T3-L1 지방세포주에 이나무 추출물로부터 분리한 화합물 1 내지 7, 12, 14 및 1-히드록시-6-옥소-2-시클로헥산 메틸 에스테르 (10, 50 및 100 ㎍/mL)를 처리한 경우 농도별로 지방세포로의 분화에 미치는 효과를 도시한 그래프이다 (ctrl: 음성대조군(미분화군), diff.ctrl: 양성대조군(분화유도군)) (대조군 대비 *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001).
도 7은 실험예 2에 기술된 바와 같이, 3T3-L1 세포주에 화합물 1(이데솔리드), 4(이데스카르핀), 5(폴리오트리신) 및 14(비스이데스카르핀)를 농도별로 (10, 50 및 100 ㎍/mL) 처리한 후, 오일 레드 오 염색에 의해 지방세포로의 분화 정도를 관찰한 현미경 사진이다.
도 8 및 9는 실험예 3-1에 따라, C3H10T1/2 세포주 및 인간 중간엽 줄기세포주의 분화유도 배지에 이데솔리드를 처리한 후, 오일 레드 오 염색에 의해 지방세포로의 분화 정도를 관찰한 현미경 사진이다.
도 10은 실험예 3-2에 따라, C3H10T1/2 세포에 이데솔리드를 농도별로 처리하여 지방세포 분화를 유도한 경우, 세포 용해물 중 PPARγ mRNA의 발현수준을 웨스턴 블롯에 의해 분석한 사진이다.
도 11은 실험예 3-3에 따라, C3H10T1/2 세포 및 인간 중간엽 줄기세포에 이데솔리드 10 ㎍/mL의 존재 또는 부재하에 지방세포 분화를 유도한 경우, qRT-PCR에 의해 지방생성 마커 유전자 (aP2, PPARγ, 아디포넥틴 및 C/EBPα)의 상대적 유도 수준을 측정한 그래프이다.
도 13은 실험예 3-4에 따라, aP2 프로모터를 갖는 루시퍼라제 리포터 구조물 및 PPARγ 발현 벡터로 형질감염된 293T 세포에 이데솔리드 (0, 1, 5, 및 10 ㎍/mL)를 처리한 경우 농도별 루시퍼라제 활성을 도시한 그래프이다 (대조군 대비 * P <0.01).
도 14는 실험예 4-1에 따라, C3H10T1/2 세포에 이데솔리드 10 ㎍/mL를 처리하여 지방세포 분화를 유도하고 1일 및 2일 후, 산화질소로부터 생성된 아질산염 농도를 측정한 그래프이다 (대조군 대비 * P <0.01).
도 15는 실험예 4-2에 따라, C3H10T1/2 세포에 이데솔리드 10 ㎍/mL의 존재 또는 부재 하에 지방세포 분화를 유도한 경우, qRT-PCR에 의해 iNOS 유전자의 상대적 유도 수준을 측정한 그래프이다 (대조군 대비 * P <0.01).
도 16은 실험예 5-1에 따라, C3H10T1/2 세포에 이데솔리드 10 ㎍/mL의 존재 또는 부재 하에 아르기닌을 처리하여 지방세포 분화를 유도하고 1일 및 2일 후, 산화질소로부터 생성된 아질산염 농도를 측정한 그래프이다
도 17은 실험예 5-2에 따라, 아르기닌-유도 지방생성 분화에서 이데솔리드 처리 농도에 따른, C3H10T1/2 세포의 지방세포로의 분화 정도를 오일 레드 오 염색에 의해 관찰한 현미경 사진이다.
도 18 및 19는 실험예 5-3에 따라, C3H10T1/2 세포의 아르기닌-유도 지방생성 분화에서 이데솔리드 처리 농도에 따른 세포 용해물 중 지방생성 마커 유전자 (각각 aP2 및 아디포넥틴)의 상대적 발현 수준을 qRT-PCR에 의해 측정한 그래프이다.
도 20 내지 도 23은 실시예 2-3에서 동정된 대표적인 4가지 화합물에 대한 1H-NMR 스펙트럼 및 13C-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 2는 실시예 2-1에 따라 이나무 추출물의 CHCl3 분획으로부터 활성 화합물을 분리하는 과정을 도식화한 개략도이다.
도 3은 실시예 2-2에 따라 이나무 추출물의 n-부탄올 분획으로부터 활성 화합물을 분리하는 과정을 도식화한 개략도이다.
도 4는 실시예 2에서 이나무 추출물로부터 분리하여 동정한 화합물(1~14)들의 구조를 나타낸 것이다.
도 5는 실험예 1에 기술된 바와 같이, 3T3-L1 세포주에 이나무 열매의 총 추출물 및 그의 n-헥산, CHCl3, EtOAc, n-부탄올 분획물을 농도별로 (10, 50 및 100 ㎍/mL) 처리한 경우 지방세포로의 분화에 미치는 효과를 도시한 그래프이다 (ctrl: 음성대조군(미분화군), diff.ctrl: 양성대조군(분화유도군), T: 총 추출물 처리군, H: n-헥산 분획물 처리군, C: CHCl3 분획물 처리군, EA: EtOAc 분획물 처리군, B: n-부탄올 분획물 처리군, W: 물 분획물 처리군) (대조군 대비 *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001).
도 6은 실험예 2에 기술된 바와 같이, 3T3-L1 지방세포주에 이나무 추출물로부터 분리한 화합물 1 내지 7, 12, 14 및 1-히드록시-6-옥소-2-시클로헥산 메틸 에스테르 (10, 50 및 100 ㎍/mL)를 처리한 경우 농도별로 지방세포로의 분화에 미치는 효과를 도시한 그래프이다 (ctrl: 음성대조군(미분화군), diff.ctrl: 양성대조군(분화유도군)) (대조군 대비 *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001).
도 7은 실험예 2에 기술된 바와 같이, 3T3-L1 세포주에 화합물 1(이데솔리드), 4(이데스카르핀), 5(폴리오트리신) 및 14(비스이데스카르핀)를 농도별로 (10, 50 및 100 ㎍/mL) 처리한 후, 오일 레드 오 염색에 의해 지방세포로의 분화 정도를 관찰한 현미경 사진이다.
도 8 및 9는 실험예 3-1에 따라, C3H10T1/2 세포주 및 인간 중간엽 줄기세포주의 분화유도 배지에 이데솔리드를 처리한 후, 오일 레드 오 염색에 의해 지방세포로의 분화 정도를 관찰한 현미경 사진이다.
도 10은 실험예 3-2에 따라, C3H10T1/2 세포에 이데솔리드를 농도별로 처리하여 지방세포 분화를 유도한 경우, 세포 용해물 중 PPARγ mRNA의 발현수준을 웨스턴 블롯에 의해 분석한 사진이다.
도 11은 실험예 3-3에 따라, C3H10T1/2 세포 및 인간 중간엽 줄기세포에 이데솔리드 10 ㎍/mL의 존재 또는 부재하에 지방세포 분화를 유도한 경우, qRT-PCR에 의해 지방생성 마커 유전자 (aP2, PPARγ, 아디포넥틴 및 C/EBPα)의 상대적 유도 수준을 측정한 그래프이다.
도 13은 실험예 3-4에 따라, aP2 프로모터를 갖는 루시퍼라제 리포터 구조물 및 PPARγ 발현 벡터로 형질감염된 293T 세포에 이데솔리드 (0, 1, 5, 및 10 ㎍/mL)를 처리한 경우 농도별 루시퍼라제 활성을 도시한 그래프이다 (대조군 대비 * P <0.01).
도 14는 실험예 4-1에 따라, C3H10T1/2 세포에 이데솔리드 10 ㎍/mL를 처리하여 지방세포 분화를 유도하고 1일 및 2일 후, 산화질소로부터 생성된 아질산염 농도를 측정한 그래프이다 (대조군 대비 * P <0.01).
도 15는 실험예 4-2에 따라, C3H10T1/2 세포에 이데솔리드 10 ㎍/mL의 존재 또는 부재 하에 지방세포 분화를 유도한 경우, qRT-PCR에 의해 iNOS 유전자의 상대적 유도 수준을 측정한 그래프이다 (대조군 대비 * P <0.01).
도 16은 실험예 5-1에 따라, C3H10T1/2 세포에 이데솔리드 10 ㎍/mL의 존재 또는 부재 하에 아르기닌을 처리하여 지방세포 분화를 유도하고 1일 및 2일 후, 산화질소로부터 생성된 아질산염 농도를 측정한 그래프이다
도 17은 실험예 5-2에 따라, 아르기닌-유도 지방생성 분화에서 이데솔리드 처리 농도에 따른, C3H10T1/2 세포의 지방세포로의 분화 정도를 오일 레드 오 염색에 의해 관찰한 현미경 사진이다.
도 18 및 19는 실험예 5-3에 따라, C3H10T1/2 세포의 아르기닌-유도 지방생성 분화에서 이데솔리드 처리 농도에 따른 세포 용해물 중 지방생성 마커 유전자 (각각 aP2 및 아디포넥틴)의 상대적 발현 수준을 qRT-PCR에 의해 측정한 그래프이다.
도 20 내지 도 23은 실시예 2-3에서 동정된 대표적인 4가지 화합물에 대한 1H-NMR 스펙트럼 및 13C-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
일 양태에서, 본 발명은 메틸 1-히드록시-6-옥소-2-시클로헥센카르복실레이트를 모핵으로 갖는 하기 화학식 Ⅰ 또는 화학식 Ⅱ의 화합물, 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 유효성분으로 함유하는, 지방세포 분화 억제용 약학적 조성물을 제공한다.
- 식 중, R은 H, 4-히드록시-페닐 β-D-글루코피라노시드, 또는 6-히드록시-페닐 β-D-글루코피라노시드로부터 선택된다.
본 발명에 따른 지방분화 억제용 조성물은, 메틸 1-히드록시-6-옥소-2-시클로헥센카르복실레이트, (-)-이데솔리드, 및 이들의 말단 메틸이 4-히드록시-페닐 β-D-글루코피라노시드 또는 6-히드록시-페닐 β-D-글루코피라노시드로 치환된 유도체로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함한다. 본 명세서에서, 메틸 1-히드록시-6-옥소-2-시클로헥센카르복실레이트 및 그의 유도체는 화학식 Ⅰ로 표시되며, (-)-이데솔리드 및 그의 유도체는 화학식 Ⅱ로 표시된다 (R= H, 4-히드록시-페닐 β-D-글루코피라노시드 또는 6-히드록시-페닐 β-D-글루코피라노시드).
일 구체예에서, 상기 화합물은 하기 화학식 Ⅲ, Ⅳ, Ⅴ, Ⅵ 및 Ⅶ의 화합물 중 하나 이상일 수 있다.
바람직하게는, 상기 화합물은 화학식 Ⅲ으로 표시되는 (-)-이데솔리드이다.
본 발명의 화학식 Ⅲ 내지 Ⅵ의 화합물은 상기 화학식 Ⅶ의 화합물의 이합체, 유도체 또는 유도체의 이합체로서, 공통적으로 메틸 1-히드록시-6-옥소-2-시클로헥센카르복실레이트 구조를 모핵으로 갖는다. 구체적으로, 이데솔리드 (화학식 Ⅲ)는 메틸 1-히드록시-6-옥소-2-시클로헥센카르복실레이트 모노머 2개가 결합하여 생성된 이합체로서, 상기 모노머에 비해 화학적으로 안정하여 자연 상태에서는 이러한 이합체 형태가 주로 발견된다. 이데스카르핀 (화학식 Ⅳ) 및 폴리오트리신 (화학식 Ⅴ)은 상기 모노머의 말단 메틸기의 수소가 각각 6-히드록시-페닐 β-D-글루코피라노시드 또는 4-히드록시-페닐 β-D-글루코피라노시드로 치환된 유도체이다. 또한, 비스-이데스카르핀 (화학식 Ⅵ)은 이데스카르핀의 이합체에 해당한다.
본 발명자들은 국내외에서 자생하고 있는 약용 식물의 추출물을 대상으로 지방세포 분화 억제 활성을 가지며, 부작용 없이도 우수한 효과를 갖는 비만 치료용 물질에 대한 연구를 수행한 결과, 이나무 열매의 추출물이 상기 메틸 1-히드록시-6-옥소-2-시클로섹센카르복실레이트계 화합물에 기인한 지방세포 분화 억제 활성을 나타내는 것을 확인하였다. 특히, 이나무 열매 추출물로부터 분리된 단일 화합물 중, 우수한 지방세포 분화 억제 활성을 나타내는 화합물로서 상기 화학식 Ⅲ 내지 Ⅵ의 화합물을 동정하였다.
또한, 본 발명자들은 화학식 Ⅲ의 화합물 ((-)-이데솔리드)로부터 그의 모노머인, 하기 화학식 Ⅶ의 메틸 1-히드록시-6-옥소-2-시클로헥센카르복실레이트를 반합성하였으며, 상기 모노머 화합물 역시 우수한 지방세포 분화 억제 활성을 갖는 것을 확인하였다 (표 2 및 도 6 참조).
본 발명에서 유효성분으로 사용되는 화합물들은 이나무 등 상기 화합물을 다량으로 함유하는 식물로부터 추출 및 분리하거나, 또는 통상의 화학적 제조 방법에 의해 합성적으로 제조가능하다. 식물로부터 분리하여 얻는 경우, 상기 화합물들은 예를 들면, 후술되는 제조 방법에 의해 수득되는 이나무 추출물, 바람직하게는 이나무 열매 추출물로부터 크로마토그래피법에 의해 분리함으로써 수득될 수 있다. 합성적으로 제조되는 경우, Richardson 등에 의한, "Synthesis of methyl 1-hydroxy-6-oxo-2-cyclohexenecarboxylate, a component of salicortin and tremulacin, and the monomer of idesolide" (Lournal of organic chemistry, v.72 no.21 pp.8099-8102 (2007)), 및 Yamakoshi 등에 의한, "Total synthesis and determination of the absolute configuration of (-)-idesolide" (Organic letters, v.12 no.5, pp.980-983 (2010))에 기재된 방법을 참조할 수 있다.
상기 화합물들은 1개 이상의 카이랄 중심(chiral center)을 포함하므로, 거울상 이성질체, 부분입체 이성질체 및 절대 입체화학의 관점에서 (R)- 또는 (S)-로 정의되는 다른 입체 이성질체 형태를 생성할 수 있다. 본 발명의 조성물은 상기 화합물의 가능한 모든 입체 이성질체, 예를 들면 라세미 혼합물(racemic mixture), 광학적으로 순수한 형태 및 중간체 혼합물을 포함한다. 예를 들면, 화학식 Ⅰ의 화합물은 하나의 카이랄 중심을 포함하므로, 본 발명의 조성물은 상기 탄소에서의 원자 배치에 따라 (R)-이성질체, (S)-이성질체 및 이들의 라세미 혼합물을 사용하여 제조될 수 있다. 이와 같은 광학 활성 (R)- 및 (S)-이성질체는 카이랄 합성 단위체 또는 카이랄 시약으로 사용하여 제조되거나, 또는 혼합물을 통상의 기술로 분할하여 수득될 수 있다.
본 발명의 조성물에 있어서, 유효성분으로서 화학식 Ⅰ 또는 화학식 Ⅱ의 화합물의 약제학적 또는 식품학적으로 허용가능한 염을 이용할 수 있다. 이러한 염은 본 발명의 화합물의 비독성 무기 및 유기 염기 또는 산 부가염을 포함한다. 본 발명의 화합물은 특히, 히드록시기 또는 그와 유사한 기의 존재로 인해 산 및/또는 염기 염을 형성할 수 있다. 일 구체예에서, 적합한 무기 염기 부가염은 나트륨, 칼륨, 리튬, 칼슘, 마그네슘, 철, 아연, 구리, 망간, 알루미늄 염을 포함하나 이에 제한되지 않으며, 바람직하게는 칼륨, 나트륨, 칼슘 및 마그네슘 염과 같은 알칼리 금속염 또는 알칼리토 금속염이다. 또한, 적합한 유기 염기 염은 이소프로필아민, 트리메틸아민, 디에틸아민, 트리에틸아민, 트리프로필아민, 에탄올아민과 같은 1급, 2급 및 3급 아민염; 또는 메틸요오다이드, 메틸브로마이드, 에틸요오다이드, 에틸브로마이드 등의 저급 알킬할로게니드; 메틸메탄설포네이트, 에틸메탄설포네이트 등의 저급 알킬설포네이트; 메틸-p-톨루엔설포네이트 등의 저급 알킬아릴설포네이트와 같은 4급 암모늄염을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 또다른 구체예에서, 본 발명의 염은 바람직하게는 유리산에 의해 형성된 산 부가염(이염)일 수 있다. 적합한 산 부가염은 예를 들면, 아세테이트, 아디페이트, 아스파테이트, 벤조에이트, 베실레이트, 바이카보네이트/카보네이트, 바이설페이트/설페이트, 보레이트, 캄실레이트, 시트레이트, 사이클라메이트, 에디실레이트, 에실레이트, 포메이트, 퓨마레이트, 글루셉테이트, 글루코네이트, 글루쿠로네이트, 헥사플루오로포스페이트, 히벤제이트, 하이드로클로라이드/클로라이드, 하이드로브로마이드/브로마이드, 하이드로아이오다이드/아이오다이드, 이세티온에이트, 락테이트, 말레이트, 말리에이트, 말론에이트, 메실레이트, 메틸설페이트, 나프틸레이트, 2-납실레이트, 니코틴에이트, 나이트레이트, 오로테이트, 옥살레이트, 팔미테이트, 파모에이트, 포스페이트/하이드로젠 포스페이트/다이하이드로젠 포스페이트, 피로글루탐에이트, 사카레이트, 스테아레이트, 숙시네이트, 탄네이트, 타르트레이트, 토실레이트, 트리플루오로아세테이트 및 지노포에이트 염 등의 무기산 염 또는 유기산 염을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 그 외에 적합한 염에 대한 개론은 문헌 "Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use" (Stahl 및 Wermuth, Wiley-VCH, 독일 바인하임, 2002)을 참조한다.
본 발명의 화합물 또는 그의 약제학적 또는 식품학적으로 허용가능한 염은 용매화물 또는 수화물로서 존재할 수 있으며, 본 발명의 치료제의 유효성분으로 이러한 용매화물 또는 수화물을 이용할 수 있다. 또한 포접 화합물, 즉 전술한 용매화물과는 달리 약물과 호스트 분자가 화학량론적 양 또는 비-화학량론적 양으로 존재하는 약물-호스트 분자 포함 착체와 같은 착체 또한 본 발명의 영역에 포함된다. 또한, 화학량론적 양으로 또는 비-화학량론적 양으로 존재할 수 있는 둘 이상의 유기 및/또는 무기 성분을 함유하는 약물의 착체도 포함된다. 이러한 착체에 대한 개론은 문헌 "J Pharm Science" (64(8), 1269-1288, Haleblian, 1975년 8월)을 참조한다.
본 발명에 따른 이나무 열매 추출물 또는 그로부터 분리된 화합물을 포함하는 조성물은, 다분화능 줄기세포 또는 지방전구세포(preadipocyte)가 성숙 지방세포(adipocyte)로 분화해 가는 과정을 억제하여 지방생성을 방해한다. 용어 "성숙 지방세포" 또는 "지방세포"는 지방세포의 분화 과정에서 생성된 완전한 지방세포의 형태를 지칭하며, 구체적으로는 줄기세포가 지방전구세포로 이행하고, 상기 지방전구세포가 완전한 지방세포로 성숙하게 되는 과정을 거쳐 생성된다. 용어 "다분화능 줄기세포(multipotent stem cell)"는 여러 장기 또는 신체 조직으로 분화할 수 있는 능력을 가진 원시세포를 의미하며, 본 명세서에서는 일반적으로 지방세포로 분화가능한 성체 줄기세포인 중간엽 줄기 세포(mesenchymal stem cell)를 지칭한다. 중간엽 줄기 세포는 골수, 제대혈, 지방조직, 성인의 근육 또는 젖니의 치수(dental pulp) 등으로부터 유래할 수 있으며, 조골세포, 연골세포, 지방세포, 근세포 또는 뉴런 등으로 분화될 수 있다. 용어 "지방전구세포(preadipocyte)"는, 지방세포의 분화 단계 중 줄기세포로부터 가장 먼저 생성되는 지방세포로의 분화능을 갖는 세포를 의미한다. 지방전구세포는 성장이 진행되어 100% 컨플루언시(confluency)에 도달하면, 성장이 정지되고 지방세포로의 분화가 서서히 진행된다. 지방전구세포가 지방세포로 분화하는 과정은 배양액에 분화유도인자(분화촉진인자) (예를 들면, 인슐린, 덱사메타손, 3-이소부틸-1-메틸잔틴 등) 또는 분화억제인자 (예를 들면, 악티노마이신 D, 종양괴사인자 α, 브로모데옥시우리딘 등)를 첨가함으로써 조절될 수 있다. 최종적으로 분화된 지방전구세포는 세포내 지방이 축적되는 등 성숙 지방세포로서의 형태를 나타내며, 지방세포 특유의 유전자 발현 및 지방 축적으로 유도하는 효소의 활성화가 일어난다. 본 발명에서는 지방세포로 분화가능한 전구세포로서 3T3-L1, C3H10T1/2, 및 인간 중간엽 줄기세포(human mesenchymal stem cell)를 검색계로 하여 본 발명의 추출물 및 화합물의 지방세포 분화 억제능을 확인하였다.
본 발명의 실시예에서, 3T3-L1의 분화유도물질과 함께 이나무 열매의 총 메탄올 추출물 및 그의 n-헥산 분획물, 클로로포름 분획물, 에틸아세테이트 분획물 및 n-부탄올 분획물을 농도별로 처리한 결과, 총 메탄올 추출물, 클로로포름 분획물, 에틸아세테이트 분획물 및 n-부탄올 분획물 투여시 지방세포로의 분화 및 지방생성이 유의하게 억제되는 것을 확인하였다 (도 5). 특히, 상기 추출물 중 클로로포름 분획물 및 n-부탄올 분획물은 100 ㎍/mL의 농도에서 대조군에 비해 약 97.6% 및 79.0%만큼 지방 생성량을 감소시킨 것으로 나타나, 우수한 지방세포 분화 저해 활성을 나타냈다.
상기 우수한 활성을 보인 분획들을 대상으로 단일 활성 화합물의 분리를 수행하여, 이나무 열매 추출물의 클로로포름 분획으로부터 5종의 화합물을, n-부탄올 분획으로부터 9종의 화합물을 분리하고, 그 구조를 동정하였다 (도 4). 이들 화합물에 대해 3T3-L1 지방전구세포를 사용한 인 비트로 활성 검색 결과, 특히 (-)-이데솔리드 (화학식 Ⅲ), 이데스카르핀 (화학식 Ⅳ), 폴리오트리신 (화학식 Ⅴ) 및 비스-이데스카르핀 (화학식 Ⅵ)이 유의성 있게, 용량의존적으로 높은 지방세포 분화 억제 활성을 갖는 것을 확인하였다. 또한, (-)-이데솔리드를 산 가수분해하여 얻은 모노머 (화학식 Ⅶ) 또한 이들과 동등한 수준의 억제 활성을 나타내어, 상기 화합물들에 공통적으로 포함된 메틸 1-히드록시-6-옥소-2-시클로헥센카르복실레이트 모이어티가 지방생성 억제 효능을 갖는 것을 확인하였다 (도 6). 3T3-L1 세포주에 상기 4가지 물질들을 각각 처리한 후 형태학적 변화를 현미경으로 관찰한 결과 용량 의존적으로 지방세포 분화 및 지방 생성량이 감소하는 것을 확인하였으며, 유효 농도 범위에서 세포 괴사와 같은 독성이 관찰되지 않았다 (도 7).
C3H10T1/2, 및 인간 중간엽 줄기세포를 대상으로 한 실험에서, (-)-이데솔리드는 상기 중간엽 세포들이 지방세포로 분화되는 것을 억제하며, PPARγ, aP2, 아디포넥틴, 및 C/EBPα와 같은 지방생성 마커 유전자의 전사를 억제하는 것으로 나타났다 (도 8 내지 도 12). 이러한 전사 조절 활성은 PPARγ 결합 부위를 갖는 루시퍼라제 리포터의 활성이 이데솔리드 처리시 농도의존적으로 감소한 것에 비추어 (도 13), 이데솔리드에 의한 PPARγ 타겟 유전자의 전사 억제에 기인한 것으로 판단되었다. 따라서, 이데솔리드는 중간엽 세포 분화에 있어서 세포의 종류와 무관하게 지방생성 분화(adipogenic differentiation)를 강력하게 억제하는 것을 확인하였다.
또한, 이러한 이데솔리드의 지방생성 분화 억제 활성은, iNOS 유전자 발현의 억제를 통한 산화질소 생성의 감소에 기인한 것으로 나타났다. 산화질소는 지방생성을 자극하는 인자로 알려져 있으며, 본 실험예에서 C3H10T1/2 세포주의 지방세포 분화 유도 후 1일 및 2일차에 산화질소 증가량은 이데솔리드 처리시 농도의존적으로 감소된 것을 확인하였다 (도 14). 이러한 산화질소 생성의 저해 기전은, 이데솔리드가 지방생성 과정 중 산화질소 합성에 관여하는 iNOS 유전자의 발현을 억제 (도 15)하기 때문인 것으로 판단되었다. 본 명세서에서는 또한, 추가적인 C3H10T1/2 세포 실험에서, 이데솔리드는 NO 전구물질인 아르기닌에 의해 유도된 지방생성 분화를 용량의존적으로 유의하게 억제하는 것으로 나타나, 상기 화합물이 NO 생성을 감소시킴으로써 지방세포 분화 과정을 저해한다는 결론을 다시 확인하였다 (도 16 내지 19).
본 발명의 조성물은 지방전구세포 또는 다분화능 줄기세포가 지방세포로 분화하는 과정을 저해하여 지방세포수 및 지방생성을 감소시키므로, 지방세포 분화 및 중성지방 생합성과 관련된 지질 대사성 질환의 예방, 개선 또는 치료 용도로 사용될 수 있다. 이러한 질환은 예를 들면, 비만과 같은 피하지방 축적에 기인한 질환, 또는 고지혈증, 이상지질혈증, 관상동맥질환, 간지방증, 비알코올성 지방간, 제2형 당뇨, 대사성 증후군과 같은 내장지방 축적에 기인한 질환을 포함한다. 특히 비만의 치료에 있어서, 기존의 치료제들이 지방생성 기전에 관여하기보다는 중추신경계 (식욕억제제) 또는 위장관 (지방흡수 저해제)에 작용하여 관련 기관에서의 부작용이 빈번했던 반면에, 본 발명의 조성물은 지방세포 분화 경로를 직접적인 작용점으로 하므로, 선행기술에 비해 보다 근본적이고 효율적인 항비만 효과를 달성할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "이상지질혈증(dyslipidemia)"은 고지혈증, 동맥경화증 등 혈장내 총 콜레스테롤, 저밀도지단백(LDL) 콜레스테롤, 중성지방, 유리 지방산의 증가 또는 고밀도지단백(HDL) 콜레스테롤의 감소로 유발되는 혈관 질환을 통칭하는 것으로, 혈관 내벽에 지질이 침착되어 혈관 내면이 좁아짐에 따라 여러 장기 및 사지말단에 혈액공급이 원활치 않은 순환 장애 등의 증상이 발생한다. 특히 "고지혈증(hyperlipidemia)"은 중성지방 및 콜레스테롤 등의 지방 대사가 원만하게 이루어지지 않아 혈액 내에 지질 성분이 과다하게 존재하는 상태로서, 일반적으로 혈중 콜레스테롤이 240 mg/dL 이상이거나 중성지방이 200 mg/dL 이상인 경우를 지칭한다. 광의적으로, 상기 고지혈증은 고콜레스테롤혈증, 과트리글리세리드혈증, 과베타지단백혈증 등을 포함하며, 협의로는 발생빈도가 높은 고콜레스테롤혈증을 의미한다. 용어 "동맥경화(arteriosclerosis)"는 동맥 내벽에 콜레스테롤이 침착하고 내피조직이 증식한 결과 혈관이 두꺼워지고 탄력이 감소하여 경화되는 병적 상태를 의미한다. 상기 용어는 뇌동맥경화, 관상동맥경화, 죽상동맥경화 등 혈관벽 세포에 콜레스테롤의 과다 축적에 기인하여 발생하는 동맥혈관질환을 포괄적으로 지칭한다.
본 명세서에서 용어 "간지방증(liver steatosis)" 또는 "지방성 간질환(fatty liver disease)"은 간세포에 지방이 이상 축적된 상태를 지칭하며, 특히, "비알코올성 지방성 간질환(nonaclcoholic fatty liver disease, NAFLD)"은 간장해를 야기할 정도의 알콜 섭취력이 없고, 바이러스성 간염 또는 자기면역성 간염 등 원인이 명확한 것을 배제한 간장의 지방 침착으로 정의된다. 이러한 간지방증의 발증은 간세포로의 지방 유입 또는 합성과 같은 증가 요인, 및 지방의 이화 또는 간세포로부터의 방출과 같은 감소 요인의 균형에 의해 좌우된다.
용어 "당뇨병(diabetes mellitus)"은 인슐린 작용의 결핍에 의한 만성 고혈당증을 특징으로 하며 여러 특징적인 대사 이상을 수반하는 질환군을 의미한다. 본 발명의 조성물의 대상 치료 질환으로서의 "2형 당뇨(type 2 diabetes)" 또는 "인슐린 비의존형 당뇨"는 인슐린 분비 저하 또는 인슐린 저항성으로 인해 발생하며, 비만은 2형 당뇨 또는 인슐린 저항성의 핵심적인 위험인자로 알려져 있다. 즉, 체내 지질 증가로 인한 ER 스트레스(endoplasmic reticulum stress)가 당신생(gluconeogenesis) 기능을 교란하며, 이는 인슐린 저항성 발생의 중요한 원인으로 작용한다 (The CREB coactivator CRTC2 links hepatic ER stress and fasting gluconeogenesis, Nature advance online publication 21 June 2009). 또한, 용어 "대사 증후군(metabolic syndrome)"은 상기 언급한 고지혈증, 당대사 이상, 비만 및 고혈압과 같은 위험인자가 함께 나타나는 증후군을 지칭하며, 최근 세계보건기구와 미국 국립보건연구원의 심·폐·혈액 연구소가 제정한 성인 치료프로그램 Ⅲ (dult Treatment Program Ⅲ : ATP Ⅲ)을 통해 공식 명명되었다.
본 명세서에서, 전술된 비만, 이상지질혈증, 고지혈증, 동맥경화, 지방간, 2형 당뇨 및 상기 질환들이 동시다발적으로 발생하는 대사 증후군을 총칭하여 "지질 대사성 질환"으로 명명한다. 상기 질환들의 직접적 발병 요인은 유전, 식이 등 환경적 요인 또는 다른 질환 등 다양할 수 있으나, 공통적으로 피하 또는 내장 지방의 과다축적, 혈중 지질수준의 상승, 그로 인한 당 대사 이상이 수반되며 이들은 상기 질환의 주요 위험인자가 된다. 본 발명의 조성물은 지방전구세포의 지방세포로의 분화 또는 지방생성 과정을 억제함으로써 체내 지질 합성량을 감소시키는 효과를 나타내므로, 전술된 지질 대사성 질환의 위험인자를 제거하거나 증상을 완화킴으로써 그의 예방, 개선 또는 치료에 직접적으로 기여할 수 있다.
다른 양태에서, 본 발명은 이나무 열매의 C1-C4 알코올 추출물, 그의 n-헥산 분획물, 클로로포름 분획물, 에틸아세테이트 분획물 및 n-부탄올 분획물로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 지방세포 분화 억제용 약학적 조성물을 제공한다.
본 명세서에서, 용어 "이나무 추출물"은 이나무의 열매 및/또는 메틸 1-히드록시-6-옥소-2-시클로헥센카르복실레이트계 화합물을 다량으로 포함하는 임의의 다른 기관 또는 부위로부터 추출하여 얻은 것을 의미한다. 바람직하게는, 상기 이나무 추출물은 특히 이나무 열매의 추출물을 의미한다.
용어 "추출물"은 이나무 또는 그의 추출물에 추출 용매를 처리하여 얻은 추출 결과물뿐만 아니라 이나무의 열매 자체를 동물에게 투여할 수 있도록 제제화(예컨대, 분말화)한 가공물도 포함하는 의미를 갖는다. 또한 상기 "추출물"은 상술한 바와 같이 당업계에서 조 추출물(crude extract)로 통용되는 의미를 갖지만, 광의적으로는 추출물을 추가적으로 분획화(fractionation)한 분획물도 포함한다. 즉, 이나무 추출물은 상술한 추출용매를 이용하여 얻은 것뿐만 아니라, 여기에 정제 과정을 추가적으로 적용하여 얻은 것도 포함한다. 예를 들면, 상기 추출물을 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 얻은 분획물, 다양한 크로마토그래피 (크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의해 분리한 분획물 등, 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획물을 포함한다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어 "추출물" 및 "분획물"은 추출에 의해 수득되는 추출액 및 분획뿐만 아니라, 상기 추출액 및 분획의 희석액 또는 농축액, 추출액 및 분획을 건조하여 수득되는 건조물, 또는 추출액 및 분획의 조 정제물 또는 정제물을 포함한다.
추가적인 양태에서, 본 발명은 상기 조성물의 유효성분인 이나무 열매 추출물 및 이의 분획물의 제조 방법을 제공한다.
일 구체예에서, 상기 제조 방법은
i) 이나무 열매를 저급 알코올 (C1-C4 알코올)로 추출하는 단계;
ⅱ) 단계 i)의 이나무 열매 추출물을 여과 및 농축하는 단계;
ⅲ) 단계 ⅱ)의 농축물을 유기 용매로 추가적으로 분획화하는 단계; 및
ⅳ) 단계 ⅲ)의 분획물로부터 컬럼 크로마토그래피법을 통해 활성 분획물을 수득하는 단계를 포함할 수 있다.
이나무 추출물은 이나무를 저극성 용매, 알코올 또는 이들의 혼합물을 용매로 하여 통상의 추출 방법에 의해 추출하고, 이를 감압 농축하여 수득된다. 바람직하게, 본 발명에서는 이나무의 열매를 사용하여, 유효성분인 1-히드록시-6-옥소-시클로헥센카르복실레이트계 화합물을 다량으로 포함하도록 제조할 수 있다. 이때 사용되는 저극성 용매는 클로로포름, 디클로로메탄, 에테르 또는 에틸아세테이트 등 당업계에서 통상적으로 사용하는 것이면 어느 것이나 가능하다. 알코올은 C1 -4 알코올이 바람직하며, 메탄올, 에탄올, 프로판올, n-프로판올, 이소프로판올, 부탄올, n-부탄올 등 당업계에서 추출 용매로 통상적으로 사용되는 것들을 포함하나 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 본 발명의 이나무 추출물은 이나무 열매의 메탄올 추출물이다. 상기 추출 방법은 환류 냉각추출법, 냉침 추출법, 초음파 추출법, 온침 추출법, 초임계 추출법 및 이들을 조합한 추출법을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 바람직하게는, 본 발명의 이나무 추출물은 이나무의 열매 2 내지 10 kg (건조중량 기준)을 80% 메탄올로 2-4 시간 동안 초음파 추출을 3-5회 반복 수행하여 제조된다.
상기 과정에 더하여, 필요에 따라 농축 및/또는 건조하는 단계를 추가적으로 포함할 수 있으며, 상기 농축 및/또는 건조는 통상의 방법, 예를 들면, 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게, 본 발명에서 사용되는 이나무 추출물은 감압 농축 및 동결 건조에 의해 건조시킨 분말의 형태일 수 있다.
상기 단계로부터 얻은 이나무 총 추출물을 증류수에 현탁시킨 후, 이로부터 용매 극성에 따라 순차적으로 상기 추출물의 분획물들을 얻을 수 있다. 예를 들면, 상기 분획물은 n-헥산, 클로로포름(CHCl3), 에틸아세테이트(EtOAc) 및 n-부탄올로 순차 분획하여 수득된 n-헥산, 클로로포름(CHCl3), 에틸아세테이트(EtOAc) 및 n-부탄올 가용성 분획물일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 지방분화 억제용 조성물에 사용되는 분획물은 클로로포름 분획물 또는 n-부탄올 분획물이다.
본 발명의 조성물은 유효성분으로서 이나무 추출물 또는 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물을 0.01 내지 90 중량% 함유할 수 있으며, 바람직하게는 0.1 내지 50 중량% 함유한다. 그러나 상기 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 질환의 종류 및 진행 정도에 따라 당업자가 적절히 변화시킬 수 있다.
본 발명에 따른 이나무 추출물, 그의 분획물, 화학식 1 또는 화학식 2의 화합물 중 하나 이상을 포함하는 약학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유 동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식이 예상될 수 있으며, 예를 들면, 경구, 관절 내, 정맥, 근육, 피하, 경피, 직장, 비강, 자궁내경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 투여 등이 가능하다. 상기 조성물은 또한 당해 기술 분야에 공지되어 있는 다른 방법 (예를 들어 Remington's Pharmaceutical Science 최신판에 기재된 방법들)을 이용할 수도 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 특정한 투여 경로로 투여하기 위해 본 발명이 속하는 기술분야에 공지되어 있는 통상적인 약제학적 제형으로 제제화될 수 있다. 상기 제형은 경구투여제제, 주사제, 좌제, 경피투여제제, 및 경비투여제제를 포함하며 이에 한정되지 않는 임의의 제형으로 제제화되어 투여될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 약학적 조성물은 정제, 캡슐제, 환제, 산제, 과립제 또는 좌제와 같은 고체 형태, 또는 용액제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 엘릭서제 또는 엑스제와 액체 형태로 제제화될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
또한 본 발명의 조성물은 제형에 따라 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 이와 같은 담체, 부형제 및 희석제는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구체예에서, 본 발명의 조성물은 경구 투여를 위한 고형 제제로서, 상기 이나무 추출물 또는 화학식 1 또는 2의 화합물 중 하나 이상에 적어도 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 부형제, 예를 들면, 희석제, 활택제, 결합제, 붕해제, 감미제, 안정제, 및 방부제를 포함할 수 있다. 구체적으로, 희석제로는 유당, 옥수수 전분, 젤라틴, 칼슘카보네이트, 대두유, 미정질 셀룰로오스, 또는 만니톨, 활택제로는 마그네슘 스테아레이트 또는 탈크, 결합제로는 폴리비닐피롤리돈 또는 히드록시프로필셀룰로오스가 사용될 수 있다. 또한, 붕해제로는 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘, 전분글리콜산나트륨, 폴라크릴린칼륨, 또는 크로스포비돈, 감미제로는 백당, 과당, 솔비톨, 또는 아스파탐, 안정제로는 카르복시메틸셀룰로오스나트륨, 베타-사이클로덱스트린, 백납, 또는 잔탄검, 방부제로는 파라옥시안식향산메틸, 파라옥시안식향산프로필, 또는 솔빈산칼륨이 사용될 수 있다.
또다른 구체예에서, 본 발명의 조성물은 경구용 액상 제제로서, 현탁제, 내용 액제, 유제, 시럽제 등의 형태일 수 있다. 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 또한, 상기 성분 이외에도 공지의 첨가제로서 미각을 돋구기 위하여, 매실향, 레몬향, 파인애플향, 허브향 등의 천연향료, 천연과즙, 클로로필린, 플라보노이드 등의 천연색소, 과당, 벌꿀, 당알코올, 설탕과 같은 감미성분, 또는 구연산, 구연산 나트륨과 같은 산미제를 혼합하여 사용할 수도 있다.
또다른 구체예에서, 본 발명의 약학적 조성물은 비경구 투여용 제제일 수 있으며, 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함된다. 주사제의 경우는 이에 한정되는 것은 아니나, 한크액(Hank's solution), 링거액(Ringer's solution), 생리 식염 완충액과 같은 생리학적으로 적합한 완충액을 사용하여 제조할 수 있다. 또한 비수성 용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있으며, 그 외에 안정제, 분산제 등을 추가적으로 포함할 수 있다. 또한 본 발명의 조성물은 분말 형태로 제조되어, 사용 전에 멸균수와 같은 적당한 담체에 의해 재구성되어 사용될 수 있다. 좌제로 제제화되는 경우, 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있으나 이에 한정되지 않는다.
본 발명의 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물 제형, 투여 경로 및 기간에 따라 달라질 수 있으며, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 이나무 추출물 또는 화학식 1 또는 2의 화합물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 성인을 기준으로 1일 0.01 mg/kg 내지 5 g/kg, 바람직하게는 10 mg/kg 내지 1 g/kg이 되도록 임의로 수회 나누어서 투여할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 또한, 비만 및 기타 지질 대사성 질환의 예방 및 개선을 위한 건강기능성 식품 또는 음료 조성물로서 제조될 수 있다. 따라서, 추가적인 양태에서, 본 발명은 화학식 Ⅰ 또는 화학식 Ⅱ의 화합물, 이나무 열매의 추출물, 분획물, 이들의 염 또는 용매화물과 함께, 식품학적으로 허용가능한 식품 보조 첨가제를 포함하는 건강 기능성 식품 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 용어 "건강 기능성 식품(nutraceutical)"은 건강 보조의 목적으로 특정 성분을 원료로 하거나 식품 원료에 함유된 특정 성분을 추출, 농축, 정제, 혼합 등의 방법에 의해 제조 또는 가공된 식품으로, 상기 성분에 의해 생체방어, 생체 리듬의 조절, 질병의 예방 및 회복 등 생체 조절 기능을 충분히 발휘할 수 있도록 설계된 식품을 지칭한다. 본 명세서에서, 상기 기능성 식품은 비만 등을 포함한 지질 대사성 질환, 예를 들면, 고지혈증, 동맥경화, 간지방증, 2형 당뇨, 대사성 증후군 등의 예방, 개선 및 회복과 관련된 기능을 수행할 수 있다.
본 발명의 기능성 식품 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food) 및 식품 첨가제(food additive) 등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 제조할 수 있으며, 당해 기술분야에 공지되어 있는 통상적인 건강기능성 식품의 제형으로 제제화될 수 있다. 상기 건강 기능성 조성물은 예를 들어 산제, 과립제, 정제, 캅셀제, 현탁액, 에멀젼, 시럽제, 액제, 엑스제, 차, 젤리, 또는 음료 등으로 제조될 수 있다. 상기 식품학적으로 허용 가능한 보조첨가제로는 제조하고자 하는 제형의 제조에 당해 기술분야에서 사용 가능한 것으로 공지되어 있는 임의의 담체 또는 첨가제가 이용될 수 있다. 그 외에, 본 발명의 건강기능성 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 착색제 및 증진제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술 용어는 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 균등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 예증일 뿐, 어떠한 의미로든 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예
1:
이나무
열매의 메탄올 추출물 및
분획물의
제조
이나무 열매 (건조 중량 2.4 kg)를 분쇄하고 80% MeOH를 가하여 3시간씩 4회 초음파 추출하였다. 추출액을 수집 및 여과한 후, 감압 농축하여 총 메탄올 추출물 약 584.4 g을 얻었다. 총 메탄올 추출물을 증류수에 현탁시킨 후, 도 1에 제시된 바와 같이 용매의 극성에 따라 n-헥산 분획물 (24.7 g), CHCl3 분획물 (12.1 g), EtOAc 분획물 (119.3 g) 및 n-BuOH 분획물 (109.5 g)을 얻었다 (도 1).
실시예
2: 활성 화합물의 분리 및 구조 동정
2-1.
이나무
열매의
CHCl
3
분획물로부터
화합물의 분리
제조예 1에서 얻은 이나무 열매의 CHCl3 분획물을 대상으로 ODS 겔 컬럼 크로마토그래피 (0% → 100% MeOH)를 실시하여 극성에 따라 순차적으로 14개의 소분획 (C1 ~ C14)으로 분리하였다. 이 중, 지방세포 분화 저해 활성이 가장 강한 분획 C2, C4, C9 및 C10에 대해 역상 크로마토그래피 또는 재결정을 실시하여 최종적으로 순수한 화합물 5종 (화합물 1, 2, 3, 6 및 14)을 얻었다 (도 2). 그 구조를 동정한 결과를 도 4에 나타내었다.
2-2.
이나무
열매의 n-
BuOH
분획물로부터
화합물의 분리
이나무 열매의 n-BuOH3 분획물을 대상으로 MeOH과 H2O의 혼합용매 (0% → 100% MeOH)로 HP-20 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 극성에 따라 6개의 소분획 (B1 ~ B6)으로 분리하였다. 그 중 4번째 소분획을 대상으로 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피 (CHCl3 : MeOH : Water = 50:4:1 → 100% MeOH)를 실시하여 극성에 따라 순차적으로 10개의 소분획 (B4-1 ~ B4-10)으로 분리하였다. 이들 중 지방세포 분화 저해 활성이 가장 강한 B4-8 및 B4-9 분획에 대해 역상 크로마토그래피 및/또는 재결정을 실시하여 순수한 화합물 9종 (화합물 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12 및 13)을 얻었으며 (도 3), 그 구조를 동정하여 도 4에 나타내었다.
2-3. 화합물의 구조 동정
상기 화합물 1~14의 성상, 분자량, 질량분석, NMR 스펙트럼을 측정한 결과, 대표적인 4가지 화합물들의 이화학적 특성 및 화학 구조는 하기와 같았다. 각각의 화합물에 대한 1H-NMR 스펙트럼 및 13C-NMR 스펙트럼을 도 20 내지 도 23에 나타내었다.
(-)-이데솔리드(
Idesolide
)
디메틸(2R,2'S,3aS,7aR)-2',7a-디히드록시-6,7,3a,7a-테트라히드로스피로[1,3-벤조디옥솔-2,1'-시클로헥-3-센]-2',3a-디카르복실레이트 [dimethyl (2R,2'S,3aS,7aR)-2',7a-dihydroxy-6,7,3a,7a-tetrahydrospiro[1,3-benzodioxole-2,1'-cyclohex-3-ene]-2',3a-dicarboxylate]
성상: 무색의 결정
분자식: C16H20O8
[α]25 D : -180.1 (c 0.2, CHCl3)
CD : [θ]262 -0.39, [θ]216 -167.81, [θ]203 -0.12 (c 0.02. acetonitrile)
Rf : 0.3 (Silica TLC, C:M=20:1)
Positive ESIMS (m/z) : 363.10 [M+Na]+
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ 1.80 (1H, m, H-6', 2.09 (2H, m, H-7), 2.21 (2H, m, H-6), 2.30 (2H, m, H-5', 2.41 (1H, m, H-6'), 3.74 (3H, s, 3a-OMe), 3.88 (3H, s, 2'-OMe), 5.44 (1H, dt, J=9.9, 2.1 Hz, H-3'), 5.57 (1H, dm, J=9.9 Hz, H-4), 5.94 (1H, m, H-5), 5.97 (1H, m, H-4')
13C-NMR (75 MHz, CDCl3) : δ 22.4 (C-6), 24.6 (C-5'), 29.7 (C-7), 31.0 (C-6'), 52.7 (3a-OMe), 54.2 (2'-OMe), 77.4 (C-2'), 86.4 (C-3a), 102.1 (C-7a), 110.9 (C-2), 126.2 (C-4), 126.5 (C-3'), 130.6 (C-5), 132.5 (C-4'), 169.0 (3a C=O), 173.2 (2' C=O)
이데스카르핀
(
Idescarpin
)
6-히드록시-2-({[(1-히드록시-6-옥소-2-시클로헥센-1-일)카르보닐]옥시}메틸)페닐 β-D-글루코피라노시드 [6-hydroxy-2-({(1-hydroxy-6-oxo-2-cyclohexen-1-yl)carbonyl]oxy}methyl)phenyl β-D-glucopyranoside]
성상: 엷은 황색의 시럽
분자식: C20H24O11
[α]25 D : -103.4 (c 0.2, MeOH)
CD : [θ]249 -0.38, [θ]214 -25.41, [θ]204 -1.76 (c 0.02. acetonitrile)
Rf : 0.45 (Silica TLC, C:M:W=15:4:1), 0.58 (RP TLC, 50%M)
Positive ESIMS (m/z) : 463.07 [M+Na]+
1H-NMR (300 MHz, DMSO-d 6) : 하기 표 1 참조
13C-NMR (75 MHz, DMSO-d 6) : 하기 표 2 참조
폴리오트리신(
Poliothrysin
)
4-히드록시-2-({[(1-히드록시-6-옥소-2-시클로헥센-1-일)카르보닐]옥시}메틸)페닐 β-D-글루코피라노시드 [4-hydroxy-2-({(1-hydroxy-6-oxo-2-cyclohexen-1-yl)carbonyl]oxy}methyl)phenyl β D-glucopyranoside]
성상 : 황색빛의 시럽
분자식 : C20H24O11
[α]25 D : -86.8 (c 0.2, MeOH)
Rf : 0.42 (Silica TLC, C:M:W=15:4:1), 0.84 (RP TLC, 50%M)
Negative ESIMS (m/z) : 463.07 [M+Na]+
1H-NMR (500 MHz, CD3OD) : 하기 표 1 참조
13C-NMR (125 MHz, CD3OD) : 하기 표 2 참조
비스
-이데스카르핀(
Bis
-
idescarpin
)
비스(1-O-β-D-글루코피라노실-2-메틸-6-히드록시-페닐)(2R,2S,3aS,7aR)-2',7a-디히드록시-6,7,3a,7a-테트라히드로스피로[1,3-벤조디옥솔-2,1'-시클로헥-3-센]-2',3a-디카르복실레이트 [bis(1-O-β-D-glucopyranosyl-2-methyl-6-hydroxy-phenyl)(2R,2S,3aS,7aR)-2',7a-dihydroxy-6,7,3a,7a-tetrahydrospiro[1,3-benzodioxole-2,1'-cyclohex-3-ene]-2',3a-dicarboxylate]
성상 : 백색 무정형 분말
분자식 : C40H48O22
[α]25 D : -15.9 (c 0.2, pyridine)
CD : [θ]214 -0.17, [θ]213 -5.10, [θ]212 -0.81 (c 0.05. acetonitrile)
IR (KBr) Vmax cm-1 : 3348, 2931, 2890, 1746, 1598, 1475, 1389, 1350, 1299, 1240, 1222, 1199, 1078
Rf : 0.12 (Silica TLC, C:M=7:1), 0.13 (RP TLC, 50%M)
Positive ESIMS (m/z) : 903.24 [M+Na]+, 1782.74 [2M+Na]+
Negative ESIMS (m/z) : 878.78 [M-H]-, 1758.75 [2M-H]-
1H-NMR (500 MHz, DMSO-d 6) : 하기 표 3 참조
13C-NMR (125 MHz, DMSO-d 6) : 하기 표 3 참조
실시예
3:
메틸
1-히드록시-6-옥소-2-
시클로헥센
카르복실레이트의
합성
이나무 추출물에서 분리된 이데솔리드로부터, 모노머인 하기 메틸 1-히드록시-6-옥소-2-시클로헥센 카르복실레이트를 반합성하였다.
상기 실시예 2에서 수득한 (-)-이데솔리드 13.2 mg을 실온에서 메탄올 용매중에서 2시간 동안 교반하여 산 가수분해하였다 (트리클로로아세트산 10 g/100 mL, 0.4 mL). 30분 간격으로 반응액을 취하여, TLC (실리카, 클로로포름:메탄올 = 3:1)를 통해 반응물 변화 상태를 확인하였다. 메탄올 중 1N NaOH를 사용하여 반응액을 pH 7로 중화시켜 반응을 종결시켰다. 반응액을 메틸렌 클로라이드 및 물로 3회 분획하여 얻은 메틸렌 클로라이드 층을, 충분한 양의 MgSO4를 사용하여 수분을 제거하고, 여과하고, 감압 및 농축시켜, 분말 상태의 생성물 3 mg을 수득하였다.
참고예
1: 재료 및 시약
본 연구에 사용된 이나무 열매(건조 중량 2.4kg)는 2009년 10월에 서울대학교 농업생명과학대학 남부 학술림 내 추산 시험장에서 채집한 후 건조하여 사용하였다.
지방전구세포의 분화 활성 측정시험에 사용되는 3T3-L1 세포주는 American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA)로부터 구입하였다. 세포 배양에 필요한 소듐 바이카보네이트(sodium bicarbonate), 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin) 및 트립신(trypsin)은 Sigma 사 (St. Louis, USA) 제품을 사용하였고, DMEM 및 소 혈청(calf serum)은 Hyclone 사(Franklin, USA) 제품을 사용하였다. 또한, 활성 검색에 필요한 3-이소부틸-1-메틸잔틴 (IBMX), 덱사메타손(dexamethasone), 인슐린은 Sigma 사 (St. Louis, USA) 제품을 사용하였고, 소 태아 혈청(fetal bovine serum), 인산 완충 염수(phosphate-buffered saline, PBS)는 Hyclone 사 (Franklin, USA)에서 구입하였다.
참고예
2: 통계 처리
각 시험 물질에 대한 농도별 실험은 3개의 웰에 걸쳐 수행되었으며, 그 결과를 3개 측정값의 평균 ± 표준편차로 나타내었다. 통계적 유의성을 검토하기 위해 대조값으로부터의 변동을 일원 분산분석(one-way ANOVA) 검정에 의해 판정하였으며, P 값이 5% 미만인 경우 (p < 0.05) 통계적으로 유의성이 있는 것으로 간주하였다.
실험예
1:
이나무
열매 추출물 및
분획물의
지방전구세포 분화 억제 활성
3T3-L1 세포주를 검색계로 사용하여 지방세포 분화 및 지방생성(adipogenesis)에 이나무 열매 추출물이 미치는 영향을 알아보기 위해 오일 레드 오(Oil red O) 염색 실험을 수행하였다 (Jeon T 등, Red yeast rice extracts suppress adipogenesis by downregulating adipogenic transcription factors and gene expression in 3T3-L1, Life Sci, 12:75(26), pp.3195-3203, 2004).
1-1. 3
T3
-
L1
세포주의 배양
3T3-L1 마우스유래 배아섬유아세포(mouse embryo fibroblast)를 하기의 실험방법으로 배양하였다 (Lin. J. et al., Green Tea Polyphenol Epigallocatechin Gallate Inhibits Adipogenesis and Induces Apoptosis in 3T3-L1 Adipocytes, Obesity Research, 13(6), pp.982-990, 2005).
3T3-L1 세포주를 10% BCS, 100 IU/mL 페니실린, 100 mg /ml 스트렙토마이신을 포함하는 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium, DMEM)을 배양액으로 하여, 37 ℃ 배양기에서 공기 (95 %)와 CO2 5 %)의 혼합 기체를 지속적으로 공급하여 주며 배양하였다. 세포가 80~90% 컨플루언시에 도달하면 트립신-EDTA를 처리하여 계대배양하였다. 분화용 세포는 24-웰 배양 플레이트에 5ⅹ104 cells/mL 농도로 심은 후, 100% 컨플루언시에 도달할 때까지 2~3일 간격으로 배지를 교체하며 배양하였다.
1-2. 오일
레드
오 염색에 의한 지방생성 관찰
방법
3T3-L1 세포를 100% 컨플루언시 상태에서 이틀 동안 더 배양한 후 (day 0) 분화유도물질 (0.5 mM IBMX, 1μM 덱사메타손, 1㎍/mL 인슐린)을 포함한 DMEM 배양액 (10% FBS, 100 IU/mL 페니실린, 100 ㎍/mL 스트렙토마이신)을 10, 50 및 100 ㎍/mL의 농도로 희석한 시험 물질들과 함께 처리하였다. 분화 유도 이틀 후 (day 2) 1 ㎍/mL 인슐린을 포함한 분화용 DMEM 배양액 (10% FBS, 100 IU/mL 페니실린, 100 ㎍/mL 스트렙토마이신)으로 교환하였으며 (day 4), 다시 이틀 뒤에 분화용 DMEM 배양액 (10% FBS, 100 IU/mL 페니실린, 100 ㎍/mL 스트렙토마이신)으로 교환하여 이틀 간격으로 배양액을 교체하며 4일간 더 배양하여 (day 8) 성숙한 지방세포(mature adipocyte)를 대상으로 시험물질의 지방전구세포 저해 활성을 측정하였다. 모든 시험물질들은 상기 농도(10, 50 및 100 ㎍/mL)로 희석하여 분화 유도 후 4일차 되는 날(day 4)까지 배양액 교환시마다 5 ㎕씩 처리하였다.
3T3-L1 세포의 분화능을 오일 레드 오(Oil red O) 시약으로 염색하여 측정하였다. 배양된 세포를 PBS 완충액으로 2회 세척한 후, 10% 포르말린으로 1시간 동안 고정하고 증류수로 세척하였다. 오일 레드 오 용액 (이소프로필 알코올:물 = 3:2 중 0.6% 오일 레드 오)을 웰 당 200 ㎕씩 처리한 후 37 ℃에서 15분간 염색시켰다. 염색액을 제거하고 증류수로 2회 세척한 후 정량을 위해 Nonidet P-40 (이소프로필 알코올 중 4% Nonidet P-40)을 처리하였다. 15분 동안 회전식 진탕기(rotary shaker)를 사용하여 염색된 지방을 추출한 후 544 nm에서 ELISA 분광광도계를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 대조군 대비 시험군의 지방 생성율(%)을 하기 식에 따라 산출하여, 그 결과를 하기 표 5 및 도 5에 나타내었다.
대조군 대비 지방 생성율(%)
= [A544nm(sample)-A544nm(ctrl)]/[A544nm(diff. ctrl)-A544nm(ctrl)] x 100
- sample: 시험군
- ctrl: 음성 대조군 (분화유도물질 미투여군)
- diff. ctrl: 양성 대조군 (분화유도물질 투여군)
결과
오일 레드 오 염색법은 지방세포를 선택적으로 붉은 색으로 염색시키는 오일 레드 오 시약을 사용하여 세포내 생성된 지방을 측정하는 방법이다. 실험 결과, 이나무 열매의 메탄올 총 추출물, 클로로포름 분획물, 에틸아세테이트 분획물, 및 n-부탄올 분획물을 처리한 경우 양성대조군(분화유도군)에 비하여 붉은색으로 염색한 부위가 크게 감소하였다. 상기 추출물 및 분획물들은 50 ㎍/mL 이상의 농도에서 3T3-L1 지방전구세포에서 지방세포로의 분화를 유의하게 억제하였으며, 특히 클로로포름 분획물 및 n-부탄올 분획물은 100 ㎍/mL 농도에서 지방전구세포의 분화를 각각 97.6% 및 79.0% 억제하였다.
실험예
2:
이나무
유래 화합물의 지방전구세포 분화 억제 활성
3T3-L1 세포주를 검색계로 하여 이나무 열매 유래 14종의 화합물 및 그로부터 반합성한 모노머 화합물(메틸 1-히드록시-6-옥소-2-시클로헥센카르복실레이트)이 지방세포 분화 및 지방생성에 미치는 효과를 관찰하기 위해, 오일 레드 오로 세포 염색을 실시하여 분화 상태를 관찰하고, 지방을 추출하여 정량하였다.
방법
실험예 1-1에서와 같이 배양한 3T3-L1 세포를 100% 컨플루언시 상태에서 이틀동안 더 배양하고 (day 0), 분화유도물질 (0.5 mM IBMX, 1μM 덱사메타손, 1㎍/mL 인슐린)을 포함한 DMEM 배양액 (10% FBS, 100 IU/mL 페니실린, 100 ㎍/mL 스트렙토마이신)을 10, 50 및 100 ㎍/mL의 농도로 희석한 시험 물질 (화합물 1, 4, 5, 14 및 모노머 화합물)과 함께 처리하였다. 실험예 1-2에 기재된 것과 동일한 방법으로 DMEM 배양액을 교환해가며 배양하여 성숙한 지방세포로의 분화를 유도하였다. 모든 시험 물질들은 상기 농도 (10, 50 및 100 μM)로 희석하여 분화유도 후 4일차 되는 날(day 4)까지 배양액 교환시마다 5 ㎕씩 처리하였다.
실험예 1-2에서와 마찬가지 방법으로, 3T3-L1 세포를 오일 레드 오(Oil red O) 시약으로 염색하였다. 그 다음, 염색액을 제거하고 증류수로 2회 세척한 후, 염색된 세포를 현미경 영상 (Labomed, USA)으로 관찰하였다 (도 7). 정량을 위해 544 nm에서 ELISA 분광광도계를 이용하여 흡광도를 측정한 후 지방 생성율(%)을 산출하였다. 그 결과를 하기 표 6 도 6에 나타내었다.
결과
표 6에 나타난 바와 같이, 3T3-L1 지방전구세포의 분화 과정 중에 시험물질을 처리한 결과, 모두 농도의존적으로 양성대조군에 비해서 세포 분화 및 지방생성을 저해하는 것을 확인하였다. 특히, 화합물 1, 4, 5, 14 및 모노머 화합물을 100 μM의 농도로 처리시 세포분화를 각각 91.8%, 81.1%, 86.8%, 84.8% 및 83.8%만큼 억제하여, 유의성 있게, 용량 의존적으로 높은 활성을 갖는 것으로 나타났다.
화합물 1, 4, 5 및 14를 처리한 군에 대한 현미경 관찰 결과, 양성 대조군에 비해 지방 생성이 현저하게 감소하였으며, 이러한 경향은 농도의존적으로 나타났다. 또한, 세포 괴사 등이 관찰되지 않아, 상기 활성 화합물 모두 유효 농도에서 세포에 대한 독성을 나타내지 않는 것을 확인하였다.
실험예
3:
중간엽
줄기세포에서
이데솔리드에
의한 지방세포분화 억제 효과
3-1. 오일
레드
오 염색
방법
C3H10T1/2 세포를 10% 우 태아 혈청을 포함하는 DMEM에서 유지시키고, 분화유도물질 (덱사메타손 1μM), 인슐린 5㎍/mL, 및 트로글리타존(troglitazone) 5μM) 및 시험물질 (이데솔리드 0, 1, 2.5, 5, 10, 또는 20 ㎍/mL)을 처리한 지방생성 분화(adipogenic differentiation) 배지로 교환하였다. 세포들을 이틀마다 신선한 지방생성 분화 배지로 교체하면서 8일 동안 지방세포로 분화시켰다.
골수에서 유래한 인간 중간엽 줄기세포(human mesenchymal stem cell)를 Lonza에서 구입하였다. 인간 중간엽 줄기세포의 지방생성 분화를 유도하기 위해, 이데솔리드를 처리하거나 처리하지 않은, 분화유도물질(덱사메타손 1μM, 인슐린 5㎍/mL, 및 트로글리타존 1μM)을 포함하는 지방생성 분화 배지를 사용하였다.
분화된 지방세포를 PBS로 세척하고, 10% 포르말린 중에서 1시간 동안 고정시켰다. 세포들을 PBS로 세척한 후, 실온에서 55% 이소프로판올 용액에서 오일 레드 오로 염색시켰다. 그 다음, 증류수로 세포를 세척하고, 광학 현미경으로 관찰하였다 (도 8 및 9).
결과
도 8 및 9에 나타난 바와 같이, 중간엽 C3H10T1/2 세포 및 인간 MSC는 지방생성 분화 배지에서 배양한 경우 지방세포로 분화하나, 이러한 분화 유도는 이데솔리드 처리에 의해 억제되는 것을 확인하였다. C3H10T1/2 세포 실험에서, 이데솔리드 농도가 증가함에 따라 유적(lipid droplet)의 크기는 점차적으로 감소하여, 이데솔리드에 의한 지방생성 억제 효과는 용량의존적인 것으로 나타났다.
3-2.
웨스턴
블롯에
의한
PPAR
γ 발현량 분석
방법
실험예 3-1에서 수득된 세포들을 20 mM 트리스-HCl (pH 7.5), 1% NP-40, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 50 mM NaF, 1 mM Na-오르소바나데이트(orthovanadate) 및 프로테아제 억제제를 포함하는 TNE 용해 완충액에 용해시켰다. 총 세포 용해물을 4 X SDS 샘플 완충액을 사용하여 변성시키고, SDS-PAGE 겔에 의해 분석하였다. 로딩 대조군으로서 β-액틴(actin)을 사용하였으며, 세포를 막에 옮긴 후, 막에 항-PPARγ 항체(Cell Signaling technologies) 및 항-β-액틴 항체를 처리하여 인큐베이션시켰다 (도 10).
결과
도 10에 나타난 바와 같이, PPARγ의 mRNA 발현 수준은 이데솔리드 처리시 농도 의존적으로 감소하였다.
3-3. 지방생성
마커에
대한 실시간
PCR
분석
방법
실시예 3-1에서 이데솔리드 10 ㎍/mL를 첨가하여 분화를 유도한 세포군에 TRIzol 시약(Invitrogen)을 처리하여 mRNA를 분리하고, M-MLV 역전사효소 (Promega)에 의해 cDNA를 합성하였다. 정량적 RT-PCR에 의해 지방생성 마커 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하였다. 각각의 발현량을 β-액틴 수준에 대해 정규화(normalization)한 후, 상대적 발현 수준을 결정하였다.
C3H10T1/2 세포로부터 분리한 mRNA에 대해 사용한 정방향(F) 및 역방향(R) 프라이머 쌍은 하기와 같았다: aP2-F 5'-GCATGAGCCAAAGGAAGAGG-3' 및 aP2-R 5'-CCGACTGACTATTGTAGTG-3'; 아디포넥틴-F 5'-AAGAAGGACAAGGCCGTTCTC-3' 및 아디포넥틴-R 5'-GAGTCCATTGTGGTCCCC-3'; PPARγ-F 5'-ATGGGTGAAACTCTGGGAGA-3' 및 PPARγ- R 5'-CTTGTGAAGTGCTCAGC-3'; C/EBPα-F 5'-GTGCTGGAGTTGACCAGTGA-3' 및 C/EBPα-R 5'-CCAAGGAGCTCTCAGGCAG-3'; GAPDH-F 5'-GCTTGTCATCAACGGGAAG-3' 및 GAPDH-R 5'-GATGTTAGTGGGGTCTCG-3'.
인간 중간엽 줄기세포로부터 분리한 mRNA에 대한 정방향 및 역방향 프라이머 쌍은 하기와 같았다: 아디포넥틴-F 5'-AAGGAGATCCAGGTCTTATTG-3' 및 아디포넥틴-R 5'-ACCTTCAGCCCCGGGTAC-3'; aP2-F 5'-GGCATGGCCAAACCTAACAT-3'?및 aP2-R 5'-TTCCATCCCATTTCTGCACAT-3'; C/EBPα-F 5'-AAGGTGCTGGAGCTGACCAG-3' 및 C/EBPα-R 5'-AATCTCCTAGTCCTGGCTCG-3'; GAPDH-F 5'-CCCATCACCATATTCCAGG-3' 및 GAPDH-R 5'-GGTGCCATGGAATTTGCCATG-3'.’
결과
도 11에 나타난 바와 같이, 인간 MSC를 사용한 실험에서 지방생성 마커인 aP2, PPARγ, 아디포넥틴, 및 C/EBPα의 전사량은 10 ㎍/mL 이데솔리드 처리시 크게 감소하여, 이데솔리드가 지방생성에 강력한 억제 효과를 갖는다는 것을 확인하였다. 도 12에 나타난 바와 같이, 인간 MSC를 사용한 실험에서도 이데솔리드 처리시 aP2, 아디포넥틴, 및 C/EBPα의 유도는 감소하였으며, 이에 비추어 이데솔리드의 지방생성 억제 효과는 세포의 종류와 무관한 것을 확인하였다.
3-4.
루시퍼라제
리포터 활성 분석
이데솔리드에 의한 전사 억제 메커니즘을 이해하기 위해, 전사 조절 목적으로 PPARγ 결합 부위를 포함하는 루시퍼라제 리포터를 사용하였다.
방법
루시퍼라제 리포터(luciferase reporter) 활성 분석을 위해, 24-웰 배양 플레이트에 293T 세포를 1 X 105개의 세포/웰의 밀도로 분포시켰다. 24시간 후에, aP2 프로모터를 포함하는 루시퍼라제 리포터(aP2-luc) 및 PPARγ의 발현 벡터(플라스미드)를 X-tremeGene9 DNA 형질감염 시약(transfection reagent) (Roche)을 사용하여 형질감염시키고, 이데솔리드 (0, 1, 5, 또는 10 ㎍/mL)를 처리하여 24시간 동안 인큐베이션시켰다. passive lysis buffer (Promega)를 사용하여 20분 동안 세포를 용해시키고, Luciferase Assay System (Promega)의 시약을 사용하여 루시퍼라제 리포터 활성을 평가하였다.
루시퍼라제 활성을 계산하여 상대적 유도 배율(fold induction)로서 표시하였다 (도 13).
결과
도 13에 나타난 바와 같이, PPARγ에 의해 유도된 리포터 활성은 이데솔리드에 의해 용량 의존적으로 유의하게 억제되었다.
실험예
4:
이데솔리드에
의한
NO
생성의 억제 활성
산화질소는 지방생성을 자극하는 것으로 알려져 있다. 본 실험예에서는 이데솔리드가 지방생성 과정에서 산화질소 생성에 미치는 효과 및 그의 메커니즘을 분석하였다.
4-1.
이데솔리드에
의한 지방생성 중
NO
생성의 억제
방법
C3H10T1/2 세포를 10% 우 태아 혈청을 포함하는 DMEM에서 유지시키고, 이데솔리드 10 ㎍/mL의 존재 또는 부재 하에, 분화유도물질(덱사메타손 1μM, 인슐린 5㎍/mL, 및 트로글리타존(troglitazone) 5μM)을 포함하는 지방생성 분화 배지 중에서 배양하였다. 세포들을 이틀마다 신선한 지방생성 분화 배지로 교체하면서 지방세포로 분화시켰다.
분화 유도 1일 및 2일 경과시, Griess 방법에 기반한 산화질소 검출 키트 (iNtRON biotechnology)를 사용하여, 제조자의 프로토콜에 따라 산화질소 전환(transformation)의 부산물인 아질산염(nitrite) 농도를 측정함으로써 산화질소의 생성량을 분석하였다 (도 14).
결과
도 14에 나타난 바와 같이, 지방생성 유도 1일 및 2일 후 산화질소로부터 생성된 아질산염 농도는 증가하였으나, 이데솔리드 처리시 그 증가 수준이 유의하게 감소하였다. 따라서, 이데솔리드는 지방생성 중 산화질소의 생성을 억제하는 효과를 갖는다.
4-2.
이데솔리드에
의한
iNOS
발현 억제
방법
실시예 4-1에서 수득한 분화된 지방세포에 TRIzol 시약을 처리하여 총 mRNA를 분리하고, M-MLV 역전사효소 (Promega)에 의해 cDNA를 합성하였다. 정량적 RT-PCR에 의해 iNOS의 mRNA 발현 수준을 측정하였다. 발현량을 β-액틴 수준에 대해 정규화시킨 후, 상대적 발현 수준을 결정하였다.
C3H10T1/2 세포로부터 분리한 mRNA에 대해 정방향(F) 및 역방향(R) 프라이머로서 iNOS-F 5'-CAGCTGGGCTGTACAAACCTT-3' 및 iNOS-R 5'-CATTGGAAGTGAAGCGTTTCG-3'을 각각 사용하였다.
결과
iNOS는 지방생성 중 산화질소의 생성에 기여하는 것으로 알려져 있다. 도 15에 나타난 바와 같이, 이데솔리드 처리는 지방생성 분화 유도 1일 및 2일 후 iNOS 유전자 발현을 감소시켰으며, 이는 이데솔리드가 산화질소 생성을 억제함으로써 지방생성을 감소시킨다는 것을 시사한다.
실험예
5:
이데솔리드에
의한 아르기닌-유도 지방생성의 억제 활성
아르기닌은 이산화질소의 전구물질로서 지방생성 분화를 활성화하는 것으로 알려졌다. 본 실험예에서는, 아르기닌에 의해 유도된 지방생성에 대한 이데솔리드의 억제 활성을 평가하였다.
5-1. 아르기닌-유도 지방생성에서
NO
생성의 억제
방법
C3H10T1/2 세포를 10% 우 태아 혈청을 포함하는 DMEM에서 유지시키고, 이데솔리드 10 ㎍/mL를 처리하거나 처리하지 않은, 분화유도물질 (덱사메타손 1μM, 인슐린 5㎍/mL, 및 트로글리타존 5μM) 및 아르기닌 1 μM을 포함하는 지방생성 분화 배지 중에서 인큐베이션시켰다. 세포들을 이틀마다 신선한 지방생성 분화 배지로 교체하면서 지방세포로 분화시켰다.
분화 유도 1일 및 2일 경과시, Griess 방법에 기반한 산화질소 검출 키트 (iNtRON biotechnology)를 사용하여, 제조자의 프로토콜에 따라 아질산염 농도를 측정함으로써 산화질소의 생성량을 분석하였다 (도 16).
결과
도 16에 나타난 바와 같이, 아르기닌은 아질산염의 농도를 현저하게 증가시켰으나, 이러한 산화질소의 생성 유도는 이데솔리드를 처리한 군에서 분화 1일 및 2일 후에 유의하게 억제되었다.
5-2. 오일
레드
오 염색
방법
C3H10T1/2 세포를 이데솔리드의 처리 농도를 달리하여 (0, 1, 5 또는 10 ㎍/mL) 상기 실시예 5-1에서와 동일한 방법으로 지방세포로의 분화를 유도하였다. 대조군으로서, C3H10T1/2 세포를 아르기닌을 포함하지 않는 지방생성 분화 배지에서 배양하였다.
분화된 지방세포를 PBS로 세척하고, 10% 포르말린 중에서 1시간 동안 고정시켰다. 세포들을 PBS로 세척한 후, 실온에서 55% 이소프로판올 용액에서 오일 레드 오로 염색시켰다. 그 다음, 증류수로 세포를 세척하고, 광학 현미경으로 관찰하였다 (도 17).
결과
도 17에 나타난 바와 같이, 아르기닌 처리시 지방 생성이 증가하였으며, 이데솔리드 처리시 아르기닌에 의해 유도된 지방세포 분화가 억제된 것을 관찰하였다. 특히, 이데솔리드 처리 농도가 증가할수록 지방 유적의 크기는 감소하여, 이데솔리드에 의한 억제 효과가 용량의존적으로 나타나는 것을 확인하였다.
5-3. 아르기닌-유도 지방생성에서 지방생성
마커
발현량 측정
방법
상기 실시예 5-2에서 수득한 분화된 지방세포에 TRIzol 시약을 처리하여 총 mRNA를 추출하고, M-MLV 역전사효소 (Promega)에 의해 cDNA를 합성하였다. 정량적 RT-PCR에 의해 지방생성 마커 유전자인 aP2 및 아디포넥틴의 mRNA 발현 수준을 측정하였다. 발현량을 β-액틴 수준에 대해 정규화시킨 후, 상대적 발현 수준을 결정하였다 (도 18 및 19).
C3H10T1/2 세포로부터 분리한 mRNA에 대해 정방향(F) 및 역방향(R) 프라이머로서 aP2-F 5'-GCATGAGCCAAAGGAAGAGG-3' 및 aP2-R 5'-CCGACTGACTATTGTAGTG-3'; 아디포넥틴-F 5'-AAGAAGGACAAGGCCGTTCTC-3' 및 아디포넥틴-R 5'-GAGTCCATTGTGGTCCCC-3'을 각각 사용하였다.
결과
도 18 및 19에 나타난 바와 같이, 아르기닌 처리시 지방생성 마커 유전자인 aP2 및 아디포넥틴의 발현 수준이 증가하였으며, 이러한 발현 유도는 이데솔리드 처리시 용량의존적으로 억제되었다.
이하 본 발명의 조성물을 포함하는 의약, 기능성 식품 및 기능성 화장료의 일부 제제예가 제시되나, 본 발명의 범위가 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물, 기능성 식품 조성물 및 기능성 화장료 조성물은 용도 및 적용증에 적합한 임의의 형태로, 가능한 가장 우수한 제제를 얻기 위하여 당업자에 의해 당해 기술분야에 알려진 모든 방식으로 제조될 수 있다.
제제예
1. 정제의 제조
정제 1정 중 함량
(-)-이데솔리드 ....................... 25 mg
유당 ................................. 50 mg
전분 ................................. 10 mg
스테아린산 마그네슘.................... 적량
상기의 성분을 혼합하고 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
제제예
2. 연질캡슐제의 제조
연질캡슐제 1정 중 함량
이데스카르핀 .......................... 100 mg
폴리에틸렌글리콜 400 ...................400 mg
농글리세린 ............................. 55 mg
정제수 ................................. 35 mg
폴리에틸렌글리콜과 농글리세린을 혼합한 다음 정제수를 투입하고 이 혼합물을 약 60 ℃로 유지한 상태에서 플라본을 첨가한다. 약 1,500 rpm으로 교반하여 균일하게 혼합되면 서서히 교반하면서 실온으로 냉각시키고, 진공펌프를 사용하여 기포를 제거한 후 연질캡슐의 내용물로 한다.
연질캡슐의 피막은 일반적으로 널리 알려진 젤라틴, 가소제의 소프트 처방으로 하여 1 캅셀당 젤라틴 132 mg, 농글리세린 52 mg, 70% 디솔비톨액 6 mg 및 착향제로 에틸바닐린 적량, 코팅기제로 카르나우바납을 사용하여 통상의 조제방법으로 제조한다.
제제예
3.
현탁제의
제조
폴리오트리신 .......................... 250 mg
이성화당 ................................ 10 g
설탕 ................................... 30 mg
나트륨 CMC ........................... 100 mg
레몬향 .................................. 적량
정제수 적량 가하여 전체 100 ml
상기의 성분을 통상의 현탁제의 제조 방법에 따라 혼합하여 현탁제를 제조하고, 100 ml 용량의 갈색병에 충진하고 멸균하여 현탁제를 제조한다.
제제예
4: 건강 음료의 제조
(-)-이데솔리드 ......................... 1000 ㎎
구연산 ................................. 1000 ㎎
올리고당 ................................. 100 g
매실농축액 ................................. 2 g
타우린 ..................................... 1 g
정제수를 가하여 전체 900 ㎖
통상의 건강 음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85 ℃에서 교반 가열한다. 제조된 용액을 여과한 후 멸균된 2ℓ용기에 취득하여 밀봉 멸균하고, 냉장 보관하여 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.
제제예
5: 로션 제조
(-)-이데솔리드 ...................................10.00(%)
이데스카르핀 .....................................10.00
수용성 콜라겐 (1 % 수용액)..............,..........1.00
시트르산나트륨...........................,.........0.10
시트르산...........................................0.05
감초 엑기스........................................0.20
1,3-부틸렌글리콜...................................3.00
유지...............................................2.00
세린...............................................1.00
정제수로 전량을 100으로 하였으며, 상기의 배합비(중량%)에 의해 피부 외용 로션을 제조하였다.
Claims (12)
- 제2항에 있어서, 상기 화합물은 화학식 Ⅲ의 화합물인 것인 약학적 조성물.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질 대사 질환은 비만, 이상지질혈증, 고지혈증, 동맥경화, 간지방증, 비알코올성 지방간, 2형 당뇨병, 인슐린 저항성 및 대사 증후군으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 약학적 조성물.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 경구투여용으로 제제화되는 것인 약학적 조성물.
- 이나무(Idesia polycarpa Maxim,) 열매의 C1 -4 알코올 추출물 또는 그의 약제학적으로 허용가능한 염 또는 용매화물을 유효성분으로 포함하는, 지질 대사 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
- 제6항에 있어서, 상기 이나무 열매 추출물은 메탄올 추출물인 것인 약학적 조성물.
- 제7항에 있어서, 상기 메탄올 추출물의 CHCl3 분획물, EtOAc 분획물 및 n-부틸알코올 분획물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는 것인 약학적 조성물.
- 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 지질 대사 질환은 비만, 이상지질혈증, 고지혈증, 동맥경화, 간지방증, 비알코올성 지방간, 2형 당뇨병, 인슐린 저항성 및 대사 증후군으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 약학적 조성물.
- 제5항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 경구투여용으로 제제화되는 것인 약학적 조성물.
- 이나무 열매의 C1 -4 알코올 추출물을 포함하는, 비만, 이상지질혈증, 고지혈증, 동맥경화, 간지방증, 비알코올성 지방간, 2형 당뇨병, 인슐린 저항성 및 대사 증후군으로 이루어진 군으로부터 선택되는 지질 대사 질환의 예방 또는 개선용 건강기능성 식품 조성물.
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